氧化鐵‑介孔碳納米複合材料及其製備方法和應用與流程
2023-11-03 08:55:47 1
本發明涉及一種適體傳感器，特別涉及一種氧化鐵-介孔碳(fe3o4@c)納米複合材料及其製備方法和應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
現在大量的自然生成的抗生素經常被用於治療生病的動物、促進動物的生長。其中，土黴素(otc)作為一種使用頻率很高的抗生素，被廣泛應用於治療農業和水產養殖動物的傳染性疾病。然而，由於其較低的生物利用度，只有一部分otc可以在動物身體中代謝吸收，殘留的otc將被排洩並釋放到土壤、地表水和地下水中，這導致嚴重的環境問題和潛在的人類健康風險。因此，為了使人類免受殘留藥物的危害，世界衛生組織、歐盟和中國農業部規定土黴素在牛奶中的最大殘留限量為0.1mg·kg-1。迄今為止，對殘留土黴素的痕量檢測吸引了很多人的注意。傳統的檢測土黴素的方法有液相色譜、電泳、酶聯免疫吸附法和高效液相色譜法。即使這些傳統的方法可靠、靈敏和穩定，但是它們的應用因為一些缺陷如：昂貴的設施、高成本和樣品準備時間長而受到限制。為了滿足經濟快速發展和食品安全保障的要求，迫切需要制定新的傳感策略，為食品安全領域的otc殘留提供簡單、靈敏度高、便捷的檢測工具。
最近，因為與適配體的靶向結合位點互補的寡核苷酸的順序可以設計，適體基生物傳感器檢測小分子靶標(適體傳感器)越來越引起關注。與抗體生物傳感器相比，適體傳感器具有更高的親和力、合成方法簡單、方便標記和更好的穩定性等優點。適體傳感器綜合了電化學技術的優點和適體傳感器的卓越的性能，所以它的發展引起很多人的興趣。為了尋求更好地固定平臺，已經探索不同修飾電極的材料包括碳納米材料、金屬納米粒子、導電聚合物等等，用於提高裝載量以及探針分子的生物活性。
近年來，作為一個新興的納米多孔材料，金屬有機框架材料(mofs)由有機配體連接金屬節點合成，由於其具有獨特的性能，例如高表面積，以及結構和功能的可調性，已經顯示出很好的應用前景。而以mofs為模板製備的相關納米材料已經廣泛應用於超級電容器，電極材料和催化劑。在這些mofs材料中，fe基mofs(fe-mofs)表現出卓越的化學穩定性，因為它們的毒性低且含量豐富，最重要的是它們的路易斯強酸性，這使它可以與羧酸鹽更好地配位，使骨架更穩定。此外，fe-mofs用作電極材料時具有優異的生物相容性和氧化還原活性。然而，在實際應用中fe-mofs的導電性差從而導致循環性能差。
技術實現要素：
本發明的主要目的在於提供一種氧化鐵-介孔碳納米複合材料及其製備方法和應用，以克服現有技術的不足。
為實現前述發明目的，本發明採用的技術方案包括：
本發明提供了一種氧化鐵-介孔碳納米複合材料，包括多孔碳基質以及至少均勻分布於所述多孔碳基質內的複數個fe3o4納米顆粒。
進一步的，所述多孔碳基質為多孔碳納米片，並且至少所述多孔碳納米片內嵌入有複數個fe3o4納米顆粒；
優選的，所述多孔碳納米片的表面也分布有fe3o4納米顆粒；
優選的，所述fe3o4納米顆粒的粒徑為8-70nm，優選為40-70nm，尤其優選為60-70nm；
優選的，所述多孔碳基質所含孔洞的孔徑為18.5-29.7nm；
優選的，所述多孔碳基質為無定型碳基質；
優選的，所述多孔碳納米片的厚度為3-8nm，所述多孔碳納米片的孔徑為18.5-29.7nm；
優選的，所述多孔碳基質與所述fe3o4顆粒的質量比為10.64∶1-26.08∶1；
優選的，所述氧化鐵-介孔碳納米複合材料的比表面積為27.24-315.12m2.g-1。
本發明還提供了一種氧化鐵-介孔碳納米複合材料的製備方法，包括：
提供fe-mofs，
以及，將fe-mofs於350-900℃溫度下煅燒4-6h，然後冷卻至室溫，獲得氧化鐵-介孔碳納米複合材料。
進一步的，所述方法包括：將fe-mofs以5-7℃·min-1的升溫速率加熱至350-900℃，並保溫煅燒4-6h，然後自然冷卻至室溫，獲得氧化鐵-介孔碳納米複合材料。
進一步的，所述方法包括：將feso4·7h2o，4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，n-甲基甲醯胺(nmf)和n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)混合後，於140-160℃加熱3-5d，製得所述fe-mofs；
優選的，所述h3ntb與feso4·7h2o的摩爾比為(1-3)∶(8-10)；
優選的，所述nmf與nmp的體積比為(1-3)∶(1-3)。
本發明還提供了一種土黴素電化學適體傳感器，包括：
所述氧化鐵-介孔碳納米複合材料；
修飾於所述氧化鐵-介孔碳納米複合材料上的土黴素適體鏈。
進一步的，所述土黴素電化學適體傳感器還包括：電極基體，所述fe3o4@c納米複合材料固定於所述電極基體表面；
優選的，所述電極基體包括金電極；
優選的，所述土黴素適體鏈的序列為：5『-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3』。
本發明還提供了一種土黴素電化學適體傳感器的製備方法，包括：
採用前述的方法製備氧化鐵-介孔碳納米複合材料；
將所述氧化鐵-介孔碳納米複合材料分散於溶劑形成均勻懸浮液，將所述均勻懸浮液施加於電極基體上並乾燥；
以土黴素適體鏈的溶液浸潤固定於所述電極基體上的氧化鐵-介孔碳納米複合材料，使土黴素適體鏈修飾於氧化鐵-介孔碳納米複合材料上，形成所述電化學適體傳感器。
本發明另一方面還提供了一種土黴素的檢測方法，包括：
提供所述土黴素電化學適體傳感器；
將所述土黴素電化學適體傳感器浸漬於可能含有土黴素的待測液體樣品中，之後以所述土黴素電化學適體傳感器作為工作電極進行電化學測試，實現對待測液體樣品中土黴素的檢測。
進一步的，所述電化學測試方法包括電化學阻抗譜或循環伏安法。
與現有技術相比，本發明的優點包括：
本發明提供的fe3o4@c納米複合材料的納米結構具有低毒性、高穩定性和電化學活性；
本發明提供的基於fe3o4@c納米複合材料的適體傳感器製備方法簡單，檢測流程簡單；並且所述適體傳感器的比表面積高、生物親和力強、檢測靈敏度高、檢測限低，可用於快速、精確地檢測otc。
附圖說明
圖1a是本發明實施例1中fe-mofs的ntb配體的配位模式結構示意圖；
圖1b是本發明實施例1中fe-mofs的1-d棒狀陣列的視圖；
圖1c是本發明實施例1中fe-mofs的3-d框架結構示意圖；
圖2是本發明實施例1中fe-mofs的晶體結構數據示意圖；
圖3a、圖3b、圖3c分別是本發明實施例2中fe-mofs、fe3o4@c納米複合材料的xrd與tga圖；
圖4a1、圖4a2、圖4b1、圖4b2、圖4c1、圖4c2、圖4d1、圖4d2、圖4e1、圖4e2分別是本發明實施例2中fe-mofs、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900納米複合材料的xps分解譜；
圖5是本發明實施例2中fe-mofs、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900複合材料的xps全譜圖；
圖6a、圖6b是本發明實施例2中fe-mofs在3000倍和1800倍的sem圖，圖c、圖d是tem圖；
圖7a、圖7b、圖7c、圖7d、圖7e、圖7f、圖7g、圖7h分別是本發明實施例2中fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的納米複合材料的低倍和高倍tem圖像，插圖是相應的saed圖；
圖8是本發明實施例2中fe-mofs和不同fe3o4@c納米複合材料的氮氣吸附-解吸附等溫線；
圖9a中的cv曲線和圖9b中的eis曲線是本發明實施例2中使用基於fe-mof開發的適體傳感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]3-/4-的溶液中檢測otc；
圖10a1、圖10b1、圖10c1、圖10d1、圖10a2、圖10b2、圖10c2、圖10d2分別是本發明實施例2中使用基於fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900開發的適體傳感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]3-/4-的溶液中檢測otc的cv和eis曲線圖；
圖11是本發明實施例2中使用基於fe-mof、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900開發的適體傳感器檢測otc的每個階段的δrct值；
圖12a是本發明實施例2中apt/fe3o4@c900/ae檢測不同濃度的otc(0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1ng·ml-1)的eis響應曲線；
圖12b是本發明實施例2中δrct與otc濃度的曲線，其中插圖為校準曲線的線性部分；
圖13a、圖13b分別是本發明實施例2中用於檢測otc的fe3o4@c900基適體傳感器的選擇性和重現性圖譜；
圖14a、圖14b分別是本發明實施例2中用於檢測濃度為0.005ng·ml-1的otc的fe3o4@c900基適體傳感器的的穩定性和再生性圖譜。
具體實施方式
鑑於現有技術中的不足，本案發明人經長期研究和大量實踐，得以提出本發明的技術方案。如下將對該技術方案、其實施過程及原理等作進一步的解釋說明。
本發明實施例提供了一種氧化鐵-介孔碳納米複合材料，包括多孔碳基質以及至少均勻分布於所述多孔碳基質內的複數個fe3o4納米顆粒。
進一步的，所述多孔碳基質為多孔碳納米片，並且至少所述多孔碳納米片內嵌入有複數個fe3o4納米顆粒；
優選的，所述多孔碳納米片的表面也分布有fe3o4納米顆粒；
優選的，所述fe3o4納米顆粒的粒徑為8-70nm，優選為40-70nm，尤其優選為60-70nm；
優選的，所述多孔碳基質所含孔洞的孔徑為18.5-29.7nm；
優選的，所述多孔碳基質為無定型碳基質；
優選的，所述多孔碳納米片的厚度為3-8nm，所述多孔碳納米片的孔徑為18.5-29.7nm；
優選的，所述多孔碳基質與所述fe3o4顆粒的質量比為10.64∶1-26.08∶1；
優選的，所述氧化鐵-介孔碳納米複合材料的比表面積為27.24-315.12m2·g-1。
本發明還提供了一種氧化鐵-介孔碳納米複合材料的製備方法，包括：
提供fe-mofs，
以及，將fe-mofs於350-900℃溫度下煅燒4-6h，然後冷卻至室溫，獲得氧化鐵-介孔碳納米複合材料。
進一步的，所述方法包括：將fe-mofs以5-7℃·min-1的升溫速率加熱至350-900℃，並保溫煅燒4-6h，然後自然冷卻至室溫，獲得氧化鐵-介孔碳納米複合材料。
進一步的，所述方法包括：將feso4·7h2o，4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，n-甲基甲醯胺(nmf)和n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)混合後，於140-160℃加熱3-5d，製得所述fe-mofs；
優選的，所述h3ntb與feso4·7h2o的摩爾比為(1-3)∶(8-10)；
優選的，所述nmf與nmp的體積比為(1-3)∶(1-3)。
本發明還提供了一種土黴素電化學適體傳感器，包括：
所述氧化鐵-介孔碳納米複合材料；
修飾於所述氧化鐵-介孔碳納米複合材料上的土黴素適體鏈。
進一步的，所述土黴素電化學適體傳感器還包括：電極基體，所述fe3o4@c納米複合材料固定於所述電極基體表面；
優選的，所述電極基體包括金電極；
優選的，所述土黴素適體鏈的序列為：5『-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3』。
本發明還提供了一種土黴素電化學適體傳感器的製備方法，包括：
採用前述的方法製備氧化鐵-介孔碳納米複合材料；
將所述氧化鐵-介孔碳納米複合材料分散於溶劑形成均勻懸浮液，將所述均勻懸浮液施加於電極基體上並乾燥；
以土黴素適體鏈的溶液浸潤固定於所述電極基體上的氧化鐵-介孔碳納米複合材料，使土黴素適體鏈修飾於氧化鐵-介孔碳納米複合材料上，形成所述電化學適體傳感器。
本發明另一方面還提供了一種土黴素的檢測方法，包括：
提供所述土黴素電化學適體傳感器；
將所述土黴素電化學適體傳感器浸漬於可能含有土黴素的待測液體樣品中，之後以所述土黴素電化學適體傳感器作為工作電極進行電化學測試，實現對待測液體樣品中土黴素的檢測。
進一步的，所述電化學測試方法包括電化學阻抗譜或循環伏安法。
如下將結合具體實施例對該技術方案、其實施過程及原理等作進一步的解釋說明。
本發明如下實施例中採用的fe(no3)3·9h2o，4，4′，4″-亞硝基二苯甲酸(h3ntb)，n-甲基吡咯烷酮(nmp)和甲酸可以從上海晶純生化科技股份有限公司購買；土黴素(otc)、四環素、強力黴素和金黴素可以從索萊寶公司購買。如下實施例中採用的水均是超純水(18.2ωcm-1)。所有試劑均為分析純級別。本發明實施例中採用的otc適體序列是：5『-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3』。因為適體是具有獨特3d結構的功能性ssdna或rna，可以以高特異性和親和力識別並結合其同源靶標，這些功能鏈主要針對目標檢測。
如下實施例中採用的表徵設備及方式如下：
在perkin-elmer240chn元素分析儀上進行c，h和n的分析，使用nicolet850光譜儀(thermoelectroncorporation，massachusetts，usa)通過傅立葉變換紅外光譜(ftir)分析納米複合材料的化學結構；使用cukα輻射在rigakud/max-2500x射線衍射儀上記錄x射線衍射測量(xrd)；用labsysnetzschtg209setaram儀器在n2氣氛中加熱速率為10℃·min-1時測量熱重(tga)；使用axishis165光譜儀(kratosanalytical，manchester，uk)採用單色鉻化alkαx射線源(1486.71ev光子)測量x射線光電子能譜(xps)；採用日本jeoljem-2100高分辨透射電子顯微鏡測試高解析度透射電子顯微鏡圖像(hr-tem)，在超高度真空下，在帶有隔膜和渦輪泵系統的belsorpmax體積吸附設備上，測量n2吸附-脫附數據。
x射線單晶分析：用安裝石墨單色mokα或cukα(λ＝0.71073或)安捷倫科技公司的supernova單晶晶體計在不同溫度下測量數據，用shelxs(直接方法)解析結構，並在olex2包中用shelxl(全矩陣最小二乘法)進行修正。所有非氫原子都用各向異性位移參數重新定義，將連接到碳上的氫原子置於幾何理想的位置，並使用模型進行修復；由於框架中的溶劑分子性質高度無序，不能直接確定，因此採用platon軟體中的squeeze程序進行處理。晶體數據、tga和元素分析的組合可以確定化學式，c372h493na31n66o164的晶體數據(m＝5973.07g.mol-1)：立方體，空間群f-43c(編號219)，a＝48.1642(8)，v＝111731(5)z＝8，t＝293(2)k，μ(cukα)＝0.640mm-1，dcalc＝0.710g·cm-3，15687測量的反射(6.356°≤2θ≤144.072°)，7387獨特(rint＝0.0604，rsigma＝0.0594)，最終的r1為0.0954(i＞2σ(i))，wr2為0.2877。
如下實施例中涉及的電化學測量方案，包括電化學阻抗譜(eis)和循環伏安法(cv)可以採用chi660d電化學工作站(上海辰華)測量。測試使用常規的三電極系統，其中包括作為工作電極的直徑為3mm的金電極，作為參比電極的ag/agcl(飽和kcl)電極和作為對電極的鉑片；在含有0.1mkcl的0.5mm[fe(cn)6]3-/4-(eis參數：電位：0.21v；頻率範圍：100khz至0.1hz；振幅：5mv)中測得eis曲線；使用zview2軟體分析譜圖，使用非線性最小二乘擬合來確定等效電路中的元件參數。
實施例1：
通過混合0.242gkh2po4，1.445gna2hpo4·12h2o，0.200gkcl和8.003gnacl，並加入0.1mhcl溶液調節混合物的ph＝7.4，獲得磷酸鹽緩衝溶液(pbs，ph7.4)。用pbs配製適體和otc溶液，通過將1.650gk3fe(cn)6和2.111gk4fe(cn)6溶於1lpbs中即可製備電解質溶液。
在特氟隆襯裡的不鏽鋼容器中加入22.2mg的feso4·7h2o，3.0mg的4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，2ml的n-甲基甲醯胺(nmf)和2ml的n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)的混合物，在160℃的烘箱中下加熱3d。用dmf洗滌之後得到棕色片狀晶體，即為fe-mofs。產率：45％，基於h3ntb配體。ir(kbr，cm-1)：3414w(br)，1682m，1654m，1592vs，1555m，1505m，1398vs，1354m，1318m，1266m，1173m，1102w，1013w，840w，784m，713w，671w，629w，583w，532w，513w，436w；元素分析(計算值)：c56h50fe3n6o16：c，51.6(52.5)；h，4.43(5.05)；n，7.40(6.93)，所述fe-mofs的晶體結構數據如圖1、2所示。
將所製備的fe-mofs置於管式爐中並以5℃·min-1～7℃.min-1的升溫速率升至350℃、550℃、700℃和900℃，分別在350℃、550℃、700℃和900℃煅燒4h～6h；然後將樣品自然冷卻至室溫，獲得一系列氧化鐵-介孔碳納米複合材料，其可以被分別命名為：fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900。
fe-mofs和fe3o4@c納米複合材料的化學結構和組分分析：
採用xps測量fe-mofs和fe3o4@c納米複合材料的化學成分和所處環境。五個樣品的xps光譜都表明它們有與c、o和fe相關的特徵峰以及較弱的n峰；c1s和o1s的特徵峰來自於有機配體，fe2p的峰源自於配位中心fe。圖3a、3b、3c分別是fe-mofs和fe3o4@c納米複合材料的xrd和tga圖；
表1為各個原子的百分含量，從表1中可以看出對於在不同溫度下fe-mofs熱解後的材料，例如fe3o4@c350，c1s含量首先降低到一定程度，這是由於含碳有機溶劑(nmf)的揮發和甲酸的分解。隨著煅燒溫度升高到550℃、700℃和900℃，c1s含量不斷增加，表明有機連接體配體熱分解產生多孔碳。對於fe2p和o1s含量，fe3o4@c350首先增加到一定程度，然後隨著煅燒溫度的升高而連續下降，變化趨勢與c1s含量相反。
表1fe-mofs和熱裂解後不同fe3o4@c納米複合材料的原子百分比
為了進一步了解熱分解前後fe-mofs和fe3o4@c納米複合材料的化學成分c1s和fe2p，還分析了它們的xps圖(如圖4(a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1、d2、e1、e2)所示)。原始的fe-mofs(圖4a1)的c1s分解譜可以分為5個主峰，在～283.7、～284.8、～285.6和～287.9ev，分別對應c-c/c-h、c-n、c-o、coo-和π-π*的基團，這些峰都源自於有機連接配體。至於在不同溫度下熱裂解的材料，例如fe3o4@c350(圖4b1)，在c1s高解析度xps光譜中有與c＝o基團對應的～286.8ev附加峰；對於fe3o4@c550和fe3o4@c700(圖4c1和d1)，c1s高解析度xps光譜中的結合能的位置與fe-mofs的結合能一致，但強度是不同的，至於fe3o4@c900，在c1s高解析度xps光譜(圖4e1)中也觀察到分配給c＝o基團的～286.8ev處的附加峰。
從五個樣品(圖4a2，圖4b2，圖4c2，圖4d2和圖4e2)的fe2p核心光譜可以觀察到明顯的差異。原始的fe-mofs(圖4a2)的fe2p光譜中的～711.1和～724.9ev，分別對應於fe2p3/2和fe2p1/2。fe-mofs熱解後，fe3o4@c350(圖4b2)的fe2p光譜有～711.0和～724.8ev兩個峰，與fe-mofs一致。隨著煅燒溫度的升高，fe3o4@c550(圖4c2)的fe2p光譜分為5個峰，分別為～709.3、～711.4、～717.7、～722.3和～724.1ev，結合能為711.4和724.1ev的峰是fe3+的特徵峰，而結合能為709.3和722.3ev的峰值是由於fe2+。此外，結合能為717.7ev的峰是由於fe2+和fe3+共同作用產生的伴峰。當溫度升至700℃和900℃時，fe3o4@c700和fe3o4@c900的fe2p光譜觀察到類似的情況(圖4d2和圖4e2)；fe3+、fe2+的特徵峰和伴峰的結合能分別位於712.5、725.3、710.0、723.0、717.5ev和711.3、724.0、709.2、722.1、717.6ev，樣品中fe2+和fe3+的存在進一步證實了fe3o4的形成。
圖6為fe-mofs的sem和tem圖像，從圖像中可以看出，fe-mofs是塊狀結構，大多數晶體超過幾十甚至幾百微米，尺寸不均勻分布，說明製備的fe-mofs更像多晶或粉末材料；fe-mofs的不連續性導致它們的導電性差，因此電化學活性不好。如圖7所示，從tem圖中可以看出在不同熱解溫度下的fe3o4@c納米複合材料的形態變化；在第一個溫度350℃下，保留了fe-mofs的塊狀形貌，在複合材料的邊緣可以觀察到fe2o3，如圖7a和圖7b所示大部分fe3o4@c350納米複合材料有均勻分布的球狀結構，所述球狀結構為fe3o4納米顆粒，平均尺寸約為8-10nm。此外，所選區域電子衍射(saed，圖7b，插圖)中的電子衍射圖是幾個晶格組成的同心圓形，表明fe3o4@c350納米複合材料是多晶，並且0.247和0.283nm的晶格空間為對應於(311)和(220)晶面，證明了fe3o4@c的形成。
如圖7c和圖7d所示，在第二階段(550℃)中，發現更大的球形顆粒形成並嵌入到多孔碳納米片中，而大多數顆粒團聚得到尺寸在100-150nm之間的納米球(所述納米球為fe3o4顆粒形成的團聚體)。這可能是因為有機殘餘物作為還原劑使fe2o3轉化為fe3o4，並且在製備用於tem的樣品時可能分散的不完全。此外，如圖7d，插圖中的saed圖案顯示了fe2o3和fe3o4的晶格，其中所述fe3o4納米顆粒呈現為單分散狀態。如圖7e圖，圖7f，圖7g和圖7h所示，當煅燒溫度進一步提高至700℃和900℃，由於晶體聚集會引起的氧化鐵顆粒增大。如圖7e和7f所示，從700℃下煅燒的fe-mofs的tem圖像可以看出納米複合材料是複合結構，從中可以看到平均直徑為40nm的由薄碳邊界單獨包裹的fe3o4納米顆粒，並且這些顆粒分散在多孔碳的基質內部和/或表面，如圖7g和圖7h所示，在fe3o4@c900納米複合材料中觀察到類似的情況，fe3o4顆粒的平均尺寸(粒徑)增加到60-70nm，多孔碳作為fe3o4顆粒聚集的緩衝區使晶體分布的更均勻，圖7f和7h中的插圖saed說明已經形成典型的fe3o4晶格，進一步證明了fe3o4的形成。
fe-mofs和不同fe3o4@c納米複合材料的n2吸附-脫附等溫線如圖8所示，fe-mofs和煅燒產物的比表面積分別為846.19，27.24，119.45，315.12和258.03m2.g-1。
實施例2：
將適體在90℃下孵育5min，然後緩慢冷卻至室溫，將實施例1所製備的fe3o4@c350粉末(0.5mg)加入到乙醇中並徹底超聲直至獲得均勻的fe3o4@c350懸浮液；然後，將10μl的fe3o4@c350懸浮液(0.5mg·ml-1)鋪展到金電極(ae)的表面上，然後在室溫下乾燥5h；隨後，將修飾的電極浸入適體溶液(100nm)中2h，保證適體鏈固定在電極表面上直至達到飽和狀態；在該過程中，適體與fe3o4@c納米複合材料通過適體鏈與靶特異性部分形成醯胺鍵結合，這將導致氧化還原探針對修飾的ae的表面接近程度降低，因此電化學活性將減小。最後，將適體固定的fe3o4@c350/ae浸入otc溶液中進行電化學測試。在電化學檢測中，配體可以形成與otc具有高親和力的g-四鏈體結構。
為了比較，也以相同的方式構築基於前述fe-mofs、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的適體傳感器作為對比。
之後將空白ae、基於前述fe-mofs的適體傳感器、基於前述各氧化鐵-介孔碳納米複合材料的適體傳感器在含有一定濃度otc、0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]3-/4-的溶液中檢測otc，其中採用的電化學檢測方法是cv和eis。
如圖9a中的cv曲線所示，空白ae圖中有一對明確的可逆氧化還原峰，峰間電位差(δep)為248mv。ae經fe-mofs改性後(fe-mof/ae)，δep增加到292mv，氧化還原峰電流相應降低，說明fe-mofs塗在ae上後導電率降低。當otc靶向適體鏈(apt)固定在fe-mof/ae表面時(apt/fe-mof/ae)，δep稍微升高到311mv，氧化還原峰電流幾乎不變，表明apt對於fe-mof/ae的影響不明顯。然而，當使用製備的apt/fe-mof/ae檢測otc時(otc/apt/fe-mof/ae)，δep進一步增加到369mv，氧化還原峰電流進一步降低，證明了otc/apt/fe-mof/ae的導電性和電化學性降低。從圖9b中的eis圖中可以得出檢測otc的不同階段的四種aes的電荷轉移電阻(rct)分別為141.2、366.6、427.5和478.1ω，表明在空白ae上固定有fe-mofs，apt和otc之後電化學活性降低依次，rct結果的變化趨勢與上述cv結果一致。
採用同樣的方式測試基於前述fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的適體傳感器的cv曲線，結果如圖10a1、10b1、10c1、10d1所示。其中，基於fe3o4@c350的傳感器(apt/fe3o4@c350/ae)的四個aes的δep分別為271、301、354和399mv；基於fe3o4@c550的傳感器(apt/fe3o4@c550/ae)的四個aes的δep分別為256、305、402和463mv；基於fe3o4@c700的傳感器(apt/fe3o4@c700/ae)的四個aes的δep分別為243、354、433和500mv；基於fe3o4@c900的傳感器(apt/fe3o4@c900/ae)的四個aes的δep為251、283、354和420mv。結果表明，δep和氧化還原峰電流的變化趨勢均符合相同的規律，即在空白ae被fe3o4@c、apt和otc連續固定後，δep連續增加，氧化還原峰電流下降，四種基於fe3o4@c納米複合材料的適體傳感器的電化學活性相應降低。如圖10a2、10b2、10c2、10d2所示，是用eis表示基於在不同溫度下煅燒的四種fe3o4@c納米複合材料適體傳感器來檢測otc的整個過程。對於空白ae，在較高頻率處有小的半圓，分別對應(a)fe3o4@c350，(b)fe3o4@c550，(c)fe3o4@c700和(d)fe3o4@c900的rct值為122.7、39.26、69.17和42.24ω。用四種fe3o4@c納米複合材料分別改性後，rct值分別明顯增大到260.7、98.4、133.3和119.6ω，表明fe3o4@c納米複合材料的電導率相對較差；當otc靶向適體(apt)鏈固定在fe3o4@c/aes表面時，apt/fe3o4@c/ae的rct值分別進一步分別增加到330.3、183.0、236.8和334.1ω，因為適體鏈中包含的帶負電荷的磷酸基與[fe(cn)6]3-/4-氧化還原對之間的相互排斥作用，所以分析物溶液和電極之間的界面處的rct增加。當使用製備的fe3o4@c基適體傳感器來測定otc時，eis曲線的半圓進一步增加，半圓曲線的相應rct值分別為409.6、288.2、375.3和507.3ω，在otc存在的情況下，otc靶向的適體鏈通過與otc結合而改變其構象，以形成g-四鏈聯體，這將阻止電荷轉移。此外，如在n2吸附-脫附等溫線中所討論的，fe3o4@c納米複合材料具有介孔結構和高比表面積，因此otc可以吸附到fe3o4@c納米複合材料上，大量的otc被吸附到apt/fe3o4@c/aes的表面，進一步使電荷轉移變得困難。因此，otc的阻塞和阻塞效應都導致apt/fe3o4@c/ae的電化學活性顯著降低。
為了比較fe-mofs和四種基於fe3o4@c納米複合材料的電化學適體傳感器對檢測otc的不同檢測效果，本發明提供了前述五個生物傳感體系每步的rct值(δrct)的變化並表示在圖11中。δrct值的差異如圖11中的柱狀圖所示，從柱狀圖可以看出，與其他四種材料相比，fe3o4@c900/ae表面的apt吸附量最大，由於fe3o4@c900/ae的比表面積和介孔結構最高，因此可以進一步幫助吸收大多數otc，並具有最大的δrct(rct，apt-rct，材料)和δrct(rct，otc--rct，apt)。因此，測量電化學的最佳電極材料是fe3o4@c900。
apt/fe3o4@c900/ae的靈敏度測試：通過將apt/fe3o4@c900/ae與不同濃度的otc一起孵育，然後在[fe(cn)6]3-/4-溶液中測定它們的eis圖譜。圖12a是用於檢測不同濃度的otc的apt/fe3o4@c900/ae的eis圖，因為適體傳感器對otc的有效識別，所以rct的值隨otc濃度的增加(從0.005至1.0ng·ml-1)而逐漸增加。這可能是因為隨著otc濃度的增加，在納米複合電極表面上產生了抗原-抗體複合物之間更多的分子識別，從而導致了rct值的增強。傳感器在檢測otc之前和之後的δrct是確定的數值(參閱圖12b)，且當otc濃度的對數值(logcotc)的範圍從-2.301到0時，δrct值與logcotc成正比，它的線性回歸方程為δrct＝0.676logcotc+1.762，相關係數(r2)為0.9944。根據langmuir吸附方程，在信噪比(s/n)比為3時，模擬檢測限(lod)低至0.027pg·ml-1。
apt/fe3o4@c900/ae的選擇性和穩定性測試：使用apt/fe3o4@c900/ae分別檢測可能與otc共存的濃度為10-3nm(otc濃度的10倍)的抗生素包括四環素、多西環素、金黴素和空白pbs緩衝液。如圖13a所示，與檢測otc顯著的δrct響應值相反，通過添加其他幹擾得到的響應變化可忽略。因此，otc與其相應的探針適體之間具有高度特異性，電化學適體傳感器對otc具有較高的選擇性；再現性是評估開發適體傳感器性能的重要指標，在相同條件下製備的五個基於fe3o4@c900納米複合材料的適體傳感器，通過檢測在室溫(25℃)下溶解於pbs中的10-5nm的otc引起的δrct值來測試適體傳感器的再現性(圖13b)。用五個適體傳感器同時檢測相同濃度的otc的δrct值的相對標準偏差(rsd)為2.6％，表明傳感器之間的重現性很好。
此外，穩定性和再生性也是評估適體傳感器性能的重要指標。在數天之內，每次測量後將電極浸入超純水中並將其保存在4℃的冰箱中並記錄電極的δrct值，用這些δrct值來表示fe3o4@c900適體傳感器的穩定性(圖14a)。15天後未發現60nmotc的rct明顯減少；再過一周，rct值下降約10％，一個月後，下降了約17％。在室溫下將結合有otc的納米複合電極浸入1.0mnaoh中80分鐘並用水洗滌，測其rct值，然後再浸入相同濃度的otc溶液中2小時測其rct值，重複這個步驟數次，比較rct值並評估再生性。如圖14b所示，在前5次再生運行期間，觀察到適體傳感器的δrct值沒有實質變化，表明可以容易地再生。所有這些結果表明，本發明提供的適體傳感器不僅具有高靈敏度和選擇性，而且具有良好的再現性，穩定性和再生性。
實施例3：
採用實施例2製得的一系列傳感器對實際樣品進行測試，該實際樣品為牛奶。相應的測試過程包括：
在50ml離心管中，將12ml生奶與18ml超純水以及6ml10％三氯乙酸和氯仿的混合物在渦流震蕩下混合1min以沉積蛋白質並溶解基質中的有機物質，然後將混合物在20℃下超聲處理15min，並以13000rpm離心10min以分離沉積物；將上清液轉移到另一個離心管中，並以10000rpm離心10min以再次除去沉積物；在原液中加入一定量的otc，然後按照上述步驟進行預處理和分析；根據上述方法檢測所述溶液，通過hplc分析加標樣品以驗證所提出的分析方法的可靠性。
根據圖12b的標準曲線得到結果。如表2所示，該適體傳感器的回收率為98％至104％，rsd小於3.0％。同時，根據中國國家標準gb/t22990-2008，還用hplc測定了牛奶中的otc，通過比較得出本發明提供的適體傳感器的結果完全符合hplc的要求，這些都表明這一新策略對於快速檢測牛奶中的otc具有很高的重現性，準確性和可行性。
表2開發的適體傳感器檢測牛奶樣品中的otc
本發明通過將fe-mofs於不同溫度熱解形成一系列fe3o4@c納米複合材料，在這些納米複合材料中fe3o4納米顆粒均嵌入介孔無定形碳基底中，使得這些納米複合材料均具有比表面積高，生物相容性好，生物親和力強等優點，特別是其中的fe3o4@c900對otc的檢測顯示出最佳的電化學活性，因此可以用於構建電化學適體傳感器。尤其是，基於fe3o4@c900開發的otc適體傳感器顯示出高靈敏度，在otc濃度從0.005到1ng·ml-1的寬線性範圍內檢測限低至0.027pg·ml-1，同時該傳感器還具有高選擇性，良好的再現性，穩定性，再生性和適用性等特徵。
應當理解，上述實施例僅為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。