抗腫瘤疫苗、其製備方法以及抗腫瘤免疫療法的製作方法

2023-12-09 02:09:31

專利名稱：抗腫瘤疫苗、其製備方法以及抗腫瘤免疫療法的製作方法
技術領域：
該組發明涉及醫療技術，尤其涉及腫瘤患者的免疫治療，本發明也可應用 於肺瘤疾病的治療和預防該病復發的藥物中。
背景技術：
對於肺瘤疾病的治療，由於手術、化學療法和》支射線療法在實施中受到限 制，迫切需要治療腫瘤患者的新方法的開發。特別是，人們相信，由於免疫治 療的原則是增強人體自身的、防禦性的抗腫瘤免疫能力，因而免疫療法的發展 前景良好。
免疫治療的有效方法之一是疫苗接種。疫苗接種的效果好壞，取決於由腫 瘤抗原引起的免疫應答強度，這些腫瘤抗原可存在於疫苗的組分中，也可存在 於疫苗製備的不同階段(例如，基於抗個體抗體，樹突狀細胞等而製備的疫苗)。 因此，肺瘤抗原的分離是開發抗胂瘤疫苗的必要先決條件。
現已知有^f艮多不同製備抗腫瘤疫苗的方法。
一些疫苗是利用腫瘤細胞(TC)的特異性抗原製備——即肽類、熱休克 蛋白、多糖和其他物質。特別公知的方法是通過合成的方法製備腫瘤肽類抗原。 由9個胺基酸合成的肽類疫苗，在髓細胞性白血病患者的臨床試驗中效果良好 (Williams R.， "Harnessing the Immune System: The Promise and Potential of Cancer Vaccines", Oncolog.， 2005, v. 50, W 4)。其4也的肽類治療效果不一。例如， gplOO蛋白組成的肽類在初期效果良好，但不能引起足夠的免疫應答來對抗患 者的月中瘤發展(Yu Z., Restifo N.R， "Cancer Vaccines: Progress Reveals New Complexities", J. Clin. Invest., 2002, v. 110, 289-294 )。
使用肺瘤糖類物質作為激活免疫反應抗原的方法是眾所周知的。但是，類 似的抗原療效僅表現在對單一的腫瘤細胞時以及早期的轉移階段。(Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens", Scand. J. Immunol., 2005， v. 61,391-397)。
應注意的是，基於確定抗原的疫苗具有其本質缺點。腫瘤細胞不僅具有多 種抗原，而且其突變率較高且在機體中具有不斷地細胞選擇作用機制，這導致 新抗原和經過修飾的已有的腫瘤抗原的出現。由此使用自體疫苗(基於病人自 身腫瘤細胞的疫苗)的優點更為突出，這些自體疫苗覆蓋引起免疫反應的整個 抗原譜，包括個體的和疾病狀態下的特異性抗原，這些抗原具有特定的病人在 腫瘤發展過程中的所有特徵。
使用外來體(exosome)製備腫瘤抗原的方法是公知的。外來體是直徑不 足幾納米的嚢泡，可由多種細胞分泌，包括腫瘤細胞(如，論文Wolfers J. et al., "Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming", Nat. Med., 2001, v. 7, 297-303 )、 T-'淋巴細胞和B-淋巴細胞 (Raposo G. et al., "B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles", J. Exp. Med" 1996, v. 183, 1161-1172 ),以及樹突狀細胞(Zitvogel L. et al., "Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes", Nature Med., 1998， v. 4, 594-600 )。
這種方法的缺點是具有表面蛋白的外來體濃縮水平低，而這些表面蛋白是 實質上免疫治療中的抗原。眾所周知，外來體主要包含胞漿蛋白和內涵體間隔 擔保(見論文Thery C. et al" "Exosomes: composition, biogenesis and flmction" Reviews Immunology, 2002, v. 2, 569-579 )。該方法的第二個公知缺點是，收集 外來體所需時間較長，這使得生長培養基中必須有腫瘤細胞，並且必須從生長
培養基成分中純化抗原。
另一種公知的製備抗腫瘤疫苗的方法，是向機體引入編碼抗原的DNA, 而不是引入抗原本身。抗原遞呈細胞吸取DNA,形成肺瘤抗原，並且主要與 組織相容性複合體(hystocompatibility complex)結合表達於細胞表面，以激 活細胞毒性T淋巴細胞。由此，採用基於病毒載體的疫苗，在動物模型上得 到4交好的效果(見i侖文Yu Z., Restifo N.R, "Cancer Vaccines: Progress Reveals New Complexities", J. Clin. Invest, 2002, v. 110, 289-294 )。
這種方法的缺點是病毒載體自身會引發免疫系統的反應，這會導致人體內 的抗腫瘤疫苗缺乏明顯的療效。
另一種製備抗腫瘤疫苗的公知方法是，事先用整個肺瘤細胞作為抗原，從病人自身的腫瘤細胞或者其他病人的腫瘤細胞製備自體疫苗或同種異體疫苗。 細胞預先用電離輻射滅活。這種疫苗的優勢在於不需要鑑別和分離具體的抗 原。由此與作為佐劑的卡介苗疫苗混合後的細胞，可用於治療結腸直腸癌、黑
色素瘤以及腎癌(見Armstrong A.C., Eaton D.， Ewing J.C., "Cellular Immunotherapy for Cancer", Brit. Med. J" 2001, v. 3323， 1289-1293 )。
這種方法的缺點是腫瘤細胞必須滅活，以及由於吞噬作用和抗原呈遞細胞 的作用而導致的位於整個腫瘤細胞表面的抗原的低適應性。
美國專利US 6039941 (分類號C12N 15/09, A61K 31/00，公開于于2000 年3月21日)公開了利用基因工程的方法處理編碼具有免疫活性的表面蛋白的 基因，以從腫瘤細胞中製得高致免疫性抗腫瘤疫苗的方法。
這種方法的缺點是，第一，必須對腫瘤細胞滅活；第二，腫瘤細胞表面抗 原很難適合吞噬作用和抗原呈遞細胞的作用。
國際申請WO 02053176 (分類號A61K 39/00; C12N 5/06; A61K 39/00; C12N5/06,公開於2002年7月11日)公開了一種基於培養腫瘤細胞的溶胞產物 製備抗腫瘤疫苗的方法。這些疫苗的優勢在於，不需經電離輻射滅活，以及不 同於完整的腫瘤細胞，裂解的的細胞抗原更適合吞噬作用和抗原呈遞細胞的作 用，由此產生更明顯的免疫反應。
這種方法的缺點是腫瘤細胞溶胞產物的主要部分是細胞內蛋白，並且由這 種蛋白引起的免疫應答沒有抗腫瘤的活性，因為腫瘤細胞的細胞內蛋白很難進 入免疫體系。
最接近本專利的是美國專利5993829(分類號A61P 35/00, C07K 14/47，公 開於1999年11月30日)中描述的製備抗腫瘤疫苗的方法。美國專利US 6338853 (分類號A61P 35/00， C07K 14/47， 7>開於2002年1月15日)，美國 專利5030621(公開於1991年7月9日)以及美國專利US 5635188(公開與1997 年6月3日)中也描述了類似的方法，包括肺瘤細胞培養以及其表面抗原的分 離。
另一種公知方法是預先在無血清生長培養基中培養肺瘤細胞，並從生長培 養基中分離表面細胞抗原，在此培養程中腫瘤細胞消失。經純化收集抗原可用 作抗胂瘤疫苗的抗原。這種疫苗的優勢在於，細胞表面腫瘤抗原含量高，這種 胂瘤抗原(並非隱藏在細胞內)容易被免疫系統作用。這種方法的缺點是-由於不受外部影響、自發地反應，以及缺少培養腫瘤細胞的抗原，因而抗原產量低；-所得物質中目的產物(抗原)含量低，且雜質多。這是由於抗原收集之前，腫瘤細胞要在生長培養基中孵育若干小時(如美國專利6338853所述，在 1640培養基中培養三個小時)，這意味著要在含有40多種物質(胺基酸、鹽、 緩衝劑、維生素、葡萄糖等)的生長培養基中收集抗原，同時培養基中還含有 代謝產物以及在培養進程中由腫瘤細胞分泌的其他物質；-要分析抗原混合物的成分，必須事先純化從生長培養基和細胞代謝產物 中得到的產物。-要分離得到足以滿足疫苗接種所需劑量的抗原，必須延長腫瘤細胞培養 時間以使其增殖，這會導致抗原混合物組成發生改變並使疫苗功效降低；-根據該方法，要得到疫苗接種所需的抗原數量，必須通過腫瘤細胞培養， 也就是說，利用該方法不可能從離體(無培養)細胞中提取抗原；-鑑於腫瘤細胞的長時間培養和表面腫瘤抗原必須經過純化，上述疫苗價 格昂貴。其他公知的抗腫瘤疫苗，其基本組成是不同抗原的混合物或者抗原與不同 免疫刺激物質的混合物。國際申請WO 2004012685 (分類號A61K 39/00,公開於2004年2月12 日)所公開的抗腫瘤疫苗是基於表面腫瘤抗原的，這些抗原在細胞培養過程中 會"消失"。這種疫苗的製備，可能加快在不同因素影響下，通過生長培養基的 細胞分泌抗原的速度，在受到一定程度上提高疫苗效果的不同影響下，疫苗制 備中，加速了通過生長培養基中的細胞分泌抗原的進程。但是這種疫苗也具有 與其他通過無血清培養基中培養腫瘤細胞所得到的疫苗相同的固有缺點。這裡描述的最相近的專利申請是基於表面腫瘤抗原的疫苗，由美國專利 US 5993829 (分類號A61P 35/00, C07K 14/47,公開於1999年11月30日) 所披露。美國專利US 6338853 (分類號A61P 35/00, C07K 14/47，公開於2002 年1月15日)，美國專利US 5030621 (公開於1991年7月9日),美國專利US 5635188 (公開於1997年6月3日)中對相似的疫苗也有描述。正如前面所提到 的，這個公開疫苗的缺點是其高昂的價格，這主要是因為腫瘤細胞的培養期和 純化步驟。還有很多已知的不同的抗腫瘤治療方法。
公知的利用單價疫苗進行抗胂瘤免疫治療，包括向機體中導入確定的腫瘤 抗原。例如，這種疫苗屬於基於合成肽、熱休克蛋白、多糖及其他物質的疫苗。
這些方法特別7/Hf於專利WO 2005083074 (分類號A61K 31/7088; A61P 35/00; C07K 7/06,7>開於2005年9月9日)和俄羅斯專利RU 2271831 (A61K 39/385; A61K 39/39; A61K 51/00,公開於2006年3月20日)。
這些方法的缺點是引入的抗腫瘤免疫的特異性較差，這是因為某些抗原對 具體患者的腫瘤不具有特異性，統計發現這些抗原是各類腫瘤的共同抗原。
公知的抗肺瘤療法，包括向機體注射全部的滅活腫瘤細胞，和經過強化免 疫原性的全部的肺瘤細胞(例如，US Patent 6039941，分類號C12N 15/09, A61K31/00, />開於2000年3月21日)。
這種免疫療法的缺點是誘導的抗腫瘤反應特異性低，因為腫瘤細胞表面抗 原幾乎不適合吞噬作用和接下的抗原呈遞細胞的過程。此方法的也需要預先在 體外進行細胞增殖，以獲得疫苗接種所必須劑量的抗原，這也會引起抗原組成 的改變以及免疫治療效果的降低。
國際申請WO 02053176 (分類號A61K 39/00; C12N 5/06; A61K 39/00; C12N 5/06，公開於2002年7月11日)公開了實施抗肺瘤免疫治療的方法， 包括將腫瘤細胞溶胞產物導入機體的步驟。
這種免疫接種方法的缺點誘導的抗肺瘤免疫特異性低。這種方法中，疫苗 中除了含有免疫應答所需的表面腫瘤抗原外，還含有作為溶胞產物主要成分的 細胞內蛋白。因此，針對大量壓載蛋白(ballastproteins)的免疫反應由此產生， 使得免疫應答的腫瘤特異性變"模糊"。該方法也需要預先進行細胞體外增殖， 以獲得疫苗接種所需的足夠的抗原劑量，這也會引起腫瘤細胞抗原組成的改 變，繼而降低抗肺瘤治療的效果。
基於特定腫瘤抗原的組合以及不同抗原與各種免疫興奮劑的組合的方法， 是公知的。
同本發明最相近的抗腫瘤治療的方法，為美國專利US 5993829 (分類號 A61P 35/00, C07K 14/47,公開於1999年11月30曰)所披露的。相近的方法也 在專利US 6338853 (分類號A61P 35/00， C07K 14/47，公開於2002年1月15 日),US 5030621 (公開於1991年7月9日)，美國專利US 5635188 (公開於1997年6月3日)以及WO 2004012685(分類號A61K 39/00,公開與2004年2月12 日)中有所描述。該方法包括將從抗原混合物中得到的疫苗注入機體內，這些
抗原是腫瘤細胞表面蛋白的片段，在無血清培養基培養的過程中的被細胞自然 地除去。
這種方法的缺點之一是所誘導的免疫應答的低特異性。該方法首先要長時 間地培養腫瘤細胞，這引起其抗原組成的改變並降低疫苗效果。另一個缺點是 該方法成本相對較高，這是由於細胞培養時間長，以及必須從生長培養基中的 組分中分離純化抗原而導致。

發明內容
本發明所達到的技術效果為由於強化了抗肺瘤免疫應答而提高了肺瘤疾 病的治療效果。
本發明的技術效果是通過使用基於表面腫瘤抗原的抗腫瘤疫苗而實現的。 根據本發明，疫苗包含表面腫瘤抗原的混合物，所述抗原是通過收集活的肺瘤 細胞表面蛋白的肽類而得到，所述肽類是通過向原代培養的活的肺瘤細胞周期 性加入不使細胞死亡的蛋白酶進行處理而得到的。
根據本發明優選的實施方式，所述抗腫瘤疫苗中使用的蛋白酶可為胰蛋白酶。
前述技術效果，也可通過本發明所提供的製備抗肺瘤疫苗的方法而實現， 所述製備方法包括培養肺瘤細胞和分離表面肺瘤抗原。根據本發明，將預先從 生長培養基上洗脫的活的腫瘤細胞進行原代培養，用蛋白酶對腫瘤細胞進行不 使細胞死亡的處理，收集釋放的表面腫瘤抗原。接著，經過一段時間，用蛋白 酶對原代培養的活的腫瘤細胞進行重複處理，該段時間的間隔足以使得表面肺 瘤抗原的活性被細胞恢復。積聚(富集，收集；accumulate)表面胂瘤抗原直 至達到滿足疫苗接種的劑量，控制得到的表面腫瘤抗原的組分。
根據本發明的實施例，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
本發明的技術效果也可通過抗腫瘤免疫療法的實施而獲得，包括將疫苗注 射到患者體內的步驟，該疫苗由表面腫瘤抗原的混合物製成，這些抗原為肽類， 該肽類來源於腫瘤細胞表面蛋白。
根據本發明，使用表面腫瘤抗原，其抗原為收集的活的胂瘤細胞表面蛋白的肽類，是通過向原代培養的活的腫瘤細胞中周期性地加入不使細胞死亡的蛋 白酶進行處理而得到的。
根據本發明的一個實施方式，所用蛋白酶為胰蛋白酶。
為了獲得更強的特異性免疫應答，所述表面腫瘤抗原可以為患者自身的表 面肺瘤抗原。
根據本發明的另一實施方式，所述表面腫瘤抗原可以為其他患者的表面腫 瘤抗原。
根據本發明的一種實施方式，可以加入佐劑作為疫苗組成之一。


以下通過具體實施方式
和附圖來進一步說明本發明。
圖1為實現本發明製備抗肺瘤疫苗的大體工藝總流程圖； 圖2A為根據本發明第二個實施方式，從原代培養肺瘤細胞得到的表面抗 原的質譜圖2B為源自同樣的培養細胞，在表面抗原完全修復和經過蛋白酶重複處
理後，得到的表面抗原的質譜圖2C為源自同樣的培養細胞，在經過蛋白酶處理、部分修復後，所得到
的表面抗原的質譜圖3為根據本發明所述方法獲得的表面抗原片段質譜圖3A,圖3B為抗原的碳水化合物中的CID片段圖譜；
圖3C,圖3D為具有b/y離子的抗原肽段序列的CID片段圖譜；
圖4為接種肽混合物後的H22腫瘤細胞荷瘤小鼠的生命曲線圖。
具體實施例方式
實施例一是利用人肝癌細胞H22的荷瘤小鼠製備抗腫瘤疫苗的方法。利 用了培養的H22細胞來製備疫苗。
1.將生長培養基從培養有H22細胞的細胞瓶中移出，用不少於生長培養 基一半體積的無菌生理溶液沖洗單層細胞。沖洗至少三次，以徹底清除培養基
中的雜質。
接下來至關重要的一步，是用不致細胞死亡的濃度的蛋白酶處理細胞，一般使用胰蛋白酶(酶活力~ 3000U/mg )。
2. 將0.0001 %的胰蛋白酶溶液加入到單層細胞中，每25 cn^的細胞瓶面積 力口入lml溶液。
3. 細胞瓶在37。C環境下進行孵育，在孵育到第5至第7分鐘之間時，收 集含有從細胞表面裂解出的抗原的胰蛋白酶溶液。
4. 將新製備的含有血清(通常含10%)的生長培養基加入到細胞中，繼 續培養。
5. 為了得到所需數量的抗原，隔24小時重複步驟2-4。
6. 採用質譜分析以評估抗原的有效性。
7. 將積聚的抗原用於製備疫苗。
質譜分析的操作步驟如下。140ul的抗原溶液與140ul的乙醇和720ul的丁 醇混合，再加入15ul的CL4B瓊脂糖凝膠。混合物孵育45分鐘並緩慢攪拌。 孵育後，用相同的乙醇-丁醇溶液衝洗瓊脂糖凝膠2遍，並在50%乙醇溶液中 孵育30分鐘。收集乙醇溶液並在旋轉蒸發裝置(rotor-evaporating device)中 晾乾。所得到的乾燥物質復溶於10ul水中，並採用MALDI-TOF質譜儀分析。 將待分析的2ul溶液，以1:1的比例同含有50%的乙腈和0.5%的三氟乙酸的 2,5-二羥基苯曱酸的飽和溶液混合，至於質譜儀靶上。在樣品板上製備好的樣 品液滴在空氣中乾燥，多肽的質譜分析在質量範圍600-4000道爾頓(Da)進行。
已知大多數的腫瘤抗原都位於細胞表面，這些抗原在疫苗開發上有一定益 處(如綜述 Bocchia M. et al., "Antitumor vaccination: where we stand", Hematologica, 2000, v. 85, 1172-1206 )。用在不致細胞死亡條件下用胰蛋白酶處 理原代培養的細胞，會導致蛋白片段從細胞表面裂解(見Lokhov P.G., Archakov A丄,"Proteomic footprinting: a method for cells profiling by direct mass spectrometry", HUPO theses, 5-th Annual World Congress, 2006， abstract No 1201)。因此，根據本發明，胰蛋白酶以及其他蛋白酶的作用會使肺瘤表面蛋 白片段釋放到溶液中。在胰蛋白酶作用下釋放的表面肺瘤抗原(表面蛋白片段) 主要為可用於免疫治療的抗原，可用於腫瘤患者的免疫接種。
有必要指出，應在細胞脫離細胞瓶壁之前收集含有細胞上分離出的肽類的 胰蛋白酶溶液，這樣會避免細胞轉移到樣品中，不必進行額外的純化步驟。實驗上根據每種腫瘤細胞以及所用蛋白酶的活性程度而確定用蛋白酶處
理細胞的條件，這些條件可以極不相同，蛋白酶濃度可以從0.0001%到0.05%， 處理時間可以從30秒到IO分鐘。使用不同活性的胰蛋白酶時，其濃度可以適 當調整以提高或者降低酶活性。
細胞經過非致死濃度的蛋白酶處理後不會死亡，由此可以用胰蛋白酶重複 處理原代培養的細胞。為了使得表面腫瘤抗原的劑量足以達到用接種疫苗的要 求，可以用胰蛋白酶對所培養的活性細胞進行多次重複處理，兩次處理之間應 至少間隔24小時。用胰蛋白酶處理細胞的間隔期間，細胞孵育的實驗方案要 根據特定的細胞來確定(即培養於37。C的C02培養箱中，生長培養基中含有 血清和必須的添力卩物)。
積聚的表面腫瘤抗原按照特定疫苗的製備技術處理，即，這些抗原可以經 純化、濃縮、組成分析，也可進行修飾或與佐劑混合以增強免疫原性。 在本發明的其他實施方式中，蛋白酶的處理可與細胞傳代培養相結合。 胰蛋白酶溶液由無菌生理溶液或任何合適的鹽溶液配製。 除了胰蛋白酶，也可採用其他蛋白酶，例如胰凝乳蛋白酶(chemotrypsin)等。
根據本發明的一個實施例，當使用細胞懸液的時候，需在積聚抗原以前， 使用離心或其他合適的方法收集細胞。
本發明實施例一中所述的抗原組成分析，採用分析糖基化的肽類的質譜儀 器來進行(M. Tajiri et al., "Differential analysis of site-specific glycans on plasma and cellular fibronectins: application of a hydrophilic affinity method for glycopeptide enrichment", Glycobiology, 2005, v. 15, 1332-1340 )。部分原因是由
苗抗原的有益部分(如Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens", Scand. J, Immunol" 2005, v. 61, 391-397 )。
糖基化抗原的脫鹽和濃縮可通過任何適當的方式進行，特別是高效液相色 譜法(HPLC)。
在其他實施方式中，腫瘤細胞可從生物源液體中分離，如血液、尿液、體 液(liquor )、淋巴液、腹水以及胸膜液。抗肺瘤疫苗的製備方法適用於各種類型的細胞培養，包括貼壁培養、懸浮 培養、與母體組織或其他培養基培養、各種形式的細胞共培養、器官培養以及 細胞集合體(顆粒、球體)，也同樣包括新分離的腫瘤細胞和腫瘤組織片段。
進一步的，實施例二描述了本發明採用人結腸癌細胞貼壁原代培養，製備 而成的抗肺瘤疫苗和疫苗的製備方法。
1. 通過腫瘤切除手術取得的結腸腫瘤組織片段，移入含RPMI1640培養 基和抗生素的無菌管中，送入實驗室。
2. 在無菌條件下將腫瘤組織轉移至有蓋培養皿中，去除壞死的部分、血 塊、殘留的脂肪以及結締組織。
3. 將組織小心地用剪刀剪成小片。
4. 用10ml的曱矽烷磷酸鹽緩衝液(PBS)懸浮組織碎片，強力吹打，使 腫瘤組織石爭片解離成細胞團塊。
5. 靜置使剩餘較大的組織碎片沉到試管底部。
6. 用吸管小心收集懸浮於液體中的細胞團塊，並轉移到一個新的試管中。
7. 試管以400g的重力加速度離心5分鐘，丟棄上清。將含有細胞團塊的 沉澱重新懸浮於RPMI 1640培養基中。該培養基內含有胰島素(20)ag/ml)，轉 鐵蛋白(10iag/ml)，皮質醇(50nM),表皮生長因子(l ng/ml),乙醇胺(IO pM)， 磷酸乙醇胺(10nM),三硪曱腺原氨酸(triiodthyronine ) (100 pM)，牛血清蛋白 (2mg/ml),穀氨醯胺(2mM),丙酮酸鈉(sodium piruvate ) (0.5 mM),胎牛血 清(5%)。然後轉移至25 cm2的細胞瓶中進行細胞培養。
8. 在37°C和5% C02的條件下進行細胞培養。
9. 為了從基質細胞中分離腫瘤細胞，將細胞瓶緊壓在震動攪拌器上數秒 鍾。由於腫瘤細胞附著力較弱，因而分離並進入生長培養基中。
10. 用吸管收集含有漂浮細胞的培養基，然後將其轉移到一個新的細胞瓶 中，在37。C和5% C02條件下進行培養。
11. 腫瘤細胞長到80%融合時，從細胞瓶中移除生長培養基，用0.9%的 NaCl或曱矽烷磷酸鹽緩衝液衝洗細胞三次，所用衝洗溶液的體積不少於生長 培養基體積的一半。沖洗後生長培養基中的血清應除去。
12. 將0.0001%的胰蛋白酶溶液(酶活性~ 3000U/mg )加入到細胞中，加 入量為每25cm2細胞並瓦的面積lml溶液。13、 37。C醉育細胞瓶。在孵育到第5至第7分鐘時，收集含有從細胞上裂
解的表面抗原的溶液。收集的過程中，腫瘤細胞仍緊貼細胞瓶壁。如果一部分
細胞由於胰蛋白酶的作用脫離了細胞並瓦壁而漂浮於液體中，需對溶液以400g 的重力加速度離心5分鐘，取無細胞的上清備用。
14、 為滅活培養細胞瓶中剩餘的胰蛋白酶，應加入新製備的含有胎牛血清 的生長培養基，並繼續在37。C以及5% C02的條件下孵育細胞。
15、 由步驟13獲得的溶液在真空濃縮器中，於45。C條件下進行濃縮。濃 縮前應用適當方法對溶液脫鹽，如反相色譜法、凝膠過濾法等。為了除去剩餘 的胰蛋白酶,應預先用可濾過分子量低於4kDa肽段的過濾器對溶液進行過濾。
16、 經過24小時，重複步驟11-15步驟，以使抗原達到所需的量。這些 抗原對疫苗接種的有效性通過質譜儀來評定。
用蛋白酶處理細胞的次數以及數次處理間隔時間的長短，是通過分析所積 聚的抗原混合物的組成來決定的。如果抗原組成開始改變，數次用蛋白酶處理 細胞之間的間隔增長，不能得到由新分離出的腫瘤細胞得到的最初的抗原組 成，那麼這些細胞便不能用於疫苗製備。
所積聚到抗原混合物的組成，是通過質譜測定來控制的，正如本發明實施 例一種所描述的。
任何合適的方法都可用於從腫瘤組織中分離細胞。用蛋白酶分離腫瘤組 織，意在分離腫瘤細胞，進行表面結構的質譜分析時，必須在肺瘤細胞原代培 養24小時之後進行。
根據本發明得到的表面腫瘤抗原對腫瘤細胞供體有特異性。但是細胞培養 明顯改變了原代培養的表型，這是因為人工重建與腫瘤細胞在供體內的生長環 境體相類似的體外培養條件造成的。所以積聚的抗原需要進行嚴格控制。下面 進一步說明根據本發明實施例二進行抗原質量鑑定的方法。
根據在對抗原混合物重複進行質譜分析後得到的數據，不少於95%質量比 的糖基化肽類得到複製，可以作為兩個待比較的抗原組合物的標準品。如果積 聚的用於疫苗接種的抗原，其比例不少於一般新分離的腫瘤細胞中糖基化肽類 質量的90%,則認為此抗原是可以用於治療的。
從實驗數據中可得知，直腸肺瘤細胞只有使用第 一和第二代傳代細胞在培養3-4天的情況下，才可用於製備適合免疫接種的抗原。不能否認，在生長培 養基中加入一些成分，可以保持細胞表型，增加細胞傳代次數，利於疫苗抗原 的積聚。
當不能從腫瘤組織中製備得到足夠數量的細胞時，則必須對細胞進行培養 以增殖，直至達到所需數量，同時必須在細胞培養期間控制表面抗原的變異。 根據本發明，在培養過程中控制抗原組成，不需另外的細胞增殖。例如，細胞 培養期間，每周一次或兩次的用不會使細胞致死的蛋白酶進行處理，以及進行
質譜分析。
肺瘤和疫苗抗原的鑑定，保證了由疫苗誘導的抗腫瘤免疫反應的特異性。
對比原肺瘤抗原和根據本發明所提供的抗原之間的質i普，可以進行鑑定。圖 2A所示為原腫瘤細胞表面抗原的質譜圖。圖2B所示為利用本發明所提供的 方法製備的適用於疫苗接種的抗原質譜圖(圖2A和圖2B的質譜具相似性)。 圖2C所示也是根據本發明所得到的不適用於疫苗接種的抗原的質譜圖(圖2A 和圖2C所示明顯不同)。箭頭指向的面積分別對應消失的抗原(圖2B)和新 出現的抗原(圖2C)。因此，通過控制肽類的組成，可以積聚到疫苗接種所需 足夠數量的抗原，從而誘導特異性抗肺瘤免疫反應。
為了確定來自腫瘤細胞表面蛋白的抗原的真正起源(雖然這對發明的實現 是非必要的)，給出了抗原片段的質譜圖，如圖3所示的圖例。
為此，在加入胰蛋白酶孵育細胞的過程獲得的樣品，先用自動吸管的頭取 反相ZipTipd8(Millipore Corp.， USA),按照說明書的方法進行脫鹽。按照前述 方法將其置於質鐠儀的樣品板上。質譜是通過離子片段的狀態進行記錄的。蛋 白的鑑定是通過搜索系統Mascot (MatrixScience, USA)進行，該系統建立於蛋 白質序列資料庫NCBI (USA)的人類分類單元，使用離子質譜 'b，和'y，(序 列標記法)和/或使用已確立的胺基酸序列。(新生法& "ovo method)
圖3A和圖3B顯示了分離的質量在1640-1480Da之間的糖基化肽類的碳 水化合物部分，裂解片>^分子量為162Da、 203Da和291Da,這分別與己糖(甘 露糖，葡萄糖或者半乳糖)、乙醯葡萄糖胺和唾液酸相對應。利用肽類片段， 可以確定其氨基S吏序列，並可利用其免疫球蛋白重鏈(含大部分CD抗原，組 織相容性複合體，T-細胞受體和細胞粘附分子)上的可變區和恆定區、低密度 脂蛋白受體、白細胞介素IR-2受體、G蛋白偶聯受體、主要組織相容性複合體I和II來確定抗原混合物中的肽類。圖3C所示為一個分離片段，其中利用
b-y離子指示出分子量為857.4Da的雙電荷肽類，確定的胺基酸序列與G蛋白 結合受體的片段相對應
lie Cys Cys Ala Cys Cys Leu Cys Arg Asn Asn Cys Cys Val Phe Arg 15 10 15
圖3D所示為另一個分離片段，由b-y離子示出具有分子量為573.3Da的 單電荷肽類，確定的氨基S吏序列與主要組織相容性複合體II相對應 Ala Val Leu Asn Arg
1 5 因此，根據本發明獲得的抗原的特徵如下
1) 它們是有水溶性物質組成，主要為糖基化的肝水解蛋白(當用胰蛋白 酶作為蛋白酶時，它們的序列通常以賴氨酸或精氨酸結尾)，其分子量為 1.2-4kDa,
2) 它們來源相同——都是肺瘤細胞質膜外蛋白的胞外片段，
3) 它們都是在不使得細胞死亡的濃度條件下用蛋白酶處理活的細胞而得 到的。
根據本發明得到的腫瘤抗原混合物，其實際應用是由確定的胺基酸序列與 細胞表面呈現的與蛋白片段混合存在的修飾的(糖基化)肽類來決定。眾所周 知，腫瘤疾病的發生，是免疫系統無法破壞機體中形成的腫瘤細胞的結果。經 過積聚純化的抗原，與能增強免疫反應的佐劑相混合，然後注入人體或動物體 內。由於生物體細胞和體液免疫反應的存在，在機體消滅注射入體內的肽類的 同時，體內已有的或新出現的肺瘤細胞也會被破壞，從而決定了抗肺瘤疫苗接 種的治療和預防效果。為了發揮免疫反應的最大作用，可重複注射抗原。
為了確定根據本發明所得抗腫瘤疫苗的活性，用20隻年齡和體重相同的 BALB/c系雄性小鼠做模型試驗(10隻作為對照，10隻作為實驗組)。
根據實施例一得到的腫瘤抗原，來自於培養的肝癌細胞H22。將收集的抗 原採用葡聚糖凝膠G-10進行凝膠過濾脫鹽，然後並用真空濃縮器SpeedVac 進行濃縮。
先將抗原與完全弗氏佐劑以1:1 (體積比)的比例混合，然後取150ug進 行皮下注射。使用不完全弗氏佐劑在三周內進行反覆免疫(每周注射一次)。對照組動物同時注射混有生理溶液的弗氏完全佐劑。在第四次免疫接種後，用 皮下注射的方法將1百萬個肝細胞瘤H22接種到小鼠體內。記錄三個月內對
照組和實驗組動物的存活率。繪製存活曲線(圖4)確定根據本發明所得抗原
的抗腫瘤活性。
需要注意的是，該動物實驗的結果並不能認為本發明僅能在動物中成功應 用，因為動物和人的抗腫瘤免疫的機制是一樣的。抗原的使用方法和其在每公 斤體重的使用劑量，保證了其在人類免疫療法中的作用，但是針對每一個病人， 其治療方案可以根據病情的嚴重性，疾病所處的階段，腫瘤細胞的突變性，機 體針對抗原而產生顯著性免疫應答的能力等，進行個體化定製。
進一步地，以下提供抗肺瘤疫苗和及其抗腫瘤療法，該腫瘤疫苗是基於表 面肺瘤抗原，根據本發明實施例二而製備，用於進行人的抗腫瘤治療。
疫苗包含lmg腫瘤抗原混合物，該抗原是根據本發明實施例二製備的， 溶於0.5ml的曱矽烷磷酸鹽緩沖溶液中，並與lml的佐劑山小星蒜鹼 (Montanide) ISA-51 ( Syntex廠利用含有角鯊烯、Plu匿icL121、吐溫-80的 油水乳劑製備而成的佐劑)混合。
給患者皮下注射一個劑量的疫苗，每周一次，持續三周以及每月一次，持 續五個月。
用注射腫瘤抗原的免疫強度來評估疫苗的效果。在注射後2-3，注射抗原 引起的過敏性反應通過注射局部紅斑的尺寸來衡量。以首次注射後出現的紅斑 尺寸作為基數。重複疫苗接種引起明顯的過壽文反應，表示免疫反應的發生。
根據本發明的其他實施方式，進行抗腫瘤免疫療法也可採用靜脈或肌肉注 射疫苗，也可注射不含佐劑的疫苗。
由於腫瘤抗原混合物的使用，通過本發明所提供方法可確保免疫反應的發 生。疫苗中存在的許多抗原，保證能對每一個細胞產生免疫反應，這些細胞自 身沒有具有相同胺基酸序列的表面蛋白。
因此，本發明與現有的使用單價疫苗的方法相比，其抗腫瘤免疫療法的效 果增強很多倍。
本發明提供的由腫瘤細胞表面抗原組成的富含腫瘤特異性抗原的疫苗，其 應用為抗腫瘤免疫療法的實施提供了可能。
產生這種療效，主要是由於用不使細胞死亡濃度的蛋白酶對腫瘤細胞進行處理。釆用不使細胞死亡濃度的蛋白酶，僅能使胂瘤細胞的表面抗原分離，而 不會使細胞死亡。而細胞死亡會伴隨著細胞膜的損壞，從而使得疫苗中出現細 胞質內容物，特別出現大量的非疫苗成分的胞內蛋白。這會降低已有疫苗中腫 瘤特異性抗原部分含量減少，擾亂免疫應答，從而降低免疫應答的特異性，即 肺瘤抗原的特異性。
因此，使用根據本發明製備的富含腫瘤抗原的疫苗，可提高抗腫瘤免疫療 法的效果。
此外，免疫療法的效果提高，是因為使用了積聚自培養的原代腫瘤細胞的 抗原。這種製備抗腫瘤疫苗的方法，其收集抗原的步驟可以在每次蛋白酶處理 之後，這樣每次收集的抗原組成實際上是一樣的，如此增加了用於疫苗接種的 從原代細胞培養中獲得的疫苗的數量。使用僅對特定腫瘤具有抗原特異性的疫 苗是安全的，因為收集抗原的組分是可控的。
本發明不會導致疫苗中出現對特定腫瘤具有非特異性的抗原。這種非特異 性抗原可能出現在現有的用增殖細胞製備的疫苗中，這是因為體外繁殖過程中 的原代培養改變了其抗原組成。因此，從增殖細胞中收集得到的抗原混合物， 其組成與通過分離(而非培養)的肺瘤細胞而得到的抗原的組成明顯不同。
根據本發明製備的疫苗，可以是自體疫苗(從患者自身細胞獲得)或者異 體疫苗(從其他患者細胞獲得)。
在兩種情況下，本發明所提供的免疫療法都是有效的，因為不同患者的胂 瘤細胞，其表面的肽類具有相同的胺基酸序列。
此外，根據本發明製備的自體疫苗更有效，因為這時疫苗含有特定病人在 肝瘤發展過程中所個別擁有的、符合特定疾病階段的抗原特性。 工業應用
本發明基於細胞表面抗原製備腫瘤抗原，並在此基礎上治療腫瘤疾病，主 要利用疫苗接種的方法。
權利要求
1、一種基於表面腫瘤抗原的抗腫瘤疫苗，其特徵在於，所述疫苗包含表面腫瘤抗原的混合物，所述抗原是通過收集活的腫瘤細胞表面蛋白的肽類而得到的，所述肽類是通過向原代培養的活的腫瘤細胞周期性加入不使細胞死亡的蛋白酶進行處理而得到的。
2、 如權利要求1所述的抗腫瘤疫苗，其特徵在於，所述疫苗是在所述蛋 白酶為胰蛋白酶的條件下得到的。
3、 一種抗肺瘤疫苗的製備方法，包括培養肺瘤細胞和分離表面腫瘤抗原， 其特徵在於將預先從生長培養基上洗脫的腫瘤細胞進行培養，用蛋白酶對腫瘤細胞進 行不使細胞死亡的處理；收集釋放的表面腫瘤抗原；經過一段時間後，重複肺瘤細胞培養，所述時間的間隔足以使得表面抗原 被所述腫瘤細胞恢復；積聚表面腫瘤抗原直至達到滿足疫苗接種的劑量； 控制積聚的表面肺瘤抗原的組分。
4、 如權利要求3所述的製備方法，其中所述蛋白酶為胰蛋白酶。
5、 一種抗胂瘤免疫療法，包括將疫苗注入到患者體內的步驟，所述疫苗 由一種表面腫瘤抗原的混合物製得，所述表面腫瘤抗原為肽類，所述肽類來源 於腫瘤細胞表面蛋白，其特徵在於，所述表面腫瘤抗原混合物的應用，所述抗 原為收集的活的腫瘤細胞表面蛋白的肽類，是通過向原代培養的活的腫瘤細胞 中周期性地加入不使細胞死亡的蛋白酶進行處理而得到的。
6、 如權利要求5所述的療法，其中所述蛋白酶為胰蛋白酶。
7、 如權利要求5所述的療法，其中所述表面腫瘤抗原來自自體腫瘤細胞。
8、 如權利要求5所述的療法，其中所述表面腫瘤抗原來自同種異體腫瘤 細胞。
9、 如權利要求5所述的療法，其中抗腫瘤的所述疫苗含有佐劑。
全文摘要
本發明涉及醫療技術，尤其涉及腫瘤患者的免疫治療。抗腫瘤疫苗以表面腫瘤抗原為基礎，包含表面腫瘤抗原混合物。包括培養腫瘤細胞和分離表面腫瘤抗原。將預先從生長培養基上洗脫的腫瘤細胞進行原代培養，用蛋白酶對腫瘤細胞進行不使細胞死亡的處理，收集釋放的表面抗原。在一段時間間隔後，用蛋白酶重複處理原代培養的活體腫瘤細胞，該時間間隔足以使得細胞表面腫瘤抗原得到恢復。積聚表面腫瘤抗原，直至達到足夠的疫苗劑量，控制表面腫瘤抗原的組成。蛋白酶可以採用胰蛋白酶。本發明所提供抗腫瘤治療的方法，包括向患者體內注入抗腫瘤疫苗。本發明所達到的技術效果包括通過強化抗腫瘤免疫反應來提高腫瘤疾病的的治療效果。
文檔編號A61K38/00GK101636174SQ200780052044
公開日2010年1月27日 申請日期2007年10月16日 優先權日2007年3月7日
發明者彼得·詹裡耶維奇·盧克霍夫 申請人:彼得·詹裡耶維奇·盧克霍夫