B肝L基因和結核Ag85B融合基因及其表達載體的構建與應用的製作方法

2023-12-08 10:15:36 3

專利名稱：B肝L基因和結核Ag85B融合基因及其表達載體的構建與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥生物工程技術領域，特別涉及一種B肝病毒全包膜L基 因與結核桿菌Ag85B的融合抗原基因及其載體的構建和表達方法。
背景技術：
B型肝炎病毒(H印atitis B virus ， HBV)和結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis ， MTB)感染所致傳染性疾病是嚴重危害我 國乃至全人類健康和生命安全的重大公共衛生問題。疫苗接種是預防和控制 B肝與結核發生和流行的重要手段。目前，B肝基因工程零組疫苗和卡介苗 在預防B肝和結核方面取得了巨大的成就，但各自還存在一些不足。如基因 工程重組B肝疫苗需多次接種，且部分人群接種後出現免疫不應答或低應 答，且該疫苗僅有預防目的，無治療作用。卡介苗在不同地區不同人群中存 在著差異，免疫保護效果不穩定(保護率為0_80%之間)，，由於MTB耐藥菌
株的出現以及愛滋病的合併感染以及世界人口流動的增加等等問題，使得 MTB近年來有死灰復燃的趨勢。因而，研究效果更好的B肝疫苗和結核疫苗 勢在必行。
DNA疫苗是近年興起的新型疫苗，具有亞單位疫苗或滅活疫苗的安全性， 同時具有減毒疫苗或重組疫苗才具有的誘導保護性細胞免疫應答的特點。 DNA疫苗構建方便、製備工藝簡單、化學性質穩定、保存運輸方便、價格低 廉、可用於構建多價疫苗及預防不同亞型的病毒感染。
疫苗種類和數量的增多，在預防多種傳染病的同時，也伴隨著一系列問 題的產生，如兒童預防接種次數增加、疫苗管理難度加大、預防接種工作成 本增高等。因此，當前聯合疫苗已經成為疫苗研發、生產和使用的一大趨勢。 因為聯合疫苗可以減少頻繁的注射次數和漏種的機會，提高及時接種率和接 種者的依從性，節省接種管理成本和受種者的時間成本。因此，在實施計劃 免疫時，採用多價疫苗進行聯合免疫受到了世界各國的重視。目前世界各國 的科學工作者都在致力研製新型的B肝與結核聯合疫苗。但是，各種聯合疫苗在穩定性、劑型、處方的設計和生產成本上都還存在一些問題，有待改進， 致使B肝與結核聯合疫苗至今仍未在全世界廣泛應用。生物工程技術的進展 為重組疫苗提供了新的途徑，以DNA疫苗為基礎的聯合疫苗被寄予厚望。
HBV基因組是一部分雙鏈DNA分子，由約3200個鹼基對組成，HBV基因組 的全部順序均為蛋白編碼區，由相互重疊的4個基因S、 C、 P和X基因組成， 分別編碼外膜蛋白(HBsAg)、核心蛋白(HBcAg)、聚合酶和X蛋白。本研究中 選擇的B肝抗原基因為可以表達B肝包膜大蛋白(L蛋白)的s區全基因，即 可表達PreSl、 PreS2和S抗原三種抗原成分。目前市售的HBsAg啤酒酵母疫 苗是僅由S蛋白組成的疫苗，雖然已顯示了較好的免疫保護作用，但是許多 實驗結果表明preSl、 preS2區所擁有的B和T細胞表位具有很高的免疫原性， 可以增強對S蛋白的免疫反應，克服對S蛋白的無反應性在疫苗中加入PreSl 和PreS2後，可降低人群對B肝疫苗的不反應和低反應性。因此，選擇了乙 肝包膜大蛋白L基因，作為B肝的優勢抗原基因與結核基因聯合。Ag85B是結 核分支桿菌和BCG的分泌性蛋白，是結核菌主要的保護性抗原，含有9個免疫 優勢表位，具有體外激活T細胞並能刺激記憶T細胞產生的能力。因此選擇將 B肝包膜大蛋白基因和結核優勢抗原Ag85基因融合構建新型的DNA疫苗，將 有利於B肝和結核的防治。本研究所選用的pVAXl真核表達載體是由 pcDNA3. l改造而來的，全長3.0 kb，是美國FDA認可的安全性較高並且可以 用於人體研究的基因疫苗表達載體。

發明內容
本發明的目在於克服現有疫苗的缺點，提供一種B肝病毒全包膜L (HBVL)基因和結核桿菌Ag85B (鵬T-Ag85B)基因的融合基因。
本發明的另一目的在於提供一種包含上述融合基因的真核表達載體的 構建和表達方法。
本發明的再一目的在於提供一種上述融合基因的真核表達載體的應用。 本發明的目的通過下述技術方案實現 一種B肝病毒全包膜L基因和結
核桿菌Ag85B基因的融合基因，其序列如SEQ ID NO. l所述。
一種包含了上述B肝病毒全包膜L基因和結核桿菌Ag85B基因的融合基
因的真核表達載體的構建和表達方法，包括以下步驟 (1)引物設計
根據B肝病毒全包膜L基因的編碼序列，設計擴增B肝病毒全包膜L基
5因的l對引物
上遊引物序列為PI 5' -CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel 酶切位點和起始密碼子ATG;
下遊引物序列為P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind in酶切位點，並刪除終止密碼子；
根據人結核分支桿菌H37Rv株Ag85B基因的編碼序列，設計擴增結核杆 菌Ag85B基因的l對引物
上遊引物序列為P3 5' - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII(AAGCTT)酶切位點和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker 序列；
下遊引物序列為P4 5, -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I酶切位點和終止密碼子；
(2) 重組質粒pVL的構建 將B肝表面抗原陽性患者血清採用苯酚/氯仿抽提法獲得DNA提取液，作
為L基因擴增模板，用歩驟(1)設計的引物P1和P2進行常規鏈式聚合酶反應， 擴增出B肝病毒全包膜L基因片段，將純化後的B肝病毒全包膜L基因片段和 質粒pVAXl分別用Nhel和HindlII進行雙酶切，純化、連接、轉化獲得重組質 粒pVAX-L;
(3) 重組質粒pVLA的構建
提取人結核分支桿菌H37Rv基因組DNA作為模板，用步驟(1)設計的 引物P3和P4進行常規鏈式聚合酶反應，擴增獲得結核桿菌Ag85B基因；將 純化的結核桿菌Ag85B基因與步驟(2)所得重組質粒pVL分別用HindIII 和Kpn I雙酶切，純化、連接、轉化獲得重組質粒pVLA;
(4) 重組質粒pVLA轉染真核細胞及體外表達鑑定 將酶切和測序鑑定正確的步驟(3)所得重組質粒pVLA轉染HEK293細
胞，並通過免疫組織化學法和免疫印記法檢測融合基因的表達蛋白質。
步驟(2)所述常規鏈式聚合酶反應具體步驟如下將混合液在94"C預 變性5min，然後進入下列循環94°C、 45s，55。C、 45s， 72°C、 lmin，共進 行30個循環，最後72。C延伸10min，擴增完畢後置4'C終止反應；所述混合 液組成如下
濃度為1Oumo1/1的上遊引物Pl 1 lU
濃度為10umol/l的下遊引物P2 1 P 1dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
DNA提取液 5 " 1
含Mf的Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩衝液 5 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 u 1 滅菌水 33.75ul
步驟(3)所述常規鏈式聚合酶反應具體步驟如下將混合液在94'C預 變性5min，然後進入下列循環94°C、 45s，52。C、 45s， 72°C、 1 min,共進 行30個循環，最後72。C延伸10min，擴增完畢後置4。C終止反應；所述混合
液組成如下
濃度為1Oumo1/1的上遊引物P3 1 u 1
濃度為1Oumo1/1的下遊引物P4 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
H37Rv基因組DNA 4ul
含Mg2+的Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩衝液 5 p 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 u 1
滅菌水 34. 75 u 1
上述方法構建的真核表達載體作為製備B肝和結核聯合疫苗的用途。
上述方法表達的融合基因的表達蛋白質作為製備B肝和結核聯合疫苗 的用途。
本發明的原理是本發明中將B肝病毒全包膜L基因與結核桿菌Ag85B基 因聯合表達於pVAXl載體，重組質粒pVLA轉染細胞並通過免疫組織化學法和 West blot檢測融合蛋白L-Ag85B的表達，從而為研究B肝和結核的聯合DNA 疫苗奠定基礎。載體pVAXl是美國FDA認可的安全性較高並且可以用於人體研 究的基因疫苗表達載體，可以攜帶B肝病毒L與結核桿菌Ag85B基因轉染到細 胞中，表達出含有B肝病毒L與結核桿菌Ag85B基因的融合蛋白。
基因L禾口 Ag85B在NCBI中的登陸號為GI: 157091234和GI :6469794。 本發明相對於現有技術，具有如下的優點及有益效果(l)本發明將乙 肝病毒L與結核桿菌Ag85B兩種抗原同時克隆到同一載體上，構建B肝病毒L 與結核桿菌Ag85B的融合質粒，以期為製備B肝和結核的聯合疫苗奠定基礎，有利於B肝和結核的聯合防治；(2)本發明利用的pVAXl載體是美國FDA認 可的安全性較高並且可以用於人體研究的基因疫苗表達載體，為後續的動物 實驗及臨床實驗奠定基礎。


圖1為重組質粒pVL構建示意圖。 圖2為重組質粒pVLA構建示意圖。 圖3為重組質粒pVLA蛋白表達鑑定圖。 圖4為重組質粒pVL示意圖。 圖5為重組質粒pVLA示意圖。
圖6為PCR擴增HBV-L基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為1KbDNA Ladder Maker; Linel、 2為麗-L片段，1. 2Kb。
圖7為菌落PCR鑑定重組質粒pVL圖，其中1為以DNA提取液為模板 的PCR結果；2-6為以轉化的單菌落為模板的PCR結果。
圖8為pVL重組質粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為1Kb DNA Ladder Maker; 1、 2為pVL的Nhel和Hindi 11雙酶切產物；3為pVL的 HindIII單酶切產物4: pVAXl的HindIII單酶切產物。
圖9為PCR擴增MBT-Ag85B基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為150bp DNA Ladder Maker; 1、 2為Ag85B， 860bp。
圖10為菌落PCR鑑定重組質粒pVLA基因片段圖，其中1為以 pcDNA3-Ag85B為模板的PCR擴增的Ag85B; 2-6:菌落PCR。
圖11為pVLA重組質粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為1KB DNA Ladder Maker; 1、 2為pVLA的HindIII和Kpnl雙酶切產物。
圖12為pVLA重組質粒三酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為1KB DNA Ladder Maker; 1: pVLA的Nhel、 HindIII和Kpnl的三酶切產物。
圖13為重組質粒大小比較鑑定圖，其中M為1KB DNA Ladder Maker; l為pVAXl; 2為PVAX-L; 3為pVLA。
圖14為免疫組織化學檢測融合蛋白在HEK293細胞中的表達圖，其中 圖a為轉染pVLA質粒的HEK293細胞呈染色棕黃色陽性(200X);圖b為轉 染pVAXl質粒的HEK293細胞呈染色呈陰性(200X )。圖15為重組質粒轉染293細胞後的蛋白印跡分析圖，其中M為蛋白
markers; 1、 2為樣品為轉染重組質粒pVLA的293細胞的裂解液上清；3、 4為樣品為293細胞的裂解液上清。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施 方式不限於此。
首先對實驗材料的說明如下
質粒pVAXl:美國FDA批准可用於人體的DNA疫苗載體，購自Invitrogen 公司；MTB H37Rv購自中科院微生物菌種保藏中心；B肝表面抗原陽性患者
血清由廣州華僑醫院提供。
大腸桿菌E. coli T0P10購自天津天有利科技有限公司。
細胞株HEK293細胞((人胚腎上皮細胞)購自上海桑戈生物科技有限公司。
試劑酶類(大連寶生物公司)；試劑盒(質粒DNA小提試劑盒，細菌 基因組DNA抽提試劑盒，Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑盒，凝膠DNA 純化回收試劑盒，OMEGA去內毒素質粒提取試劑盒)(OMEGA); PCR引物合成 (上海生工生物工程技術服務有限公司)；重組質粒上目的基因的序列測定 (上海生工生物工程技術服務有限公司)；鼠源性抗HBsAg單克隆抗體(北 京博奧森生物技術有限公司)即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒(武漢 博士德生物工程有限公司)
酵母提取物、胰蛋白腖、瓊脂糖粉(上海生物工程有限公司)；瓊脂糖(美 國Sigma公司)；DMS0、青黴素鈉、硫酸鏈黴素、胰蛋白酶、H印es鹼(廣州 博理生物科技有限公司)；氨苄青黴素(北京鼎國生物技術有限公司)；DMEM 培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 6孔細胞培養、1.8ml凍存管板、0.22um—次性濾器(廣州普博公司)。
實施例1: 1、引物設計
根據B型肝炎病毒全包膜L基因的編碼序列，設計擴增HBVL的1對引
物
上遊引物序列為:PI 5' —CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel(GCTAGC)酶切位點和起始密碼子ATG;
下遊引物序列為P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind III (AAGCTT)酶切位點，並刪除終止密碼子；
根據人結核分支桿菌H37Rv株Ag85B基因的編碼序列，設計擴增結核杆 菌Ag85B基因的l對引物
上遊引物序列為P3 5' - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII(AAGCTT)酶切位點和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker 序列；
下遊引物序列為P4 5' -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I (GGTACC)酶切位點和終止密碼子；
2、重組質粒pVL的構建如圖1和圖4所示 (1) PCR法獲得HBV L基因
L基因擴增模板取自B肝表面抗原陽性患者血清。血清抽提採用苯酚/氯 仿抽提法。B肝病毒DNA的提取採集靜脈血，將100UL血清與蛋白酶K(PK) 緩衝液1UL混勻，加人10ULpK(20mg/mL)， 55。C過夜。與250UL飽和酚/氯仿 (l:l)混勻，10000轉/min4。C離心5MIN， 500UL冰乙醇沉澱15MIN， 12000轉 /min離心15MIN， 20UL TE緩衝液(10 mmol /L三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽 (pH8.0) ，1腿ol /L乙二胺四乙酸二鈉)溶解DNA後，一20。C保存備用。 以上述方法所得DNA提取液作為模板，用步驟(1)設計的引物P l和 P2進行常規鏈式聚合酶反應，擴增獲得HBVL基因；擴增的PCR產物大小約 為1. 2Kb。
具體步驟如下將混合液在94'C預變性5 min，然後進入下列循環94 。C變性45s， 55。C退火45s， 72。C延伸1 min，共進行30個循環，最後72°C 再延伸10min，擴增完畢後置4'C終止反應；所述混合液組成如下
濃度為1Oumo1/1的上遊引物Pl 1 y 1
濃度為lOumol/1的下遊引物P2 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
DNA提取液 5 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩衝液(含Mg2+) 5 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 u 1
滅菌水 33. 75 y 1
10PCR產物上樣電泳(質量百分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳)，回收1.2KB 的目的條帶，如圖6所示
用OMEGA凝膠回收試劑盒純化PCR產物
(2) 將HBVL基因插入到pVAXl中
將純化後的PCR產物和pVAXl質粒用Nhe I和Hind III進行雙酶切處 理，具體反應體系如下PCR產物酶切體系10XM buffer 2yl ， Nhe I lul， Hind III lul， PCR產物6ul ，滅菌水lOul。載體pVAXl酶切 體系10XM buffer 2 u 1 ， Nhe I lul， Hind III lul， pVAX110ul， 滅菌水6ul.。反應體系旋渦振蕩混勻後置於PCR儀中，37t:反應5小時。
用OMEGA凝膠回收試劑盒純化酶切產物，酶切並純化後的PCR片段HBV-L 與載體pVAXl質粒利用T4 DNA連接酶進行連接反應。體系配好混勻後16°C 過夜，連接產物4t:保存，在24h內進行轉化。連接反應體系如下lOXLigase buffer 2ul， T4 DNA Ligase ;U 1， PCR片段5yl，載體片段10iU， 滅菌水3 u 1 。
(3) 轉化
將上述連接反應產物以CaC12法轉化至感受態大腸桿菌TOPIO中連 接產物5u 1與lOOix 1 T0P10感受態細菌混勻，冰浴30分鐘，42°C熱休 克90秒，迅速置冰中1-2分鐘，加入LB培養基800 u 1置乾燥恆溫搖床中 200 rpm 37'C振搖45分鐘，使細菌復甦並表達質粒編碼的抗性基因。加於 含有卡那黴素的固體LB培養基平板上，室溫放置20分鐘，將培養皿倒置於 37"C培養箱中過夜。
(4) 篩選鑑定陽性克隆
16小時左右長出菌落。從平板中挑出單菌落於4ml含Kana 50 u g/mL 的LB培養基中，置37'C200rpm的恆溫搖床中劇烈振搖6h，待抗性E. coli 生長並達到一定濃度後，取出lOOyl菌液於0.5ml EP管中，置沸水中煮 5min。冷卻後取出1 u 1用作菌落PCR的模板。菌落PCR鑑定，如圖7所示 將菌落PCR陽性的菌落擴增，提取質粒，進行雙酶切鑑定，酶切產物用質量 分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑑定，如圖8所示。
2、重組質粒pVLA的構建(如圖2和圖5所示) (1) PCR法獲得MTB-Ag85B基因
MTB H37Rv基因組DNA的提取與純化將MTB H37Rv接種於改良羅氏培 養基，器皿口加橡皮塞於37。C培養，每周觀察1次。結核分枝桿菌生長緩慢， 一般需2 4周長成肉眼可見的菌落。培養2-4周後，刮取少量細菌 於生理鹽水中磨菌，用OMEGA細菌基因組DNA抽提試劑盒提取純化基因組 腿。
以上述方法提取的基因組DNA為模板，用引物P3和P4進行常規鏈式聚 合酶反應，擴增Ag85B基因，擴增的PCR產物大小約為860bp。
具體步驟如下將混合液在94。C預變性5 min，然後進入下列循環94 。C變性45s， 52。C退火45 s， 72°〇延伸1 min，共進行30個循環，最後72 'C再延伸10min，擴增完畢後置4"C終止反應；所述混合液組成如下
濃度為10umo1/1的上遊引物P3 1 ii 1
濃度為10umo1/1的下遊引物P4 1 U 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
H37Rv基因組DNA 4ul
Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩衝液(含Mg2+) 5 P 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 " 1
滅菌水 34. 75 u 1
PCR產物上樣電泳(質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳)，回收860bp的目 的條帶，如圖9所示。
用OMEGA凝膠回收試劑盒純化PCR產物。 (2)將Ag85B插入到PVAX-L
將純化後的PCR產物Ag85B和重組質粒pVL用Hind III和Kpn I進行 雙酶切處理，具體反應體系如下PCR產物酶切體系lOXMbuffer 2ul， Kpnllul， Hind III lul， PCR產物6 u 1 ，滅菌水lOiU。載體Pvax-L 酶切體系lOXMbuffer 2ul， Kpn I 1， Hind III lul， pVL10 u 1 ， 滅菌水6ul 。反應體系旋渦振蕩混勻後置於PCR儀中，37"C反應5小時。
用OMEGA凝膠回收試劑盒純化酶切產物，酶切並純化後的PCR片段Ag85B 與載體Pvax-L質粒利用T4 DNA連接酶進行連接反應。體系配好混勻後16 "C過夜，連接產物4t:保存，儘量24h內進行轉化。連接反應體系如下10 XLigase buffer 2ul， T4 DNA Ligase lul， PCR片段5ul，載體片段 10u 1，滅菌水3u 1 。 (3)轉化將上述連接反應產物以CaC12法轉化至感受態大腸桿菌T0P10中連接 產物5u 1與100y 1 T0P10感受態細菌混勻，冰浴30分鐘，42°C熱休克 90秒，迅速置冰中1-2分鐘，加入LB培養基800 ii 1置乾燥恆溫搖床中200 rpm 37'C振搖45分鐘，使細菌復甦並表達質粒編碼的抗性基因。加於含有 卡那黴素的固體LB培養基平板上，室溫放置20分鐘，將培養皿倒置於37 'C培養箱中過夜。
(4)篩選鑑定陽性克隆
16小時左右長出菌落。從平板中挑出單菌落於4ml含Kana 50 u g/mL 的LB培養基中，置37'C200rpm的恆溫搖床中劇烈振搖6h，待抗性E. coli 生長並達到一定濃度後，取出100ul菌液於0. 5ml EP管中，置沸水中煮 5min。冷卻後取出1 u 1用作菌落PCR的模板。菌落PCR鑑定，如圖10所示將 菌落PCR陽性的菌落擴增，提取質粒，使用Hind III和Kpn I雙酶切，Nhel、 Hind III和Kpn I三酶切鑑定，如圖11和圖12所示。 (5)重組質粒序列分析
經初步鑑定正確的重組質粒pVLA，還需要通過測序驗證插入基因序列的 正確性，從插入片段的上遊開始延順時針方向採用雙脫氧鏈末端終止法進行 單向測序，引物序列為pVAXl載體的通用引物，引物設計合成及測序工作由 上海生物技術工程公司完成。
3.重組質粒pVLA轉染真核細胞及體外表達鑑定
(1) HEK293細胞的培養
(2) 重組質粒pVLA轉染293細胞
1) HEK293細胞培養轉染前1 d，將處於對數生長期的細胞用質量體 積比為0. 25%的胰酶消化，製備成單細胞懸液，以每孔lX10Vml接種6孔 培養板，每孔加含體積百分比為20。/。的胎牛血清的DMEM培養基2ml，在37 °C、體積百分比為5%的C02的飽和溼度培養箱中，細胞生長至面積百分比為 50% 60%。
2) 脂質體/DNA複合物製備A液為4 u g去內毒素的重組質粒pVLA稀釋 於無血清OPTi-MEM培養基500" 1， B液為Lipofacta mine 2000 10u 1稀 釋於OPTi-MEM培養基500 u 1，輕輕混合AB液成脂質體/DNA複合物，室溫 放置20 min。
3) 轉染準備用2 ml無血清躍EM培養基漂洗3次。4)轉染:將脂質體/DNA複合物緩緩加入6孔培養板中，搖勻，37'C體積 百分比為5%的C02細胞培養箱中放置4 h，加入體積百分比的20%胎牛血清 的DMEM培養基，並置入培養箱中培養。
(3 )免疫組化檢測融合蛋白在細胞中的表達
轉染質粒DNA48h後，吸出培養基，每孔細胞加入300ul質量體積比 濃度為4%的多聚甲醛，4"固定過夜或37。C固定半小時，用磷酸鹽緩衝液 (PBS)洗三次，每次5min。加過氧化物阻斷溶液(質量體積比為3%的H202) 孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS洗三次，每次5min;再 加稀釋後的一抗，4。C溼盒過夜;PBS衝洗三次，各5min。加生物素標記的第 二抗體，室溫孵育10min， PBS衝洗三次，各5min。加鏈親和素一過氧化酶 溶液，室溫孵育10min。 二氨基聯苯胺溶液(DAB)顯色，水洗終止，光鏡下 觀察染色結果並拍照，如圖14所示。
(4 )免疫印記檢測融合蛋白的表達 1)細胞的裂解
PBS預冷，冰上配細胞裂解緩衝液，倒掉培養基，將培養細胞在冰上用 冰冷的PBS洗3次，甩淨。加0. 7ml細胞裂解緩衝液(含有50mmol/L三羥 甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8. 0)， 150醒ol/L氯化鈉，0.02%疊氮鈉，0. 1%十二 烷基磺酸鈉，100ug/ml異丙醇溶液，lug/ml抑肽酶，1%乙基苯基聚乙二醇， 0.5%去氧膽酸鈉)，冰上放置20min隔一段時間搖一搖培養瓶。用細胞刮子 將貼壁細胞刮離，移至1. 5ml離心管中。12000xg離心5 min。取上清，-80 'C保存。
2 )蛋白質SDS-PAGE電泳
採用SDS-PAGE電泳，底層分離膠為8% (體積百分比)、上部積層膠為 5% (體積百分比)；待測蛋白樣品與2XSDS加樣緩衝液按等體積混勻，100 。C加熱3-5min。上樣，室溫下1 XSDS電泳緩衝液中，開始電壓為130V，進 入分離膠後該為170V電泳至染料抵達分離膠底部，約lh(雙面兩個完全相同 的SDS-PAGE電泳)。
電泳完畢取下凝膠，在5倍體積的固定液中室溫緩慢搖動2h， 5倍體 積的考馬斯亮藍染色液浸泡、室溫緩慢搖動4h。 50ml固定液衝洗、脫色液 再緩慢搖動至獲得藍色條帶及乾淨的背景，期間換液3-4次。將脫色後的凝 膠照像。
3)蛋白印跡》去(Western blotting)電泳後的另一凝膠置轉移緩衝液中室溫平衡30min。依次組裝轉印夾層 海綿墊層、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜(NC膜)、濾紙、海綿墊層(NC膜和 濾紙均與凝膠等大，並預先以轉移緩衝液溼潤)。排出所有氣泡。前後端用 多孔有機玻璃板扣緊，在轉移緩衝液中冷卻條件下恆流350mA，電轉50min。 轉印結束，取出轉印膜，膜上標記定位。凝膠用考馬斯亮藍染色以確定轉移 效率。轉印膜置於平皿中，加lxPBST緩衝液，在水平搖床上緩慢搖動lh; 將NC膜浸入質量體積比為5%的脫脂奶粉中，37"C於水平搖床緩和振蕩lh; lxPBST洗膜3次，每次10min;將NC膜封於雜交袋中，用Mouse Anti- HBsAg 單克隆抗體按照l: 400的稀釋倍數用lxPBS稀釋，雜交袋中加入相應的一 抗稀釋液5ml，排盡袋中氣體，封口，水平搖床振蕩，4"C反應過夜；將NC 膜從雜交袋中小心取出，lxPBST (將20mL滅菌磷酸鹽緩衝液中加入10 y L 0. 05 %吐溫20)洗膜3次，每次1 Omin。再將NC膜封於雜交袋中，用 辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG 二抗血清按照1: 5000的稀釋倍數用 lxPBS稀釋，雜交袋中加入相應的二抗稀釋液5ml，排盡袋中氣體，封口， 37。C水平搖床振蕩2-3h;取出NC膜，lxPBST洗膜3次，每次10min，用ECL 試劑盒以發光法顯色，顯影1 min，曝光5min，如圖15所示。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上 述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改 變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的 保護範圍序列表
〈110〉 李君武
〈120〉B肝L基因與結核桿菌Ag85B融合基因及其表達載體的構建和應用
〈130〉 2
〈160〉 5
Patentln version 3. 5
〈210〉 1
〈211〉 2093
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 1
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gtatacattaagcttggatccggaggttcattctcccggccggggctgccggtcgagtac1260image see original document page 17〈213〉人工序列 <400〉 4
ttataagctt ggatccggag gttcattctc ccggccgggg ctg 43
〈210〉 5 〈211〉 29 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 5
aatggtacct cagccggcgc ctaacgaac 29
權利要求
1、一種B肝病毒全包膜L基因和結核桿菌Ag85B基因的融合基因，其特徵在於其序列如SEQ ID NO.1所述。
2、 一種包含了權利要求1所述B肝病毒全包膜L基因和結核桿菌Ag85B 基因的融合基因的真核表達載體的構建和表達方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 引物設計根據B肝病毒全包膜L基因的編碼序列，設計擴增B肝病毒全包膜L基因的l對引物上遊引物序列為Pl 5' -CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel 酶切位點和起始密碼子ATG;下遊引物序列為P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind III酶切位點，並刪除終止密碼子；根據人結核分支桿菌H37Rv株Ag85B基因的編碼序列，設計擴增結核杆 菌Ag85B基因的l對引物上遊引物序列為P3 5, - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII酶切位點和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker序列；下遊引物序列為P4 5' -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I酶切位點和終止密碼子；(2) 重組質粒pVL的構建 將B肝表面抗原陽性患者血清採用苯酚/氯仿抽提法獲得DNA提取液，作為L基因擴增模板，用步驟(1)設計的引物P1和P2進行常規鏈式聚合酶反應， 擴增出B肝病毒全包膜L基因片段，將純化後的B肝病毒全包膜L基因片段和 質粒pVAXl分別用Nhel和HindlII進行雙酶切，純化、連接、轉化獲得重組質 粒pVL;(3)重組質粒pVLA的構建提取人結核分支桿菌H37Rv基因組DNA作為模板，用步驟(1)設計的 引物P3和P4進行常規鏈式聚合酶反應，擴增獲得結核桿菌Ag85B基因；將 純化的結核桿菌Ag85B基因與步驟(2)所得重組質粒pVL分別用HindIII 和Kpn I雙酶切，純化、連接、轉化獲得重組質粒pVLA (4)重組質粒pVLA轉染真核細胞及體外表達鑑定將酶切和測序鑑定正確的步驟(3)所得重組質粒pVLA轉染HEK293細胞，並通過免疫組織化學法和免疫印記法檢測融合基因的表達蛋白質。
3、根據權利要求2所述真核表達載體的構建和表達方法，其特徵在於:步驟(2)所述常規鏈式聚合酶反應具體歩驟如下將混合液在94t:預變性 5 min，然後進入下列循環94°C、 45s，55。C、 45s， 72°C、 lmin，共進行30 個循環，最後72。C延伸10min，擴增完畢後置4。C終止反應；所述混合液組成如下濃度為10umo1/1的上遊引物Pl 1 u 1濃度為10umol/l的下遊引物P2 ly 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1DNA提取液 5 u 1含Mg"的Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩衝液 5 ii 1Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 u 1滅菌水 33.75ul
4、根據權利要求2所述真核表達載體的構建和表達方法，其特徵在於 步驟(3)所述常規鏈式聚合酶反應具體步驟如下將混合液在94。C預變性 5 min，然後進入下列循環94°C、 45s，52。C、 45s， 72°C、 1 min,共進行 30個循環，最後72。C延伸10min，擴增完畢後置4。C終止反應；所述混合液組成如下濃度為1Oumo1/1的上遊引物P3 1 U 1濃度為1Oumo1/1的下遊引物P4 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度各為2. 5 raM的dNTP混合物 4 u 1H37Rv基因組DNA 4iU含Mg"的Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩衝液 5 u 1Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 P 1滅菌水 34. 75 u 1
5、 根據權利要求2所述方法構建的真核表達載體作為製備B肝和結核 聯合疫苗的用途。
6、 根據權利要求2所述方法表達的融合基因的表達蛋白質作為製備乙 肝和結核聯合疫苗的用途。
全文摘要
本發明公開了一種B肝病毒全包膜L基因與結核桿菌Ag85B的融合抗原基因及其構建和表達方法。該融合基因的真核表達載體pVLA的構建和表達根據B肝病毒全包膜L基因設計1對擴增B肝病毒全包膜L基因的引物，根據結核桿菌Ag85B基因的編碼序列設計1對擴增Ag85B基因的引物；重組質粒pVL的構建；重組質粒pVLA的構建；重組質粒pVLA轉染真核細胞及體外表達鑑定。本發明融合抗原基因及其真核表達載體和表達蛋白質均可用於製備B肝和結核的聯合DNA疫苗。
文檔編號C12N15/79GK101509009SQ200910037758
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月11日 優先權日2009年3月11日
發明者李君武 申請人:李君武