「一步三階段」高效生產馬鈴薯試管薯的方法及其培養瓶與流程

2023-06-04 17:43:36

本發明與馬鈴薯脫毒快繁技術有關，屬於生物技術細胞工程中的植物組織培養領域。

背景技術：

我國自20世紀70年代，就開展了利用脫毒技術和植物組織培養技術快速繁殖馬鈴薯無毒種苗。該繁殖技術取得了巨大的成功，已成為馬鈴薯種薯生產的重要環節；但仍存在著繁殖周期較長、操作過程繁瑣，生產成本較高等關鍵問題。部分相關的技術文獻報導如下：發明專利申請「大量生產無類病毒病和病毒病馬鈴薯繁殖材料的方法」(專利申請號：87106041.8)，「活體外-活體內生產馬鈴薯微瘤的一種有效工藝」(專利申請號：88101458.3)，「馬鈴薯脫毒微型種薯快繁技術」(專利申請號：90106636.2)，「馬鈴薯組培苗分化培養方法」(專利申請號：01140273.3)，上述專利中涉及的方法雖具有一定的生產推廣價值，但仍需在田間開放條件下繁殖多年，很大程度上會產生病毒再次感染，給生產造成損失，同時其生產用種的成本亦偏高。

馬鈴薯試管薯的生產可解決上述問題。馬鈴薯試管薯是指在組織培養的條件下，以經過莖尖分生組織培養脫去主要病毒的馬鈴薯脫毒苗為材料，通過控制培養基的成分和培養條件，誘導腋芽頂端膨大所形成的塊莖。試管薯具有無病原、體積小、運輸儲運方便，能工廠化周年生產等優勢，展現出良好的產業化前景。目前馬鈴薯試管薯的生產主要有兩種方式：其一，是在一般組織培養室中，以玻璃器皿為容器，先培養結薯母苗，然後將其整體轉入結薯培養基中誘導試管薯(連勇等，馬鈴薯雜誌，1994，8卷，4期：連勇等，馬鈴薯雜誌，1994，13卷，1期)；其二，是利用類似於生物反應器的特殊裝置，在較大的容器中生產試管薯(Hulscher et al,International symposium an plant production in closed ecosystem.Automation,Culture and Environment,August 26-29,1996,Narita,Japan.ActaHorticulture.1996,No.440，533-538；Akita M and Ohta Y,Plant Cell Reports.1998,vol.18,No.3-4,284-287；Jimenez E,et al.Plant Cell,Tissue and Organ Culuture.1999,vol.59,No.1,19-23)。前者需經過多次更換培養基和轉接，費時、費工、生產周期長、成本較高(約100天左右)；後者採用小型生物反應器生產試管薯，雖在生產效率上有一定的改善，但需要特殊的設備，生產成本高，推廣應用困難。中國專利申請「一種高效生產馬鈴薯試管薯的方法及其培養盒」(專利申請號：02131125.0)，雖在培養技術上做了改進，採用一步培養法，即：將馬鈴薯基礎苗直接接種於試管薯誘導培養基上，省略了結薯母苗的培養過程；但基礎苗一般較弱，結薯率較低，且其前期仍需在其他容器培養基礎苗，並未實際縮短培養周期。

目前，用於植物組織培養的器具或裝置也有一些報導。例如：實用新型專利「一種培養瓶結構」(中國實用新型專利號：ZL 95244625.1)，在一個玻璃錐形瓶的瓶底開通形成開口面積較大的瓶口，呈筒狀體的承物盤的外徑小於瓶口內徑，其底側周緣向外凸起一緣邊，緣邊的外徑大於瓶口內徑，並開有至少一個氣孔，樞蓋餘瓶口相連接，樞蓋上至少開有一個氣孔，其內可存放慮棉塊，瓶口外圈的瓶體有一圈遮陰部。實用新型專利「植物組織培養瓶」(專利號：ZL 99252172.6)，該實用新型培養瓶包括瓶體和置於瓶體扣上的瓶蓋設有帶透氣孔的進氣孔，進氣孔內置有透氣片和內部通氣孔壓緊帽等構成，瓶蓋與瓶體之間需要藉助一個專門設置的消毒用的中間蓋體。「一種高效生產馬鈴薯試管薯的方法及其培養盒」(專利號：ZL02131125.0)，該培養盒為方形，由下筒體和盒蓋構成，盒蓋上設計了即有利於通氣又有利於無菌培養的透氣柱。上述培養瓶或培養盒均存在著設計複雜，不便操作，生產成本較高等問題；且無培養板支撐，試管苗易倒伏或需要另外添加脫脂棉等支持物。實用新型專利「馬鈴薯脫毒基礎苗液體培養用組培瓶」(授權公告號：CN 201947752 U)，其培養瓶包括瓶體和瓶蓋，在瓶蓋上設有通氣濾膜，在瓶體內設有與瓶體軸向垂直的培養板，培養板與瓶底間距為0.3-0.7cm。該培養瓶通過增加培養板解決了試管苗倒伏的問題，但培養板與瓶底的距離過短，容納的培養液量少，只適用於短時間基礎苗的培養，不適用於多階段試管苗的培養和試管薯的誘導。

綜上所述，目前現有馬鈴薯試管薯生產技術依然存在著技術規程有待優化，繁殖效率有待提高，生產成本有待降低，配套生產裝置有待於革新等問題。

技術實現要素：

為解決現有技術費時、費工、生產周期長、成本高的問題，本發明提供一種「一步三階段」高效生產馬鈴薯試管薯的方法，可簡化操作程序，縮短生產周期，提高生產效率，降低生產成本。

本發明提供的技術方案如下：

一種高效生產馬鈴薯試管薯的方法。以脫毒馬鈴薯試管苗為材料，採用改良的高鉀MS培養基，在光暗條件下，分階段培養液體馬鈴薯試管苗，誘導馬鈴薯試管薯。具體地，所述改良的高鉀MS培養基中N:P:K的比例為10:1:15，提高了硝態氮比例，不添加有機物質，採用「一步三階段」液體培養：第一階段基礎苗培養，向培養瓶中加入「試管苗培養基」，在25-27℃、光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時；第二階段壯苗培養，無需更換培養基，去頂芽(用於轉接)，在23-25℃、光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時；第三階段試管薯誘導，無需倒出原「試管苗培養基」，直接在培養瓶加入「試管薯誘導培養基」，「試管薯誘導培養基」體積為原「試管苗培養基」體積的2/3，在18-20℃、光強500-1000lux下每天光照6-8小時。

按上述方法培養液體馬鈴薯試管苗和誘導試管薯，其中所述高鉀MS培養基分成為：NH4NO3 1050mg/L、KNO3 2450mg/L、KH2PO4 300mg/L、CaCl2 440mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、Fe·NaEDTA 30mg/L、H3B03 6.0mg/L、MnSO4·H2O 8.6mg/L、ZnS04·7H2O 3.4mg/L、CuS045H2O 0.20mg/L。培養基中N:P:K比例為10:1:15，提高了硝態氮的比例，不添加有機物質。試管苗培養基為：高鉀MS培養基+白糖30g/L+活性炭1.5g/L，pH值為5.8；試管薯誘導培養基為：高鉀MS培養基+香豆素90mg/L+白糖120g/L+活性炭8g/L，pH值為5.8。本發明採用高水平的硝態氮更利於植物吸收，促進植物生長；同時，不添加有機物，能夠減輕菌汙染。

上述「一步三階段」的培養方法，即基礎苗培養、壯苗培養和試管薯誘導在一個培養瓶中進行，避免多次更換培養基、苗子轉接等過程，可節省1/2以上的操作時間。不同階段設置不同的溫度、光強和光照時間，分別適應馬鈴薯基礎苗快速生長(25-27℃，光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時)、馬鈴薯匍匐莖的形成(23-25℃，光強2000-3000lux下每天光照14-16小時)和試管薯的誘導(18-20℃，光強500-1000lux下每天光照6-8小時)。

同時，本發明還提供了一種適合於「一步三階段」高效生產馬鈴薯試管薯的培養瓶。所述培養瓶包括瓶蓋(2)、瓶體(3，6)，在瓶蓋(2)上設有透氣柱(1)。瓶體(3，6)分為上下兩部分，下部瓶體(6)直徑略窄於上部瓶體(3)，下部瓶體(6)有黑色塗層；在上部和下部瓶體交界處放置培養板(4)，培養板上開有培養孔(5)。

所述培養瓶可採用玻璃或塑料材質。

該培養瓶的設計，改進了原有類似產品的結構。下部瓶體有黑色塗層，能夠模擬根部環境，促進壯苗和結薯；培養板(4)寬鬆擱置於下部瓶體(6)上，便於培養板(4)擱置，不需要額外的支撐物，方便操作。

優選的，培養板(4)與瓶底(7)間距2-3cm，可以容納足量的培養基，並為根系生長提供充足的空間，能夠滿足「一步三階段」長時間培養的需要；培養板(4)上培養孔直徑0.3-0.4cm，即可以保證組培苗切段直立於液體培養基上，又不造成操作困難。

更優選的，透氣柱孔徑為2-3cm。

更優選的，上部瓶體(3)內徑為8.0cm，高為12cm，培養板(4)直徑為7.8cm，下部瓶體(6)內徑為7.5cm。瓶體部分直徑和高度為建議尺寸，方便於整個培養瓶的拿取。

所述培養瓶可全程實現液體培養，達到壯苗促薯，降低生產成本。該培養瓶還解決了試管苗液體培養不能直立，而固體生產成本高、生長周期長、長勢弱等問題；且黑色下部瓶體模擬馬鈴薯根部生長所需的黑暗條件，有利於植株的生長和試管薯的誘導。

本發明的有益效果在於：

與現有技術相比，本發明的生產方法和專用培養瓶，可節省操作時間1/2以上，節省成本1/3以上，馬鈴薯試管薯的生產周期從原來的90-100天左右縮短為70-80天左右，單瓶結薯數(每瓶平均按25株計算)可到35-45粒，較常規方法提高50％以上。

附圖說明

圖1：是本發明的馬鈴薯試管薯專用培養瓶的結構示意圖。

圖中：1—透氣柱，2—瓶蓋，3—上部瓶體，4—培養板，5—培養孔，6—下部瓶體，7—瓶底。

具體實施方式

一種高效生產馬鈴薯試管薯的方法設計思路如下：以脫毒馬鈴薯試管苗為材料，採用改良的高鉀MS培養基，在光暗條件下，分階段培養液體馬鈴薯試管苗，誘導馬鈴薯試管薯。具體地，所述改良的高鉀MS培養基中N:P:K的比例為10:1:15，採用「一步三階段」液體培養：第一階段基礎苗培養，向培養瓶中加入「試管苗培養基」，在25-27℃、光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時；第二階段壯苗培養，無需更換培養基，去頂芽(用於轉接)，在23-25℃、光強2000-3000lux條件下每天光照14-16小時；第三階段試管薯誘導，無需倒出原「試管苗培養基」，直接在培養瓶加入「試管薯誘導培養基」，「試管薯誘導培養基體積為原「試管苗培養基」體積的2/3，在18-20℃、光強500-1000lux下每天光照6-8小時。

按上述方法培養液體馬鈴薯試管苗和誘導試管薯，其中所述高鉀MS培養基分成為：NH4NO3 1050mg/L、KNO3 2450mg/L、KH2PO4 300mg/L、CaCl2 440mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、Fe·NaEDTA 30mg/L、H3B03 6.0mg/L、MnSO4·H2O 8.6mg/L、ZnS04·7H2O 3.4mg/L、CuS045H2O 0.20mg/L。培養基中N:P:K比例為10:1:15，提高了硝態氮的比例，不添加有機物質。試管苗培養基為：高鉀MS培養基+白糖30g/L+活性炭1.5g/L，pH值為5.8；試管薯誘導培養基為：高鉀MS培養基+香豆素90mg/L+白糖120g/L+活性炭8g/L，pH值為5.8。

實施例1：

馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：改良的高鉀MS培養基，配製大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、活性炭1.5g/L，配製成液體「試管苗培養基」，調整pH值為5.8，每瓶裝培養基約60mL；121℃，高壓滅菌備用。在超淨工作檯上，每瓶接種馬鈴薯品種「魯引1號」脫毒試管苗節段25個，分「三階段」培養。第一階段為基礎苗培養：在25℃，光強2000lux下每天光照16小時，培養約15天，待苗高長至6-7cm。第二節段為壯苗培養：無需更換培養基，剪取頂芽(用於轉接)，在23℃、光強2000lux下每天光照16小時，培養約20天，待苗高長至8-10cm。第三階段為試管薯誘導：改良的高鉀MS培養基，配製成大量元素、微量元素，添加香豆素90mg/L、白糖120g/L、活性炭8g/L，調整pH值為5.8，121℃，高壓滅菌；無需倒出原「試管苗培養基」，直接在培養瓶加入「試管薯誘導培養基」，每瓶約40mL(原「試管苗培養基」體積的2/3)；在18℃，光強600lux下每天光照8小時，在第45天，收穫試管薯。每瓶收穫試管薯40-45粒。

實施例2：

馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：改良的高鉀MS培養基，配製大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、活性炭1.5g/L，配製成液體「試管苗培養基」，調整pH值為5.8，每瓶裝培養基約60mL；121℃，高壓滅菌備用。在超淨工作檯上，每瓶接種馬鈴薯品種「荷蘭15」脫毒試管苗節段25個，分「三階段」培養。第一階段為基礎苗培養：在25℃，光強2000lux下每天光照16小時，培養約15天，待苗高長至6-7cm。第二節段為壯苗培養：無需更換培養基，剪取頂芽(用於轉接)，在23℃、光強2000lux下每天光照16小時，培養約20天，待苗高長至8-10cm。第三階段為試管薯誘導：改良的高鉀MS培養基，配製成大量元素、微量元素，添加香豆素90mg/L、白糖120g/L、活性炭8g/L，調整pH值為5.8，121℃，高壓滅菌；無需倒出原「試管苗培養基」，直接在培養瓶加入「試管薯誘導培養基」，每瓶約40mL(原「試管苗培養基」體積的2/3)；在18℃，光強500lux下每天光照8小時，在第45天，收穫試管薯。每瓶收穫試管薯35-40粒。

實施例3：

馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：改良的高鉀MS培養基，配製大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、活性炭1.5g/L，配製成液體「試管苗培養基」，調整pH值為5.8，每瓶裝培養基約60mL；121℃，高壓滅菌備用。在超淨工作檯上，每瓶接種馬鈴薯品種「荷蘭15」脫毒試管苗節段25個，分「三階段」培養。第一階段為基礎苗培養：在26℃，光強2500lux下每天光照15小時，培養約15天，待苗高長至6-7cm。第二節段為壯苗培養：無需更換培養基，剪取頂芽(用於轉接)，在24℃、光強2500lux下每天光照15小時，培養約20天，待苗高長至8-10cm。第三階段為試管薯誘導：改良的高鉀MS培養基，配製成大量元素、微量元素，添加香豆素90mg/L、白糖120g/L、活性炭8g/L，調整pH值為5.8，121℃，高壓滅菌；無需倒出原「試管苗培養基」，直接在培養瓶加入「試管薯誘導培養基」，每瓶約40mL(原「試管苗培養基」體積的2/3)；在19℃，光強800lux下每天光照7小時，在第45天，收穫試管薯。每瓶收穫試管薯35-40粒。

實施例4：

馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：改良的高鉀MS培養基，配製大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、活性炭1.5g/L，配製成液體「試管苗培養基」，調整pH值為5.8，每瓶裝培養基約60mL；121℃，高壓滅菌備用。在超淨工作檯上，每瓶接種馬鈴薯品種「荷蘭15」脫毒試管苗節段25個，分「三階段」培養。第一階段為基礎苗培養：在27℃，光強3000lux下每天光照14小時，培養約15天，待苗高長至6-7cm。第二節段為壯苗培養：無需更換培養基，剪取頂芽(用於轉接)，在25℃、光強3000lux下每天光照14小時，培養約20天，待苗高長至8-10cm。第三階段為試管薯誘導：改良的高鉀MS培養基，配製成大量元素、微量元素，添加香豆素90mg/L、白糖120g/L、活性炭8g/L，調整pH值為5.8，121℃，高壓滅菌；無需倒出原「試管苗培養基」，直接在培養瓶加入「試管薯誘導培養基」，每瓶約40mL(原「試管苗培養基」體積的2/3)；在20℃，光強1000lux下每天光照6小時，在第45天，收穫試管薯。每瓶收穫試管薯35-40粒。

對比例1：

馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：常規MS培養基，配製大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、瓊脂粉6g/L，配製成固體培養基，調整pH值為5.8，每瓶裝培養基約40mL；121℃，高壓滅菌備用。在超淨工作檯上，每瓶接種馬鈴薯品種「魯引1號」脫毒試管苗節段25個，在25-27℃，光強2000-3000lux下每天光照16小時，培養20-25天，待苗高長至6-7cm。將帶有4-5個莖節的苗，去掉頂芽，打破頂端優勢，接種在液體培養基(常規MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，另外加入活性炭0.15％、白糖3％，pH值為5.8)上，每瓶接種4-5個莖段，進行淺層靜止培養；晝夜溫度分別為25℃和16℃，每天光照16h，光強2000Lux；培養10天左右，每個莖段由時腋處生出多個小苗。20-25天後，每個腋芽發育成具有5-7個莖節的健壯苗時，倒出原有液體培養基換成誘導培養基(常規MS+BA5.0mg/L+CCC500mg/L，白糖8％，活性炭0.5％，pH值為5.8)或將壯苗轉入含有誘導培養基的新培養瓶，每瓶裝培養基約60mL，在25℃條件下全黑暗培養；約40-45天，收穫試管薯。每瓶收穫試管薯25-30粒。

對比例2：

馬鈴薯品種和試管薯誘導條件設計：常規MS培養基，配製大量元素、微量元素，添加白糖30g/L、瓊脂粉6g/L，配製成固體培養基，調整pH值為5.8，每瓶裝培養基約40mL；121℃，高壓滅菌備用。在超淨工作檯上，每瓶接種馬鈴薯品種「荷蘭15」脫毒試管苗節段25個，在25-27℃，光強2000-3000lux下每天光照16小時，培養20-25天，待苗高長至6-7cm。將帶有4-5個莖節的苗，去掉頂芽，打破頂端優勢，接種在液體培養基(常規MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，另外加入活性炭0.15％、白糖3％，pH值為5.8)上，每瓶接種4-5個莖段，進行淺層靜止培養；晝夜溫度分別為25℃和16℃，每天光照16h，光強2000Lux；培養10天左右，每個莖段由時腋處生出多個小苗。20-25天後，每個腋芽發育成具有5-7個莖節的健壯苗時，倒出原有液體培養基換成誘導培養基(常規MS+BA5.0mg/L+CCC500mg/L，白糖8％，活性炭0.5％，pH值為5.8)或將壯苗轉入含有誘導培養基的新培養瓶，每瓶裝培養基約60mL，在25℃條件下全黑暗培養；約40-45天，收穫試管薯。每瓶收穫試管薯20-25粒。

將本發明的技術方案與傳統方法培養的馬鈴薯試管薯對比生產效率，匯總結果如表1所示。

表1不同培養技術馬鈴薯試管薯的生產效率比較

註：傳統方法見對比例1和2(原霽虹，等.馬鈴薯生產技術[M].武漢大學出版社,2015)

最後應該說明的是，以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分進行等同替換。實施例中所列出的尺寸，僅為優選尺寸，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。上述雖然結合附圖對本發明的具體實施方式進行了描述，但並非對本發明保護範圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護範圍以內。