IRT1基因及其在提高植物耐缺鐵能力中的應用
2024-04-16 05:47:05
irt1基因及其在提高植物耐缺鐵能力中的應用
技術領域
1.本發明屬於分子育種技術領域，尤其涉及irt1基因及其在提高植物耐缺鐵能力中的應用。
背景技術：
2.中國是柑橘的重要原產地之一，栽培面積及生產產量均居世界首位，有4000多年的栽培歷史，資源豐富，優良品種繁多。
3.在四川、重慶等柑橘產區，較多果園以紫色土為主，土壤ph值偏高，呈鹼性或弱鹼性，柑橘樹體易出現缺鐵黃化現象，極大影響了柑橘的產量和品質。生產上，柑橘樹體一般由砧木和接穗組成，通過砧木直接從土壤吸收水分和營養，不同的砧木對柑橘樹體的生長發育影響不同，也決定了樹體耐缺鐵能力。枳作為柑橘栽培中大面積使用的砧木，具有抗寒、抗旱、品質優的特點，但在鹼性土壤上極易缺鐵；資陽香橙作為近年大量推廣的砧木，具有生長勢強和耐缺鐵的優點，但不耐寒且果實品質差於枳，在生產中無法大面積取代枳砧。
4.植物鐵缺乏治理難度大，解決植物的缺鐵情況，現階段主要的方法是施用鐵肥增加土壤中的鐵含量，但由於鐵肥易氧化，有效性低，在植物中流動性差，施用鐵肥效果並不顯著。
技術實現要素：
5.本發明的目的在於提供irt1基因在提高植物耐缺鐵能力中的應用，以解決上述技術問題。
6.本發明提供的技術方案為：irt1基因，irt1基因來源於資陽香橙和/或枳，資陽香橙irt1基因編碼蛋白的胺基酸序列為seq id no:2，枳irt1基因編碼蛋白的胺基酸序列為seq id no:4。
7.本發明還提供上述irt1基因在提高植物耐缺鐵能力中的應用，所述植物為擬南芥和/或柑橘。
8.本技術方案的原理和有益效果在於：
9.施用鐵肥對於提高植物耐缺鐵的效果並不顯著，採用分子育種技術，利用不同柑橘砧木對缺鐵耐受性的差異較大，將能提高砧木耐缺鐵能力的重要基因導入其中，提高砧木的缺鐵耐受性，才能從根本上解決植物缺鐵的問題，改善柑橘苗木的缺鐵耐受能力。
10.團隊於2019年發表的《枳和資陽橙鐵轉運基因irt1及其啟動子的克隆和功能比較研究》論文以枳(不耐缺fe)和資陽香橙(耐缺fe)為材料，克隆了枳和資陽香橙中irt1基因和轉錄因子fit序列，實驗中，枳的基因命名為ptirt1和ptfit，資陽香橙的基因命名為cjirt1和cjfit，研究枳和資陽香橙irt1基因及啟動子序列和功能差異。
11.本發明在之前研究的基礎上，進一步發現並驗證了irt1基因能夠提高植物的耐缺鐵，證明將資陽香橙和枳中的cjirt1、ptirt1表達量提高，可以有效提升柑橘對缺鐵環境的耐受能力，可為柑橘育種提供基因資源和技術支持，為柑橘育種提供基因資源和技術支持。
附圖說明
12.圖1為資陽香橙與枳耐缺鐵表型比較；a.資陽香橙正常培養(ck)及缺鐵脅迫下水培苗表型(-fe-pt-16d)；b.枳正常培養(ck)及缺鐵脅迫下水培苗表型(-fe-cj-16d)；c.正常培養及缺鐵脅迫處理後資陽香橙與枳新葉葉綠素a(chla)、葉綠素b(chlb)、總葉綠素(chla+b)含量；d.正常培養及缺鐵脅迫處理後資陽香橙與枳總鐵(ferric)及活性鐵(ferrous)含量；
13.圖2為cjirt1與ptirt1基因缺鐵脅迫下的表達；a.cjirt1基因缺鐵脅迫下的表達；b.ptirt1基因缺鐵脅迫下的表達；
14.圖3為cjirt1與ptirt1蛋白亞細胞定位情況；
15.圖4為cjirt1、ptirt1超量擬南芥轉基因株系驗證及缺鐵脅迫分析；a.轉基因株系pcr驗證，oe-cjirt1的6個電泳孔位分別代表oe-cjirt1-4-1、oe-cjirt1-4-2、oe-cjirt1-5-1、oe-cjirt1-5-2、oe-cjirt1-7-1、oe-cjirt1-7-2，oe-ptirt1的6個電泳孔位分別代表oe-ptirt1-3-1、oe-ptirt1-4-1、oe-ptirt1-4-2、oe-ptirt1-5-1、oe-ptirt1-7-1、oe-ptirt1-7-2；b.陽性轉基因株系表達量分析；c.缺鐵脅迫下轉基因株系表型情況；d.缺鐵脅迫下轉基因株系主根根長分析，****表示p《0.0001。
具體實施方式
16.下面通過具體實施方式進一步詳細說明：
17.實驗一：資陽香橙與枳耐缺鐵表型比較，探究資陽香橙、枳兩大砧木耐缺鐵能力的差異
18.試驗材料：枳和資陽香橙種子、霍格蘭營養液(購於北京酷來博(coolaber)科技有限公司，貨號nsp1020-50l
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10)、缺鐵霍格蘭營養液(購於北京酷來博(coolaber)科技有限公司，貨號為ns1010-fe-500ml)。
19.試驗方法：將生根1cm左右的柑橘種子移至含有霍格蘭營養液的容器中培養，待長至3-4張葉片後轉移至缺鐵霍格蘭營養液中進行脅迫處理。
20.圖1為資陽香橙與枳耐缺鐵表型比較；a.資陽香橙正常培養(ck)及缺鐵脅迫下水培苗表型(-fe-pt-16d)；b.枳正常培養(ck)及缺鐵脅迫下水培苗表型(-fe-cj-16d)；c.正常培養及缺鐵脅迫處理後資陽香橙與枳新葉葉綠素a(chla)、葉綠素b(chlb)、總葉綠素(chla+b)含量；d.正常培養及缺鐵脅迫處理後資陽香橙與枳總鐵(ferric)及活性鐵(ferrous)含量，ck-r(ck-root)：對照的根；ck-l(ck-leaf)：對照的葉；ck-s(ck-stem)：對照的莖；fe-r：缺鐵處理的根：fe-：缺鐵處理的葉：fe-s：缺鐵處理的莖。
21.如圖1a、圖1b所示，柑橘缺鐵時新梢葉片呈現失綠黃白化，資陽香橙與枳水培苗在缺鐵營養液培養16天後，資陽香橙嫩葉呈現正常翠綠色，但枳新梢葉片失綠髮黃、脈紋清晰可見缺鐵表型明顯。
22.對資陽香橙和枳正常、缺鐵培養狀態下的新梢葉片葉綠素、總鐵、活性鐵含量進行測定。如圖1c顯示，正常培養的枳新葉chla的含量為3.48mg/g，chlb的含量為1.22mg/g，總含量達到4.70mg/g。與此同時出現明顯缺鐵表型的枳新葉chla的含量為2.09ng/mg，chlb的含量為0.82mg/g，因此葉綠素總含量顯著低於正常培養枳，僅含2.90mg/g；而資陽香橙正常及缺鐵培養下的新葉chlb含量幾乎沒有差異，chla含量缺鐵脅迫下僅比正常培養下低
0.2mg/g，因此資陽香橙在缺鐵脅迫下新葉中仍有較高的葉綠素含量。
23.測定資陽香橙與枳根、莖、葉三部位的活性鐵、總鐵含量，如圖1d所示，枳根、莖、葉的活性鐵含量在缺鐵脅迫培養下分別從101.40mg/kg、49.88kg/g、43.50mg/kg顯著降低至87.58mg/kg、29.43mg/kg、28.09mg/kg。資陽香橙根、莖部的活性鐵含量雖然分別從86.81mg/kg、59.29mg/kg下降至53.40mg/kg、35.64mg/kg，但葉中的活性鐵含量相較於正常培養的植株活性鐵含量上未觀察到明顯變化；觀察總鐵含量的變化，枳在缺鐵條件下根、莖、葉的總鐵含量相較於正常培養的植株發生了顯著下降，而對於資陽香橙，僅根部總鐵含量存在明顯下降，莖、葉部分的總鐵含量無明顯變化。
24.綜上，通過資陽香橙與枳耐缺鐵表型比較，證明了當資陽香橙、枳遭受缺鐵脅迫時，資陽香橙比枳表現出更強的耐缺鐵能力。
25.實驗二：資陽香橙與枳irt1基因的功能比較
26.1、cjirt1、ptirt1的表達模式分析
27.對資陽香橙、枳水培苗進行缺鐵處理，具體地，將枳和資陽香橙種子剝去種皮，進行暗培養，待種子生根1cm左右時，移至含有霍格蘭營養液的水培容器中培養，待幼苗長至3-4張葉片後轉移至缺鐵霍格蘭營養液中進行脅迫處理。在處理後的0d、1d、3d、5d、8d進行根部取樣，檢測irt1基因的表達量，以0d樣品為實驗對照。實驗結果如圖2所示，缺鐵處理後cjirt1基因的表達量相較於ptirt1上調幅度更大約為2倍，表明irt1基因在資陽香橙根系中更易受到缺鐵脅迫誘導。
28.2、cjirt1、ptirt1的亞細胞定位
29.為了檢測cjirt1、ptirt1蛋白的作用功能位置，將cjirt1蛋白序列(seq id no:2)、ptirt1蛋白序列(seq id no:4)放入plant-mploc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/plantmploc.cgi)在線預測網站中，根據網站預測結果顯示cjirt1、ptirt1均定位於細胞膜。
30.亞細胞定位載體構建：
31.(1)利用gateway體系進行亞細胞定位載體構建。通過ncbi在線工具batch cd-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)預測cjirt1、ptirt1、cjfit及ptfit基因保守結構域位置，根據其位置選擇pmdc83-rfp(kana+)為終載體，入門載體則選用gateway系統中的pdonr207(gen+)；
32.(2)根據基因的orf(去除終止密碼子)在其兩側設計帶有attb序列引物分別擴增得attb-cjirt1、attb-ptirt1目標片段用於gateway中的bp反應。bp反應參照gateway bp clonase tmⅱenzyme mix(11789-020，invitrogen)，所得反應液用於大腸桿菌dh5α轉化；
33.(3)挑取bp反應的陽性菌落進行質粒提取得到pdonr207克隆產物用於gateway中的lr反應，lr反應參照gateway lr clonase tmⅱenzyme mix(11791-020，invitrogen)，所得反應液用於大腸桿菌dh5α轉化；
34.(4)利用attb-f及attb-r通用引物進行陽性克隆測序，選擇正確的重組質粒pmdc83-cjirt1-rfp、pmdc83-ptirt1-rfp用於農桿菌gv3101轉化。
35.採用混合轉注射野生本氏菸草的方法：挑取pmdc83-cjirt1-rfp、pmdc83-ptirt1-rfp陽性農桿菌單菌落進行培養。獲得飽和菌液4000rmp離心10min，用菸草重懸液(終濃度為10mmol l-1的mgcl2和138μmol
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l-1as的無菌水)重懸農桿菌至od 600為0.2。
36.根據亞細胞定位在線工具(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預測結果選取細胞核marker h2b-gfp與細胞膜marker，其菌液培養方式與上述方法一致，將調好的目的基因菌液與marker菌液2:1配比，室溫靜置2h。將菌液注射接種4-6周左右的野生本氏菸草，暗培養48h後使用打孔器進行取樣(取樣範圍在注射點附近為宜)，隨後放置於雷射共聚焦顯微鏡fv300下觀察488nm(gfp)與561nm(rfp)螢光蛋白的亞細胞定位情況。
37.將構建的重組質粒pmdc83-cjirt1-rfp、pmdc83-ptirt1-rfp與mc-gfp marker共轉化。實驗結果如圖3所示，通過觀察螢光共聚焦，pmdc83-cjirt1-rfp、pmdc83-ptirt1-rfp的紅色螢光與mc-gfp的綠色螢光重合呈現黃色，表明在菸草中cjirt1、ptirt1融合蛋白與細胞膜marker蛋白共定位表達，說明cjirt1與ptirt1蛋白的功能作用位置為細胞膜。
38.3、cjirt1、ptirt1超量擬南芥植株耐缺鐵分析
39.比較資陽香橙cjirt1與枳ptirt1在缺鐵脅迫下的功能，具體在擬南芥野生型中分別超表達cjirt1、ptirt1並對純合的轉基因株系進行驗證及缺鐵處理。具體試驗方法：將而野生型(wt)擬南芥及超量擬南芥株系置於正常的1/2ms固體培養基中生長5天至擬南芥髮根發芽時，選擇生長發育一致的幼苗，將其轉移至-fe的1/2ms固體培養基(北京酷來博(coolaber)科技有限公司，貨號：pm1010-fe-250g)，在正常的光照條件下培養一段時間。
40.結果表明，在鐵缺乏培養基上培養10天後，wt擬南芥株系的生長與發育受到明顯的抑制，大部分wt的葉片出現了黃化現象而轉基因擬南芥株系葉盤翠綠、生長狀態良好。
41.使用irt1的全長擴增引物(seq id no:5和seq id no:6)對wt、cjirt1的4個超量轉基因株系、ptirt1的3個超量轉基因株系進行了pcr驗證並進行了株系內的生物學重複。
42.f(seq id no:5)：atggacacttcacttgtca；
43.r(seq id no:6)：ttaagcccatttagccataagg。
44.實驗結果如圖4所示，圖4為cjirt1、ptirt1超量擬南芥轉基因株系驗證及缺鐵脅迫分析；a.轉基因株系pcr驗證，oe-cjirt1的6個電泳孔位分別代表oe-cjirt1-4-1、oe-cjirt1-4-2、oe-cjirt1-5-1、oe-cjirt1-5-2、oe-cjirt1-7-1、oe-cjirt1-7-2，oe-ptirt1的6個電泳孔位分別代表oe-ptirt1-3-1、oe-ptirt1-4-1、oe-ptirt1-4-2、oe-ptirt1-5-1、oe-ptirt1-7-1、oe-ptirt1-7-2；b.陽性轉基因株系表達量分析；c.缺鐵脅迫下轉基因株系表型情況；d.缺鐵脅迫下轉基因株系主根根長分析，****表示p《0.0001。
45.實驗結果如圖4a所示，7個轉基因株系均擴增出了預期1000bp左右的基因片段，而野生型擬南芥wt沒有擴增出對應條帶，表明所檢測的轉基因株系均為陽性植株。
46.為了對轉基因株系進行進一步分析，分別在cjirt、ptirt1中選取2個陽性轉基因株系(oe-cjirt1-4-2、oe-cjirt1-7-2、oe-ptirt1-4-1、oe-cjirt1-4-2)進行表達量檢測，結果顯示四個株系均在擬南芥中具有上萬倍表達量，但在野生擬南芥中尚未檢測到irt1基因的表達，再次證明cjirt1、ptirt1在野生擬南芥中超量成功(圖4b)。
47.對選取的超量擬南芥株系oe-cjirt1-4-2、oe-cjirt1-7-2、oe-ptirt1-4-1、oe-cjirt1-4-2進行缺鐵處理，將wt及超量擬南芥株系置於正常的1/2ms固體培養基中生長5天至擬南芥髮根發芽時，選擇生長發育一致的幼苗，將其轉移至-fe的1/2ms固體培養基，在正常的光照條件下培養7至10天。如圖4c實驗結果表明，在鐵缺乏培養基上培養7天後，相對於oe-cjirt1與oe-ptirt1轉基因擬南芥株系，野生型擬南芥株系的生長與發育均受到抑制的
同時，部分野生型擬南芥株系的葉片出現黃化現象。對其主根根長進行測定，如圖4d實驗結果表明，發現不論是cjirt1還是ptirt1的超量擬南芥株系均顯著高於野生型擬南芥。
48.綜上實驗結果表明：過表達的cjirt1、ptirt1可以提高轉基因擬南芥的耐缺鐵能力，可以有效提升柑橘對缺鐵環境的耐受能力，可為柑橘育種提供基因資源和技術支持，為柑橘育種提供基因資源和技術支持。
49.以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護範圍內。