涉及hpv相關的癌前期的和癌的生長(包括cin)的方法和組合物的製作方法

2023-11-04 11:06:27 4

專利名稱：：涉及hpv相關的癌前期的和癌的生長(包括cin)的方法和組合物的製作方法
背景技術：
：本申請要求於2001年7月20日提交的美國臨時專利申請60/306,809的優先權,在此其全文作為參考。依據從國家癌症研究院(NCI)的授權號CA65561和CA77378以及國家健康研究院(NIH)的授權號CA16672，美國政府可擁有本發明的權利。1.發明領域本發明一般涉及免疫學，病毒學和腫瘤學。具體來說，涉及診斷和治療由人乳頭瘤病毒(HPV)引起的癌前期的和癌的生長或損傷(包括子宮頸上皮內瘤(CIN))發生和復發的方法。2.相關技術描述全世界女性中，子宮頸癌是第二惡性癌，佔到所有女性癌症患者的15％(Parkin等，1993)。在美國，子宮頸癌是女性生殖道最為普遍的瘤之一。實驗室和流行病學的研究已經集中於一些種類的人乳頭瘤病毒(HPV)在子宮頸瘤發病機理中的病原學作用上(Brinton，1992；Munoz等，1992)。一般的，在超過79％的確診患有子宮頸疾病的婦女的樣品中檢測出HPV的DNA。最普遍的HPV類型是HPV16，它發現於高度鱗狀上皮內損傷和癌症中(Lorincz等，1992)。流行病學研究結論支持了子宮頸瘤與HPV之間的相關性，在HPV型16中，這一關係更為顯著(Morrison等，1991；Koutsky等，1992；和Munoz等，1992)。腫瘤由細胞的非正常生長形成，它通常導致入侵正常組織，如原發性腫瘤，或導致向遠處組織的傳播，如轉移瘤。HPV16的E6和E7基因經常共同表達，且它們在HPV16陽性宮頸癌的活組織的病毒轉錄產物中異常豐富(Wettstein，1990；Seedorf等，1987)。充分的證據表明，E6和E7可讀框的共同表達對於多種哺乳動物細胞的惡性轉化是必要且充分的(Munger等，1989)。而且，病毒基因組的E6和E7區域的連續表達似乎是保持惡性表型所必需的(vonKnebelDoeberitz等，1988)。一些HPV感染患者會產生子宮頸瘤，而另一些則不會。也觀察到很大比例的自發消退，這表明宿主的免疫作用。引入一種細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的反應建立了針對病毒感染的主要防禦機制；有時，一種病毒特異的CTL反應可起到完全的保護作用而無需抗體反應伴隨(Sastry等，1992；Bevan，1989；Lukacher，1984)。基於現有文獻關於抗HPV抗體，尤其是那些直接抗E7癌蛋白的抗體的廣泛增長和子宮頸疾病嚴重性之間的關係(Cason等，1992；Hamsikova等，1994；Jha等，1993)，表明了HPV特異的體液反應可能不會對HPV相關的子宮頸疾病起到保護作用(Nakagawa等，1996)。另一方面，已經報導帶有CMI缺陷個體的HPV相關子宮頸瘤的發病率增長，證明了T細胞參與控制人HPV相關的瘤的形成(Nakagawa等，1996；Tsukui等；1996；Feltkamp等，1993和Clerici等，1997)。在侵入性宮頸癌患者體內，已經觀察到IL-2產生量和對於促細胞分裂劑如PHA和伴刀豆球蛋白-A的增殖反應的減少(Park等，1992)。已經描述了大量體外和體內策略從HPV-16的E6、E7肽，和LI蛋白鑑別誘導小鼠和人的T細胞活性的肽(Feltkamp等，1993；Strang等，1990；Tindel等，1991；Shepherd等，1992；Stauss等，1992；Kast等，1993)。典型地，誘導病毒特異的CTL可以通過感染表達病毒基因產物的病毒或重組病毒來實現。該病毒基因產物經加工且以肽的形式存在於受感染細胞的表面，與MHCI類分子相結合，被CTL識別(Unanue，1989)。另外，研究也集中在引起病毒特異的CTL反應的HIV肽的鑑別和描述上。Townsend等闡明了用蛋白質中T細胞抗原決定基作為疫苗候補物質的觀念，當時他們的小組證明了流感核蛋白中的短合成肽作為抗原決定基對CTL反應的作用(Townsend等，1986)。本發明者和其他人已經報導了用合成肽體內產生病毒特異的CTL(Kast等，1991；Aichele等，1990；Deres等，，1989；Sastry等，1992；Sastry等，1994；Casement等，1995)以抵抗流感，淋巴細胞脈絡叢腦膜炎，仙臺病毒和HIV。超過90％的宮頸癌表達人乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7蛋白。這些獨特的抗原是開發細胞毒性T淋巴細胞(CTL)用於抗癌免疫療法的理想目標。相應於HPV-16的E6和E7癌蛋白的合成肽已經鑑別出來了，它對於體內誘導HPV特異的CTL反應是有效的(Sarkar等，1995)。最近，Nakagawa等報導了在許多沒有子宮頸損傷的處女和有性生活的婦女中，可檢測到針對HPV-16肽和蛋白的全身T細胞增殖反應和CTL反應，而在患有疾病的婦女體內則檢測不出(Nakagawa等，1997)。類似地，Tsukui等報導了對HPV抗原的TH淋巴細胞反應，尤其是IL-2的產生，在細胞學正常的婦女中比在有不同程度宮頸瘤進程的婦女中要多(Tsukui等，1996)。而且，Clerici等發現，能潛在增強CMI的TH1細胞因子(IL-2和IFN-γ)的產生在感染大量HPV的婦女體內有缺陷，並且發現CIN的進展與從TH1到TH2細胞因子產生的轉變相關(Clerici等，1997)。使用長期體外刺激方案確定TH活性，Kadish等報導了對特定HPV肽的淋巴增殖反應與HPV的清除和CIN的退化有關(Kadish等，1997)。另一方面，deGruijil等報導了針對HPV16E7肽的T細胞增殖反應與HPV的持續感染相關，但是抗原特異的IL-2生產與病毒清除和宮頸損傷進程均相關(deGruijil等，1996)。對於CIN患者的普通臨床治療方案包括切除或燒蝕治療。然而，進一步的研究證明，有相當數量的患者會復發。目前，在接受過針對CIN的燒蝕或切除治療的患者中，關於癌前期的或癌的生長，復發或康復狀況的發生不存在明確的認識。需要更好且改進的方法來有效治療與HPV相關的癌前期的或癌的生長和損傷疾病。發明概述本發明基於觀察到感染人乳頭瘤病毒(HPV)的患者對HPV的E6和/或E7肽的細胞介導的免疫(CMI)應答與其預後相關。對於泌尿生殖道，尤其對於子宮頸的癌前期的或癌的生長的發生，表現細胞介導的免疫應答比那些不表現出細胞介導的免疫的患者危險性減少；換句話說，尤其針對E6和/或E7肽顯示出陽性的細胞介導的免疫應答的患者，就發展HPV相關的癌前期的或癌的生長來說，會有良好的預後情況。或者說，一個對HPV的E6或E7蛋白質化合物顯示無或低CMI反應的患者，就HPV感染結果的生理性效應而言，預後不良的危險性會更大。因而，本發明涉及鑑別患者有危險患HPV相關的高增殖性病情(包括疣，CIN和惡性腫瘤或其它癌前期的或癌的生長)的組合物和方法，；本發明尤其適於評價患者復發高增殖性病情的可能性。此處，術語「生長」和「損傷」可交替使用。並且，術語「癌前期的或癌的生長」指與HPV相關的生長。除子宮頸的癌前期的或癌的生長或損傷，這樣的腫瘤或損傷也可以出現在尿生殖道，包括會陰，陰戶和陰莖的瘤生長或損傷。適用於本方法的患者可以包括任何能夠感染HPV病毒的哺乳動物；在一些實施方案中，患者被特定為人，男性或女性。在一些實施方案中，本發明涉及能確定感染人乳頭瘤病毒的患者發展或復發癌前期的或癌的生長的可能性的方法。在一些案例中，患者已經治療了瘤生長。該方法包括以下步驟從患者體內獲得樣品，用至少一種HPV的E6或E7肽溫育該樣品；以及測定樣品針對這些肽的細胞介導的免疫(CMI)應答。對E6或E7肽或其組合有細胞介導的免疫應答，則表明比不顯示這一反應的人，復發的危險性減少。在宮頸癌的發展中頻繁觀察到的一種前癌生長是宮頸上皮內瘤樣病變或CIN。在本發明的一些實施方案中，本發明方法可適用於處於CIN任何階段(CIN1，CIN2，CIN3或鱗狀上皮內損傷(SIL)，低度SIL(L-SIL)和高度SIL(HSIL))的患者。進一步，在其它實施方案中，該方法可以適用於患有CIN以外的更嚴重的高增殖性生長的患者，如惡性或癌生長。在本發明中，術語「復發」是指癌前期的或癌的生長的出現，或最初生長的再現，或最初癌前期的或癌的生長在退化，消除，或治療之後的顯現。此處，術語「溫育」指將樣品露置或接觸含有肽的組合物。要求保護的方法適用於人乳頭瘤病毒的感染。所述人乳頭瘤病毒可以是高等級或高危型，如HPV16，18，31，45，56或58。在一些實施方案中，人乳頭瘤病毒是HPV16。在另一些實施方案中，人乳頭瘤病毒是中危型，如HPV33，35，37，51，52，59，66或68。更進一步的實施方案中，HPV是與疣相關的低危或低等型，如類型6，11，26，40，42，43，44，53，55，62，或66。所述樣品包括能夠引起細胞介導的免疫應答的細胞。在一些實施方案中，樣品是血液樣品或血清樣品，而在其它實施方案中，樣品通過灌洗，塗片或拭抹疑似感染或已感染的區域，如陰道，宮頸或陰莖的區域而獲得。外周血單核細胞(PBMC)能導致細胞介導的免疫應答，且含有這種細胞的任何樣品也能用於本發明的方法。在一些實施方案中，考慮來自樣品的細胞在獲得之後和檢定之前在培養基中培養。考慮在檢定之前在培養基中該樣品可以培養1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多小時和多達1，2，3，4，5，6或7天，並多達1，2，3，4，5或更多星期，並且多達1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12個月。也考慮細胞在檢定之前在培養基中培養和/或在低於零攝氏度保藏。細胞自身或細胞培養上清液(培養液，不完整的細胞)可以用於隨後細胞介導的免疫應答的分析。在一些實施方案中，先在培養基中培養細胞2-8小時(一些情況下6小時)，然後用流式細胞儀分析胞內細胞因子。在其它實施方案中，先在培養基中培養細胞2天到20天(一些情況下15天)，然後用鉻釋放分析以確定細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性。本發明的方法涉及確定患者是否顯示對HPV肽的細胞介導的免疫應答。在個別實施方案中，所述肽是E6或E7肽，意味著它們的胺基酸序列在其長度上與E6或E7多肽的連續胺基酸序列具有至少90％的相同性。具體地，考慮使用5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50或更多的SEQIDNO19(來自HPV16的E6)或SEQIDNO20(來自HPV16的E7)的連續胺基酸。考慮在一些實施方案中，僅有一個序列的肽被檢測(如E6肽，或另一個實例，E7肽)，而在其他實施方案中，多序列可被檢測。在一個實施方案中，E6肽和E7肽在本發明中被使用。在其它實施方案中，至少兩個E6肽(指至少兩個不同的E6序列)，至少兩個E7肽(指至少兩個不同的E7序列)，或二者同時被檢測。可以考慮使用1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，14，15或更多的E6或E7肽，也可以是任何E6或E7肽的組合。在更具體的方式中，E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，P9L，P10I，Q20P，R16R，或G10S，或其組合。在特定的實施方案中，以下的E6肽將單獨使用或作為包括以下一個或多個肽的混合物來使用，這些肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，或VIOC。而在其它實施方案中，E7肽是T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C，或其混合物。在特定的實施方案中，以下的E7肽Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C單獨或作為混合物使用。此外，以下肽中包括至少一個E6肽和一個E7肽的混合物K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，Q19D，R9F，R9V，L9V或G10C。在一些實施方案中，特別考慮排除上述混合物中一個或多個肽。特別考慮涉及本發明診斷方法的組合物還可適用於本發明的預防和治療方法。本發明方法涉及抗人乳頭瘤病毒的細胞介導的免疫(CMI)應答。有不同的方法可以鑑別和評價細胞介導的免疫應答(區別於血清或抗體介導的免疫應答)。在本發明的實施方案中，測定T細胞的增殖。T細胞增殖可通過測定氚化胸苷的摻入來分析。針對至少一個E6或E7肽的SI數值範圍等於或大於2.0的增殖反應被認為是陽性，它表示患者的癌前期的或癌的生長或損傷復發的危險減少。針對至少一個E6或E7肽的SI值等於或大於3.0的增殖反應表明了細胞介導的應答，因此鑑定患者癌前期的或癌的生長方面改良的預後進展。換句話說，SI低於2.0，包括SI值為零的患者被認為對E6或E7肽具有低的或沒有細胞介導的免疫應答，並認為他們的癌前期的或癌的生長有增加的發展或復發危險。細胞介導應答也可用非放射性方法如MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)染料或還原測定法，這是一種活細胞(T細胞增殖)比色分析法(daCosta等，1999)，或alamarBlue分析法，它是另外一種測定IL-2-應答性細胞的比色分析法(Gloeckner等，2001；Kwack等，2000)。在本發明的另一實施方案中，測定細胞介導的免疫應答包括測量TH1或TH2細胞因子量。即使患者由T細胞增殖測定沒有顯示CMI應答，復發增長的危險性仍與TH2細胞因子的產生相關，如IL-10。對E6和/或E7肽顯示產生TH1細胞因子的應答的患者，如IFN-γ和IL-2，觀察到他們復發的危險性減少。在一些實例中，TH1細胞因子的量被測量，如IL-2，幹擾素(IFN)γ，腫瘤壞死因子(TNF)α，或THF-β，IL-3，IL-12，IL-15，IL-16，IL-17或IL-18。在一個具體的實施方案中，測量IL-18的量。在另外的實例中，測量TH2細胞因子的量，如IL-1，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-13或IL-14。可以通過免疫測定法測定CMI應答，如ELISA或放射免疫測定法或通過流式細胞儀。在一些實施方案中，來自患者的樣品可測試不止一次，以復份樣品或不同的測試。在一些實施方案中，來自患者的樣品可有多份。多份樣品可以是同類型的，如多份的血液樣品，或者它們可以是不同類型，如一份血液樣品和一份陰道拭擦樣品。適用於本發明方法的患者包括那些還沒有診斷出HPV但認為有HPV的患者，曾經感染有HPV但再也沒有顯示感染HPV徵象的患者，已知感染了HPV的患者，在宮頸或其它泌尿生殖器區域或周圍有癌前期的或癌的生長，而她自己並不知道感染了HPV的患者，癌前期的或癌的生長已經成功或不成功治療的患者，和至少一個癌前期的或癌的生長復發的患者。癌前期的或癌的生長或損傷是指生長不能控制的高增殖性細胞，包括前期瘤形成，如CIN和瘤形成(良性和惡性)，涉及鱗狀上皮細胞和不確定顯著的非典型鱗狀細胞(ASCUS)。考慮患者有不止一個腫瘤或損傷。任何腫瘤的治療既涉及外科(燒蝕或切除)手術，又涉及抗HPV的常規癌症治療。這種治療包括化學療法，放射療法，激素療法，免疫療法，施用磷酸膽鹼鈣，Thiovir，thiovir類似物(BioKeys)，podofilox，鬼臼脂，三氯乙酸(TCA)，或5氟尿嘧啶(5-FU)，損傷內或intransal幹擾素，Imiquimid霜劑。燒蝕技術包括使用液氮，電炙或電解剖，外科切除，或雷射技術。成功的治療指完全除去任何腫瘤徵象的治療，而部分成功治療指影響腫瘤使其大小或生長率變小，或防止腫瘤的增大，或如果有多個腫瘤，減少腫瘤生長的數量。曾經感染HPV的患者隨後可以不顯示HPV感染的跡象。然而，相信這樣的患者仍然經受癌前期的或癌的生長復發的可能，象連續感染HPV徵象的患者。本發明的一些實施方案中，評價了患者是否確定感染HPV。具體的，也包括HPV的血清型鑑定或其成為最初確定感染的部分。進一步實施方案中，評價了患者是否有癌前期的或癌的生長，如果是癌症，評價腫瘤為良性還是惡性。本發明的方法包括其中在治療癌前期的或癌的生長至少一個月後，從患者獲得樣品的實施方案。患者可以對至少一個癌前期的或癌的生長接受治療，如通過某些形式的燒蝕。本發明也包括跟本發明的診斷方法一起使用的治療方法。在本發明的一些實施方案中，癌前期的或癌的生長的復發進展危險性增加的患者被鑑別。可以採用在患者被認為具有增長的危險性之前未考慮的措施。在一些實施方案中，對沒有另外被治療的患者進行抗癌前期的或癌的生長的預防性治療或進行經常性檢查，或二者同時進行。預防性治療是對缺乏癌前期的或癌的生長生理性病徵時進行的治療；「治療方法」包括對患者顯示的生理情況進行內科治療。預防性治療包括如上所述的，對HPV感染和與HPV相關的癌前期的和癌的生長治療的使用。在一些實施方案中，防禦或減少癌前期的和癌的生長進展危險的預防方法包括用本發明公開的HPV的E6和E7肽的免疫療法。如果患者被鑑定為對特別是E6或E7肽，或對這些肽的組合具有低的或沒有細胞介導的免疫應答，那麼給患者施用E6或E7的肽序列，用以引發CMI應答。這些肽包括任何E6或E7肽，尤其包括表3的全部或部分肽。並且，來自E6或E7多肽的肽，如本發明診斷方法中所論述的，也可以在預防性方法中施用。考慮患者施用含有一或多種肽序列的組合物，在一些實施方案中，還包括輔藥，基於脂質體的組合物，或二者。在其它實施方案中，患者不止一次被施用肽。在一些實施方案中，對感染了HPV的患者有一種通過用本發明方法中公開的方法鑑定患者有危險復發HPV相關腫瘤生長的防止癌前期的或癌的生長(如CIN)復發的方法；以及防止或治療任何復發的方法。治療方法包括外科手術(燒蝕或切除術)，以及上述常規抗HPV的癌症治療方法。在一些實施方案中，所述方法是至少包括上述一個來自HPV的E6或E7肽的免疫療法治療。此外，本發明還包括確定曾感染有HPV並治療腫瘤生長的患者體內癌前期的或癌的生長的復發可能性的試劑盒，該試劑盒在適當的試劑容器中包括至少一個來自HPV的E6或E7肽，和能夠檢測針對肽的細胞介導的免疫應答的抗體。在一些實施方案中，抗體附著在不起反應的結構上，樣品施加於其中，如帶有孔的板。在另一些實施方案中，不起反應的結構具有膜，這種膜能粘貼或附著在該結構上。在一些實施方案中，試劑盒可用於酶聯免疫斑點(ELISPOT)測定來檢測，一些實施方案中，測定細胞因子分泌細胞的數量。在另一些實施方案中，試劑盒包括一種本發明公開的抗TH1或TH2細胞因子抗體。其它方式包括檢測所含抗體的檢測試劑。檢測試劑是任何能檢測另一化合物的化合物，包括能在視覺上檢測的試劑，如比色檢測試劑。權利要求和/或說明書中使用「一」與術語「包括」連接可表示「一種」但也有「一或多種」，「至少一種」，「一種或更多」的意思。本發明的其它目的，特徵和有益效果將通過以下詳細的描述清楚表明。然而，應該理解，說明本發明特殊實施方案的詳細描述和特殊實施例僅為描述而給出，因此屬於本發明精神和範圍之內的各種變更和更改，本領域技術人員從這一詳細描述都可清楚得到。附圖簡要說明以下附圖形成本說明書的一部分，並且成為本發明某方面的進一步說明。通過參考這些附圖的一幅或多幅結合本發明的特殊實施方案的詳細描述，本發明可以得到更好的理解。圖1A-B各不相同的四組被研究婦女的PBMC對不同E6和E7合成肽的增殖反應。第1組婦女正常(CIN(-)/HPV(-)，n＝6)，第2組婦女剛診斷為HPV相關的CIN(CIN(+)/HPV(+)，n＝31)，第3組是療後無疾病(Recur(-)，n＝22)，且第4組是有疾病復發的(Recur(+)，n＝10)。測定來自四個不同組婦女的PBMC對來自HPV-16的癌蛋白E6或E7的肽的增殖反應。A.顯示了每個患者對各種被測肽的刺激指數(SI)值，該值是根據3[H]胸腺嘧啶摻入肽處理過的樣品超過培養基對照的倍數的增加來計算。B.各組對E6，E7肽或這兩種肽的陽性反應的匯總。組數表示於x軸上，而陽性反應的百分數表示於y軸上。圖2A-D.第3組(Recur(-))和第4組(Recur(+))對來自HPV-16癌蛋白E6和E7的合成肽的PBMC的增殖反應。檢測這些組婦女的PBMC相對對照肽(對照)的，分別針對來自HPV-16癌蛋白E6和E7的7和8肽的增殖反應。顯示表現SI值的代表數據，它們分別來自第3組(圖A和B)和第4組(圖C和D)的兩位患者。圖3.第3組婦女的PBMC對所選E6和E7肽刺激響應的TH1細胞因子生產。第3組(Recur(-))和第4組(Recur(+))婦女的PBMC在E6肽Q15L和E7肽Q19D的存在下培養兩天，並且通過ELISA在各自的上清液中檢測各種TH1(IL-2，IFN-γ，IL-12)和TH2(IL-4，IL-10)細胞因子的存在。經與培養基對照調節後，顯示第3和4組各被測患者產生的細胞因子數量。說明性實施方案的描述人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要危險因素，並且強的HPV-特異的細胞介導的免疫和CIN較小嚴重程度之間有關聯。對於CIN患者的普通臨床治療策略包括切除或燒蝕治療，然而隨後的研究表明相當數量的患者經歷了復發。目前，對於這些患者的病情復發或無病情況並沒有明確的認識。對感染，沒有感染和復發患者而言，對CIN的預測和治療或預防性治療是關鍵。多數治療方法已經試驗並實施，但是它們還不能排除疾病或防止疾病復發。有相當數量的患者CIN復發，但是還沒有可測試復發可能性的方法。本發明提供了一種確定CIN復發可能性的方法，該方法作為感染HPV並治療CIN患者的預後性和生物標記物。該方法涉及檢測和分析針對HPV癌蛋白肽，如E6和E7，的細胞介導的免疫應答。該方法也幫助鑑別有復發CIN危險的感染有HPV的患者。進一步，本發明利用定向傳輸系統，試劑盒和免疫療法來防止CIN復發並診斷有高度危險患CIN的患者。I.HPV在宮頸瘤形成和癌症發展階段，人乳頭瘤病毒(HPV)先被作為一種重要的輔因子鑑別出來。然而感染HPV並不足以導致宮頸癌。並不是所有感染HPV的女性都會發展成宮頸癌。婦女通常治療在每年的巴氏(Pap)塗片中檢測到的宮頸發育異常疾病。儘管存在巴氏塗片檢測，流行病學研究繼續暗示HPV是產生宮頸瘤和癌症僅有的最大危險因素。宮頸上皮內瘤(CIN)是由人乳頭瘤病毒(HPV)引起的一種宮頸癌。HPV與宮頸癌的發展相關，尤其是HPV型16，18，31，45，56和58。它們構成HPV的高級型/高危型。中級/中危型包括HPV33，35，37，51，52，59，66和68。其它與疣相關的低級/低危型是類型6，11，26，40，42，43，44，53，54，55，62和66。這些低級型性質上不是惡性的。HPV基因組目前以游離基因形式(不完整的，環狀的)存在於CIN中，而在侵入性宮頸癌中，基因組通常完整地整合到宿主DNA中。HPV的高危型表達的E6和E7癌蛋白對於宮頸鱗狀上皮的惡性轉化起關鍵作用，因為它們能夠結合然後失活兩個重要腫瘤抑制基因，p53和成視網膜細胞瘤基因(Rb)。這些腫瘤抑制蛋白的失活成為HPV致癌潛力的關鍵因素。A.宮頸癌的診斷和治療人乳頭瘤病毒被鑑定為與宮頸癌的發展有關，宮頸癌是宮頸上皮瘤(CIN)經若干階段表現出惡性狀況。儘管存在巴氏塗片檢測，流行病學研究連續暗示HPV是發展CIN僅有的最大危險因素，許多研究繼續尋找能夠幫助鑑別處於CIN危險中的感染HPV的婦女的宿主和/或病毒標記物。與此同等重要的是經過治療的患者復發CIN的可能性。對經過切除或燒蝕治療的患者跟蹤研究表明有相當數量的患者復發。因此，能夠評價CIN復發可能性是非常重要的。預知復發可允許醫生考慮預防或治療的選擇。自從二十世紀八十年代初，HPV與宮頸癌相關的首次報導出現以來(zurHausen，1994)，人們已經普遍承認了高危HPV型有助於侵襲前的上皮內損傷到癌症的啟動和進展。事實上，已經注意到，在Pap塗片上明顯的細胞病理中HPV感染達到頂點，其特徵為相關核異型性的核周清除(Kurman等，1994)。在修訂的Bethesda術語中，這些HPV改變與輕度發育不良結合定義為LSIL(Kurman和Solomon，1994)。HPV試驗的有效性是複雜的，因為需要區分低危(L-SIL)和高危(H-SIL)HPV型(僅有後者引起與發育異常→癌進展相關的重要危險)，和實際的進展危險。在以前的病例中，新的針對HPV的雜種捕獲檢測區分了高危HPV型(Sherman等，1995；Poijak等，1999；Clavel等，2000)。除了本發明的方法，DNA圖象細胞計數也可用來診斷處於宮頸損傷的患者(Lorenzato等，2001)。1.巴氏塗片在過去的五十年中，巴氏塗片(PapaniclaouSmear，″PapSmear″)已經成為減少宮頸癌死亡率的基礎。巴氏塗片是有效的，因為它能鑑別出宮頸癌的最早期階段。目前估算，在美國每年要做6-7千萬個巴氏塗片。巴氏塗片因此成為檢驗宮頸癌的標準。儘管它在醫學界有廣泛的可接受性，但研究表明巴氏塗片篩選未能發現50-80％的低級癌損傷和甚至15-30％的高級癌損傷。任何細胞學診斷方法的第一步是獲得合適的巴氏塗片細胞來觀察。在常規的巴氏塗片試驗，細胞學家檢測到了脫落細胞樣品，它們獲自宮頸內襯刮下的細胞，塗抹細胞於載玻片，並用巴氏染料染色。細胞學家在染了色的塗片上檢測到異常形態的細胞，這表明存在惡性病症。術語「惡性病症」指存在發育異常，包括原位腺癌(AIS)，侵入性癌(CA)，腫瘤，或類似的惡性或腫瘤細胞。在本發明方法中，脫落細胞樣品來自有或沒有惡性病症的患者。這些樣品可以通過旋轉宮頸取樣裝置獲得，如沿宮頸或陰道黏膜部分的擦拭籤，刮刀，或細胞刷以獲得細胞樣品。合適的樣品應含帶有鱗狀和/或腺細胞的宮頸內膜細胞。脫落細胞樣品通常塗於載玻片，在載玻片表面形成一薄層樣品。然而，手工操作觀察細胞異常或自動化分析細胞學物質可以通過在樣品載玻片上製備「單層」細胞來優化。「單層」的定義實質上是均勻分布的細胞物質的二維的層，主要由單個細胞和小細胞簇組成。當進行巴氏塗片檢測時，婦科學家從宮頸表面收集到脫落細胞，並把它們置於載玻片上，交給細胞學家進行進一步檢測。然後細胞學家觀察置於載玻片上的細胞，並尋找異常細胞。如果發現異常細胞，則認為該巴氏塗片為陽性。如果沒有異常細胞，則認為該巴氏塗片為陰性。對於早期宮頸癌檢測，巴氏塗片篩選通常作為一種實用並經濟的方法。在本發明中，通過Virapap/Viratype分析(TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)來確定HPV陽性。2.陰道鏡檢巴氏塗片處理設計為初期篩檢之用，而陰道鏡檢查及其相關方法通常用於確定巴氏塗片異常，癌症等級和潛在癌損傷。自從1925年陰道鏡檢查被引進以來，它作為經巴氏塗片檢測有宮頸異常可能性患者的後繼診斷方法，已經被廣泛認識。通常認為利用陰道鏡檢查評價巴氏塗片異常的患者是非常有效的，因此它已成為西方社會對這種病情的醫療標準。在美國每年估計會進行4百萬次陰道鏡檢查。3.螢光分光鏡檢查另一種檢測癌前期的和癌的生長或損傷的方法是螢光分光鏡檢查，其能快速的，非侵襲性的，定量探測出組織變為腫瘤時，其生物化學和形態學變化。腫瘤組織改變了的生物化學和形態學狀態反射為可測量的螢光的特性。美國專利6,258,576和6,135,965論述了宮頸鱗狀上皮(CIN)損傷的診斷並特別引入作為參考。3.癌前期的和癌的生長的治療治療意指腫瘤生長的消除，減少或延遲效果。癌生長可通過切除或燒蝕方法治療。除了下面將要詳細描述的免疫療法之外，也可以在本發明方法中使用以下治療或預防方法。i)化學療法癌症療法還包括基於化學和放射治療兩者結合的多種組合療法。組合的化學療法，如順鉑(CDDP)，卡鉑，甲基苄肼，鹽酸氮芥，環磷醯胺，喜樹鹼，異環磷醯胺，苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，白消安，亞硝基脲(nitrosurea)，放線菌素D，紅比黴素，阿黴素，博來黴素，plicomycin，絲裂黴素，鬼臼亞乙苷(VP16)，他莫昔芬，雷洛昔芬，雌激素受體粘合劑，紫杉醇，gemcitabien，諾威本，法呢基蛋白轉移酶抑制劑，反鉑(transplatinum)，5氟尿嘧啶，長春新鹼，長春滅瘟鹼和氨甲蝶呤，或上述藥物的任何類似物或衍生物變異體。ii)放射療法其它導致DNA損傷的因素並廣泛使用的方法包括通常所說的γ射線，X射線和/或放射性同位素向腫瘤細胞定向的輸送。還包括其它形式的DNA損傷因素，如微波和UV照射。所有這些因素很可能影響大範圍的DNA損傷，前體DNA，和DNA的複製和修復，以及染色體的裝配和維持。X射線的劑量值從每日在50至200倫琴持續一段時間(3至4周)到2000至6000倫琴的單劑量。放射性同位素的劑量值改變範圍很大，並且它依賴同位素的半衰期，放射的強度和類型，以及腫瘤細胞的吸收。當用於細胞時，此處的術語「接觸」和「暴露於」描述的是治療的或診斷的肽或多核苷酸，或化學療法或放射性療法的試劑被送達靶細胞或直接與靶細胞並列放置的過程。為了獲得細胞致死或停滯，兩種試劑以有效殺死細胞或防止其分裂的結合總量送達細胞。iii)基因在另外一個實施方案中，次級治療採用基因療法，其中治療性多肽在本發明的嵌合多肽之前，之後或同時施用。嵌合多肽與編碼以下基因產物的第二載體結合的傳輸會在靶腫瘤上產生聯合的抗高增殖性效應。或者，可以使用編碼兩個基因的單個載體。本發明包括多種蛋白，包括細胞增殖誘導物(如生長因子受體)，細胞增殖抑制劑(如腫瘤抑制劑)，和細胞死亡調節劑。iv)燒蝕方法多數患有癌症的人一般都要進行一些類型的手術，包括預防性的，診斷性或分級的，治療或減輕性的手術。治療手術是對癌前期的或癌的治療方法，它可與其它療法結合應用，如本發明所述的，化學療法，放射性療法，激素療法，基因療法，免疫和/或另外的療法。有療效的手術包括切除術，該手術中所有或部分的癌前期的或癌的組織被物理割除，切離，和/或破壞。腫瘤切除術指至少物理切除至少腫瘤的部分。除了腫瘤切除術，手術治療包括雷射手術，冷凍手術，電外科手術和基因錯錄受控的手術(Mohs’surgery)。進一步考慮本發明可聯合表面癌，前期癌或附帶一定正常組織的除去而使用。切除癌細胞，組織或腫瘤的所有和部分後，在體內會形成一個腔。通過灌注，直接注射或在該區域局部施用另外的抗癌治療來完成治療。這樣的治療可以重複，如每1，2，3，4，5，6或7天，或每1，2，3，4和5周，或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12個月。這種治療也可以改變劑量。v)其它藥劑也考慮其它藥劑與本發明的方法結合使用來改進治療效果。這些附加藥劑包括免疫調節試劑，影響細胞表面受體和GAP連接的增量調節的藥劑，抑制細胞增長的和分化藥劑，細胞粘附抑制劑，或增加高增殖性細胞對細胞凋亡誘導劑敏感性的藥劑。免疫調節劑包括腫瘤壞死因子，幹擾素α，β，γ；IL-2和其它細胞因子；F42K和其它細胞因子類似物；或MIP-1，MIP-1β，MCP-1，RANTES，以及其它趨化因子。進一步還包括通過對高增殖性細胞建立自分泌或旁分泌效應，細胞表面受體或它們的配體，如Fas/Fas配體，DR4或DR5/TRAIL，的增量調節能加強本發明的細胞凋亡誘導能力。通過增加GAP連接數目增加細胞間信號傳導會提高相鄰高增殖性細胞群體的抗高增殖性效應。在其它實施方案中，細胞生長抑制的或分化的藥劑可以與本發明聯合使用以提高該方法的抗高增殖效應。還考慮使用細胞粘附抑制劑提高本發明的療效。考慮的細胞粘附抑制劑有粘著斑激酶(FAKs)抑制劑和洛伐他汀。此外還包括增加高增殖性細胞對凋亡的敏感性的其它試劑，如抗體c225可以結合本發明使用來提高療效。激素療法也可與本發明方法或上述其它任何癌症療法結合使用。激素療法可用於治療某些癌症如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌或宮頸癌，以使某些激素，如睪丸素或雌激素的水平降低或阻止其作用。這種療法通常與至少一種其它癌症療法結合使用，作為一種治療方法或減少轉移的危險性。v)抗病毒劑感染HPV的患者可以單獨使用抗病毒劑治療或與抗癌療法結合治療。「抗病毒劑」指一類組合物，它能防止或抑制病毒感染；防止或抑制病毒感染進展；減少病毒的浸染性；防止，抑制或減少病毒感染的生理學症狀；防止或減少病毒活化的發生率；抑制病毒宿主細胞；誘導宿主細胞凋亡；從全身或局部清除病毒；誘導病毒失活；或上述作用的任意結合。抗HPV劑包括施用如下藥物，磷酸膽鹼鈣，Thiovir，thiovir類似物(BioKeys)，坡多非洛，鬼臼脂，三氯乙酸(TCA)，5氟尿嘧啶(5-FU)，損傷部內或intransal幹擾素，或Imiquimid霜劑。其它試劑公開於美國專利6,245,568、6,238,659，和6,214,874。II.蛋白和肽的選擇、合成和應用本發明中，肽被應用於診斷和治療的方法。這些肽與HPV16癌蛋白相關。A.蛋白質組合物在某些實施方案中，本發明涉及的新的組合物，其至少包括一種如以下肽序列的蛋白質分子SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7，SEQIDNO8，SEQIDNO9，SEQIDNO10，SEQIDNO11，SEQIDNO12，SEQIDNO13，SEQIDNO14，SEQIDNO15，SEQIDNO16，SEQIDNO17，SEQIDNO18，SEQIDNO19以及多肽SEQIDNO20和SEQIDNO21。此處，「蛋白質分子」，「蛋白質組合物」，「蛋白質化合物」，「蛋白質鏈」或「蛋白質物質」通常包括，但不限於，一種多於200個胺基酸的蛋白質或從一個基因翻譯來的全長內源性序列的蛋白質；多於約100個胺基酸的多肽，和/或來自約3至約100個胺基酸的肽。上述所有的「蛋白質」術語可在此交替使用。在某些實施方案中，至少一種蛋白質分子包括的胺基酸長度是，但不限於，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1750，2000，2250，2500或更多氨基分子殘基，以及其中任何可變範圍。本發明的肽包括4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或直到包括100個來自SEQIDNOS1-21的相鄰胺基酸。SEQIDNOS1-10的肽來自HPV的E6多肽，SEQIDNOS11-19的肽來自HPV的E7多肽。SEQIDNOS20和21分別是來自HPV癌蛋白E6和E7的多肽。HPV16中E6的GenBank編號為AF327851(SEQIDNO26)，HPV16中E7的編號為U76404(SEQIDNO27)，它們都特別引入作為參考。根據表3可知，特別考慮作為本發明一部分的肽包括以下的E6肽K9L(SEQIDNO26的胺基酸18-26)，E10I(SEQIDNO26的胺基酸23-34)，C10R(SEQIDNO26的胺基酸37-46)，Q15L(SEQIDNO26的胺基酸43-57)，VIOC(SEQIDNO26的胺基酸49-58)，P9L(SEQIDNO26的胺基酸66-74)，P10I(SEQIDNO26的胺基酸102-111)，Q20P(SEQIDNO26的胺基酸97-116)，R16R(SEQIDNO26的胺基酸131-146)，G10S(SEQIDNO26的胺基酸141-150)，或其組合。根據表3，進一步可知，特別考慮作為本發明的一部分的肽包括如下E7肽T10Q(SEQIDNO27的胺基酸7-15)，M9T(SEQIDNO27的胺基酸12-20)，D9L(SEQIDNO27的胺基酸14-22)，Q19D(SEQIDNO27的胺基酸44-62)，R9F(SEQIDNO27的胺基酸49-57)，R9V(SEQIDNO27的胺基酸66-74)，L9V(SEQIDNO27的胺基酸82-90)，G10C(SEQIDNO27的胺基酸85-94)，D20C(SEQIDNO27的胺基酸75-94)，或其組合。此處，「氨基分子」指任何本領域技術人員公知的胺基酸，胺基酸衍生物或胺基酸類似物。在某些實施方案中，蛋白質分子的殘基是連續的，不存在任何非氨基分子中斷氨基分子殘基的序列。在其它實施方案中，所述序列可以包括一個或多個非氨基分子部分。在特定的實施方案中，蛋白質分子的殘基序列可以被一個或多個非氨基分子部分中斷。因此，術語「蛋白質組合物」包括氨基分子序列，該序列含有存在於天然合成蛋白質中20個普通胺基酸的至少一個胺基酸，或包括但不限於下表1所示的至少一個修飾的或非常見的胺基酸。在某些實施方案中，蛋白質組合物包括至少一種蛋白質，多肽或肽。進一步的實施方案中，蛋白質組合物包括一種生物相容的蛋白質，多肽或肽。此處所用的術語「生物相容的」指以這裡描述的方式和劑量施用或用藥到給定的生物體時，不產生明顯的不適反應。生物體包括，但不限於，這樣的不適或不利反應例如顯著毒性或不利的免疫反應。在優選的實施方案中，含有生物相容的蛋白質，多肽或肽的組合物通常是哺乳動物蛋白或肽或合成的蛋白或肽，它們基本上不含毒素，病原體或有害免疫原。蛋白質組合物也可由任何本領域公知的技術製備，包括通過標準分子生物學技術表達蛋白質，多肽或肽，從天然源料中分離蛋白質化合物，或化學合成蛋白質物質。不同基因的核苷酸和蛋白質，多肽和肽序列已經公開了，並可由本領域普通技術人員從計算機資料庫獲得。其中一個資料庫是美國國家生物技術信息中心Genbank和GenPept資料庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本發明公開的技術或本領域公知的技術對這些已知基因的編碼區域進行擴增和/或表達。在某些實施方案中，蛋白質組合物可以為純化的。通常「純化的」指經分級分離除去不同的其它蛋白質，多肽，或肽的某一特定蛋白質，多肽，或肽組合物，並且該組合物基本仍保持其活性，並可測定，如通過本領域普通技術人員公知的，針對特殊的或目的蛋白質，多肽或肽的蛋白質測定。事實上可以使用含有任何蛋白質，多肽或肽的成分用於本發明的組合物和方法。然而，蛋白質物質優選為生物相容性的。在某些實施方案中，考慮形成更粘的組合物有利於組合物更加精確或更易施用於組織，並在整個過程中保持接觸組織。在這種情況下，考慮使用肽組合物，或更優選地，使用多肽或蛋白質組合物。粘度範圍包括，但不限於，大約40至100泊。在某些方面，優選粘度為80至100泊。B.肽的選擇，合成和使用根據與現有文獻中描述的已知T細胞表位相關的兩親性結構和信息，選擇與HPV16的E6和E7癌蛋白相應的肽序列。本發明的肽可以按照常規方法在溶液中或固體支持物上合成。各種自動合成器可以通過商業獲得並按照已知的步驟使用。通常，長度小於100個殘基的小的合成的肽序列通常通過逐步的固相合成法製備。這種固相合成法利用不溶性樹脂支撐低聚物的生長。預定包含目的聚合物的亞基序列在支持物上依次共同反應。在起始反應中末端胺基酸直接或通過連接劑連結在固體支持物上。該末端殘基依次與一系列進一步的殘基如胺基酸類或阻斷的胺基酸部分反應，以得到通過該末端殘基附著在固相物上的生長的寡聚體。在合成方案的每一步，未反應的反應物被洗掉或從與固相接觸中除去。這一循環以預選殘基序列一直持續直到所需聚合物完全形成，但仍保持與固相接觸。然後從固相支持物上切割該聚合物並純化有待使用。上述的常規合成方案是由R.B.Merrifield發明並用於製備某些肽(Merrifield，1986)。這些肽可以在改良的Vega250自動肽合成器中合成(VegaBiochemicals，Tucson，AZ)或利用Houghten提及的「口袋法」(″bagmethod″)合成(Houghten，1985)。也可參見，如Stewart和Young，(1984)；Tam等，(1983)；和Barany和Merrifield(1979)，這些都在此處引入作為參考。符合所述所選區域的短肽序列，或重疊肽的文庫，通常由6至35到50個胺基酸組成，能容易地合成，並且然後通過設計用來鑑定反應肽的篩選方法進行篩選。本發明包括SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7，SEQIDNO8，SEQIDNO9，SEQIDNO10，SEQIDNO11，SEQIDNO12，SEQIDNO13，SEQIDNO14，SEQIDNO15，SEQIDNO16，SEQIDNO17，SEQIDNO18，SEQIDNO19和SEQIDNO20，SEQIDNO21中至少含有4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或多達約100個連續的胺基酸殘基的肽。本發明使用的組合物可包括一種經修飾能增強其活性或使其具有生物防護性的肽。如美國專利5,028,592(引入本申請作為參考)中公開的，生物防護性肽與非防護性肽相比在給病人施用時具有某些優點，防護性肽通常顯示出增強的藥理學活性。用於本發明的組合物也可包含包括有所有L-胺基酸，所有D-胺基酸，或其混合物的肽。使用D-胺基酸可以對天然存在於人體的蛋白酶具有額外的抗性並且具有較少的免疫原性，因此預期能具有較長的生物半衰期。III.蛋白質純化來自HPV的肽和蛋白質可以通過多種方法純化。通常，「純化」是指經分級除去各種其它的蛋白質，多肽或肽的特定的蛋白質，多肽或肽組合物，該組合物基本仍保持其活性，可通過如下文所述的蛋白質測定，或通過本領域普通技術人員公知的方法評估目的蛋白質，多肽或肽。蛋白質純化技術是本領域技術人員公知的。這些技術在一個水平上包括，粗分級細胞成分與多肽和非多肽部分。從其它蛋白中分離出多肽後，可利用層析和電泳技術對目的多肽進一步純化，達到部分或完全純化(純化至均質)。尤其適合製備純肽的分析方法是離子交換層析，排阻層析；聚丙稀醯胺凝膠電泳；等電聚焦電泳。尤其有效的純化肽的方法是快速蛋白液相層析或甚至是HPLC。本發明的某方面涉及純化，在特定的實施方案中，實質上涉及純化編碼的蛋白質和肽，尤其來自E6或E7癌蛋白的肽。本發明使用的術語「純化的蛋白質或肽」是指一種可從其它組分分離的成分，其中蛋白質或肽純化到相對於其天然狀態的任何程度。因此純化的蛋白質或肽也指離開其天然環境的蛋白質或肽。通常，「純化的」指經分級分離去除各種其它成分的蛋白質或肽組合物，這些組合物實質上仍保持其表達的生物活性。而術語「基本純化的」的使用，指蛋白質或肽形成該組合物的主要成分，如佔該組合物的蛋白質的約50％，約60％，約70％，約80％，約90％，約95％或更多。根據本發明公開的內容，本領域技術人員將了解定量蛋白質或肽的純度的不同方法。這些方法包括，如確定一個活性級分的特定活性，或通過SDS/PAGE分析評估一個級分中的多肽數量。評估一個級分純度的優選方法是算出這個級分的特定活性，將其與初提取物中的特定活性相比較，從而算出純度，此處通過「純化倍數」(-foldpurificationnumber)估值。當然用來體現活性值的真實單位有賴於純化之後選擇的特定分析技術，以及表達的蛋白質或肽是否顯示可檢測的活性。各種適用於蛋白質純化的技術是本領域技術人員公知的。這些技術包括，如，用硫酸銨，PEG，抗體等沉澱，或通過加熱變性，然後離心；層析步驟如離子交換，凝膠過濾，反相，羥磷灰石，和親水層析；等電聚焦；凝膠電泳；以及這些技術和其它技術的結合。正如本領域所公知的，可改變實施各純化步驟的順序，或可省略某些步驟，仍能得到基本純化的蛋白質或肽的合適方法。通常不需要總是提供最純淨狀態的蛋白質或肽。事實上，在某些實施方案中，基本不純的產物也具有可利用性。部分純化可以聯合使用較少的純化步驟，或使用相同常規純化方案的不同形式來完成。如，利用HPLC裝置進行陽離子交換柱層析分離相比利用低壓層析系統的同樣技術通常會導致更高級別的純化。顯示相對較低純化程度的方法對於蛋白產物的總回收或保持所表達的蛋白的活性是有利的。已知多肽的遷移隨著SDS/PAGE的不同情況而變，有時會很明顯(Capaldi等，1977)。因此在不同的電泳條件下，須知純化的或部分純化的表達產物所表現的分子重量會不同。高效液相層析(HPLC)表徵為具有非凡的峰解析度的非常快速的分離。這是通過使用非常精細的微粒和高壓來保持足夠的流速達到的。分離可以在大約幾分鐘或至一小時內完成。此外，只需要很少量的樣品，因為微粒非常小且填充密實，柱床體積中只有很小的部分是空隙體積。而且樣品的濃度也不需要很高，因為譜帶很窄，樣品僅有很小的擴散。凝膠層析或分子篩層析是基於分子大小的一種特殊類型的分離層析方法。凝膠層析法分離技術所依據的理論是，所述柱由含有小孔的惰性物質微粒製成，當溶液通過或路過孔隙時，柱根據分子大小將大分子物質從小分子物質中分離出來。只要微粒製成的物質不吸收分子，決定流速的唯一因素就是分子大小。因此，只要性狀相對不變，分子按照減小的大小順序從柱中洗脫。對於分離不同大小的分子，凝膠層析是最好的，因為該分離不依賴其它所有因素，如PH，離子強度，溫度等。並且該方法不存在吸收，較少有區帶擴散，洗脫體積與分子量簡單相關。親和層析是一種依賴於被分離物質與它能特定結合的分子之間的特定親和力的層析操作。這是一種受體-配體型相互作用。柱材料通過將其中的結合夥伴之一共價結合到不溶基質上而合成。然後柱材料能特定吸附溶液中的物質。通過將條件改為不發生結合的情況而發生洗脫(如改變PH，離子強度和溫度)。用於純化含糖化合物的特殊型親和層析是凝集素親和層析。凝集素是能結合各種多糖和糖蛋白的一類物質。凝集素通常通過溴化氰連結到瓊脂糖上。「偶聯葡聚糖的伴刀豆球蛋白A」是第一種應用並已廣泛應用於分離多糖和糖蛋白的這類物質，其它凝集素包括扁豆凝集素，用於純化N-乙醯葡糖胺殘基小麥胚芽凝集素和蓋罩大蝸牛(Helixpomatia)凝集素。凝集素自身用帶有糖配體的親和層析方法純化。乳糖已用於從蓖麻子和花生中純化凝集素；麥芽糖用於從扁豆和刀豆中提取凝集素；N-乙醯-D半乳糖胺用於從大豆中純化凝集素；N-乙醯葡糖胺從小麥胚芽中結合凝集素；D-半乳糖胺用於從蛤和L-巖藻糖從蓮中結合凝集素。基質應是一種自身不以任何明顯度吸收分子並具寬範圍的化學，物理和熱穩定性的物質。配體應以不影響其結合性的方式被偶聯。配體也應提供相對緊密的結合。洗脫該物質時應儘可能不損傷樣品或配體。最常見的親和層析之一是免疫親和層析。適合用於本發明的抗體的生產在下文中論述。IV.核酸A.篩選DNA在本發明中，核酸篩選不僅用於篩選受感染的樣品，而且用於發現疾病復發的可能性。依賴核酸雜交的篩選方式使得可能從任何生物體中分離任何基因序列，只要有適合的探針。與一部分編碼目的蛋白質的序列相應的寡核苷酸探針可以用化學法合成。這需要知道短的寡肽的胺基酸序列。編碼蛋白質的DNA序列能從遺傳密碼中推出，然而必須考慮該密碼的簡併性。當序列簡併時有可能進行混合加成反應。包括變性雙鏈DNA的異質性混合。對於這種篩選，雜交作用最好在單鏈DNA或變性的雙鏈DNA上進行。雜交是在檢測cDNA克隆中尤為有用，其中cDNA克隆源於存在有極少量與目的多肽有關的mRNA序列的來源。換句話說，通過利用避免非特異結合的嚴緊雜交條件，有可能使得，如允許通過將靶DNA雜交混合物中與它完全互補的單個探針而自顯影特定cDNA(Wallace等，1981)。使用13到100個核酸的探針或引物，尤其是長度介於17至100個核酸的，或在本發明的一些方面，多達1至2千個鹼基對或更長的探針或引物，可以形成既穩定又有選擇性的雙鏈分子。通常優選具有連續長度多於20個鹼基的互補序列的分子，以增強所得雜交分子的穩定性和/或選擇性。通常優選設計用於雜交的核苷酸分子具有一個或多個含20至30個核苷酸或所需更長的互補序列。這樣的片段容易製備，如通過化學方法直接合成或通過將選擇性序列引入重組載體重組製得。因此，本發明的核酸序列根據其能力可用於選擇性形成具有DNA和/或RNA的互補序列的雙鏈分子，或為從樣品中擴增DNA或RNA而提供引物。根據使用需要，希望使用各種雜交條件獲得探針和引物對靶序列的不同等級的選擇性。對於需要高選擇性的應用，典型地希望使用相對高度嚴緊的條件形成雜交物。例如，相對低鹽和/或高溫條件，如提供0.02M至約0.10M的NaCl濃度和約50℃至約70℃的溫度。這種高度嚴緊的條件幾乎不允許(如果存在的話)探針或引物與模板或靶鏈之間的錯配，特別適合分離特定基因或檢測特定mRNA轉錄。通過附加增加量的甲醯胺，可以致使條件更加嚴緊。對於某些應用，如定點誘變，須知優選使用較低嚴緊性的條件。在這種情況下，雖然雜交鏈的序列並沒有完全互補，也會發生雜交，只是在一個或多個位置錯配。通過增加鹽濃度和/或降低溫度，條件會變得不嚴緊。如，中等嚴緊程度的條件是0.1至0.25M的NaCl濃度在約37℃至約55℃，而低嚴緊度條件可以提供約0.15M至約0.9M的鹽濃度，和約20℃至55℃範圍的溫度。雜交條件可依據需要的結果方便的控制。在其它實施方案中，雜交可以在下述條件下進行，如50mMTris-HCl(pH8.3)，75mMKCl，3mMMgCl2，1.0mM二硫蘇糖醇，溫度在約20℃至約37℃之間。其它使用的雜交條件包括約10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，1.5mMMgCl2，溫度範圍在約40℃至約72℃之間。在某些實施方案中，使用本發明確定的核酸序列結合適當的方法(如標記物)確定雜交是有利的。各種適當的指示劑為本領域公知，包括發螢光的，放射性的，酶的或其它配體的，如親和素/生物素，這些試劑能用於檢測。在優選的實施方案中，宜使用螢光標記物或酶標記，如尿素酶，鹼性磷酸酶或過氧化物酶，而不使用放射性的或其它對環境不利的試劑。在使用酶試劑的例子中，已知比色指示物能夠提供可看得見的或可分光光度檢測的檢測試劑，從而檢測同含互補核酸的樣品的特定雜交。通常，考慮這裡描述的探針或引物在雜交溶液中作為試劑使用，如在PCRTM中，用於檢測相應基因的表達，也用於利用固相的實施方案。在涉及固相的實施方案中，測試的DNA(或RNA)被吸收或粘貼到所選擇的基質或表面上。該固定的單鏈核酸然後在所需條件下與所選的探針進行雜交。這種條件的選擇取決於特定的環境(如取決於G+C的含量，靶核酸的類型，核酸的來源，雜交探針的大小等)。根據具體目的應用來優化雜交條件是本領域技術人員是公知的。洗脫雜交分子去除非特異性結合的探針分子後，檢測雜交，和/或通過確定結合標記的數量來定量。典型的固相雜交方法已經公開於美國專利5,843,663、5,900,481和5,919,626中。其它可在本發明實踐中使用的雜交方法公開於美國專利5,849,481、5,849,486和5,851,772中。說明書這部分確定的這些或其它相關參考部分在此引入作為參考。B.合成DNA當目的多肽產物的胺基酸殘基全序列已知時，合成DNA序列是經常選擇的方法。當目的多肽產物的胺基酸殘基全序列未知時，不可能直接合成DNA序，選擇的方法是合成cDNA序列。分離目的cDNA序列的標準程序是形成由質粒或噬菌體攜帶的cDNA文庫，該文庫獲自富含於供體細胞的mRNA的逆轉錄，該供體細胞具有高水平的基因表達。若使用聚合酶鏈反應技術合成時，即使稀有的表達產物也能被克隆。在多肽胺基酸序列的主要部分已知的情況下，可以使用同靶cDNA中推定存在的序列的相同的已標記的單鏈或雙鏈DNA或RNA探針序列的進行DNA/DNA雜交，這種雜交對已變性為單鏈形式的cDNA的克隆的拷貝進行。1.生物晶片在各種支持物上分離生物分子陣列(稱為生物晶片)的方法已經發展並已用於DNA合成，測序，突變研究，基因表達分析和基因發現中。生物晶片可在本發明中使用，因為它能使我們鑑定出病理狀態的標記，在此是HPV感染，其可能具有後續診斷學價值。生物晶片的使用涉及將標記的分子或分子集合雜交在生物晶片上固定的靶。標記的分子通常是細胞或組織的mRNA的cDNA拷貝。在這種情況下，每種不同類型的cDNA的拷貝數反映了在最初分離物中相應mRNA種類的拷貝數。通常，雜交到在生物晶片固定的靶上的強度與cDNA濃度成比例，因而雜交密度的測量能夠推算出最初分離物中mRNA的相對數量。不同mRNA分離物中相同mRNA的相對數量能通過比較兩個樣品之間的對該相同靶點的雜交密度來確定。這些測量方法可用於鑑別能具有後續診斷價值的特定細胞類型或病理狀態。或者，在給定的疾病中，特定mRNA的突然增加可能表明藥物攻擊的可能目標，這樣提供了新的治療目標。C.核酸擴增反應核酸分子可通過使用多種技術檢測，包括擴增反應。本發明包括使用這種擴增反應來檢測細胞介導的免疫應答或鑑別感染HPV和/或有癌前期的或癌的生長的患者。如，細胞介導的免疫應答能通過本發明公開的TH1或TH2細胞因子的RT-PCR檢測。1.聚合酶鏈反應(PCRTM)根據標準操作方法(Sambrook，1989)，用作擴增模板的核酸從生物樣品包含的細胞中分離。核酸可以是基因組DNA或部分或整體的細胞RNA。當使用RNA時，需要將RNA轉變為cDNA。在允許選擇性雜交的條件下，選擇性雜交相應於KATP通道蛋白質或其突變體的核酸的引物對與分離的核酸相接觸。此處定義的術語「引物」包括在依賴模板的過程中能夠引發新生核酸合成的任何核酸。一般，引物是長度為10至20個鹼基對的寡核苷酸，但也可使用更長的序列。引物可以單鏈或雙鏈形式供給，但優選單鏈形式。一旦雜交，核酸引物複合物就接觸一個或多個促進依賴模板的核酸合成的酶。多輪擴增，也稱為「循環」被實施直到產生足夠數量的擴增產物。下一步，檢測擴增產物。在某些應用中，檢測可通過可視的方法進行。或者，檢測可涉及通過化學發光法，引入放射性標記物的放射性閃爍法或螢光標記法或甚至通過電或熱脈衝信號的方法(Affymax工藝)間接識別產物。許多依賴於模板的方法可以用來擴增存在於給定模板樣品中的標記序列。最著名的擴增方法是聚合酶鏈反應(稱為PCRTM)，該方法已在美國專利4,683,195、4,683,202和4,800,159中詳細描述了，此處都完全引入作為參考。簡要地，在PCRTM中，製得互補於標記序列的相反互補鏈區域的兩條引物序列。過量的脫氧核苷三磷酸與DNA聚合酶(如Tap聚合酶)加入到反應混合物中。如果標記序列存在於樣品中，引物將結合標記物，且聚合酶將通過增加核苷酸使引物沿著標記序列延長。通過提高和降低反應混合物的溫度，延伸的引物會從標記物中分離出來形成反應物，過量的引物將結合標記物以及反應物，並且重複該過程。為了量化mRNA擴增數量或從目的mRNA製備cDNA，可以採用反轉錄酶PCRTM(RT-PCRTM)擴增過程。反轉錄RNA為cDNA的方法是公知的並描述於Sambrook等，1989。可選擇的反轉錄方法利用耐熱的，依賴於RNA的DNA聚合酶。這些方法描述在1990年12月21日提交的WO90/07641中，此處引入作為參考。聚合酶鏈反應是本領域公知的方法。2.其它核酸擴增反應另一個擴增方法是連接酶鏈反應(″LCR″)，公開於EPANo.320308，此處全部引入作為參考。在LCR中，製備兩個互補探針對，在靶序列存在下，各對將結合靶序列相反的互補鏈使得它們相鄰。在連接酶存在下，兩個探針對將連成單個序列。通過溫度循環(如同在PCR中)，結合的連接序列從靶上分離，然後作為「靶序列」連接過量的探針對。美國專利4,883,750描述了類似於LCR的方法以結合探針對到靶序列上。Qbeta複製酶也可用作本發明的另一種擴增方法，該方法描述於PCT申請PCT/US87/00880中，此處全文引入作為參考。該方法中在RNA聚合酶存在時，將具有互補於靶的區域的RNA的複製序列加入到樣品中。聚合酶將拷貝該複製序列，其然後被檢測出。本發明還可使用了等溫擴增方法擴增核酸，該方法使用限制性內切核酸酶和連接酶完成靶分子的擴增，所述靶分子在酶切位點的一條鏈上包含核苷酸5』-[α-硫代]-三磷酸。鏈置換擴增(SDA)是進行核酸等溫擴增的另一方法，包括鏈置換和合成的多次循環，即切口平移。類似的方法，稱為修復鏈反應(RCR)，包括在擴增的靶區域中退火若干探針，然後在僅有四種鹼基中的兩種鹼基存在時發生修復反應。另外兩種鹼基可作為生物素化的衍生物被加入以便於檢測。類似的方法也應用於SDA中。靶特異性的序列也可用循環探針反應(CPR)檢測。在CPR中，具有非特定DNA的3』和5』序列和特定RNA的中間序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交後，就用RNaseH處理反應，且探針的產物鑑定為消化後釋放的不同產物。原始模板退火到另一個循環探針上，並重複反應。還有另外的擴增方法可用於本發明，這些方法公開於英國申請2202328和PCT申請PCT/US89/01025中，它們都全部引入本文作為參考。開始使用時，「修飾的」引物用於PCRTM類的，依賴模板和酶的合成。引物可通過標記捕獲部分(如生物素)和/或檢測部分(如酶)來修飾。隨後的使用中，過量的標記探針加入樣品中。靶序列存在下，探針結合併被催化切割。切割後，靶序列完整釋放以結合過量的探針。標記探針的切割顯示了靶序列的存在。其它的核酸擴增方法包括基於轉錄的擴增系統(TAS)，包括基於核酸序列的擴增(NASBA)和3SRGingeras等人，PCT申請WO88/10315，在此引入作為參考。在NASBA中，製備用於擴增的核酸可通過標準苯酚/氯仿提取，臨床樣品熱變性，用裂解緩衝液處理和小自旋柱分離DNA和RNA或氯化胍提取RNA。這些擴增技術涉及將具有靶特定序列的引物退火。聚合之後，DNA/RNA雜交體被RnaseH消化，而雙鏈DNA分子再次加熱退火。在任一條件下，單鏈DNA通過添加第二靶特定引物完全雙鏈化，之後進行聚合。然後雙鏈DNA分子通過RNA聚合酶如T7或SP6多重轉錄。在等溫循環反應中，RNA反轉錄為單鏈DNA，然後該DNA轉變成雙鏈DNA，於是再次用RNA聚合酶如T7或T6轉錄。不論合成產物是截短的或完整的，都能指示靶特定序列。Davey等(EPANo.329822，此處全文引入作為參考)公開了一種核酸擴增方法，其包括循環合成單鏈RNA(″ssRNA″)，ssDNA，和雙鏈DNA(dsDNA)，該方法可用於本發明。ssRNA是第一引物寡核苷酸的模板，它通過反轉錄酶延長(依賴RNA的DNA聚合酶)。然後通過核糖核酸酶H(RNaseH，一種特異於與DNA或RNA配對中的RNA的核糖核酸酶)的作用將RNA從所得DNARNA雙鏈體中去除。得到的ssDNA是第二引物的模板，也包括在其與模板的同源序列5』端的RNA聚合酶啟動子(以T7RNA聚合酶為例)的序列。該引物然後通過DNA聚合酶延長(以E.coliDNA聚合酶I的大″Klenow″片斷為例)，得到的雙鏈DNA(″dsDNA″)分子具有和最初引物之間的RNA相同的序列，此外在一端含有啟動子序列。通過適當的RNA聚合酶，該引物序列可用於製備該DNA的許多RNA拷貝。這些拷貝然後再進入循環中導致非常迅速的擴增。用適當選擇的酶，這一擴增能在等溫條件下進行而不需在每個循環中添加酶。因為這一過程的循環本質，起始序列可選擇為DNA或RNA形式之任一。Miller等(PCT申請WO89/06700，此處完全引入作為參考)公開了一種核酸序列擴增方案，該方案基於雜交啟動子/引物序列到靶單鏈DNA(″ssDNA″)，然後轉錄該序列的許多RNA拷貝。該方案不循環，即不從合成的RNA轉錄物產生新模板。其它擴增方法包括″RACE″和″單側PCR″(Frohman，1990，引入作為參考)。基於兩個(或多個)寡核苷酸連接的方法也可以用於本發明的擴增步驟中，該方法在含有得到的「雙-寡核苷酸」序列的核酸存在的情況下擴增雙-寡核苷酸。D核酸檢測經過任何擴增後，需要從模板和/或過量的引物中分離擴增產物。核苷酸的檢測可用於鑑別細胞介導的免疫應答，和感染HPV和/或有癌前期的或癌的生長的患者。在一個實施方案中，擴增產物通過瓊脂糖，瓊脂糖丙稀醯胺或聚丙稀醯胺凝膠電泳用標準方法分離(Sambrook等，1989)。可從凝膠中切下並洗脫來分離的擴增產物。用低熔點瓊脂糖凝膠，分離帶可通過加熱凝膠取出，然後提取該核酸。核酸分離也可利用本領域公知的層析分離技術。本發明的實例中可使用許多種層析技術，包括吸附層析，分配層析，離子交換層析，羥磷灰石層析，分子篩層析，反相層析，柱層析，紙層析，薄層層析，氣相層析和HPLC。在某些實施方案中，可顯現擴增產物。典型的顯現方法包括用溴化乙錠染色凝膠和在紫外光下的顯現條帶。或者，如果用放射性標記或螢光標記的核苷酸整體標記擴增產物，分離的擴增產物可以暴光x-射線膠片或在合適的激發光譜下顯影。在一個實施方案中，擴增產物分離之後，標記的核酸引物與擴增的標記序列接觸。該引物最好綴合發色團，但也可放射性標記。在另一個實施方案中，引物與結合夥伴綴合，如抗體或生物素，或其它帶有可檢測部分的結合夥伴。在特定的實施方案中，通過DNA印跡用標記引物雜交進行檢測。涉及DNA印跡雜交的技術是本領域技術人員公知的(參見Sambrook等，1989)。上述實例在美國專利5,279,721中已描述，其中公開了自動電泳和核酸轉移的儀器和方法，此處引入作為參考。允許電泳和印跡且不需要額外操作凝膠的儀器對於適合實施本發明方法是理想的。HPV感染也能通過催化放大DNA原位雜交比色信號而檢測(CSAC-ISH)(GenPointsystem，DAKO)(Birner等，2001)。其它用於實踐本發明核酸檢測的方法公開於美國專利5,840,873、5,843,640、5,843,651、5,846,708、5,846,717、5,846,726、5,846,729、5,849,487、5,853,990、5,853,992，5,853,993、5,856,092、5,861,244、5,863,732、5,863,753、5,866,331、5,905,024、5,910,407、5,912,124、5,912,145、5,919,630、5,925,517、5,928,862、5,928,869、5,929,227、5,932,413和5,935,791中，均引入此處作為參考。V.細胞介導的免疫(CMI)本發明要求保護的一些方法通過將T細胞應答用作復發診斷指示或作為防止CIN發展的預防治療方法而利用T細胞應答。更具體地，這些方法測定針對HPV16的E6和E7癌蛋白合成肽的CMI應答。HPV16的E6和E7基因常常共同表達，且它們在HPV16陽性的宮頸癌活組織的病毒轉錄產物中最為豐富(Wettstein，1990；Seedorf等，1987)。充分的證據表明，E6和E7可讀框的共同表達對於各種哺乳動物細胞的惡性轉化是必要且充分的(Munger等，1989)。而且，病毒基因組的E6和E7區域的連續表達似乎保持惡性表型所必須的(yonKnebelDoeberitz等，1988)。大多數有免疫能力的哺乳動物的病毒感染導致針對感染該病毒的細胞的細胞介導的免疫應答，並且最終效應為細胞溶解。病毒感染期間，為了包進新的病毒粒子，病毒蛋白在細胞中合成。一些這樣的內源性病毒蛋白也降解並傳送到I型抗原呈遞途徑，在這裡結合與MHCI類分子相結合的外來抗原。該肽-MHC複合物然後傳送到呈現外來抗原的細胞表面，經由自身MHC，達到細胞毒性T細胞(CTL)。CTL是特定抗原效應物細胞。淋巴細胞表面標記物的研究可用於分析這種T細胞表面標記物的存在，用本領域普通技術人員公知的各種方法，包括使用免疫螢光法和流式細胞儀。一旦識別出外來抗原，CTL就溶解靶細胞，破壞其完整性，通過誘導細胞凋亡的分子相互作用或通過分泌在質膜上產生洞的形成微孔的酶。這樣，CTL介導的免疫應答對於清除感染病毒的細胞起了關鍵的作用。CTL效應物細胞溶解病毒感染的靶細胞的能力通過基因和抗原的限制來調節。靶細胞必須攜帶與最初誘導CTL的病毒相同或等同的病毒抗原。靶細胞和誘導的CTL也必須帶有相同的I型MHC分子。A.外周血單核細胞(PBMC)增殖反應從PBMC獲得。有少數方法可以分離PBMC。單核細胞在含20％胎牛血清(FCS)的RPMI1640中，通過附著於有或無膠原塗層的玻璃或聚乙烯組織培養容器上從非蓮座細胞中分離出來，通過鱟變形溶解分析確定其不含內毒素；或者，自體血清，或10％AB+的正常供體血清作為血清源。不附著的細胞輕洗除去。利用這種方法，附著細胞通常有＞90％的單體細胞。如果組織分析暗示有T細胞，B細胞，或NK細胞的明顯汙染，這些汙染細胞用抗體混合物除去，包括抗-leu5b，抗-leu12和抗-leul1b和幼兔補體(Rossen等，1985)。在Teflon塗層容器中在37℃潮溼的含5％CO2的空氣中附著1小時或更長時間後，釋放單核細胞進行懸浮培養(Crowe等，1987)。對細胞鋪於膠原塗層表面的情況，1mg/ml的1型膠原酶加入到培養基中。通過在含有5％FCS和EDTA的，不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸緩衝鹽溶液中培養15分鐘或更長時間來釋放細胞。用EDTA培養在冰上進行。使用一次性細胞刮刀幫助去除細胞。刮下的細胞在不含鈣和鎂的Dulbecco的PBS中清洗兩次，並在Teflong培養罐中培養於RPMI1640和10％的AB+人血清，如Crowe等所述(1987)。分離外周血單核細胞的第二策略是根據Hester和Walker(1981)的Percoll密度梯度法，以增加非蓮座細胞群中單核細胞的濃度。富含單核細胞的群體，如需要用上文所述的抗體混合物和補體處理，以儘可能去除汙染的T細胞，B細胞和NK細胞殘餘物。通過這種方法回收的單核細胞直接培養在Teflon塗層的容器中，不存在單核細胞開始表面附著時必須出現的「活化作用」。然而，Percoll密度梯度步驟和/或暴露於抗體和補體也可「活化」這些細胞，可能以不同的方式進行。分離外周血單核細胞的第三策略是利用單核細胞的折射性質，用流式細胞儀的高速細胞分類功能以前向角光散射為基礎將其分類。它具有生產高純度細胞的潛力，而不會因與抗體或補體接觸受影響。B.T細胞應答T細胞應答可以通過本領域普通技術人員公知的各種方法檢測。一些分析方法將在下文中詳細描述。1.3[H]胸腺嘧啶核苷摻入分析來自不同樣品的PBMC的增殖反應可按照公開文獻中標準的3[H]胸腺嘧啶摻入分析確定(Nehete，1996；Nehete，1995)。T細胞對個別E6和E7肽的增殖反應的顯著性(根據刺激指數[SI])可以暴露於肽的細胞超過沒有肽加入的對照組細胞的3[H]胸腺嘧啶核苷摻入的增加倍數來計算。當SI值至少為2.0，包括至少2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0或更多時，認為是陽性反應。通常，SI值的計算通過測量培養基中用肽溫育的細胞的放射性(cpm)數量，除以無肽溫育(僅培養基)的細胞的放射性數量(只有培養基)得到。2.利用51[Cr]溶解細胞介導淋巴溶解(CML)可以用來指示T細胞反應。靶細胞在暴露於效應物細胞之前，可以用放射性鉻-51(51[Cr])標記。釋放到培養基中的51[Cr]的數量與細胞介導的溶解水平成比例。3.γ-幹擾素的產生伽馬乾擾素(γ-幹擾素)也稱為II型免疫幹擾素，由T細胞和NK細胞產生。它對於輔助性T細胞發展是關鍵的。因為是最初的巨噬細胞激活因子，其在細胞介導的免疫中是的強大細胞因子。γ-幹擾素增加了MHCI類分子和MHCII類分子的表達水平，這兩種分子能提高抗原呈遞和其它識別反應。而且它能放大TNF-α的效應並能增加血管內皮細胞表面粘附分子的表達水平，這些分子使得T細胞粘附並外滲。4.四聚物分析四聚物分析方法對於本領域技術人員是公知的。參見Altman，1996。5.細胞因子的產生細胞因子是在免疫應答和不同細胞型分化途徑中起重要作用的蛋白質。它們對T細胞調節和發育起關鍵作用，並且包括γ-幹擾素，白介素1(IL-1)，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，淋巴毒素，MIF，TGF-β，TNF-α和其它趨化細胞因子。TH1細胞因子包括IL-2，幹擾素(IFN)γ，腫瘤壞死因子(TNF)α，或TNF-β，IL-3，IL-12，IL-15，IL-16，IL-17，或IL-18。TH2細胞因子包括IL-1，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-13，IL-14或IL-18。細胞因子的分析是本領域公知的，其中的一些在本發明中公開。6.細胞因子分析對TH1和TH2細胞因子可以通過ELISA，放射性免疫分析(RIA)或流式細胞儀(FACS)檢測。各種有用的免疫檢測方法的步驟已在科學文獻中有描述，如Doolittle和Ben-Zeev，1999；Gulbis和Galand，1993；以及DeJager等，1993，此處都引入作為參考。7.免疫分析在更具體的實施方案中，本發明涉及結合，純化，去除，量化和/或其它一般檢測生物組分蛋白質，多肽或肽的免疫檢測方法。在一些實施方案中，免疫測定用於檢測針對HPV肽的細胞介導的免疫應答。一些提到的免疫檢測方法包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)，放射性免疫測定(RIA)，免疫放射測定，螢光免疫測定，化學發光測定，生物發光測定，和蛋白質印跡。各種有用的免疫檢測方法的步驟已公開於科學文獻如DoolittleMH和Ben-ZeevO，1999；GulbisB和GalandP，1993；和DeJagerR等，1993；此處都引入作為參考。通常，免疫結合方法包括獲得疑似含有蛋白質、多肽和/或肽的樣品，並在能有效形成免疫複合物的條件下(視情況而定)將根據本發明的樣品與抗體接觸。例如，在本發明中，E6或E7肽可用來激發細胞產生T細胞應答。抗體可以針對作為細胞介導的免疫應答結果產生的細胞因子，或針對T細胞上的細胞因子受體。或者，可採用抗CD69或CD45，或抗它們二者的抗體。這些方法包括從細胞器，細胞，組織或生物體樣品中純化蛋白質，多肽和/或肽。在這些例子中，抗體從樣品中去除蛋白質，多肽和/或肽。抗體優選與固相支持物相連，如柱狀基質，並且將疑似含有蛋白質，多肽和/或肽抗原成分的樣品施加到固定化的抗體上。不需要的成分將從柱上洗掉，留下免疫複合於固定化的抗體上的抗原，將被洗脫。對於細胞因子應答的檢測，被測生物樣品可以是疑似含有細胞因子的任何樣品，例如，組織切片或標本，均質的組織提取物，細胞，細胞器，上述任何含抗原成分的分離和/或純化形式，或甚至是任何與細胞或組織接觸的生物流體，包括血液和/和血漿，儘管如此，優選組織樣品或提取物。在有效條件下，經過足以允許形成免疫複合物(初級免疫複合物)的一段時間，將所選擇的生物樣品與抗體接觸通常是簡單地將抗體成分加入到樣品中並培養混合物足夠長的時間，使抗體與存在的任何抗原形成(即，結合為)免疫複合物。之後，通常衝洗樣品-抗體複合物，如組織切片，ELISA板，斑點印跡或蛋白質印跡，以除去任何非特異性結合的抗體種類，而只允許留下與初級免疫複合物特異性結合的待測抗體。通常，檢測免疫複合物的形成是本領域公知的，並可通過許多方法實現。這些方法通常基於檢測標記或標記物，如任何放射性的，螢光的，生物的和酶促的標記。美國專利，包括3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241涉及這些標記的應用，它們均引入此處作為參考。當然，正如本領域所知的，通過利用第二結合配體可得到附加益處，如第二抗體和/或生物素/親和素配體結合方案。用於檢測的抗原抗體可以本身連接有可檢測的標記，然後我們僅需檢測該標記，由此確定混合物中初級免疫複合物的量。或者，與初級免疫複合物結合的第一抗體可以通過對該抗體有結合親和性第二結合配體檢測。在這種情況下，第二結合配體可與可檢測的標記結合。第二結合配體本身通常是一種抗體，它可稱為「第二」抗體。在有效條件下，初級免疫複合物與標記的第二結合配體或抗體相接觸足夠長的時間以形成第二免疫複合物。然後第二免疫複合物通常洗掉任何非特異性結合的標記的第二抗體或配體，且然後在第二免疫複合物中檢測出保留的標記物。進一步的方法包括用兩步法檢測初級免疫複合物。用對抗體有結合親和性的第二結合配體，如一種抗體，形成第二免疫複合物，如上文所述。漂洗過後，再次在有效條件下，第二免疫複合物與與對第二抗體有結合親和性的第三結合配體或抗體接觸足夠的時間以第三級免疫複合物。該第三配體或抗體連接到可檢測的標記物上，能檢測到這樣形成的第三級免疫複合物。如果需要，這一系統可提供信號放大作用。由CharlesCantor設計的一種免疫檢測方法使用兩種不同的抗體。第一步生物素化的單克隆或多克隆抗體，用於檢測靶抗原，第二步，抗體然後用於檢測與複合的生物素相連的生物素。在該方法中，要檢測的樣品首先在含有第一步的抗體的溶液中溫育。如果靶抗原存在，一些抗體結合抗原形成生物素化的抗體/抗原複合物。然後通過在鏈黴抗生物素蛋白(或親和素)，生物素化的DNA，和/或互補的生物素化的DNA的連續溶液中培養該抗體/抗原複合物將其放大，每一步在抗體/抗原複合物上增加生物素位點。重複放大步驟，直到獲得適當的放大水平，在此將樣品在含有抗生物素的第二步抗體的溶液中培養。該第二步抗體被標記，如用酶，其可通過組織酶學用顯色底物能檢測抗體/抗原複合物存在。經過適當的放大，產生肉眼可見的綴合。另一個已知的免疫檢測方法利用了免疫-PCR(聚合酶鏈反應)方法。PCR方法與Cantor方法類似，直到與生物素化的DNA培養的步驟，然而，該方法並沒有使用多次循環的鏈黴抗生物素蛋白和生物素化的DNA培養，而是用釋放抗體的低PH或高鹽緩衝液清洗DNA/生物素/鏈黴抗生物素蛋白/抗體複合物。用適當的引物和適當的對照對所得到的洗出液進行PCR反應。該方法提供了一種有用的鑑定感染HPV的婦女群體患有宮頸癌或CIN的方式。另一種確定感染HPV的患者是否有癌前期的或癌的生長的方法是通過雜交捕獲，如公開於Birner等，2001和Clavel等，2000，二者均引入作為參考。本發明的免疫檢測方法對於疾病的診斷和預後具有明顯的效用，疾病如特異性表達如癌症特異性基因產物等的各種疾病。這裡使用疑似感染了能導致CIN的HPV的生物學的和/或臨床樣品。然而，這些實施方案也應用於非臨床樣品，如在抗原或抗體樣品中效價的測定中，如對雜交瘤的選擇中。a.ELISA如上所述，免疫檢測，以其最簡單和/或直接的含義，指結合測定。某些優選的免疫檢測是本領域公知的各種類型的酶聯免疫吸附測定(ELISAs)和/或放射性免疫檢測(RIA)。利用組織切片的免疫組織化學檢測也非常有用。然而，容易理解，檢測並沒有局限於這些技術，和/或蛋白質印跡，斑點印跡，FACS檢測等的技術也可以使用。在一個典型的ELISA中，本發明中針對細胞介導的免疫應答產物的抗體(包括抗原)被固定化於所選擇的顯示蛋白質親和性質的表面，如聚苯乙烯微量滴定板上的孔中。然後，向孔中加入疑似含有抗原的被測組分，如一份臨床樣品。結合和/或清洗以除去非特異性結合的免疫複合物後，可以檢測出結合的抗原。檢測是通過加入另一個連接於可檢測標記上的抗體實現。這種ELISA是一種簡單的「三明治ELISA」，檢測也可以通過加入第二抗體，然後加入對第二抗體有結合親和力的第三抗體，第三抗體與可檢測標記連接。在另一個典型的ELISA中，疑似含有抗原的樣品固定於孔表面和/或然後將其與抗體接觸，該抗體通過抗細胞介導免疫應答的產物(包括抗原)產生。經過結合和/或清洗除去非特異性結合的免疫複合物後，檢測出結合抗體。在最初的抗體結合於可檢測標記的地方，可以直接檢測到免疫複合物。同樣，免疫複合物也可用與第一抗體具有結合親和性的第二抗體檢測，該第二抗體連接有可檢測標記。另一個其中抗原被固定的ELISA涉及在檢測中利用抗體競爭。在這種ELISA中，標記的抗一種抗原的抗體被加入到孔中，使其結合，和/或通過其標記來檢測。在用被包被的孔培養的過程中，通過將樣品與標記的抗該抗原的抗體混合，可確定未知樣品中的抗原數量。樣品中抗原的存在產生減少了能夠結合孔上的抗該抗原抗體數量的作用，從而減少了最終的信號。這種方法也適合檢測未知樣品中的抗某個抗原的抗體，其中未標記的抗體結合到抗原包被的孔上，並且也減少了能夠結合標記的抗體的抗原數量。不管利用何種形式，ELISA具有某些共同的特徵，如包被，溫育和結合，清洗除去非特異性吸附物質種類，和檢測結合的免疫複合物。這些將在下文中描述。在用抗原或抗體包被一塊板時，通常用抗原或抗體溶液溫育板內的小孔，過夜或經過數小時。然後清洗板上的小孔以除去不完全吸附的物質。然後用非特異性蛋白「包被」小孔的任何殘留的可利用的表面。這種非特異性蛋白對於試驗的抗血清是抗原中性的，其包括牛血清蛋白(BSA)，酪蛋白或奶粉溶液。這種包被能封閉固定化的表面的非特異性吸附位點，從而減少抗血清在表面的非特異性吸附所導致的背景。在ELISA中，可能更常使用第二或第三級檢測方法，勝於使用直接方法。這樣，將蛋白質或抗體結合到小孔上之後，用非反應材料包被板以減少背景，清洗以除去未結合的材料，在允許免疫複合物(抗原/抗體)形成的有效條件下，將固定化的表面與待測生物樣品接觸。需要標記的第二結合配體或抗體來檢測免疫複合物，並且第二結合配體或抗體與標記的第三抗體或第三結合配體連接。「在允許免疫複合物(抗原/抗體)形成的有效條件下」意指該條件優選包括用溶液如BSA，牛丙球蛋白(BGG)或磷酸緩衝鹽(PBS)/Tween稀釋的抗原和/或抗體。這些加入的試劑也傾向於幫助減少非特異性背景。「合適的」條件也指培養是在足以允許有效結合的一定溫度或一段時間。典型的培養步驟是從約1至2至4小時左右，優選溫度大約是25℃至27℃，或如在約4℃過夜。在ELISA的所有溫育步驟之後，清洗接觸表面以除去非複合物質。優選的清洗方法包括用溶液如PBS/Tween，或硼酸鹽緩衝液來清洗。在待測樣品和原先的結合物質之間形成特異性的免疫複合物，並隨之清洗後，即使微小數量的免疫複合物的存在也可以被檢測到。為提供一種檢測方法，第二或第三抗體將與標記物結合用於檢測。優選地，標記物是一種當與適當的發光物質培養時能顯色的酶。從而，需要在適於進一步形成的免疫複合物顯影的條件下(例如在含有PBS的溶液中，如PBS-Tween中，室溫下培養2小時)，第一或第二免疫複合物與尿素酶，葡萄糖氧化酶，鹼性磷酸酶或過氧化物酶綴合的抗體接觸或培養一段時間。與標記的抗體培養過後，並且接下來清洗去除未結合的物質，定量標記數量，如在酶標記的情況，通過與發光基質如尿素，或溴甲酚紫，或2，2』-連氮基-二-(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，或H2O2培養。然後通過測量產生的顏色程度來定量，如，用可視光譜的分光光度計。b.免疫組織化學法抗體也可用於與新鮮-冷凍的和/或福馬林固定的，石蠟包埋的組織塊結合，該組織塊為免疫組織化學法(IHC)的研究而製備。從這些特殊標本製備組織塊的方法已經成功地用於先前的各種預測因素的IHC研究，和/或為本領域技術人員公知(Brown等，1990；Abbondanzo等，1990；Allred等，1990)。簡要地，冷凍切片可通過以下步驟製備，在室溫下，於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，在小塑料膠囊中將50ng的冷凍的「粉碎」組織再水化；離心沉澱微粒；在粘性包埋介質(OCT)中將其再懸浮；翻轉膠囊和/或再次離心沉澱；迅速冷凍於70℃的異戊烷中；切割塑料膠囊和/或取出冷凍柱狀組織；將該柱狀組織固定於低溫恆溫器切片機卡盤上；和/或切割25-50個連續切片。永久切片可通過類似的方法製備，包括在一個塑料微夏普列斯超速離心管(microfugetube)再水化50mg樣品；沉澱；在10％的福馬林中再懸浮4小時以固定；清洗/沉澱；在2.5％的暖瓊脂中再懸浮；沉澱；在冰水中冷卻以固化瓊脂；從管中取出組織/瓊脂塊；將塊浸潤和/或包埋於石蠟中；和/或切割成50個連續的永久切片。c.螢光分類細胞譜蛋白質也可以通過流式細胞儀檢測，如在Fujishima等，1996中所述。在該方法的實例中，細胞被固定，然後與抗要檢測的所表達蛋白的單克隆抗體溫育。結合抗體然後與標記的抗體IgG(舉例來說)接觸以檢測。典型的標記物是FITC。然後用流式細胞儀檢測螢光密度，如OrthoCytron，Orthodiagnostics，或FACScan；BectonDickinson。FACS可以最初分離細胞的亞群，根據細胞經過雷射束時它們的光散射性質。前向光散射(FALS)與細胞大小相關，並且直角光散射與細胞濃度，細胞輪廓和核質比相關。由於細胞被螢光標記的抗體標記，因而它們能被進一步檢測，通過螢光強度以及設置於FACS上收集明亮螢光和暗螢光的陽性和陰性窗口。細胞以大約3000個細胞每秒的流速被分類，並收集陽性細胞和陰性細胞。d.蛋白質印跡本發明的組合物可用於免疫印跡和蛋白質印跡分析。肽可用來刺激細胞產生細胞因子。本發明的抗體可用作高親和性初始試劑來檢測蛋白質，該蛋白質固定於固相支持物上，如硝酸纖維素，尼龍或其聯合。與免疫沉澱反應相結合，之後採用凝膠電泳，其可以作為單步試劑用於檢測抗原，用於檢測該抗原的第二試劑針對該抗原引起不利背景。當被研究的抗原是免疫球蛋白時，該方法尤其有用(排除使用結合細菌的細胞壁成分的免疫球蛋白)，被研究抗原與檢測試劑交叉反應，或者它們以作為交叉反應信號的相同的相對分子量遷移。用於協同蛋白質印跡的基於免疫學的檢測方法包括酶促的-，放射性標記-，或螢光標記抗蛋白質部分的第二抗體，在此認為有特殊作用。VIII免疫療法作為一種感染或癌症治療的方法，免疫療法基於攜帶抗原的腫瘤細胞刺激產生特異性的抗體和/或細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的前提。A.免疫療法的類型如下文所述，癌症的免疫療法可廣法地分為繼承型，被動和主動型。1.被動免疫存在許多不同的被動免疫途徑。它們可以廣泛分為以下幾類僅注射抗體；注射偶聯有毒素或化療劑的抗體；注射偶聯有放射性同位素的抗體；注射抗-個體基因型的抗體；以及最後，清除骨髓中的腫瘤細胞。優選地，在被動免疫中應用人單克隆抗體，因為它們在患者體內產生很少或不產生副作用。然而，其應用在某種程度上因缺乏而受局限，並迄今為止僅在損害內施用人單克隆抗體。抗神經節苷脂抗原的人單克隆抗體已經被施用到患有皮膚性復發黑色素瘤的患者創傷內(IrieMorton，1986)。經過每天或每周對損害部位的注射，10位患者中，其中6位觀察到消退。在另一個研究中，經向損害部位注射兩種人單克隆抗體，取得了一定成功(Irie等，1989)。優選施用直接抗兩個不同抗原的一種以上的單克隆抗體或甚至帶有多種抗原特異性的抗體。治療方案也包括施用淋巴因子或其它免疫增強劑，如Bajorin等(1988)中所述。說明書的其它部分進一步詳細描述人單克隆抗體的開發。2.主動免疫在主動免疫中，抗原的肽，多肽或蛋白質，或自體或異源的腫瘤細胞組合物或「疫苗」，通常與獨特的細菌輔助劑一起施用(RavindranathMorton，1991；MortonRavindranath，1996；Morton等，1992；Mitchell等，1990；Mitchell等，1993)。在黑色素瘤的免疫治療中，引起高IgM反應的患者經常比不引起或引起低IgM抗體的患者活的更好(Morton等，1992)。IgM抗體往往是短暫抗體，與常規例外的是抗神經節苷脂或抗糖的抗體。3.繼承性免疫療法在繼承性免疫療法中，患者的循環淋巴細胞，或腫瘤滲透的淋巴細胞在體外被分離，通過淋巴因子如IL-2被活化，或用基因轉換以使腫瘤壞死，並且再給藥(Rosenberg等，1988；1989)。為達到這點，向動物，或人類患者施用免疫學有效量的活性淋巴細胞，結合此處描述的整合有輔助劑的抗原性肽組合物。活性淋巴細胞最優選是患者自己的細胞，它較早地從血液或腫瘤樣品中分離出來並在體外活化(或「擴展」)。這種形式的免疫治療已經產生了一些黑色素瘤和腎癌消退的病例，但是有應答的百分率相比那些沒有應答的百分率要少。B.疫苗注射本發明包括使用來自HPV的E6和E7肽誘導或改善細胞介導的免疫應答的免疫療法。針對HPV的E6和/或E7肽不產生或產生低CMI應答的患者，這種方法尤為顯著。包含所有或部分SEQIDNO1至19胺基酸的肽或多肽作為治療和防止HPV感染的有效疫苗在臨床上很重要，包括防止與HPV相關的癌前期的和癌的生長，誘導患者體內的細胞介導的免疫應答。一旦生產、合成和/或純化，本發明的肽和多肽可以製成疫苗施用於患者。本發明的肽，多肽和疫苗也與其它疫苗或疫苗成分結合，如其它額外的抗原，以刺激抗原的免疫應答。在這種實施方案中，優選的附加抗原是那些暗示在癌和高增殖性條件下特異或優選表達的抗原。考慮與本發明的肽，多肽和疫苗結合的額外抗原和疫苗包括那些在美國專利5,840,317和5,882,654中所述的，此處引入作為參考。本領域普通技術人員能預想用於測試的一些潛在的治療劑和輸送方式。如，潛在的抗HPV和抗腫瘤試劑可以是天然產物或是由人工設計的合成分子。此外，該模式提供了從一組已知的和新的化合物中選擇有效試劑的手段。任何特定的潛在治療劑的劑量和輸送方式可基於已確立的製備藥學活性成分的指南來確定。例如，試驗的化合物可以通過靜脈內，皮內，肌內，局部，口服的方式，或其它藥學上有效的方式給藥。使用由本發明的方法產生的動物，研究者首次能夠評價針對高危人乳頭瘤病毒誘導的疾病，可能包括病毒的複製和傳播的預防和治療試劑。其中包括化學型藥物，基因治療，反義抑制策略，或預防或治療性疫苗。許多對評價建議療法的實驗室測試結果的方法是公知的。根據宿主種類，也可使用各種佐劑以增加免疫應答，它們包括但不限於，弗氏(完全和不完全)，無機凝膠劑如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂，聚醚多元醇，聚陰離子，肽，油乳劑，鑰孔戚血藍蛋白，二硝基酚，和對人非常有用的佐劑如BCG(細菌Calmetter-Guerin)和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。佐劑除了用於本發明的免疫治療，還可用於在本發明範圍內增強細胞介導的免疫應答的檢測。C.定向輸送系統在本發明要求的一些實施方案中，為了檢測病毒特異性的T細胞應答，HPV多肽或肽可以被輸送到靶細胞，在它們的表面表達病毒蛋白片段，以達到產生T細胞應答的目的。不同的輸送方法包括灌注，表達結構的轉染，病毒載體，和下文公開的其它方法。1.通過灌注轉移本發明要求的一個實施方案通過灌注法轉移肽或肽的組合物到細胞中。也包括表達構建體和病毒構建體的連續灌注。在連續灌注中傳輸的構建體或肽數量可由所需攝取的數量決定。本發明公開了一個灌注的實例，其中初始濃度為106個細胞/ml的細胞培養物可先被標記，清洗，並且然後在100ug的合成肽中培養兩小時。2.表達載體治療肽的輸送可利用表達載體來完成。在本發明的實施方案中，HPV多肽和肽通過使用表達構建體被輸送到靶細胞。這一應用過程中，術語「表達構建體」指包括含有編碼HPV多肽的核酸的任何遺傳結構。「病毒載體」指主要從病毒序列中衍生出的表達構建體。為了構建體有效地表達，編碼HPV多肽的多核苷酸將受啟動子的轉錄控制。「啟動子」指被宿主細胞的合成機器或引入的合成機器識別的DNA序列，該機器是啟動特定基因轉錄所必須的。短語「受轉錄控制」指啟動子在相對於多核苷酸的正確位點上，以控制RNA多聚酶的啟動和多核苷酸的表達。術語啟動子用於此處指聚簇於RNA聚合酶II啟動位點的一組轉錄控制基序。許多關於啟動子怎樣組織的思考得自對一些病毒的分析，包括HSV胸腺嘧啶激酶(tk)和SV40早期轉錄單元。通過最近工作的擴展，這些研究已經顯示啟動子由不連續的功能基序組成，每個由將近7-20bp的DNA組成，並包含一個或多個轉錄激活蛋白或阻遏蛋白識別位點。在每個啟動子中至少一個基序的功能是定位RNA合成的起始位點。其中最著名的實例是TATA框，但在一些缺少TATA框的啟動子中，如哺乳動物末端脫氧核苷酸轉移酶基因和SV40晚期基因的啟動子，覆蓋於起始位點的不連續元件本身幫助固定起始位置。另外的啟動子元件調節轉錄啟動的頻率。典型地，它們位於起始位點上遊30-110bp的區域，儘管最近已顯示出許多啟動子在起始位點的下遊也含有功能元件。啟動子元件之間的間隔是靈活的，以至於當元件顛倒或彼此之間相對移動時，啟動子功能仍保存。在tk啟動子中，啟動子元件間的間隔在活性開始下降之前可以增加到相隔50bp。依賴於啟動子，各個元件可協同地或獨立地對激活轉錄起作用。用於控制HPV多核苷酸表達的特殊啟動子並非關鍵，只要它能在靶細胞中表達該多肽。這樣，當以人細胞為目標時，最好將多核苷酸的區域編碼置於鄰近並受控制於能在人細胞中表達的啟動子的位置。一般而言，這樣的啟動子包括人啟動子或病毒啟動子。利用其它病毒或哺乳動物細胞的或細菌噬菌體的啟動子(本領域公知的)來獲得多核苷酸的表達也被考慮，只要表達水平足以誘導T細胞應答。通過利用具有公知性質的啟動子，可以優化轉染後的多核苷酸的表達水平和模式。如，選擇在特定細胞中有活性的啟動子，如酪氨酸酶(黑色素瘤)，α-胎蛋白和清蛋白(肝腫瘤)，CC10(肺腫瘤)和前列腺特異性抗原(前列腺腫瘤)允許HPV多核苷酸的組織特異性表達。進一步，選擇針對特異生理信號應答被調節的啟動子允許可誘導的HPV多肽構建物的表達。增強子最初作為增強位於相同DNA分子遠處位點的啟動子轉錄的遺傳因子被發現。在對原核生物轉錄調節的經典研究中，這一遠距離起作用的能力幾乎沒有先例。後來的工作顯示，有增強子活性的DNA區域組織形式很像啟動子。即，它們由很多單獨的元件組成，每個都結合一個或多個轉錄蛋白質。增強子和啟動子之間的基本差別是操作性的。所有的增強子區域作為一個整體必須能激發遠處的轉錄，對於啟動子區域或它的組成元件則不必具備這點。另一方面，啟動子必須具有一個或多個直接啟動RNA合成的元件，尤其在特殊位點或特殊定向，而增強子缺少這些特徵。啟動子和增強子經常重疊並接近，往往表面上具有相似的基序組織。此外，可用任何啟動子/增強子的結合(按照EukaryoticPromoterDataBaseEPDB)來驅動HPV多核苷酸構建體的表達。使用T3，T7或SP6細胞質表達系統是另一種可能的實施方案。如果提供適當的細菌噬菌體聚合酶，真核細胞能支持從某一細菌噬菌體啟動子的細胞質轉錄，或作為輸送複合物的一部分，或作為附加的基因表達載體。在本發明的某些實施方案中，細胞內表達載體的輸送可通過在表達載體內包含的標記在體外或體內鑑定。對於允許鑑別表達的受轉染細胞，標記會產生可識別的變化。通常，包括藥物選擇性標記幫助克隆和選擇轉化體。或者，可使用酶，如單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)(真核的)或氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)(原核的)。也可使用免疫標記。可選擇性標記的使用並非重要，只要它能與編碼HPV多肽的多核苷酸一起表達。可選擇性標記更多的實例是本領域技術人員公知的。人們一般以包括多腺苷酸化信號來實現轉錄產物適當的聚腺苷酸化。多腺苷酸化信號的性質對於成功實踐本發明並非重要，可以使用任何這樣的序列。發明者已使用了SV40多腺苷酸化信號，因為它很方便，並且已知在靶細胞的使用中功能良好。也作為表達結構的要素之一的是終止子。這些要素可用來增強信號水平並使減少從構建體到其它序列的通讀。3.病毒載體在本發明的一些實施方案中，表達構建體包括病毒或來源於病毒基因的改造的構建體。某些病毒經受體介導的胞吞作用進入細胞的能力，在一些情況下，與細胞染色體整合的能力，已使它們成為將基因轉至哺乳動物細胞的有吸引力的候選物。然而，由於已經證明，直接攝入裸DNA疫苗，和受體介導的DNA複合物(下文論述)，表達載體的攝入不必是病毒的，卻可以是在哺乳動物細胞中能支持編碼基因表達的任何質粒，粘粒，或噬菌體結構，如pUC或BluescriptTM質粒系列。a.逆轉錄病毒逆轉錄病毒被細分為三個主要的組腫瘤病毒，如鼠白血病病毒；慢病毒，和泡沫病毒。逆轉錄病毒是單鏈RNA病毒，由在受感染細胞中通過反向轉錄將其RNA轉為雙鏈DNA的能力而表徵(Coffin，1990)。然後，得到的DNA作為前病毒整合到細胞的染色體中，並指導合成病毒蛋白質。這種整合導致病毒基因序列保留於受體細胞與其後代。逆轉錄病毒基因組含有三種基因gag，pol，和env分別編碼衣殼蛋白，聚合酶，和包膜成分。發現於gag基因上遊的序列，稱為ψ，功能是將包裹基因組到病毒中的信號。兩個長末端重複(LTR)序列存在於該病毒基因組的5』和3』末端。它們包含強啟動子和增強子序列並且也必需整合到宿主細胞基因組中(Coffin，1990)。為了構建逆轉錄病毒載體，編碼HPV多肽的核苷酸被插入到病毒基因組的某些病毒序列中以產生複製缺陷的病毒。或者，可使用不能導致HPV感染的突變的HPV病毒。為了產生病毒粒子，構造含有gag，pol和env基因，但沒有LTR和ψ組分的包裝細胞系(Mann，1983)。當含有人的cDNA重組質粒連同逆轉錄病毒LTR和ψ序列，被引入到該細胞系(例如通過磷酸鈣沉澱)時，ψ序列允許重組質粒的RNA轉錄產物被包裝到病毒粒子中，然後分泌到培養基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Mann，1983)。然後收集含有重組的逆轉錄病毒的培養基，任選濃縮，用於基因轉移。逆轉錄病毒能感染多種類型的細胞。然而，整合和穩定表達要求宿主細胞分裂(Paskind，1975)。最近開發了一種設計為允許逆轉錄病毒載體的特異性靶向的新方法，該方法基於通過化學添加乳糖殘基到病毒包膜來化學修飾逆轉錄病毒。這一修飾可允許通過唾液酸糖蛋白受體特異地感染肝細胞。設計了一種不同的重組逆轉錄病毒的靶向方法，其中應用抗逆轉錄病毒包膜蛋白和抗特定細胞受體的生物素化的抗體。通過使用鏈黴抗生物素蛋白，抗體經生物素成分偶聯起來(Roux，1989)。通過使用抗主要組織相容性複合物I類和II類抗原的抗體，他們表明在體外用外生的病毒感染帶有那些表面抗原的人細胞。(Roux，1989)。b.腺病毒人的腺病毒是雙鏈DNA腫瘤病毒，其基因組長度接近36kb(Tooze，1981)。作為真核生物基因表達的模式系統，腺病毒被廣泛地研究和充分鑑定，這使得發展腺病毒成為有吸引力的基因轉移系統。這類病毒相對容易生長和複製，並在體內和體外顯示了較寬的宿主範圍。在裂解感染的細胞時，腺病毒能關閉宿主的蛋白合成，指導細胞機器合成大量的病毒蛋白，並產生大量的病毒。基因組的E1區域包括E1A和E1B和一些細胞基因，E1A和E1B編碼負責調節病毒基因轉錄的蛋白。E2的表達(包括E2A和E2B)能合成病毒複製功能，如DNA結合蛋白，DNA聚合酶，和最初引發複製的末端蛋白。E3基因產物通過CTL和腫瘤壞死因子防止細胞溶解，並對病毒增殖顯示重要性。與E4相關的功能包括DNA複製，後期基因表達，和宿主細胞關閉。後期基因產物主要包括病毒衣殼蛋白，它們僅在大多數從主要晚期啟動子的一次主要轉錄過程出現之後表達。主要晚期啟動子(MLP)在感染的晚期顯示高效性(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991)。由於僅有一小部分的病毒基因組顯示需要順式(Tooze，1981)，所以當使用與如293細胞相關的細胞系時，腺病毒衍生載體對於取代大DNA片段顯示了極好的潛力。Ad5-轉化的人胚腎細胞系(Graham，1977)已被開發以提供必要的反式病毒蛋白。腺病毒的性質使得它們成為用於體內靶向細胞的良好的後選物(Grunhaus和Horwitz，1992)。用腺病毒體系輸送外源蛋白到細胞的特別優勢包括(i)由外源DNA取代相對大片段病毒DNA的能力；(ii)腺病毒重組體結構的穩定性；(iii)腺病毒施於人類的安全性；(iv)腺病毒感染與癌症或惡性腫瘤之間無任何已知的相關性；(v)獲得高效價病毒重組體的能力；(vi)腺病毒的高感染性。通常，腺病毒基因傳輸體系基於重組體，它為由於一部分基因組缺失而不能複製的改造的腺病毒，如缺失E1，但還保留它的感染能力。當在腺病毒基因組中增加缺失時，編碼相對大的異源蛋白的序列可以被表達。如，缺失E1和E2區域的腺病毒能攜帶10kb的外源DNA並能在293細胞中高效價產生(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991)。腺病毒浸染後，轉基因意外的永久表達也已被報導。c.AAV載體腺伴隨病毒(AAV)是本發明用於細胞轉導的一種有吸引力的載體系統，由於它能高頻整合併能感染非分裂的細胞，這使得它具有輸送基因到哺乳動物細胞的用途，如，在組織培養中(Muzyczka，1992)或在體內。AAV具有廣泛的宿主感染範圍(Lebkowski，1988；McLaughlin，1988；Laughlin，1986；Tratschin，1984)。關於rAAV的產生和使用的詳細資料在美國專利5,139,941和美國專利4,797,368中描述，此處均引入作為參考。說明AAV用於基因傳輸的研究包括LaFace等(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；和Walsh等(1994)。重組AAV載體已成功地用於體外和體內轉導標記基因(Kaplitt，1994；Shelling和Smith，1994；Yoder，1994；Zhou，1994；Samulski，1989；Lebkowski，1988；McLaughlin，1988；Tratschin，1985；Hermonat和Muzyczka，1984)和涉及人疾病的基因(Luo，1994；Walsh，1994；Wei，1994；Flotte，1992；Ohi，1990)。近來，AAV載體已經允許用於囊性纖維化病治療的I期人體試驗。AAV是一種需要在培養細胞中與其它病毒(腺病毒或皰疹病毒的成員之一)協同感染才能有效感染的依賴性細小病毒(Muzyczka，1992)。在缺少輔助病毒協同感染時，野生型AAV基因組通過它的末端整合到人染色體19中，它以潛伏狀態作為前病毒駐留於此處(Samulski，1991；Kotin，1990)。然而rAAV並沒有因整合被限制到染色體19上，除非AAVRep蛋白也被表達(Shelling和Smith，1994)。當運輸AAV前病毒的細胞被輔助細胞雙重感染，AAV基因組從染色體或重組質粒中被「援救」出來，從而建立了通常的有效感染(Muzyczka，1992；Kotin，1990；Samulski，1989；McLaughlin，1988)。典型地，重組AAV病毒(rAAV)通過協同轉染一個在目的基因兩翼含有兩個AAV末端重複序列的質粒(McLaughlin，1988；Samulski，1989；分別引入此處作為參考)，和一個含有無末端重複序列的野生型AAV編碼序列的表達質粒製成，例如pIM45(McCarty，1991；此處引入作為參考)。細胞也可感染或轉染載有AAV所需輔助功能的腺病毒基因的腺病毒或質粒。以這種方式製得的rAAV病毒原液被腺病毒汙染，後者必須從rAAV微粒中物理分離(如通過氯化銫密度離心)。或者，可使用含有AAV編碼區域的腺病毒載體或含有AAV編碼區域的細胞系和一些或所有的腺病毒輔助基因(Clark，1995；Yang，1994)。也可以使用載有rAAVDNA作為一種整合前病毒的細胞系(Flotte，1995)。d.其它作為表達構建體的病毒載體在本發明中可以使用其它病毒載體作為表達構建體。可以使用來自病毒的載體如牛痘病毒(Coupar，1988；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)和皰疹病毒。這些病毒對各種哺乳動物細胞提供了一些有吸引力的特性(Horwich，1990；Friedmann，1989；Coupar，1988；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)。隨著近來對B型肝炎病毒的認識，對於不同的病毒序列的結構功能也產生了新的認識。體外試驗顯示，儘管缺失了基因組的80％，病毒仍能保持其依賴輔助病毒包裝和反轉錄的能力(Horwich，1990)。這意味著大部分的基因組可以通過外源基因物質代替。對於肝定向基因的轉移，趨肝性和存活率(整合)是尤為有吸引力的特性。Chang(1991)最近將氯黴素轉乙醯酶(CAT)基因引入到鴨B型肝炎病毒基因組中聚合酶的位置，表面和前表面編碼區域。它在鳥類肝癌細胞系中與野生型病毒協同轉染。含有高效價病毒重組體的培養基被用來感染原代小鴨肝細胞。在轉染後的至少24天，檢測到穩定的CAT基因表達(Chang，1991)。e.非病毒轉移方法本發明也設計了一些非病毒方法以轉移表達載體到培養的哺乳動物細胞中。它們包括磷酸鈣沉澱(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe，1990)DEAE-右旋糖(Gopal，1985)，電穿孔(Tur-Kaspa，1986；Potter，1984)，直接顯微注射(Harland和Weintraub，1985)，負載DNA的脂質體(Nicolau和Sene，1982；Fraley，1979)和脂轉染胺-DNA複合物，細胞超聲處理(Fechheimer，1987)，用高速微粒轟擊基因(Yang，1990)，聚陽離子(Boussif，1995)，和受體介導的轉染(Wu和Wu，1988；Wu和Wu，1987)。這些技術中的一些可以成功地適於體內或離體的應用。D.膠態分散體系膠態分散體系構成定向傳輸載體。這些分散體系包括大分子複合物，毫微囊複合物，毫微囊，微球體，小珠，和包括水包油型乳劑，膠粒，混合的膠粒和脂質體的脂基系統。本發明中優選的膠態體系就是脂質體。脂質體是一種人工膜泡囊，用作體外和體內的輸送載體。已經顯示，範圍在0.2-4.0um的大單層泡囊(LUV)可以包裹足夠量的大分子的水緩衝液。RNA，DNA和完整的病毒粒子可被包裹到水性內部，並以生物學活性的形式輸送到細胞(Fraley，等)。除了哺乳動物細胞，脂質體已經用於在植物、酵母和細菌細胞中輸送多核苷酸。為了使脂質體成為有效的基因傳遞載體，需要存在如下特徵(1)以高精度包裹目的基因，而不破壞它們的生物學活性；(2)同非靶細胞比較，優先並充分結合靶細胞；(3)高效輸送泡囊的水狀內含物到靶細胞質；和(4)正確而有效地表達遺傳信息(Manning，等，Biotechniques，6682，1988)。本發明的實施方案提出合成肽可以製劑為脂質體。脂質體的組成通常是磷脂，尤其是高相轉移溫度的磷脂的組合，通常結合類固醇，尤其是膽固醇。也可使用其它磷脂或其它磷脂。脂質體的物理性質取決於PH，離子強度，和二價陽離子的存在。在脂質體生產中有用的脂類的例子包括磷脂醯化合物，如磷脂醯甘油，磷脂醯膽鹼，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯乙醇胺，鞘脂，腦苷脂，和神經節苷脂。尤其有用的是二醯基磷脂醯甘油，其中脂質部分含有14-18個碳原子，尤其是16-18個碳原子，並且是飽和的。例證性的磷脂包括蛋卵磷脂，二棕櫚醯卵磷脂，二硬脂醯卵磷脂。脂質體的靶向可以基於結構分類和機制因素分類。結構學的分類是基於選擇性水平，如器官特異的，細胞特異的和細胞器特異的。機制靶向目標的區分是基於它是主動或被動的。在含有竇狀毛細管的器官中，被動靶向目標利用脂質體向網狀內皮系統(RES)細胞分配的天然趨勢。相反，主動靶向目標涉及脂質體的改變，通過將脂質體與特定配體如，單克隆抗體，糖，糖脂或蛋白質結合，或通過改變組成或脂質體的大小以靶向器官和細胞型，而不是定位於自然發生的位點。被定向的傳輸體系的表面可以各種方式修改。在脂質體的定向傳輸體系中，為了使定向配體保持與脂質體雙分子層穩定接觸，脂基可以被結合到脂質體的脂質雙分子層中。各種連接基團可被用於將質鏈結合到定向配體上。E.藥物組合物本發明包括合成肽在形成藥物組合物中的使用。一般來講藥物組合物包括有效量的一或多種蛋白質序列、核酸或抗體或溶解或分散在藥學可接受載體中的附加試劑。短語「藥物或藥學可接受的」是指分子實體和組分，當它們被適當地施用於某種動物時，如人，不會產生不利的、過敏性的或其它不良反應。根據本發明的公開內容，本領域技術人員可知包含至少一種蛋白質序列、核酸或抗體或附加活性成分的藥物組合物的製備，如Remington’sPharmaceuticalSciences(18thEd.MackPrintingCompany，1990)所例示的，此處引入作為參考。此外，對於動物(例如人)的給藥，應該了解，製備應符合FDA所要求的無菌、致熱性、一般安全性和純度的生物學標準。如在這裡所用的，「藥學可接收的載體」包括任何和所有溶劑、分散培養基、塗料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(比如抗細菌劑、抗真菌劑)，吸收延遲劑、鹽類、防腐劑、麻醉劑、藥物穩定劑、粘合劑、賦形劑、分散劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料等或其組合，正如本領域普通技術人員公知的(例如參見Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，Mack印刷公司，1990，pp.1289-1329，此處引入作為參考)。除了任何常規的載體與活性成分不相容的情況，考慮其在治療性的或藥物組合物中的使用。蛋白質序列、核酸或抗體可包含不同的載體類型，這取決於它是否以固體、液體或氣霧劑的形態被施用，也取決於在以某種方式施用，如注射方式時，是否需要無菌。本發明可以通過靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、損傷內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、葉鞘內、直腸內、局部、腫瘤內、肌內、腹膜內、皮下、泡內、黏膜內、心包內、口服、局部、局部地施藥，使用氣霧劑、注射、輸注、連續輸注、直接局部灌注浸浴靶細胞，通過導液管、通過灌洗、在乳液內、在脂類組合物中(例如脂質體)，或通過其它的方式或本領域普通技術人員公知的前述方法的結合(參見，如Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，Ed.Mack印刷公司，1990，此處引入作為參考)。本發明的組合物施用於動物患者的用量取決於身體和生理因素，如體重、病情的嚴重程度、被治療的疾病類型、先前或並存治療的幹涉、患者原發病和給藥途徑。在任何情況下，負責施藥的專業醫生決定組合物中活性成分的濃度和針對個體患者的適當劑量。在某些具體方式中，藥物組合物可包含，例如，約0.1％的活性化合物。在其它實施方案中，例如，一種活性化合物可能包含2％左右到75％左右的單位重量，或25％左右到60％左右，或其中可導出的任何範圍。在其它非限制性的例子中，劑量可以包含從約1微克/千克/體重、5微克/千克/體重、10微克/千克/體重、50微克/千克/體重、100微克/千克/體重、200微克/千克/體重、350微克/千克/體重、500微克/千克/體重、1毫克/千克/體重、5毫克/千克/體重、10毫克/千克/體重、50毫克/千克/體重、100毫克/千克/體重、200毫克/千克/體重、350毫克/千克/體重、500毫克/千克/體重、到約1000毫克/千克/體重或更多，也可以是其中可導出的任何範圍。基於上文所描述的數量，從此處所列出的數字可導出的非限制性的例子中，可以施用範圍從約5毫克/千克/體重到約100毫克/千克/體重、約5微克/千克/體重到約500微克/千克/體重的範圍等。在任何情況下，該組合物可包括各種抗氧化劑來阻止一種或多種組分的氧化。另外，通過防腐劑可以防止微生物的作用，例如各種抗細菌和抗真菌試劑，包括但不局限於對羥基苯甲酸酯類(如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、工汞硫代水楊酸鈉或其組合。蛋白質序列、核酸或抗體可以配製成游離鹼，中性的或鹽形式的組合物。藥學上可接受的鹽，包括酸加成鹽，如，與蛋白質的游離氨基形成的，或與無機酸形成的，如鹽酸或磷酸，或某種有機酸如醋酸，草酸，酒石酸或苦杏仁酸。帶有游離羧基的鹽形式也可由無機鹼衍生，如鈉，鉀，銨，鈣或鐵的氫氧化物；或某種有機鹼如異丙胺，三甲胺，組氨酸或普魯卡因。在組合物為液體形式的實施方案中，載體可以是一種溶劑或分散介質，包括但不局限於水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、類脂(如甘油三酯、植物油、脂質體)及其組合。保持適當的流動性，例如，通過使用如磷脂醯膽鹼的包衣；通過由在載體例如液體多元醇或脂類中的分散保持所需顆粒的大小；通過使用如羥丙基纖維素的表面活性劑；或這些方式的組合。在許多情況下，優選包括等滲試劑，如，糖，氯化鈉或其組合。在其它實施方案中，本發明中也可施用滴眼液，鼻溶液或噴霧劑，或氣霧劑或吸入劑。某些組合物通常被設計為與靶組織型相兼容的。在非限制性的實例中，鼻溶液是一種水溶液，通常被設計為以滴加或噴灑方式施用到鼻通道上。製備鼻溶液使其在很多方面類似於鼻分泌物，並由此保持正常的纖毛功能。因此，在優選的實施方案中，水性鼻溶液通常是等滲的或有輕微緩衝以保持約5.5至約6.5的PH。此外，如果需要，該製劑可包括類似用於眼藥製劑的抗微生物防腐劑，藥品，或適當的藥物穩定劑。例如，各種商品鼻製劑已知的並包括藥品，如抗生素或抗組胺劑等。在某些實施方案中，蛋白質序列，核酸或抗體的給藥可以通過某些途徑如口服。在這些實施方案中，該固體組合物可包括如，溶液，懸浮液，乳劑，片劑，丸劑，膠囊(如硬或軟殼膠囊)，持續釋放製劑，含服組合物、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑或其組合。口服組合物可直接與食物結合。口服給藥的優選載體包含惰性稀釋液、可吸收的食用載體或其組合。本發明的其它方面，口服組合物可被作為糖漿劑或酏劑製備。糖漿劑或酏劑也可包括，如，至少一種活性成分，甜味劑，防腐劑，風味劑，染料，防腐劑，或其組合。.在某些優選的實施方案中，口服組合物可包括一或多種粘合劑，賦形劑，分散劑，潤滑劑，風味劑，及其組合。在某些實施方案中，組合物可包括一或多種如下試劑粘合劑，如，黃蓍膠，阿拉伯樹膠，玉米澱粉，明膠或其組合；賦形劑，如，磷酸二鈣，甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂，或其組合；分散劑，如，玉米澱粉，馬鈴薯澱粉，海藻酸或其組合；潤滑劑，如硬脂酸鎂；甜味劑，如蔗糖，乳糖，糖精，或其組合；風味劑，如薄荷，鹿蹄草油，櫻桃香料，桔子香料等；或上述物質的組合。當所述單位的劑型是膠囊時，除了上述類型的物質，它可包括載體，如液體載體。各種其它物質可以作為包衣存在，或以不同的方式改變單位藥劑的物理形式。適用於其它給藥方式的另一劑型包括栓劑。栓劑是各種重量和形狀的固體製劑形式，通常通過插入直腸，陰道或尿道用藥。插入後，栓劑變軟，融化或溶解到腔內體液中。通常，對於栓劑可使用常規載體，如，聚(亞烷基)二醇，甘油三酯或其組合。在某些實施方案中，栓劑可混合物形成，其包括如，活性成分約0.5％至約10％，並優選約1％至約2％。無菌可注射溶液是通過在過濾滅菌後，在適當的溶劑中加入所需量的活性化合物和各種上文列舉的其它成分製備而成。通常，通過加入各種無菌活性成分到含有基礎分散介質和/或其它成分的無菌載體中製備分散體。當無菌粉末用於製備無菌可注射溶液，懸浮液或乳狀液時，優選的製備方法是真空乾燥或冷凍乾燥技術，它能從先前的無菌過濾的液體介質中產生出活性成分加任何所需附加成分的粉末。如果必要，液態介質應該被適當緩衝，並且在注射之前，液體稀釋劑首先用足夠的鹽或糖進行等滲。也設計製備用於直接注射的高濃度組合物，其中考慮使用DMSO作為溶劑以導致非常快速的滲透，輸送高濃度的活性成分到小面積。組合物在製造和貯藏條件下必須穩定，並保存於抗微生物如細菌和真菌汙染條件下。應該了解，內毒素汙染應該控制到最小水平，如少於0.5ng/mg蛋白質。在特定實施方案中，可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收劑，如一硬脂酸鋁，明膠或其組合而實現。由於肽可以作為一種免疫治療劑施用於患者，基於脂類的組合物也與本發明相關。這些將在下文中詳細論述。在某些實施方案中，本發明涉及一種新的組合物，其包括與至少一種肽聯合的一或多種類脂。脂類是一種特性不溶於水並可用有機溶劑萃取的物質。脂類包括，如天然出現於細胞質的脂肪滴，以及這類本領域技術人員公知的化合物種類，它們都含有長鏈脂肪族烴類及其它衍生物，如脂肪酸，醇，胺，氨基醇和醛。當然，不同於在此特別描述的化合物，其它本領域技術人員了解的作為脂類的化合物也包括在本發明的化合物和方法中。脂類可以是天然存在的或合成的(如人工設計或生產的)。然而，脂類通常是生物物質。生物脂類是本領域公知的，包括如中性脂肪，磷脂，磷酸甘油酯，類固醇，萜，溶血脂類(lysolipid)，鞘糖脂，糖脂，硫化物(sulphatide)，帶有醚和脂連接脂肪酸的脂類和可聚合的脂類，以及其組合。II.脂類類型中性脂肪包括甘油和脂肪酸。典型的甘油是三碳醇。脂肪酸通常由末端帶有酸性部分(如，羧酸)的長碳鏈組成。典型的脂肪酸碳鏈可以是任何長度的，但是，優選的碳鏈長度是從約2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29到約30或更多的碳原子，以及由它們導出的任何範圍。然而，脂肪酸的鏈部分優選的範圍是從約14至24個碳原子，在某些實施方案中尤其優選約16至約18個碳原子。在某些實施方案中，脂肪酸碳鏈可包括奇數個碳原子，而在某些實施方案中優選包括偶數個碳原子。在碳鏈上僅含有單鍵的脂肪酸被稱為飽和的，而在碳鏈上包含至少一個雙鍵的脂肪酸被稱為不飽和的。具體的脂肪酸包括，但不限於亞油酸，油酸，棕櫚酸，亞麻酸，硬脂酸，月桂酸，豆蔻酸，花生酸，棕櫚油酸，花生四烯酸，蓖麻油酸，結核硬脂酸，乳杆酸。一個或多個脂肪酸的酸性基團共價結合到甘油的一個或多個羥基上。因此，單脂醯甘油酯由一個甘油和一個脂肪酸組成，一個二脂醯甘油酯由由一個甘油和兩個脂肪酸組成，一個三脂醯甘油酯由一個甘油和三個脂肪酸組成。磷脂通常包括甘油或鞘氨醇部分，產生兩性化合物的磷酸鹽離子基團，和一或多個脂肪酸。磷脂的類型包括，如甘油磷酯，其中磷酸鹽基團與二脂醯甘油酯中甘油的第一個碳原子相連；和鞘磷脂(如神經鞘磷脂)，其中磷酸基團被鞘氨醇的氨基醇酯化。另一個鞘磷脂的實例是硫苷脂，其中包括一個硫酸鹽離子基團，它使得該分子具有兩性。當然，磷脂也包括更多的化學基團，例如，與磷酸基團相連的醇。這些醇基團包括絲氨酸，乙醇胺，膽鹼，甘油和肌醇。因此，特定的磷酸甘油酯包括磷脂醯絲氨酸，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯膽鹼，磷脂醯甘油或磷脂醯肌醇。其它的磷脂包括磷脂酸或二乙醯磷酸。一方面，磷脂醯膽鹼包括二油醯基磷脂醯膽鹼(如心磷脂)，蛋磷脂醯膽鹼，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼，單豆蔻醯磷脂醯膽鹼，單棕櫚醯磷脂醯膽鹼，單硬脂醯磷脂醯膽鹼，單油醯磷脂醯膽鹼，二丁醯磷脂醯膽鹼，二戊醯磷脂醯膽鹼，二癸醯磷脂醯膽鹼，二庚醯磷脂醯膽鹼，二辛醯磷脂醯膽鹼或二硬脂醯磷脂醯膽鹼。糖脂與鞘磷脂相關，但包含連接鞘氨脂的伯羥基的糖基團而不是磷酸基團。一種類型的糖脂稱為腦苷脂，包含一個糖基(如，葡萄糖或半乳糖)連接伯羥基。另一個糖脂的實例是神經節苷脂(如，單唾液酸神經節苷脂，GM1)，它包含大約2，3，4，5，6，7左右個糖基，其可為支鏈的，連接伯羥基。在另外的實施方案中，糖脂是神經醯胺(如，乳糖醯神經醯胺)。類固醇是菲的四元環體系衍生物。類固醇通常在細胞，組織和有機體中有調節功能，包括如，結合孕激素中的激素和相關的化合物(如孕酮)，糖皮質激素(如氫化可的松)，鹽皮質激素(如醛甾酮)，雄激素(如睪酮)和雌激素(如雌酮)系列。膽固醇是類固醇的另一實例，並通常提供結構而非調節功能。維生素D是另一個固醇的實例，它涉及從小腸內吸收鈣。萜是包含一或多個五碳異戊二烯基團的脂類。萜有各種生物功能，包括，如維生素A，輔酶Q和類胡蘿蔔素(如番茄紅素和β-胡蘿蔔素)。B.帶電荷的和中性的脂類組合物在某些實施方案中，組合物的脂類成分是不帶電的或原本不帶電的。在一個實施方案中，組合物的脂類成分包括一或多種中性脂類。另一方面，組合物的脂類成分實質上可以不含陰離子的和陽離子的脂類，如某些磷脂(如磷脂醯基膽鹼)和膽固醇。在某些方面，不帶電的或原本不帶電的脂類組合物包含約95％，96％，97％。98％，99％，100％的不帶任何電荷的脂類成分，基本不帶電的脂類，和/或帶有等量正電荷和負電荷的脂類混合物。在其它方面，脂類組合物可以是帶電荷的。如，根據本發明，帶電荷的磷脂可用於製備脂類組合物，並可以帶有陽性淨電荷或陰性淨電荷。在非限制性實例中，二乙醯磷酸可用來使脂類組合物帶負電荷，且硬脂醯胺可用來使脂類組合物帶正電荷。C.製造脂類如本領域普通技術人員公知的，脂類可由天然來源，商品或化學合成獲得。例如，磷脂可從天然來源獲得，如雞蛋或大豆磷脂醯膽鹼，腦磷脂酸，腦或植物磷脂醯肌醇，心磷脂和植物或細菌磷脂醯乙醇胺。在另一個實例中，適於根據本發明使用的脂類可以從商業來源中獲得。例如，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可從SigmaChemicalCo.獲得，聯十六烷基磷酸(「DCP」)從KK實驗室(Plainview，NY)獲得，膽固醇從Calbiochem-Behring獲得，二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)和其它可以從AvantiPolarLipids，Inc.(Birmingham，Ala.)獲得的脂類。在某些實施方案中，在氯仿或氯仿/甲醇中的脂類原液可貯存於約-20℃下。優選地，氯仿作為唯一的溶劑，因為它比甲醇更易蒸發。D.脂類組合物結構在本發明的優選實施方案中，肽與脂類相連。與脂類相連的肽可被分散到含有脂類的溶液中，用脂類溶解、乳化、混合、聯合，共價結合到脂類上，以懸浮液包含於脂類中，用膠束或脂質體包含或混合，或與脂類或脂類結構相連。本發明的脂類或脂類/嵌合多肽聯合的組合物不局限於任何特殊結構。例如，它們也可僅被散布在溶液中，可能形成大小或性狀不統一的聚合體。在另一個實例中，它們可以存在於一個雙層結構中，如膠束，或用一個「塌陷的」結構。在另一個非限制性的實例中，脂轉胺(GibcoBRL)-嵌合多肽或Superfect(Qiagen)-嵌合多肽複合物也被考慮。在某些實施方案中，脂類組合物可包括約1％，約2％，約3％，約4％約5％，約6％，約7％，約8％，約9％，約10％，約11％，約12％，約13％，約14％，約15％，約16％，約17％，約18％，約19％，約20％，約21％，約22％，約23％，約24％，約25％，約26％，約27％，約28％，約29％，約30％，約31％，約32％，約33％，約34％，約35％，約36％，約37％，約38％，約39％，約40％，約41％，約42％，約43％，約44％，約45％，約46％，約47％，約48％，約49％，約50％，約51％，約52％，約53％，約54％，約55％，約56％，約57％，約58％，約59％，約60％，約61％，約62％，約63％，約64％，約65％，約66％，約67％，約68％，約69％，約70％，約71％，約72％，約73％，約74％，約75％，約76％，約77％，約78％，約79％，約80％，約81％，約82％，約83％，約84％，約85％，約86％，約87％，約88％，約89％，約90％，約91％，約92％，約93％，約94％，約95％，約96％，約97％，約98％，約99％，約100％或從中導出的任何範圍的特定脂類，脂類型或非脂類成分，如藥物，蛋白質，糖，核苷酸或其它本發明公開的或本領域技術人員公知的物質。在非限制性的實例中，脂類組合物可包括約10％到約20％的中性脂類，和約33％至約34％的腦苷脂類，和約1％的膽固醇。在另一個非限制性的實施方案中，脂質體可以包括約4％至約12％的萜，其中約1％的膠束是特定的番茄紅素，剩餘約3％至約11％的脂質體由其它萜組成；且還包括約10％至約35％的磷脂醯膽鹼和約1％的藥。因此，本發明的脂類組合物可以以任何組合或百分比範圍包括任何脂類，脂類型或其它成分。1.乳劑脂類可被包含於乳劑中。脂類乳劑基本永久的異源液體混合物，它由兩種或多種通常互不溶解的液體通過機械攪拌或通過加入少量已知的乳化劑添加物質獲得。製備脂類乳劑的方法和加入的添加成分是本領域公知的(如，ModernPharmaceutics，，1990，此處引入作為參考)。例如，一種或多種脂類被加入到乙醇或氯仿或任何其它合適的有機溶劑中並用手工或機械技術攪拌。然後該溶劑從混合物中蒸發，留下幹的脂類光滑面。該脂類在水性介質中重懸，如磷酸緩衝鹽，最後得到乳劑。為了得到大小分布更均質的乳化脂類，可以用常規的超聲處理技術超聲處理該混合物，使用顯微流態化處理進行進一步乳化(如，使用Mierofluidizer，Newton，Mass.)，和/或高壓(如在600psi)下擠壓利用ExtruderDevice(LipexBiomembranes，Vancouver，Canada)。2.膠束脂類可被包含在膠束中。膠束是脂類組合物的群集物或聚集體，通常是脂單層形式，並通過使用本領域技術人員公知的任何膠束生產步驟製備(如，Canfieldetal.，1990；El-Gorabetal，1973；Shinodaetal.，1963；和Fendleretal.，1975，分別引入此處作為參考)。例如，一或多種脂類在有機溶劑中一般製成懸浮液，蒸發該溶劑，該脂類重懸在水溶液中，超聲處理，然後離心。3.脂質體在特定實施方案中，脂類由脂質體組成。「脂質體」是一個專業術語包括通過產生封閉的脂類雙分子層或聚集體形成的各種單或多層脂類媒介物。脂質體可以表徵為帶有雙分子層膜的膜泡結構，通常包括磷脂，和通常包含水性組合物的內部介質。多層脂質體具有由水性介質分開的多個脂類層。當含有磷脂的脂類懸浮於過量的水溶液中時，多層脂質體自然形成。在形成封閉結構之前，脂類組分進行自身重排，並且在脂類雙分子層之間捕獲水和溶解的溶質(Ghosh和Bachhawat，1991)。親脂性或帶有親脂區域的分子也可以溶解或結合到脂類雙分子層中。在某些較不優選的實施方案中，天然來源的磷脂，如蛋或大豆磷脂醯膽鹼，腦磷脂酸，腦或植物磷脂醯肌醇，心磷脂和植物或細菌磷脂醯乙醇胺最好不要用作主要的磷脂，即不構成50％或更多的總磷脂組成或脂質體，因為得到脂質體會不穩定性和有易漏性。在特定的實施方案中，脂類和/或嵌合多肽可以，例如，包裹在脂質體的水性內部，散布在脂質體的脂類雙分子層內，通過與脂質體和嵌合多肽相連的連接分子連接到脂質體上，被脂質體捕獲，與脂質體複合等。a.製備脂質體如本領域普通技術人員公知，根據本發明使用的脂質體可以通過不同的方法製備。當磷脂分散到水中時，根據脂類與水的比例，它可以形成非脂質體的各種結構。低比率時，脂質體是優選結構。例如，磷脂(AvantiPolarLipids，Alabaster，AL)，如中性磷脂，二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)溶解於叔丁醇中。該脂類然後混合嵌合多肽，和/或其它成分。在該脂類混合物中加入Tween20，使得Tween20佔組合物重量的5％。過量的叔丁醇加入到該混合物中，使得該叔丁醇的體積至少佔95％。該混合物被渦旋混合，冷凍在乾冰/丙酮浴中並過夜凍幹。該凍幹的製劑貯存於-20℃，並可使用三個月。當需要時，凍幹的脂質體在0.9％的鹽水中重構。用於封閉嵌合多肽的微粒用Tween20獲得，它們的平均粒徑是約0.7至1.0um。或者，脂質體可以在容器中通過在溶劑中混合脂類製備，如，玻璃的，梨形燒瓶。該容器的體積應該大於要求的脂質體懸浮液體積的十倍。通過使用旋轉蒸發器，溶劑在真空中接近40℃時被除去。該溶劑通常在約5分鐘至2小時之內被除去，這取決於需要的脂質體的體積。該組合物可以在乾燥器中進一步被乾燥。由於隨著時間有變質的趨勢，乾燥的脂類通常在約一周後丟棄。在無菌的、無熱原的水中以25-50mM的磷脂重構乾燥的脂類，通過振蕩直到所有的脂類薄層被重懸。該含水脂質體然後被等分，分別裝入到小瓶中，凍幹並在真空中密封。在其它可選擇性的方法中，脂質體可以按照其它已知的實驗方法製備(如，參見Banghametal.，1965；Gregoriadis，1979；Deamer和Uster1983，Szoka和Papahadjopoulos，1978，分別在相關部分引入作為參考)。這些方法因它們各自捕獲含水物質的能力以及它們各自的間隙與脂類的比率而不同。按照上文製得的乾燥的脂類或凍幹的脂質體可以在抑制肽的溶液中脫水和重構，並可用適當的溶劑稀釋到合適的濃度，如DPBS。然後在渦旋混合器中用力晃動該混合物。未包封的添加物質，如藥劑(包括但不限於激素，藥物，核苷酸組成等等)通過在29,000Xg下離心除去，而脂質體沉澱被清洗。清洗的脂質體以適當的總磷脂濃度重懸，如約50-200mM。包封的添加物質或活性劑的數量可根據標準方法確定。脂質體製備中包封的附加物質或活性劑的數量確定後，脂質體可溶解於適當的濃度並貯存於4℃備用。包含脂質體的藥物組合物通常包括一種無菌的藥學可接受的載體或稀釋劑，如水或鹽水。根據合成方法，脂質體的大小可變。本發明的脂質體可以是多種大小。在某些實施方案中，脂質體很小，如外徑小於約100nm，約90nm，約80nm，約70nm，約60nm，或小於約50nm。製備這種脂質體時，可以使用此處描述的任何方法或本領域普通技術人員公知的方法。其它製備脂質體的非限制性實施例描述於美國專利4,728,578、4,728,575，4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；國際申請PCT/US85/01161和PCT/US89/05040；英國專利申請GB2193095A；Mayeretal.，1986；Hopeetal.，1985；Mayhewetal.1987；Mayhewetal.，1984；Chengetal.，1987；和Gregoriadis，1984，分別引入此處作為參考)。懸浮於水溶液的脂質體通常是球形囊泡狀，具有一或多個脂類雙層分子的同心層。每層由式XY代表的分子的平行排列組成，其中X是親水部分，Y是疏水部分。在水懸浮液中，同心層排列使親水部分傾向於保持與水相接觸而疏水區域傾向於自聯合。例如，當水相既存在於脂質體內又存在於脂質體外時，脂類分子可以形成一個排列為XY-YX的雙分子層，即通常所說的薄層。當一個以上的脂類分子的親水和疏水部分開始互相結合時，可以形成脂類聚集體。這些聚集體的大小和形狀依賴許多不同的變量，如溶劑的性質和溶液中其它化合物的存在。在(I)反相蒸發(II)脫水-再水合(III)洗滌劑透析和(IV)薄膜水合之後，通常通過超聲處理或脂質體混合物的連續排出得到脂類製劑產品。一方面，在某些實施方案中製備脂質體的方法包括熱超聲處理，和通過過濾器或孔徑減小的膜的連續排出，從而得到小的，穩定的脂質體結構。這種製備只產生適當和均一大小的脂質體/嵌合多肽或脂質體，它們的結構穩定並且產生極大的活性。該技術是本領域技術人員公知的(參見，如Martin，1990)。只要生產出來，脂類結構可用於包裹有毒性的(如化學療法)或在循環中不穩定的(如核酸)化合物。脂質體的物理性質依賴PH，離子強度和/或二價陽離子的存在。脂質體可顯示對離子和/或極性物質的低滲透性，但是相變過程溫度的升高明顯地改變了它們的滲透性。相變涉及從密集的，有序的結構(稱為明膠態)到鬆散包裹的，無序的結構(稱為液態)。該現象發生於特有的相變溫度和/或導致對離子，糖和/或藥物的滲透性的增長。脂質體包裹已經使得這些化合物的毒性降低並且血清半衰期增長(Gabizonetal.，1990)。脂質體通過四種不同的機制影響細胞傳輸藥劑通過網狀內皮系統吞噬細胞的胞吞作用，如巨噬細胞和/或嗜中性粒細胞；通過非特異性的弱疏水力和/或靜電力吸附到細胞表面，和/或通過與細胞表面組分的特異性相互作用；通過將脂質體的脂類雙分子層插入質膜與質膜融合，同時釋放脂質體內含物到細胞質中；和/或通過轉移脂質體脂類到細胞膜和/或亞細胞膜上，和/或反過來同樣，而不需要與任何脂質體內含物聯合。雖然不止一種機制可以同時操作，但脂質體製劑可以改變哪種機制有效。許多疾病的治療使用基於脂類的基因轉移策略以強化常規療法或建立新的療法，尤其是針對高增殖性疾病的療法。脂質體製劑的進展已經改善了體內基因轉移的效率(Templetonetal.，1997)並且考慮通過這些方法製備脂質體。為傳輸核酸的基於脂質體的另一製備方法已有描述(WO99/18933)。在另一個脂質體製劑中，一種稱為溶劑稀釋微載體(SDMC)的兩性載體能夠將特定分子整合到脂類載體的雙分子層中(美國專利5,879,703)。SDMC可用於傳輸脂多糖，多肽，核酸等。當然，製備脂質體的任何其它方法可被技術人員使用以獲得本發明中需要的脂質體配方。b.定向配體定向配體既可以被固定於複合物的疏水部分，也可以連接到複合物親水部分的反應性末端基團上。定向配體可通過一個對反應基團的連接而結合脂質體，如在親水聚合物的遠端。優選的反應基團包括氨基，羧基，醯基和硫醇基。定向配體與親水聚合物的結合可以通過本領域技術人員公知的有機化學方法進行。在某些實施方案中，定向配體的總濃度可從約0.01至約10％mol。定向配體是對目標區域特定組分特異的任何配體。優選的定向配體包括蛋白質如多克隆或單克隆抗體、抗體片斷或嵌合抗體，酶或激素類，或糖類如單-，寡-和多糖(參見Heathetal.，1986)。例如，二唾液酸神經節苷脂GD2是一種腫瘤抗原，它已經鑑別為神經外胚層起源的腫瘤，如成神經細胞瘤，黑色素瘤，小細胞肺癌瘤，膠質瘤和某些肉瘤(Mujooetal.，1986，Schulzetal.，1984)。含有抗二唾液酸神經節苷脂GD2單克隆抗體的脂質體已經被用於輔助將脂質體定向到表達腫瘤抗原的細胞上(Montaldoetal.，1999；Paganetal.，1999)。在另一個非限制性的實施例中，乳腺癌和婦科癌症抗原特異的抗體描述於美國專利5,939,277中，此處引入作為參考。在進一步非限制性的實施例中，前列腺癌特異抗體公開於美國專利6,107,090中，此處引入作為參考。因此，考慮此處描述的或本領域普通技術人員公知的抗體可以用於與本發明組合物和方法結合靶向特異的組織和細胞型。在本發明的某些實施方案中，考慮的定向配體與整聯蛋白，蛋白多糖，糖蛋白，受體和轉運蛋白相互作用。合適的配體包括任何對目標器官細胞特異的物質，或對目標器官的結構特異的物質，該目標器官由於局部病理如腫瘤而暴露於循環。在本發明的某些實施方案中，為了提高細胞的轉導，增加對目標細胞的轉導，或為了限制不需要細胞的轉導，抗體或環狀肽的定向部分(配體)與脂類複合物相連。這種方法是本領域公知的。例如，特異性靶向哺乳動物中樞神經系統細胞的脂質體已被進一步描述(美國專利5,786,214，此處引入作為參考)。脂質體基本由N-戊二醯磷脂醯乙醇胺，膽固醇和油酸組成，其中對神經膠質特異的單克隆抗體與脂質體綴合。一種單克隆抗體或抗體片斷可用於向動物體內的特異性細胞，組織或器官如腦，心臟，肺，肝等的定向傳輸。更進一步，通過受體介導的傳輸和/或含有脂類或脂質體的定向載體，嵌合多肽可以輸送到靶細胞。它們利用，發生在靶細胞上的受體介導的胞吞作用對大分子選擇性的攝取。鑑於各種受體的細胞型特異的分布，這一傳輸方法另外增加了本發明的特異性程度。因此，在本發明的某些方面，選擇相應於特異性表達於目標細胞群受體的配體。細胞特異性的嵌合多肽輸送和/或定向載體可包括與脂質體結合的特定的結合配體。將要傳輸的嵌合多肽包封於脂質體中並且特異的結合配體功能性地結合於脂質體膜上。從而該脂質體特異性地結合到目標細胞的受體上並將內含物傳輸到細胞中。這一系統已顯示其功能，使用其中例如上皮生長因子(EGF)用於將核酸經受體介導傳輸到顯示EGF受體上調的細胞中。在某些實施方案中，受體介導的傳輸和/或定向載體包括細胞受體特異的配體和肽。其它包括細胞受體特異的配體，將要傳輸的肽有效連接到該配體上。例如，一些受體已被用於受體介導的基因轉移(Wu和Wu，1987；Wagneretal.，1990；Peralesetal.，1994；Myers，EPO0273085)，它證實了該技術的可操作性。在另一個實施例中，在另一種哺乳動物細胞類型中的特異性的傳輸已經被公開(Wu和Wu，1993；此處引入作為參考)。在更進一步的實施方案中，特異性的結合配體可以包括一或多種指導細胞特異性結合的脂類或糖蛋白。例如，乳醯神經醯胺，半乳糖末端去唾液酸神經節苷脂，已經結合到脂質體中並觀察到肝細胞對胰島素基因攝取量的增加(Nicolauetal.，1987)。含有末端半乳糖殘基的去唾液酸糖蛋白，去唾液酸胎球蛋白也已被證明了將脂質體靶向肝臟的作用(SpanjerandScherphof，1983；Haraetal.，1996)。當與多肽的主鏈結合時，糖類甘露醯、海藻醯或N-乙醯葡糖胺結合高親和性甘露糖(manose)受體上(美國專利5,432,260，此處整體特別引入作為參考)。本發明的細胞或組織特異性的轉化構建體可以類似的方式被特異地傳輸到目標細胞。在另一個實施例中，乳醯神經醯胺和靶向LDL受體相關蛋白的肽，如載脂蛋白E3(″ApoE″)用於將脂質體靶向肝(SpanjerandScherphof，1983；WO98/0748)。葉酸和葉酸受體用於細胞定向也已被公開(美國專利5,871,727)。在此實施例中，維生素葉酸結合到複合物上。葉酸受體對其配基具有高親和性，並且在一些哺乳動物細胞系中過量表達，包括肺、乳房和腦腫瘤中。抗葉酸，如氨甲蝶呤也可用作定向配體。轉鐵蛋白介導的傳輸系統靶向大範圍的表達轉鐵蛋白受體的複製性細胞(Gillilandetal.，1980)。c.脂質體/核酸組合物在某些實施方案中，脂質體/嵌合多肽可包括核酸，如一種寡核苷酸，多核苷酸或核酸構建體(如一種表達載體)。當在將要轉染真核細胞的DNA構建體中應用細菌啟動子時，在脂質體中包含一種合適的細菌聚合酶是有利的。當脂質體/嵌合多肽組合物考慮為包括細胞或組織特異的核酸時，該技術在本發明中具有適用性。在某些實施方案中，基於脂類的非病毒製劑提供了病毒基因治療的另一方案。儘管許多細胞培養研究已經證明了基於脂類的非病毒基因轉移，但通過基於脂類的製劑的系統性基因傳輸有限制。非病毒的基於脂類的基因傳輸的主要限制是陽離子脂類的毒性，該陽離子脂類包含非病毒傳輸載體。脂質體的體內毒性說明了體外和體內之間基因轉移結果的差異。另一個構成這一對立數據的因素是在和無血清蛋白時脂質體穩定性的差異。脂質體和血清蛋白之間的相互作用對脂質體的穩定性具有驚人的影響(Yang和Huang，1997)。陰離子脂質體吸引並結合帶負電的血清蛋白。包有血清蛋白的脂質體被溶解或被巨噬細胞吸收，使得它們從循環中清除。現有的體內脂質體傳輸方法使用煙霧化，皮下、皮內、腫瘤內或顱內注射，以避免循環中陽離子脂類相關的毒性和穩定性問題。脂質體和血漿蛋白之間的相互作用是造成體外(Felgneretal.，1987)與體內基因轉移效果差異的重要原因(Zhuetal.，1993；Philipetal.，1993；Solodinetal.，1995；Liuetal.，1995；Thierryetal.，1995；Aksentijevichetal.，1996)。d.脂類的施用施於患者的脂類組合物(如，脂質體-嵌合多肽)的實際劑量取決於身體或生理因素，如體重，病情的嚴重性，患者的原發病和給藥的途徑。考慮到這些因素，可以容易的確定適於特定患者和/或治療過程的脂類組合物的劑量。本發明可以通過靜脈那，皮內，動脈內，腹膜內，損傷內，顱內，關節內，前列腺內，胸膜內，氣管內，鼻內，玻璃體內，葉鞘內，直腸內，局部，腫瘤內，肌內，腹膜內，皮下，膜泡內，黏膜，心包內，口服，局部，局部地給藥和/或利用氣霧劑，注射，連續灌注，直接局部灌注浸浴靶細胞或通過導管和/或灌洗。IX.試劑盒本發明的某些實施方案關於診斷和治療試劑盒。肽可以試劑盒的形式利用來確定帶有HPV的患者發展和復發癌前期的或癌的生長的可能性。試劑盒可以確定T細胞淋巴細胞增殖的激發和/或T輔助1細胞因子產量的增加。各種試劑盒的組分可以貯藏於合適的容器中。該容器通常包括至少一個小瓶，試管，燒瓶，瓶子，注射器或其它容器，肽試劑被放置於其內，優選適當地分配。試劑盒也包括第二容器，用來盛放無菌的，藥學可接受的緩衝液或其它溶液。本發明的試劑盒也典型地包括一種緊密盛放小瓶的器具，用於商業銷售，如注射劑或吹模製的塑料容器，其中所需小瓶被保留。試劑盒可含有檢測樣品與抗體之間的相互作用的試劑(檢測試劑)。提供的試劑可被放射性物質，螢光或酶標記。試劑盒可包含一種已知的放射性標記的試劑，能夠與抗體結合或相互作用，該抗體允許檢測和/或測量細胞介導的免疫應答。通常，這些方法包括首先獲得疑似含有這些蛋白質，肽或抗體的樣品，按照本發明的方法將樣品與抗體或肽接觸，根據具體情況，在允許免疫複合物形成的有效條件下，檢測免疫複合物的形成。在一些實施方案中，在一個合適的容器中包括一或多種E6和/或E7肽。樣品可與該肽接觸或溫育，然後檢測該樣品針對該肽的細胞介導的免疫應答。這樣，在一些實施方案中，試劑盒中含有一種非反應性結構，在一些實施方案中，該非反應性結構可以是塑料或一些其它的合成材料。非反應性結構可以是一種盛樣品的容器，如帶有小孔的容器。作為本發明的一部分，也包括帶有多孔的容器。在一些情況下，該結構被劃線或附有膜。一個用膜劃線分割的小孔可用於溫育E6或E7肽，然後用同樣的容器檢測細胞介導的免疫應答。這一過程可通過利用檢測細胞介導的免疫應答的抗體來進行。該抗體包括抗TH1或TH2細胞因子，細胞因子受體或任何其它T細胞上指示細胞介導的免疫應答的受體的抗體。檢測試劑也包括在試劑盒中。試劑盒的試劑可以液體溶液，附著於固相支持物的或乾粉的形式被供給。當試劑以液體溶液形式被供給時，該液體溶液是水溶液。優選地，當試劑被附著到固相支持物上被供給時，固相支持物可以是層析介質，多孔檢測板，或載玻片。當被供給的試劑是一種乾粉時，粉末通過添加合適溶劑重構的方式供給。通常，對免疫複合物形成的檢測是本領域公知的並可通過使用許多方法獲得。例如，本發明考慮使用ELISA，RIA，免疫印跡(如斑點印跡)，ELISPOT，間接免疫螢光技術以及類似方法。通常免疫複合物的形成通過使用標記物來檢測，如放射性標記或酶標記(如鹼性磷酸酶，辣根過氧化物酶，或其類似物)。當然，我們發現使用第二結合配體，如第二抗體或生物素/親和素配體的結合配置時具有附加的優點，正如本領域公知的。為了達到檢測目的，事實上可以使用任何疑似含有能發生細胞介導的免疫應答的樣品，視情況而定。樣品可包括細胞，細胞上清液，細胞懸浮液，細胞提取物，酶級分，蛋白提取物，或其它疑似含有能產生細胞介導的免疫應答的細胞的非細胞組合物。一般而言，符合本發明的試劑盒包括至少一種E6或E7肽和抗與細胞介導的免疫相關的蛋白質組合物的抗體，以及免疫檢測試劑和容納抗體，肽，和試劑的容器。免疫檢測試劑典型地包括與抗體或抗原，或與第二結合配體相連的標記物。示例的配體可包括與標記物相連的抗第一抗體或抗原或生物素或親和素(或鏈黴抗生物素蛋白)配體的第二抗體。當然，如上文提到的，許多典型的標記物是本領域公知的並且所有這些標記物都可在本發明的相關之處應用。容器中通常包括其中可以放置抗體、抗原或檢測試劑的小瓶，優選容器被適當地等分。本發明的試劑盒也典型地包括用來緊密容納抗體、抗原、和試劑的容器的器具，用於商業銷售。容器可包括注射劑或吹模製的塑料容器，所需小瓶被保留在裡面。在一個實施方案中，診斷試劑盒包括探針和引物，用於核酸的檢測方法。在生物樣品中檢測肽標記物必需的所有材料和試劑都一起裝配到試劑盒中。這通常包含為特定標記物預選的引物。也包括適合擴增核酸的酶，這些酶包括各種聚合酶(RT，Taq，etc.)，以及脫氧核苷酸和緩衝液，以提供擴增所必需的反應混合物。這樣的試劑盒通常以適當的方式在不同容器中包含各種單獨的試劑和酶，以及針對各種標記物的引物對。優選的擴增核苷酸的引物被選擇用來擴增SEQIDNO1-19或其互補序列中的特定序列。在另一個實施方案中，這種試劑盒包含特異性於與SEQIDNO1-19描述的序列或其互補序列相應的雜交探針。以適當的方式，這種試劑盒通常在不同容器中包含各種單獨的試劑和酶，以及雜交探針。在其它的實施方案中，本發明涉及用於上述免疫檢測方法的免疫檢測試劑盒。由於所述肽通常是蛋白質、多肽或肽，因此該肽優選包括在試劑盒中。免疫檢測試劑盒因此在適當的容器中包括該肽，和任選的免疫檢測試劑。試劑盒的免疫檢測試劑可以有一或多種形式，包括那些與給出的抗體相聯繫或連接的可檢測的標記物。與第二結合配體相聯繫或結合的可檢測的標記物也被考慮。典型的第二配體是與第一抗體有結合親和力的第二抗體。試劑盒可進一步包括被合適等分的野生型或突變體蛋白、多肽或肽組合物，標記的或非標記的，用於繪製檢測分析的標準曲線。試劑盒也包含抗體標記綴合物，以完全綴合形式、以中間物形式，或作為單獨部分由試劑盒使用者綴合的形式。試劑盒的成分可以包裝於水介質中或為凍幹形式。本發明的治療試劑盒是包含肽序列SEQIDNO1-19肽的試劑盒。上述試劑盒通常在適當的容器中含有藥學可接受的多肽、肽、生物功能等效物、免疫片斷、功能區、抑制因子、抗體、基因、多核苷酸，核酸或補體的製劑或以藥學可接受的形式表達上述任何物質的載體。試劑盒可以只有一個容器，或者每種化合物可具有不同的容器。當試劑盒的組分在一或多種液體溶液中供給時，該液體溶液是水溶液，尤其優選無菌水溶液。肽組分也可以被製成可注射組和物的形式。在這種情況下，容器本身可以是注射器，移液管，或其它類似的儀器，製劑可以從中應用到身體的感染部位，注射到動物體內，或甚至應用於試劑盒的其它組分中並與之混合。然而，試劑盒的成分還可以乾粉的形式供給。當以乾粉提供試劑或成分時，粉末通過添加適當的溶劑被重構。預想該溶劑可以在另一個容器中供給。試劑盒的容器通常包括至少一個小瓶，試管，燒瓶，瓶子，注射器或其它容器，其中可放置抗體，且優選適當地等分。當多肽或肽，或第二或第三結合配體或附加組分被供給時，試劑盒也通常包括第二，第三或其它附加容器，其中可以放置這種配體或組分。本發明的試劑盒也典型地包括一種器具，用來緊密容納抗體，抗原和任何其它試劑的容器，用於商業銷售。容器可以包括注射劑或吹模製的塑料容器，所需小瓶被保留在其中。不管容器的數量或類型，本發明的試劑盒也可包含或被包裝有儀器來輔助注射/給藥或在體內放置最終的肽。這種儀器可以是注射器，移液管，鑷子，或任何醫學上允許的輸送工具。實施例以下包括的實例顯示了本發明的優選實施方案。本領域技術人員應該了解，由發明者揭示的公開於實施例的技術在實踐本發明時功能很好，該技術是代表技術，因而被認為它構成了實踐的優選方式。然而，本領域技術人員應根據本發明的公開內容了解到，在公開的特定實施方案中，可以做出一些改變，並仍能獲得類似或同樣的結果，而不脫離本發明的精神和範圍。實施例1材料和方法患者本發明的實施方案中包含一組被研究群體，她們選自在德克薩斯州大學M.D.安德森癌症中心的陰道鏡檢查診所受診的患者。徵得病人的同意，根據研究院內倫理委員會批准的協議，實施所有規程。這些婦女年齡為17歲或更大，且沒有懷孕，沒有免疫病史。該研究鑑定了四組婦女。第1組由六個無CIN細胞學或組織學診斷並且具有HPV陰性試驗的婦女組成(CIN(-)/HPV(-))。第2組包括31個帶有CIN組織學診斷並且HPV陽性試驗(CIN(+)/HPV(+))的婦女。第3和4組選自在研究之前在陰道鏡檢查診所經過CIN燒蝕或切除治療至少6個月的婦女。第3和4組的婦女在CIN治療之前是(CIN(+)/HPV(+))。然而，在登記時，也就是CIN治療後最少6個月之後，這些婦女僅被評估病情。第3組由22個沒有復發CIN跡象的婦女組成(Recur(-))，第4組包括10個組織學診斷復發CIN的婦女(Recur(+))。HPV陽性利用Virapap/Viratype檢測確定的(TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)。在這一程序中，對HPV的RNA的斑點印跡雜交是利用來自宮頸擦拭籤的脫落的宮頸上皮細胞完成的。檢測方法包括使用32P標記DNA探針組，它鑑定HPV型號6/11，16/18，和31/33/35。根據廠商的說明書分離並處理細胞。在研究時，這種檢測被用作陰道鏡檢查時的標準護理步驟的部分。HPV陽性通過PCR進一步被確定，該PCR使用從如先前所述的石蠟包被的組織活檢中提取的DNA(Ting等，1990；Schiffman等，1991)。用於PCR分析的一致引物來自乳頭瘤病毒的LI開放可讀框(MY11，GCMCAGGGWCATAAYAATGG(SEQIDNO23)和MY09，CGTCCMARRGGAWACTGATC(SEQIDNO24)；其中M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，Y＝C+T)。HPV-16陽性利用特異寡核苷酸探針CATACACCTCCAGCACCTAA(SEQIDNO25)證實。研究的受檢者的臨床性狀，包括HPV狀態列於表2。研究受檢者的性狀性狀總計第1組第2組第3組第4組患者數量696312210平均年齡3131313227年齡範圍17-5417-4321-5018-5420-39人種白色人種52(75.4％)3(50％)26(83.9％)15(68.2％)8(80％)西班牙人8(12.6％)3(50％)1(3.2％)4(18.2％)0(0％)非洲-美州人8(12.6％)0(0％)33(9.7％)3(13.6％)0(0％)亞洲人1(1.4％)0(0％)1(3.2％)0(0％)0(0％)HPV狀態陰性6(8.7％)6(100％)0(0％)0(0％)0(0％)陽性63(91.3％)0(0％)31(100％)22(100％)10(100％)HPV-1657(90.5％)0(0％)31(100％)17(77.3％)9(90％)其它HPV類型6(9.5％)0(0％)0(0％)5(22.7％)1(10％)最初診斷結果*陰性6(8.7％)6(100％)0(0％)0(0％)0(0％)CIN14(5.8％)0(0％)0(0％)4(18.2％)0(0％)CIN2359(85.5％)0(0％)31(100％)18(81.8％)10(100％)*注第3組中，在招來研究時對CIN診斷是陰性，而第4組中，對於CIN2/3的診斷為陽性。肽基於相關現有文獻中描述的已知的T細胞表位的兩性結構和信息選擇相應於HPV-16的E6和E7癌蛋白的肽序列。表3列出了用於本發明研究的肽。所有的肽的製備如早期報導的(Sarkar等，1995)用Merrifield固相方法(Merrifield，1963)或者在改良的Vega250自動肽合成機上合成(VegaBiochemicals，Tucson，AZ)或利用Houghten，1985描述的「袋」方法合成。在大多數實驗中，使用的肽的純度近似為70-80％，在一些實驗中，使用顯示純度＞95％的肽，也具有同樣的結果。除了E6和E7肽之外，我們使用了來自c-mos原癌基因的肽[胺基酸158-170，STRTPEDSNSLGT(SEQIDNO22)]作為陰性對照。肽的貯存液在PBS(pH7.0)中製備並過濾滅菌。T細胞增殖分析通過靜脈穿刺從研究的參與者中收集肝素化的血，在Ficoll-Hypaque密度梯度下離心分離PBMC(Histopaque-1073；SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)。用PHA，c-mou肽，或個別的E6和E7肽刺激以後，不同個體中的PBMC增殖反應用先前描述的[3H]胸腺嘧啶摻入分析來確定(Nehete等，1996)(表4)。簡要地，各樣品在96孔微量滴定板上接種三份，並於37℃在潮溼的含5％CO2的空氣中培養7天。在最後的16-18小時，加入1μCi的3[H]胸腺嘧啶(6.7Ci/mmol；ICNBiomedicals，Inc.，CostaMesa，CA)。在過濾條上收集細胞以估計3[H]胸腺嘧啶的摻入。經各種添加劑處理的細胞的特異放射性在所有情況下通過減去僅在培養基中培養的細胞的每分鐘的計數(cpm)值來計算。預實驗的數據顯示，在5ug/ml，各種肽產生一致的增殖水平。針對個別E6和E7肽的T細胞增殖反應的顯著性(根據刺激指數[SI])，可以計算為暴露於肽的細胞超過未加入肽的對照組細胞的3[H]胸腺嘧啶摻入的增加倍數。當SI值＞3.0時，被認為是陽性反應，它可用於所有的統計學分析以確定增殖反應的顯著性與疾病解除或疾病復發狀況的關係。在所有的實驗中，三份樣品的數據相當，其標準誤差＜10％。在已測試的四個研究組中，沒有婦女顯示出特異於對照c-mos肽的增殖反應(SI＜2.0)。表3來自HPV-16的E6和E7肽的胺基酸序列aa，胺基酸細胞因子分析在該檢測中使用冷藏的PBMC。PBMC(1×105)與各種HPV肽在RPMI-1640培養基(含有10％的胎牛血清)中，於37℃在96孔圓底板的三個等同的孔中培養48小時。離心後，上清液(100ul)從各孔中取出，並於-70℃冷凍貯存在另一塊96孔板中。然後解凍該板，並按照廠商的說明，用細胞篩選免疫分析試劑盒(BiosourceInternational，Camarillo，CA)檢測上清液的各種細胞因子(IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10和IL-12)。統計分析利用PearsonX2和Fisher精確試驗(exacttest)評估患者組之間的SI值的差別。為了統計分析，顯著的增殖反應被定義為SI≥3.0。統計顯著性被設置在p＜0.05。實施例2年齡範圍從17至54歲(平均31歲)的一共69個婦女參與該研究。在這些69個婦女中，52個白種人，非洲裔美國人和西班牙人各8人，1個亞洲人(表2)。分析來自這些婦女的PBMC針對合成的肽的增殖反應，這些肽相應於HPV-16癌蛋白E6和E7的抗原序列(表3)(圖1A)。在不同的四組患者中，對各種E6和E7肽特異的增殖反應的分析顯示第3組的大多數患者(Recur(-))對所有測試的七種E6肽和7/8的E7肽顯示陽性反應(SI≥3.0)(圖1A)。另一方面，在第2組(CIN(+)/HPV(+))中僅5/31的未治療患者顯示了對任何測試的肽的反應，第1組(CIN(-)/HPV(-))和第4組(Recur(+))中對任何測試的肽沒有反應。圖1B概括了上述內容。在第3和4組的婦女中，對E6和/或E7肽的增殖反應與治療後疾病狀況之間的關係顯示於表4。儘管第4組(Recur(-))的患者沒有顯示出對任何試驗的E6或E7肽的反應，但在第3組中，有64％的患者對於E6肽(p＝0.001)具有顯著的增殖反應，82％對E7肽(p＜0.001)，和86％對E6或E7肽(p＜0.001)中的至少一種顯示明顯的增殖反應。第3組和第4組對普通的促細胞分裂原如PHA(p＝0.912，未顯示數據)的增殖反應沒有區別，這表明這些患者的先天免疫狀況並沒有損傷。這些結論強烈表明針對來自HPV-16的E6和E7癌蛋白的合成肽的增殖反應與CIN治療後的無疾病情況有關。發明者確定了針對兩種分別來自E6((Q15L和V10C)和E7(Q19D和R9F)肽的高水平增殖反應。據SI值，典型的增殖反應示於圖2，它們分別來自第3和4組的2個患者對HPV-16的E6癌蛋白的7個合成肽和E7癌蛋白的8個合成肽的增殖反應。針對這四個肽的增殖反應的比較顯示了第3組和第4組的婦女之間統計學上的明顯差異(表5)。雖然在第4組中沒有觀察到對這些肽的增殖反應，但在第3組中總計11個婦女對肽Q15L(p＝0.006)顯示出反應，10人對肽VIOC(p＝0.006)，13人對肽Q19D(p＝0.002)，和10人對肽R9F(p＝0.013)有反應。如表3所示，在E6肽V10C中10個胺基酸中有9個與Q15L肽的重疊。同樣地，E7肽R9F的9個胺基酸與Q19D肽的胺基酸重疊。對這四種肽特異的增殖反應一起包括了在第3組(Recur(-))中觀察到的所有反應(19/22的婦女)。這些結果表明，對於HPV特異的細胞免疫反應，分別在HPV-16癌蛋白E6和E7中的Q15L和Q19D肽可能是免疫決定區域。在被研究群體的分樣品中，發明者也測試這些肽是否也誘導各種TH1和TH2細胞因子的生產。來自第三組(Recur(-))的8位婦女和第四組(Recur(+))6位婦女的冷藏的PBMC在體外用肽Q15L和Q19D刺激。培養物上清液中各種TH1細胞因子(IL-2，IL-12，和IFN-□)，和TH2細胞因子(IL-4和IL-10)的數量在相對未刺激培養物矯正以後，示於圖3。第三組(Recur(-))中8位中的7位(87.5％)，和8位中的5位(62.5％)婦女的PBMC顯示IFN-□和IL-2的生產，分別響應於Q15L和Q19D兩者(表6)。另外，在這一組8位婦女的3位中觀察到響應於Q15L的IL-12的產生，而Q19D介導的IL-12生產在8位婦女的6位中明顯。另一方面，這一組婦女的PBMC不響應於用肽Q15L或Q19D刺激而分泌IL-4，而只有3個婦女顯示出響應於上述任一肽的IL-10的生產。與第三組(Recur(-))的婦女相反，第四組(Recur(+))的婦女突出顯示IL-10的生產(5/6由於Q15L，6/6由於Q19D)。當用兩種試驗肽中任一刺激PBMC時，觀察到這組的6位婦女中的1位顯示IL-4的生產(表6)。總的來說，這些結果顯示，第三組(Recur(-))中的患者主要顯示出TH1細胞因子生產(IL-2，IFN-γ和IL-12)，而第四組(Recur(+))中的婦女儘管不顯示直接針對HPV肽的特定增殖反應，但卻顯示一種TH2細胞因子，IL-10的生產。表4針對HPV-16癌蛋白E6和/或E7的所有合成肽的增殖反應與CIN治療後的病情之間的相關性增殖反應第3組(無疾病)第4組(復發)顯著性E6肽是a14(64％)0否b8(36％)10(100％)p＝0.001E7肽是a18(82％)0否b4(18％)10(100％)p＜0.001任何E6或E7肽是a19(86％)0否b3(14％)10(100％)p＜0.001aSI≥3.0bSI＜3.0表5對HPV-16癌蛋白E6和/或E7的特定的合成肽的增殖反應與CIN治療後的病情之間的相關性增殖反應第3組第4組顯著性(無疾病)(n＝22)(復發)(n＝10)E6肽Q15L是a11(50％)0否b11(50％)10(100％)P＝0.006V10C是a11(50％)0否b11(50％)10(100％)P＝0.006E7肽Q19D是a13(59％)0否b9(41％)10(100％)P＝0.002R9F是a10(46％)0否b12(54％)10(100％)P＝0.013aSI≥3.0bSI＜3.0表6響應於HPV-16a的E6和E7癌蛋白合成肽刺激的第3和4組患者PBMC細胞因子生產細胞因子b第3組(n＝8)第4組(n＝6)Q15LcQ19DdQ15LQ19DIFN-γ7/87/80/60/6IL-25/85/80/60/6IL-123/86/80/60/6IL-40/80/81/61/6IL-103/83/85/66/6a陽性患者數量/測試人數b細胞因子生產的陽性是基於用於每個細胞因子的檢測試劑盒的靈敏度的值，按照濃度pg/mlIL-2＝8.7，IFN-y＝4.0，IL-12＝1.0，IL-4＝2.0，和IL-10＝5.0。c來自HPV-16中E6癌蛋白的Q15L肽d來自HPV-16中E7癌蛋白的Q19D肽根據本發明的公開，不需要過多的實驗就可以製成和實施此處公開和要求保護的所有組合物和方法。雖然根據優選方式已經描述了本發明的組合物和方法，但是對於本領域技術人員很顯然，可以改變所述組合物和方法和方法的步驟和步驟的順序，而不脫離本發明的概念、精神和範圍。更具體地，某些化學上和物理上相關的試劑明顯地可替代本發明在此所述的試劑，並且可獲得相同或相似的結果。本領域技術人員將明顯了解所有這些類似的取代和改變都包含於本發明的精神、範圍和概念內，作為附加的權利被限定。參考文獻下列參考文獻特別引入本文作為參考。U.S.Patent3,817,837U.S.Patent3,850,752U.S.Patent3,939,350U.S.Patent3,996,345U.S.Patent4,162,282U.S.Patent4,275,149U.S.Patent4,277,437U.S.Patent4,310,505U.S.Patent4,533,254U.S.Patent4,683,195U.S.Patent4,683,202U.S.Patent4,728,575U.S.Patent4,728,578U.S.Patent4,737,323U.S.Patent4,797,368U.S.Patent4,800,159U.S.Patent4,883,750U.S.Patent4,921,706U.S.Patent5,028,592U.S.Patent5,139,941U.S.Patent5,279,721U.S.Patent5,432,260U.S.Patent5,786,214U.S.Patent5,840,317U.S.Patent5,840,873U.S.Patent5,843,640U.S.Patent5,843,651U.S.Patent5,843,663U.S.Patent5,846,708U.S.Patent5,846,717U.S.Patent5,846,726U.S.Patent5,846,729U.S.Patent5,849,481U.S.Patent5,849,486U.S.Patent5,849,487U.S.Patent5,851,772U.S.Patent5,853,990U.S.Patent5,853,992U.S.Patent5,853,993U.S.Patent5,856,092U.S.Patent5,861,244U.S.Patent5,863,732U.S.Patent5,863,753U.S.Patent5,866,331U.S.Patent5,871,727U.S.Patent5,879,703U.S.Patent5,882,654U.S.Patent5,900,481U.S.Patent5,905,024U.S.Patent5,910,407U.S.Patent5,912,124U.S.Patent5,912,145U.S.Patent5,919,626U.S.Patent5,919,630U.S.Patent5,925,517U.S.Patent5,928,862U.S.Patent5,928,869U.S.Patent5,929,227U.S.Patent5,932,413U.S.Patent5,935,791U.S.Patent5,939,277U.S.Patent6,107,090U.S.Patent6,135,965U.S.Patent6,214,874U.S.Patent6,238,659U.S.Patent6,245,568U.S.Patent6,258,576EPANo.320,308EPANo.329,822EPO0273085GBApplicationNo.2202328GBApplicationNo.2193095APCTApplicationNo.PCT/US85/01161PCTApplicationNo.PCT/US87/00880PCTApplicationNo.PCT/US89/01025PCTApplicationNo.PCT/US89/05040；PCTApplicationWO88/10315PCTApplicationWO89/06700WO90/07641WO98/0748WO99/18933Abbondanzo，etal.，AmJClinPathol.，93(5)698-702，1990.Abe，etal.，NeurosciRes.，38(4)325-9，2000.Aichele，etal.，JExpMed.，171(5)1815-20，1990.Aksentijevichetal.，HumGeneTher.，7(9)1111-22，1996.Allred，etal.，ArchSurg.1990Jan；125(1)107-13.Review.Altmanetal.，Science，27494-96，1996.Baichwaletal.，「VectorsforgenetransferderivedfromanimalDNAvirusesTransientandstableexpressionoftransferredgenes，」InGeneTransfer，Kucherlapati，R.，ed.，Bajorin，etal.，JClinOncol.，6(5)786-92，1988.Bangham，etal.，JMol.Biol.，13238-252，1965.Barany，etal.，「Solid-PbasePeptideSynthesis，」InThePeptidesAtalysis，Synthesis，Biology，GrossandMeinhofer，eds.，AcademicPress、NewYork，pp.3-284，1980.Bevan，etal.，Nature，342(6249)478-9，1989.Birner，etal.，ModPathol.，14(7)702-9，2001.Boussifetal.，Proc.Nat』lAcad.Sci.USA，927297-7301，1995.Brinton，etal.，InN.Munoz，F.X.Bosch，K.V.Shah，andA.Meheus(eds.)，TheEpidemiologyofCervicalCancerandHumanPapillomavirus(IARCScientificPublications，119)，pp.3-23.LyonOxfordUniversityPress，1992.Brown，etal.，AmJVetRes.，51(9)1476-80，1990.Cantieldetal.，MethodsinEnzymology，189，418-422，1990.Capaldi，etal.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，74(2)425-433，1977.Casement，etal.，Virology，211(1)261-7，1995Cason，etal.，Int.J.Cancer，50349-355，1992.Changetal.，Hepatology，14134A，1991.Chen，etal.，Mol.CellBiol.，72745-2752，1987.Cheng，etal.，InvestigativeRadiology，vol.22，pp.47-55(1987).Clarketal.，HumanGeneTherapy，61329-1341.1995Clave，etal.，Diagn.Mol.Pathol.，9(3)145-150，2000.Clerici，etal.，J.Natl.CancerInst.，89245-250，1997.Coffin，InVirology，Fieldsetal.，eds.，RavenPress，NewYork，pp.1437-1500，1990.Couparetal.，Gene，681-10，1988.Crowe，etal.，AIDSResHumRetroviruses，3(2)135-45，1987.daCosta，etal.，Biocell，23(1)65-72，1999.DeGruijil，etal.，J.Gen.Virol.77，2183-2191，1996.DeJager，etal.，SeminNuclMed.1993Apr，23(2)165-79.Review.Deamer，etal.，inLiposomes(M.Ostro，ed.)，MarcelDekker，Inc.，NewYork(1983)，pp.27-52.Deres，etal，Nature.1989Nov30；342(6249)561-4.Doolittle，etal.，MethodsMolBiol.1999；109215-37.ReviewelGorab，etal.，BiochimBiophysActa，306(1)58-66，1973.Fechheimeretal，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，848463-8467，1987.Felgneretal.，ProcNatlAcadSciUSA.，84(21)7413-7，1987.Feltkamp，etal.，Eur.J.Immunol，232242-2249，1993.Fendleetal.，CatalysisinMicellarandMacromolecularSystems，AcademicPress，NewYork，1975.Flotteetal.，GeneTherapy，229-37，1995.Flotte，etal.，Am.J.RespirCellMol.Biol.，7349-356，1992.Fraleyetal.，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，763348-3352，1979.Fraley，etal.，TrendsBiochem.Sci，677，1981Friedmann，Science，2441275-1281，1989.Frohman，PCRProtocolsAGuideToMethodsandApplications，AcademicPress，NewYork，1990.Fujishima，etal.，Cytometry.，24(4)382-9，1996.Gabizonetal.，CancerRes.，50(19)6371-8，1990.Ghosh，etal.，InWuG.WuCed.，Liverdiseases，targeteddiagnosisandtherapyusingspecificreceptorsandligands，NewYorkMarelDekker，pp.87-104，1991.Gillilandetal.，CancerRes.，40(10)3564-9，1980.Gloeckner，etal.，J.Immunol.Methods，252(1-2)131-8，2001.Gopal，Mol.CellBiol.，51188-1190，1985.Grahametal.，J.Gen.Virol.，3659-72，1977.Graham，etal.，Virology，52456-467，1973.Gregoriadis，etal.，BiochemBiophysResCommun.，89(4)1287-1293，1979.Gregoriadis，G.，ed.，LiposomeTechnology，vol.I，pp.30-35，51-65and79-107，CRCPressInc.，BocaRaton，FL，1984.Grunhaus，etal.，SeminarinVirology，3237-252，1992.Gulbis，etal.，HumPathol.1993Dec；24(12)1271-85.Review.Hamsikova，etal.，J.Infect.Dis.，1701424-1431，1994Haraetal.，BiochimBiophysActa.，1278(1)51-8，1996Harland，etal.，J.CellBiol.，1011094-1099，1985.Heath，etal.，Chem.Phys.Lipids，40347，1986.Hermonat，etal.，Proc.Nat』lAcadSci.USA，816466-6470，1984.Hopeetal.，BiochimicaetBiophysicaActa，81255-65，1985.Horwichetal.J.Virol.，64642-650，1990.Irie，etal，Lancet，1(8641)786-7，1989.Irie，etal.，ProcNatlAcadSciUSA，83(22)8694-8，1986.Jha，etal.，Lancet，3411116-1118，1993.Kadish，etal.，J.Natl.Cancer.Inst.891285-1293，1997.Kaplittetal.，NatureGenetics，8148-154，1994Kast，etal.，ImmunolLett.，30(2)229-32，1991.Kast，etal.，J.Immunotherapy，14115-120，1993.Kotinetal.，Proc.Nat』lAcad.Sci.USA，872211-2215，1990.Koutsky，etal.，NEnglJMed.327(18)1272-8，1992Kurman，etal.，JAMA，2711866-1869，1994.Kurman，etal.，TheBethesdasystemforreportingcervical/vaginalcytologicdiagnoses.Definitions，criteriaandexplanatorynotesforterminologyandspecimenadequacy.NewYorkSpringer-Verlag.pp，30-43，1994.Kwack，etal.，MolCells，10(5)575-8，2000.LaFaceetal，Viology，162483-486，1988.Laughlinetal.，J.Virol.，60515-524，1986.Lebkowski，etal.，Mol.Cell.Biol.，83988-3996，1988.Liuetal.，BiochimBiophysActa，1240(2)277-84，1995.Lorenzatoetal.，J.Pathol.，194(2)171-6，2001.Lorincz，etal.，Obstet.Gynecol.，79328-337，1992.Lukacher，etal.，JExpMed.，160(3)814-26，1984.Luoetal.，Blood，82suppl.1303A，1994.Manning，etal.，Biotechniques，6682，1988.Martinetal.，Nature，345(6277)739-743，1990.Mayeretal.，BiochimicaetBiophysicaActa，vol.858，pp.161-168，1986.Mayhewetal.，BiochimicaetBiophysicaActa，vol.775，pp.169-174，1984.Mayhewetal.，MethodsinEnzymology，vol.149，pp.64-77，1987.McCartyetal.，J.Virol.，652936-2945，1991.McLaughlinetal.，J.Virol.，621963-1973，1988.Mitchell，etal.，AnnNYAcadSci.，690153-66，1993.Mitchell，etal.，JClinOncol.，8(5)856-69，1990.Morrison，etal.，IntJCancer.49(1)6-13，1991Morton，etal.，AnnSurg.，216(4)463-82，1992.Morton，etal.，CACancerJClin.，46(4)225-44，1996.Munger，etal.，J.Virol.，634417-4421，1989.Munoz，etal.，Int.J.Cancer，52743-749，1992.Muzyczka，N.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，15897-129，1992.Nakagawa，etal.，Clin.Diag.Lab.Immunol.，3205-210，1996.Nakagawa，etal.，J.Infect.Dis.，175927-931，1997.Neheteetal.，J.Clin.Immunol.，16115-124，1996.Nehete，etal.，CellImmunol.，160(2)217-23，1995.Nicolas，etal.，InVectorsAsurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，RodriguezandDenhardt，eds.，Butterwortb，Stoneham，England，pp.494-513，1988.Nicolauetal.，Biochim.Biophys.Acta，721185-190，1982.Ohietal.，Gene，89279-282，1990.Park，etal.，Asia-OceaniaJ.Obstet.Gynaecol.，18171-175，1992.Parkin，etal.，Int.J.Cancer，84827-841，1999.Paskindetal.，Virology，67242-248，1975.PlenumPress，NewYork，pp.117-148，1986.Poijak，etal.，J.Clin.Microbiol.37796-797，1999.Potteretal.，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，817161-7165，1984.Ravindranath，etal.，IntRevImrmunol，7(4)303-29，1991.Ridgeway，InVectorsAsurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses.，RodriguezR.L.，DenhardtD.T.，eds.，Butterworth，Stoneham，England，pp.467-492，1988.Rippeetal.，Mol.CellBiol.，10689-695，1990.Rosenberg，etal.，NEnglJMed.，319(25)1676-80，1988.Rossen，etal.，JImmunol.，135(5)3289-97，1985.Rouxetal.，Proc.Nat』lAcad.Sci.USA，869079-9083，1989.Sambrook，etal.，，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpring，Harbor，N.Y.，1989.Samulskietal.，EMBOJ.，103941-3950，1991.Samulskietal.，J.Virol.，633822-3828，1989.Sarkar，etal.，ViralImmunol.，8165-174，1995.Sastry，etal.，Vaccine.，12(14)1281-7，1994.Sastry，etal.，Virology，188502-509，1992.Seedorf，etal.，EMBOJ.，6139-144，1987.Shelling，etal.，GeneTherapy，1165-169，1994.Shepherd，etal.，J.Gen.Virol.，731269-1274，1992.Shinodaetal.，ColloidalSurfactant，AcademicPress，especially″TheFormationofMicelles″，Ch.1，1-96，1963.Solodinetal.，Biochemistry，34(41)13537-44，1995.Spanjeretal.，BiochimBiophysActa，734(1)40-7，1983.Stauss，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，897871-7875，1992.Strang，etal.，J.Gen.Virol.，71423-431，1990.Stratford-Perricaudet，etal.，InHumanGeneTransfer，O.Cohen-HaguenauerandM.Boiron，eds.，JohnLibbeyEurotext，France，p.51-61，1991.Szoka，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，754194-4198，1978.Tam，etal.，J.Am.Chem.Soc.，1056442，1983.Templetonetal.，Nat.Biotechnol.，15(7)647-52，1997.Thierryetal.，ProcNatlAcadSciUSA.，92(21)9742-6，1995.Tindle，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885887-5891，1991.Tobery，etal.，J.Immunol.Methods，254(1-2)59-66，2001.Tooze，J.，ed.，MolecularBiologyofDNATumorViruses，2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork，1991.Townsend，etal.，Cell，44949-968，1986.Tratschinetal.，Mol.Cell.Biol.，42072-2081，1984.Tratschinetal.，Mol.Cell.Biol.，532581-3260，1985.Tsukui，etal.，CancerRes.，563967-3974，1996.Tur-Kaspaetal.，Mol.CellBiol.，6716-718，1986.Unanue，etal.，FASEBJ.，132496-502，1989.VonKnebelDoeberitz，etal.，CancerRes.，483780-3786，1988.Wagneretal.，Mol.Cell40281-286，1999.Wallace，etal.，Nucl.AcidRes.，9879，1981Walshetal.，Proc.Nat』lAcad.Sci.USA，897257-7261，1994.Weietal.，GeneTherapy，1261-268，1994.Wettstein，etal.，InH.Pfister(ed.)，PapillomavirusesandHumanCancer，pp.145.FloridaCRCPress，1990.Wu，etal.，Biochemistry，27887-892，1988.Wu，etal.，J.Biol.Chem.，2624429-4432，1987.Yangetal.，J.Virol.，684847-4856，1994.Yoderetal.，Blood，82suppl.1347A，1994.Zhouetal.，Exp.Hematol.(NY)，21928-933，1993.Zhouetal.，J.Exp.Med.，1791867-1875，1994.Zhuetal，ChinJBiotechnol，9(4)257-61，1993.ZurHausen，etal.，Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.，186131-156，1994.序列表110SASTRY，K.JAGANNADHATORTOLERO-LUNA，GUILLERMOFOLLEN，MICHELE120涉及HPV相關的癌前期的癌的生長(包括CIN)的方法和組合物130UTFC560CN140PCT/US02/231981412002-07-1315060/306,8091512001-07-2016027170PatentInVer.2.121012119212PRT213人乳頭瘤病毒4001LysLeuProGlnLeuCysThrGluLeu15210221110212PRT213人乳頭瘤病毒4002GluLeuGlnThrThrIleHisAspIleIle1510210321110212PRT213人乳頭瘤病毒4003CysValTyrCysLysGlnGlnLeuLeuArg1510210421115212PRT213人乳頭瘤病毒4004GlnLeuLeuArgArgGluValTyrAspPheAlaPheArgAspLeu151015210521110212PRT213人乳頭瘤病毒4005ValTyrAspPheAlaPheArgAspLeuCys151021062119212PRT213人乳頭瘤病毒4006ProTyrAlaValCysAspLysCysLeu15210721110212PRT213人乳頭瘤病毒4007ProLeuCysAspLeuLeuIleArgCysIle1510210821120212PRT213人乳頭瘤病毒4008GlnGlnTyrAsnLysProLeuCysAspLeuLeuIleArgCysIleAsn151015CysGlnLysPro20210921116212PRT213人乳頭瘤病毒4009ArgTrpThrGlyArgCysMetSerCysCysArgSerSerArgThrArg1510152101021110212PRT213人乳頭瘤病毒40010GlyArgCysMetSerCysCysArgSerSer15102101121110212PRT213人乳頭瘤病毒40011ThrLeuHisGluTyrMetLeuGluLeuGln1510210122119212PRT213人乳頭瘤病毒40012MetLeuAspLeuGlnProGluThrThr15210132119212PRT213人乳頭瘤病毒40013AspLeuGlnProGluThrThrAspLeu152101421119212PRT213人乳頭瘤病毒40014GlnAlaGluProAspArgAlaHisTyrAsnIleValThrPheCysCys151015LysCysAsp210152119212PRT213人乳頭瘤病毒40015ArgAlaHisTyrAsnIleValThrPhe15210162119212PRT213人乳頭瘤病毒40016ArgLeuCysValGlnSerThrHisVal15210172119212PRT213人乳頭瘤病毒40017LeuLeuMetGlyThrLeuGlyIleVal152101821110212PRT213人乳頭瘤病毒40018GlyThrLeuGlyIleValCysProIleCys15102101921120212PRT213人乳頭瘤病毒40019AspIleArgThrLeuGluAspLeuLeuMetGlyThrLeuGlyIleVal151015CysProIleCys2021020211151212PRT213人乳頭瘤病毒40020MetPheGlnAspProGlnGluArgProArgLysLeuProGlnLeuCys151015ThrGluLeuGlnThrThrIleHisAspIleIleLeuGluCysValTyr202530CysLysGlnGlnLeuLeuArgArgGluValTyrAspPheAlaPheArg354045AspLeuCysIleValTyrArgAspGlyAsnProTyrAlaValCysAsp505560LysCysLeuLysPheTyrSerLysIleSerGluTyrArgHisTyrCys65707580TyrSerValTyrGlyThrThrLeuGluGlnGlnTyrAsnLysProLeu859095CysAspLeuLeuIleArgCysIleAsnCysGlnLysProLeuCysPro100105110GluGluLysGlnArgHisLeuAspLysLysGlnArgPheHisAsnIle115120125ArgGlyArgTrpThrGlyArgCysMetSerCysCysArgSerSerArg130135140ThrArgArgGluThrGlnLeu14515021021211590212PRT213人乳頭瘤病毒40021MetSerLeuProGlyGlyArgGlyThrValLysIleGluThrArgGlu151015ArgIleTrpValArgArgValAsnGlyGluThrGlyValTyrAspThr202530ArgAlaGlySerPheGluThrValSerCysGlnGluPheGluAlaAla354045AlaAspThrValProSerValProValPheCysAspArgCysPheGly505560ThrSerLeuTyrGluValProLeuThrGlyPheGlyThrPheValVal65707580GlyThrCysCysIlePheSerProGlyAspProValAspAspProSer859095IleProAlaHisMetArgLysTyrGlnGlnProIleGluAlaHisGln100105110ThrMetValGlnValAlaProGlyThrLeuLysTyrSerHisGlnIle115120125ProMetGlyLysValLeuGlyTyrTrpHisValHisMetGluAspArg130135140ValTyrLeuAsnMetIleGlyGlyIleAspGluSerGluAspThrGly145150155160LysArgCysValGluThrPheThrGluAlaAspIleProCysAlaLeu165170175SerLeuGlyThrLeuAspValGlyLeuAsnGluValIleLeuGluCys180185190SerValValValIleProAlaArgArgGlyCysHisAlaLysLeuPhe195200205ThrArgAspThrValSerAspGlyLeuGluLysPheCysPheGlnSer210215220HisAlaThrLeuProProThrLeuLeuAlaSerPheGlySerThrSer225230235240GluSerProGluArgLysThrPheTyrGluAlaHisValAspAlaLeu245250255AsnAsnTyrIleLysLeuLeuArgThrIleTyrSerHisLysGlyGlu260265270ThrGluIleGluGlnTyrLeuIleGluGlySerLysLeuTyrSerGlu275280285LeuIleGlyGluProSerArgValLeuAspAlaThrMetLysAlaAla290295300GlnIleAlaGluProGlnThrHisThrGlyGlyAlaAspArgGlnArg305310315320ProGlnArgProAspGlyIleProTyrSerValProAspArgPhePro325330335MetThrGlyTyrProPheAlaProGlnPheCysGlyAspProGlyLeu340345350ValSerHisTyrAsnProPheValProProGlnSerPheGlyGlnGly355360365TyrGlyProGluArgValGlyGlyTyrTyrProGlnProProAsnPro370375380TyrValLeuProIleSerTyrGlyGlnGlnProTyrProGlyHisPro385390395400GlnProHisGlyHisHisGlnGlnArgSerGlyGlyGlyAspLeuLys405410415AlaGluLeuIleGluThrLeuGlyLeuAlaProLysThrAsnAlaVal420425430GlnGluSerLeuLysSerPheIleSerGluIleLeuGluSerGluLeu435440445LysAsnCysGlyIleLysArgAlaAlaGlyAsnIleGluArgAsnCys450455460AspValAspGluGluProProArgThrLysArgAlaArgProGluPro465470475480LysThrAlaValGluAlaIleValArgAlaProTyrGlyAspPheAsp485490495SerThrAlaLeuThrThrLysIleGlyGlnValSerAspThrValGlu500505510LysLeuAsnLysValIleGluThrLeuLeuThrGlnSerSerAlaGln515520525ProAlaProLeuSerThrProAlaGlnAlaAlaProValGlnProSer530535540LeuProGlnProValProGluProLeuAlaProGlnGluProProPro545550555560ProGlyThrSerAlaProThrLeuGluAlaSerLeuProGlnGlnLys565570575ProValValSerLysGlyAlaPheGluThrLeuMetAsnLeu5805855902102221113212PRT213鼠40022SerThrArgThrProGluAspSerAsnSerLeuGlyThr15102102321120212DNA213人乳頭瘤病毒220221修飾的鹼基222(3)223M＝A，C，或R220221修飾的鹼基222(9)223W＝A和T220221修飾的鹼基222(15)223Y＝C和T40023gcmcagggwcataayaatgg202102421120212DNA213人乳頭瘤病毒220221修飾的鹼基222(6)223M＝A，C，或R220221修飾的鹼基222(8)..(9)223R＝A和G220221修飾的鹼基222(13)223W＝A和T40024cgtccmarrggawactgatc202102521120212DNA213人乳頭瘤病毒40025catacacctccagcacctaa202102621198212PRT213人乳頭瘤病毒16型40026MetHisGlyAspThrProThrLeuHisGluTyrMetLeuAspLeuGln151015ProGluThrThrAspLeuTyrCysTyrGluGlnLeuSerAspSerSer202530GluGluGluAspGluIleAspGlyProAlaGlyGlnAlaGluProAsp354045ArgAlaHisTyrAsnIleValThrPheCysCysLysCysAspSerThr505560LeuArgLeuCysValGlnSerThrHisValAspIleArgThrLeuGlu65707580AspLeuLeuMetGlyThrLeuGlyIleValCysProIleCysSerGln859095LysPro21027211151212PRT213人乳頭瘤病毒16型40027MetPheGlnAspProGlnGluArgProArgLysLeuProGlnLeuCys151015ThrGluLeuGlnThrThrIleHisAspIleIleLeuGluCysValTyr202530CysLysGlnGlnLeuLeuArgArgGluValTyrAspPheAlaPheArg354045AspLeuCysIleValTyrArgAspGlyAsnProTyrAlaValCysAsp505560LysCysLeuLysPheTyrSerLysIleSerGluTyrArgHisTyrCys65707580TyrSerValTyrGlyThrThrLeuGluGlnGlnTyrAsnLysProLeu859095CysAspLeuLeuIleArgCysIleAsnCysGlnLysProLeuCysPro100105110GluGluLysGlnArgHisLeuAspLysLysGlnArgPheHisAsnIle115120125ArgGlyArgTrpThrGlyArgCysMetSerCysCysArgSerSerArg130135140ThrArgArgGluThrGlnLeu145150權利要求1.一種確定感染有人乳頭瘤病毒(HPV)或疑似感染有HPV的患者癌前期的或癌的生長的復發可能性的方法，其中所述患者也在宮頸上或宮頸周圍有或曾經有過癌前期的或癌的生長，該方法包括a)來自患者的樣品與至少一種HPV的E6或E7肽溫育；和b)測定該樣品針對該肽的細胞介導的免疫應答。2.權利要求1所述的方法，其中所述樣品與至少兩種E6肽或至少兩種E7肽溫育。3.權利要求1所述的方法，其中所述樣品與HPV的E6肽溫育。4.權利要求3所述的方法，其中所述的E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，P9L，P10I，Q20P，R16R或G10S。5.權利要求4所述的方法，其中所述E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C或其組合。6.權利要求1所述的方法，其中所述樣品與HPV的E7肽溫育。7.權利要求6所述的方法，其中所述E7肽是T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C。8.權利要求7所述的方法，其中所述E7肽是Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或其組合。9.權利要求1所述的方法，其中所述樣品與至少一種E6肽和至少一種E7肽溫育。10.權利要求1所述的方法，其中所述患者已知感染了HPV。11.權利要求1所述的方法，進一步包括確定所述患者是否感染有HPV。12.權利要求1所述的方法，其中所述患者有或有過癌前期的生長。13.權利要求12所述的方法，其中所述癌前期的生長是宮頸上皮內瘤(CIN)。14.權利要求1所述的方法，其中所述患者不再有癌前期的或癌的生長。15.權利要求14所述的方法，其中所述患者不再有癌前期的生長。16.權利要求15所述的方法，其中所述癌前期的生長是CIN。17.權利要求1所述的方法，其中所述樣品是血液。18.權利要求1所述的方法，其中所述樣品通過陰道擦拭籤獲得。19.權利要求1所述的方法，其中所述樣品包含外周血單核細胞。20.權利要求1所述的方法，進一步包括在獲得樣品之後在介質中溫育該樣品。21.權利要求1所述的方法，其中所述測定包括將樣品與肽接觸並測量樣品的T細胞增殖。22.權利要求21所述的方法，其中通過測定氚化胸腺嘧啶核苷的摻入測定所述T細胞的增殖。23.權利要求22所述的方法，其中所述樣品具有大於或等於2.0的SI值，表明細胞介導的免疫應答。24.權利要求23所述的方法，其中所述樣品具有大於或等於3.0的SI值，表明細胞介導的免疫應答。25.權利要求1所述的方法，其中所述測定包括測量TH1或TH2細胞因子的量。26.權利要求25所述的方法，其中所述TH1細胞因子的量被測量。27.權利要求26所述的方法，其中所述TH1細胞因子是IL-2，IFN-γ，TNF-α或THF-β。28.權利要求25所述的方法，其中所述TH2細胞因子的量被測定。29.權利要求28所述的方法，其中所述TH2細胞因子是IL-4，IL-5，IL-10或IL-13。30.權利要求25所述的方法，其中所述TH1或TH2細胞因子通過免疫測定測量。31.權利要求30所述的方法，其中所述免疫測定是ELISA或放射免疫測定法。32.權利要求25所述的方法，其中所述TH1或TH2細胞因子用流式細胞儀測量。33.權利要求1所述的方法，其中所述樣品被測量不止一次。34.權利要求33所述的方法，其中所述樣品用不同的測定法測定。35.權利要求1所述的方法，其中進一步包括從患者獲得第二份樣品並檢測該第二份樣品針對至少一種HPV的E6或E7肽的細胞介導的免疫應答。36.權利要求1所述的方法，其中在治療其癌前期的或癌的生長後至少一個月以後從患者獲得樣品。37.權利要求1所述的方法，其中所述患者對其泌尿生殖道內的癌前期的或癌的生長已經受過燒蝕治療。38.一種鑑別有危險復發癌前期的或癌的生長的HPV感染患者的方法，包括a)用E6或E7肽溫育來自患者的血液樣品；b)評價所述樣品針對該肽的細胞介導的免疫應答。39.權利要求38所述的方法，其中所述的E6或E7肽具有K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，P9L，Q20P，P10I，R16R，G10S，T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C的胺基酸序列。40.權利要求1所述的方法，其中所述的人乳頭瘤病毒是高級型。41.權利要求40所述的方法，其中所述的人乳頭瘤病毒是HPV16。42.一種防止感染有HPV並對其癌前期的或癌的生長接受過治療的患者復發其癌前期的或癌的生長的方法，包括a)鑑別有危險復發HPV相關的癌前期的或癌的生長的患者；與b)對該患者施用有效量的至少一種HPV的E6或E7肽來誘導針對該肽的細胞介導的免疫應答。43.一種用於確定感染有HPV並對其癌前期的或癌的生長接受過治療的患者復發其癌前期的或癌的生長的可能性的試劑盒，其在適當的容器中包括，至少一種E6或E7HPV肽，抗體，和檢測試劑。44.權利要求43所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種E6肽。45.權利要求44所述的試劑盒，其中所述E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，VI0C，P9L，P10I，Q20P，R16R或GS10S。46.權利要求43所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種E7肽。47.權利要求46所述的試劑盒，其中所述E7肽是T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C。48.權利要求43所述的試劑盒，其中所述抗體抗TH1細胞因子。49.權利要求43所述的試劑盒，其中所述抗體抗TH1細胞因子受體。全文摘要本發明涉及來自人乳頭瘤病毒(HPV)的E6和E7肽的用途，用於評價感染HPV的患者體內的細胞介導的應答以確定該患者關於發生或復發包括子宮頸上皮內瘤(CIN)的癌前期或癌的生長的預測。文檔編號G01N33/50GK1556863SQ02818351公開日2004年12月22日申請日期2002年7月19日優先權日2001年7月20日發明者J·K·薩斯特裡,G·託特雷羅－露納,M·弗倫,JK薩斯特裡,乩茁露納申請人:德克薩斯大學體系董事會