一種荔枝果實衰老起始標誌基因及其應用的製作方法

2023-12-09 09:20:41 1

專利名稱：一種荔枝果實衰老起始標誌基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物化學與分子生物學領域，具體涉及一種荔枝果實衰老起始標誌基因及其應用。
背景技術：
蒸枝(Litchi chinensis Sonn.)是原產於我國且極具內銷和出口競爭優勢的熱帶名優水果，2010年全國荔枝面積863. 53萬畝，產量175. 83萬噸，面積和產量均超過世界荔枝總面積和總產量的70%。不過，荔枝果實採後極易褐變、腐爛，導致巨大的經濟損失。研究表明外源ATP處理可以抑制採後果蔬過氧化產物的積累，維持膜脂不飽和程度和膜的完整性，延緩其衰老和品質劣變(Qu等，2006 ；Yi等，2008 ；2009 ;2010)，然而荔枝果實衰老褐變的分子機制仍不明確。果實採後衰老是由內在和外部環境因素所誘導和引發的一種主動過程，其中能量水平的改變可能是啟動果實採後衰老劣變的關鍵因素。研究表明，園藝作物採後衰老和褐變的發展可能與能量供應不足和生成效率下降有關。採後蘋果、梨，荔枝、龍眼、香石竹切花等的衰老程度，以及向日葵種子的萌發活力與ATP含量和能荷值(EC)成負相關性(Saquet等，2000 Jiang 等，2007)。能量由呼吸作用產生，線粒體膜上ATP合酶(FlFo-ATP synthase)利用跨膜的電化學質子勢，通過氧化磷酸化將ADP和Pi合成ATP。ATP合酶是由α β Υ δ ε亞基組成的多聚體，其中ATP合酶β亞基是一種新型的細胞死亡調節器(Chivasa等，2011)。β亞基缺失則呼吸複合物V不能被正常組裝，呼吸速率降低(Martinez-Cruz等，2011)繼而ATP合成受阻。但是AtpB基因在果實成熟中的作用目前尚不清楚。可見，從能量角度探討荔枝果實採後衰老劣變機制，進而從能量角度提出果蔬採後保鮮新策略，不僅具有重要理論價值而且對荔枝貯藏保鮮技術發展具有重要推動作用。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種克隆自荔枝的，編碼ATP合成酶β小亞基的，能作為荔枝果實衰老起始標誌性基因的LcAtpB基因。本發明的LcAtpB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第7位 1386位所示。序列SEQID No. I由1925個核苷酸組成，自5』端第I至6位核苷酸為5』端非編碼區(5』 -UTR),第7位至1383位核苷酸為編碼序列，第1384至1386位核苷酸為終止密碼子，第1387至1925位核苷酸為3，端非編碼區(3，-UTR)ο上述LcAtpB基因編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，C端包含一個DELSEED結構域(自SEQ ID NO. 2所示序列的氨基末端第372至378胺基酸殘基)。預測編碼的蛋白質的分子量為49. 9kDa，等電點(pi)為5. 12。本發明通過實驗發現，LcAtpB基因表達水平能被外源ATP、高氧、高氮和低溫在內的保鮮處理措施所抑制和下調。外源ATP、高氧、高氮和低溫在內的處理措施通過下調LcAtpB基因的表達水平從而顯著延緩荔枝果皮褐變和延長貯藏時間。由此可見LcAtpB基因能作為荔枝果實衰老起始的標誌性基因，因此本發明的第二個目的是提供LcAtpB基因作為荔枝果實衰老起始的標誌性基因的應用。本發明的第三個目的是提供LcAtpB基因在調控荔枝果實成熟衰老和採後保鮮中的應用。本發明的LcAtpB基因具有指示荔枝果實衰老的作用，可以作為荔枝果實衰老起始的標誌性基因，可以通過調控LcAtpB基因來調控荔枝果實成熟衰老，因此本發明在荔枝果實新品種培育中具有重要作用。


圖I是洛枝LcAtpB基因編碼的蛋白序列的進化分析，涉及的氣基酸有KpAtpB(CAB89921. I), CtAtpB(ACZ73599. I), CsAtpB(YP_740482. I), MaAtpB(ABU75138.·I)，PeAtpB (ABU75177. I)，SiAtpB (CAB65433. I)，StAtpB (ΑΒΒ90048. I)，AtAtpB (ΒΑΑ8-4392.I), OsAtpB(ΝΡ_039390. I)和 ZmAtpB(CAA60293. I)；圖2是荔枝果實成熟過程中LcAtpB基因表達和外源ATP處理對荔枝果實LcAtpB基因表達的影響；圖3是外源ATP處理對荔枝褐變指數和商品率的影響；圖4是厭氧、高氧處理和冷藏荔枝常溫貨架期間果實褐變指數；圖5是厭氧、高氧處理和冷藏荔枝常溫貨架期間LcAtpB基因表達。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所使用材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例I :I、材料蒸枝(Litchi chinenis, Sonn.)採自廣州從化地區，品種為「淮枝」。2、LcAtpB基因全長cDNA的分離採用熱硼酸法提取荔枝果皮總RNA。以總RNA為模版，反轉錄合成第一鏈cDNA，作為模板用於PCR擴增。按照GenBank中登錄的已知基因功能保守區域，設計簡併引物LcAtpB Forward GGGCCGTGGCCatgwsngcnac ；LcAtpB Reverse TCGGGCAGGCCGtcnarytcncc ；以反轉錄生成的cDNA為模板與基因的簡併引物進行PCR擴增。PCR擴增條件為94°C預變性4min ;94°C變性30s，復性30s，72°C延伸30s，30個循環；然後72°C延伸IOmin0用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測PCR產物，回收目的條帶，連接在pMD20-T載體上，轉化，測序。根據得到的cDNA片段序列(1188bp)，分別設計3'端和5'端特異引物，並以cDNA片段為模版，進行 RACE(RapidAmplification ofcDNA Ends)擴增。3'端和 5'端 RACE 擴增引物如下LcATP(B)3' RACE Forwardl:GTCAACTATGCTCCAACCTCLcATP(B)3，RACE Forward2:CGTTACAAAGAACTTCAGGA
5』RACE reverse I:CCTCAATGACTTGCAATGTAGAAG5』 RACE reverse2:CAGCCTCTTCCAATAGTGCTTTA反應體系包括反轉錄反應液I μ 1，10 XcDNA Dilution Bufferl μ 1,2. 5mM dNTP
4μ I, forward primer 3 μ I, reverse primer 3 μ I, rTaq 0.3 μ I, ddH20 33.7 μ I,共50 μ I。PCR 程序94。C3min 後 94° C lmin，60。C lmin，72。C Imin 30sec，35 個循環，72° C IOmin0對:V端和Y端RACE擴增反應的擴增產物進行測序，然後與已有的1188bp保守區域序列進行拼接，得到cDNA核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO. I所示，由1925個核苷酸組成，其編碼區如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的第7位 第1386位所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具有459個胺基酸，C端包含一個DELSEED結構域(自SEQ IDNO. 2所示胺基酸序列的氨基末端第372至378胺基酸殘基)。預測編碼的蛋白質的分子量 為49. 9kDa，等電點(pi)為5. 12。將SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的第7位 第1386位所示的編碼區命名為LcAtpB基因。利用ExPASy 在線分析工具 p I/Mw (http: //wwwlexpasylch/tools/pi_tool.html)對LcAtpB基因編碼的蛋白質進行胺基酸基本性質分析。利用DNAMAN 510和ClustalX 1183軟體進行不同物種間同源基因的胺基酸序列比對，並結合MEGA 410軟體構建系統進化樹，結果如圖I所示。從圖中可以看出，荔枝AtpB與其它植物物種AtpB胺基酸序列具有同源性，其中與同屬無患子科的欒樹(Koelreuteria paniculata)的AtpB胺基酸序列相似性較高(92%)。3、螢光定量研究LcAtpB的表達模式對不同處理不同貯藏時間的荔枝提取RNA，反轉錄成cDNA用作螢光定量PCR的模版。在 ABI 7500Real_Time PCR System (Applied Biosystems, USA)上用 LightCycler480SYBR Green IMaster Mix(Roche Applied Sience,www. roche-applied-science. com)進行 Quantitative RT-PCR(qPCR)反應。以荔枝 actin 基因為內標(DQ471426)。用於 qPCR的引物序列如下針對actin基因LcACTIN Forward ACCGTATGAGCAAGGAAATCACTGLcACTIN Reverse TCGTCGTACTCACCCTTTGAAATC針對LcAtpB 基因LcAtpB Forward GAGAGTTGGTTTGACTGCCCTAALcAtpB Reverse GAAGGCATTCTACCCAATAAGGC反應條件如下95°C 30s後95°C 5s，58°C 34s, 40個循環；用2_ ΔΔ CT法進行數據處理。4、LcAtpB基因對在體成熟荔枝果實衰老的調控作用選取6株長勢中等、樹型基本一致的果樹作為供試植株，從花後50天開始取樣，每10天採樣一次，花後90天取樣結束。共5個成熟度果實取樣，用步驟3的螢光定量Q RT-PCR研究LcAtpB基因的表達。結果表明，在荔枝果實發育和成熟過程中，ATP合成酶β小亞基LcAtpB基因表達持續升高，在花後80天-90天急劇升高(圖2Α)。5、LcAtpB基因對在離體成熟荔枝果實衰老的調控作用
共進行3個試驗(I)ATP處理組荔枝採收後先用O. 5%次氯酸鈉表面消毒5s，再用無菌水清洗2次。稍晾乾後分別用無菌水和ImM ATP進行真空滲透處理，減壓至紅線(>75kPa)後，維持該壓力3min，每處理200個果，O. 015mm厚聚乙烯塑膠袋包裝，15個果/袋，25°C貯藏，從處理的當天開始，每隔I天取樣一次，共取樣4次用於各生理指標測定和LcAtpB基因的表達量分析。(2)氧氣、氮氣處理組荔枝果實用O. 05%施保功浸泡3min，晾乾備用。取810個荔枝，分成相等的3份，第一份不做處理，作為對照(control);第二份放入玻璃罐中，通入高純氮氣O. 5小時，密閉5. 5小時，作為短期厭氧處理；第三份放入玻璃罐中密閉，每隔7. 5小時通純氧O. 5小時，共密閉24小時，作為高氧處理。對照和處理果實分別用聚乙烯塑膠袋包裝，每袋30個，在25°C貯藏6天，每隔一天取樣用於各生理指標測定和LcAtpB基因的表達量分析，該試驗重複進行3次，實驗結果基本一致。
(3)貨架期試驗組荔枝果實用O. 05%施保功浸泡3min，晾乾備用。取810個荔枝，分成相等的3份，用聚乙烯塑膠袋包裝，每袋30個(每份9袋)，在1°C貯藏。於1、2和3周後各取一份置於25°C貯藏2天，分別於0、24小時和48小時取樣用於各生理指標測定和LcAtpB基因的表達量分析。結果顯示(I)外源ATP處理降低LcAtpB基因表達從而延緩荔枝果實衰老劣變，並提高商品率(圖2B、圖3) ; (2)高氧、高氮和低溫均可延緩荔枝果實果皮褐變和延長貯藏壽命(圖4) ；(3) LcAtpB基因急劇上調表達是荔枝果實衰老起始的標誌性事件(圖2)，上述保鮮處理措施通過下調LcAtpB基因的表達水平從而調控荔枝果實的成熟和衰老進程(圖2B、圖 5A 和 5B)。
權利要求
1.一種荔枝果實衰老起始的標誌性基因LcAtpB基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第7位 1386位所示。
2.權利要求I所述的LcAtpB基因編碼的蛋白質，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3.權利要求I所述的LcAtpB基因作為荔枝果實衰老起始的標誌性基因的應用。
4.權利要求I所述的LcAtpB基因在調控荔枝果實成熟衰老和採後保鮮中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種荔枝果實衰老起始標誌基因及其應用。荔枝果實衰老起始的標誌性基因LcAtpB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第7位~1386位所示。LcAtpB基因編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ IDNO.2所示。本發明的LcAtpB基因具有指示荔枝果實衰老的作用，可以作為荔枝果實衰老起始的標誌性基因，可以通過調控LcAtpB基因來調控荔枝果實成熟衰老，因此本發明在荔枝果實新品種培育中具有重要作用。
文檔編號C12N15/55GK102943082SQ201210461058
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者屈紅霞, 蔣躍明, 王慧, 錢政江, 鄺健飛, 段學武 申請人:中國科學院華南植物園