新的混合菌組合生產維生素c前體－2－酮基－l－古龍酸(2－klg)的製作方法
2023-06-12 10:56:26
專利名稱：新的混合菌組合生產維生素c前體－2－酮基－l－古龍酸(2－klg)的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的混合菌組合，使用該混合微生物可從L-山梨糖發酵生產維生素C前體-2-酮基-L-古龍酸(簡稱2-KLG)。
2-酮基-L-古龍酸(簡稱2-KLG)是生產維生素C(又稱L-抗壞血酸)的重要前體，目前主要用兩種方法生產。
1933年，德國化學家reichstein等用化學合成法(通常被稱為「萊氏法」)製取維生素C獲得成功，國外目前大多採用改良的「萊氏法」生產維生素C(
圖1)。「萊氏法」合成維生素C反應途徑主要包括葡萄糖高壓加氫變成山梨醇，山梨醇發酵生成L-山梨糖，山梨糖經過酮化，氧化成2-KLG，再經化學轉化生成維生素C。萊氏法工藝成熟，總轉化率50％左右，但是該法需消耗大量有毒、易燃易爆化學品，生產工廠需要相對較高的投資，從生態與經濟角度上看均不利。
我國在七十年代初期發明了「二步發酵法」製備維生素C新工藝，歐洲專利號NO0278447，是在「萊氏法」的基礎上予以改進的(圖2、圖3)，這個技術主要是採用一株氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和一株巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)組成的混合菌組合，將山梨醇發酵產生的L-山梨糖發酵成為維生素C前體2-KLG，代替了化學氧化，產酸50-60g/L，但是該工藝仍不能完全令人滿意，因為底物濃度和轉化率未能進一步提高，發酵過程中亦容易發生染菌，提取及後處理工藝也有待改善。
本發明旨在尋找新的混合菌組合利用L-山梨糖發酵生成2-KLG，能耐受和利用更高濃度的底物山梨糖，比現有技術更高效率地產生2-KLG，有效地解決生產中易染菌的問題。
本發明主要是通過誘變育種技術篩選得到一株產酸能力強且穩定的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)，通過與另一株蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)自然搭配混合發酵，在底物L-山梨糖濃度為80-140g/l左右時，能有效地轉化生成2-KLG 70-130g/l，轉化率可達到86％，新的發酵組合具有很強的抗染菌能力。
為了使本發明更好地被理解，下面對此進行一些細節描述氧化葡萄糖酸桿菌的誘變過程如下，將出發菌株1.945(氧化葡萄糖酸桿菌，本實驗室保存)單菌落增殖後，紫外處理30分鐘，避光培養過夜，平板分離與蘇雲金芽孢桿菌搭配通過發酵對比試驗挑選產酸能力強且性狀穩定的單菌落，其中一株具有代表性的菌株編號SCB329，其形態特徵和生理生化特性與1.945均有顯著差別。
利用本發明轉化L-山梨糖產生2-KLG的特點在於所採用的是包含有氧化葡萄糖酸桿菌和蘇雲金芽孢桿菌或者它們的變異株所組成的混合菌株，其中效果最佳的是採用了氧化葡萄糖酸桿菌SCB329和蘇雲金芽孢桿菌SCB933的混合菌組合(存放標記為CCTCC M96012，中國·武漢·武漢大學校內·中國典型培養物保藏中心)。
把該混合菌體系培養在含有L-山梨糖以及適當的營養的培養基中，在通氣條件下，微生物適宜於在液體培養。
發酵可以在搖瓶及5L、15L、147L罐中進行，甚至更大規模地實現轉化。
發酵過程pH可以在5到8之間進行，最佳為6.8到7.0之間。
發酵過程合適溫度在25到35℃之間，最好為28到32℃。
發酵周期取決於pH、溫度和山梨糖濃度等，可以有所變化，一般為1.5到3天。
發酵中用作原料的L-山梨糖底物濃度可以在大約20g/l到200g/l之間變動，最適為80g/l到140g/l。山梨糖濃度在最初培養基中可以較低，而在發酵中間流加含一定量輔料的山梨糖溶液，因此2-KLG濃度可達130g/l或更高。
按本發明所得到的2-KLG可直接由發酵液中分離提取，並能通過化學方法轉變成L-抗壞血酸(維生素C)。
本發明具有以下特點1.新的混合菌發酵技術採用產酸能力強且性狀穩定的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans SCB329)的菌株以及另一株蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis SCB933)自然搭配，混合發酵生成2-KLG，轉化率大大提高，可達到86％。
2.可以耐受較高的糖濃度，在底物濃度高達80-140g/l左右時，能有效地轉化生成2-KLG達70-130g/l以上。
3.新的發酵體系搭配有蘇雲金芽孢桿菌，因而具有很強的抗染菌能力。
本發明可用下面的例子詳細說明圖1為萊氏法工藝流程示意圖。圖2為二步發酵法工藝流程示意圖。圖3為二步發酵法中L-山梨糖氧化反應原理圖。圖4為5L罐分批發酵殘糖和產酸變化曲線圖。其中
表示L-山梨糖殘留量(g/l)
表示2-KLG生成量(g/l)圖5為147L罐流加發酵殘糖和產酸變化曲線圖。其中
表示溶氧水平(％)
表示L-山梨糖殘留量(g/l)
表示2-KLG生成量(g/l)實施例1、搖瓶發酵將氧化葡萄糖酸桿菌SCB329劃線於種子固體培養基上，28℃培養24小時，再在此培養物上直接接種蘇雲金芽孢桿菌SCB933，28℃繼續培養24小時，以無菌水將菌苔洗下得到菌懸液，接入種子搖瓶(裝量25ml/250ml)，28℃下250rpm振蕩培養12-14小時，產酸4-7g/l，以5％接種量接入發酵搖瓶(裝量50ml/500ml)，28℃下250rpm振蕩培養3天，所得發酵液產生2-KLG 70.5g/l。
種子培養基成分山梨糖(1.5％)，玉米漿(0.3％)，CaCO3(0.3％)，蛋白腖(1.0％)，酵母粉(0.5％)，尿素(0.4％)，KH2PO4(0.5％)，MgSO4.7H2O(0.02％)。搖瓶發酵培養基成分山梨糖(8％)，玉米漿(1％)，CaCO3(0.4％)。實施例2、5L罐分批發酵參見圖4，SCB329於種子固體培養基上劃線，28℃培養24小時，再劃線接上SCB933繼續培養24小時，以無菌水洗下，得到菌懸液接入種子搖瓶(裝量80ml/500ml)，28℃培養12小時，產酸4-5g/l，以5％接種量接入5L發酵罐，發酵溫度28-30℃，pH6.8-7.0，發酵周期30小時，產生2-KLG 71.35g/l，摩爾轉化率89.99％。
罐發酵培養基成分山梨糖(8％)，玉米漿(2％)，CaCO3(0.2％)，尿素(0.05％)，KH2PO4(0.05％)，MgSO4.7H2O(0.01％)。實施例3、147L罐流加發酵參見圖5，SCB329於種子固體培養基上劃線，28℃培養24小時，再劃線接上SCB933繼續培養24小時，以無菌水洗下，得到菌懸液接入種子搖瓶(裝量80ml/500ml)，28℃培養12小時，產酸4-5g/l，以5％接種量接入15L種子罐，培養溫度28-30℃，pH6.8-7.0，經12小時後產酸達4-5g/l，以5％接種量接入147L發酵罐，初始培養基中山梨糖濃度4.52％，發酵溫度28-30℃，pH6.8-7.0，發酵至16小時開始流加67.1％山梨糖溶液，使之終濃度達13.86％，38小時後流加結束並繼續發酵4-8小時，產生2-KLG 130g/l，摩爾轉化率87.04％。
權利要求
1.以L-山梨糖為底物，採用混合菌組合發酵製備維生素C前體2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)，其特徵在於使用了以氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)或者它們的變異株所組成的混合菌組合。
2.按權項要求1所述的混合菌組合，其特徵在於所述的氧化葡萄糖酸桿菌為SCB329。
3.按權項要求1所述的混合菌組合，其特徵在於所述的蘇雲金芽孢桿菌為SCB933。
4.按權項要求1所述的採用混合菌組合發酵製備2-KLG的方法，其特徵在於發酵中L-山梨糖底物濃度可從20-200g/l，最宜為80-140g/l。
5.按權項要求1，4中所述的方法，其特徵在於發酵溫度為25-35℃，最好為28-32℃。
6.按權項要求1，4中所述的方法，其特徵在於發酵過程中pH為5.0-8.0，最適pH為6.8-7.0。
7.按權項要求1，4中所述的方法，其特徵在於發酵周期為1.5-3天。
全文摘要
本發明採用一株產酸能力強且穩定的氧化葡萄糖酸桿菌與另一株蘇雲金芽孢桿菌搭配,以L－山梨糖為底物進行混合發酵,在底物濃度高達8—14%左右時,能有效地轉化生成2－KLG達70—130g/l,轉化率86%以上。新的發酵組合體系具有很強的抗染菌能力。
文檔編號C12P17/04GK1174237SQ9611646
公開日1998年2月25日 申請日期1996年8月15日 優先權日1996年8月15日
發明者尹光琳 申請人:中國科學院上海生物工程研究中心