大豆根際土壤微生物群落宏基因組文庫的構建及其應用的製作方法

2024-04-08 15:16:05 2

專利名稱：大豆根際土壤微生物群落宏基因組文庫的構建及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於環境微生物學技術領域，具體涉及大豆根際土壤微生物群落宏基因組 文庫的構建及其應用。
背景技術：
由於培養條件和技術手段的限制，傳統的微生物培養方法獲得的微生物可能還不 到自然界中實際微生物總數的1%。為了更真實全面地反應土壤微生物多樣性情況及開 發利用土壤中未可培養微生物資源，一種基於直接提取土壤微生物DNA並將其克隆到合適 的載體再導入宿主菌中構建基因組文庫的方法逐漸發展起來，這就是土壤宏基因組學。宏 基因組學作為一種探索微生物多樣性的強有力工具，經過十餘年的發展，可以超越培養手 段而直接獲得新穎的生物催化劑和有價值的活性物質(Handelsman，2004，Microbiol Mol Biol Rev. ；Streit et al. ,2004,Curr Opin Biotechnol. ；Schmeisser et al. ,2007,Appl Microbiol Biotechnol.)。宏基因組文庫促使人們將目光轉向微生物群落和功能研究上， 為未培養微生物遺傳信息的研究提供方法和手段，並用以解決醫學、農業和工業上的問題。宏基因組決定了生物群體的生命現象，包含了遠比可培養的微生物類群更海量 的遺傳信息。國外已有很多從不同環境樣品的宏基因文庫中通過功能性篩選獲得新的抗 生素、脂肪酶、幾丁質酶、蛋白酶、DNA連接酶、膜蛋白、4-羥基丁酸脫氫酶等合成基因或基 因簇，以及對群落結構組成和功能進行分析的報導(Herme et al.，1999，Appl Environ Microbiol. ；Entcheva etal. ,2001, Appl Environ Microbiol. ；Beja et al. , 2002, Appl Environ Microbiol. ；Rolf Daniel,2005, Nature ；Yun et al. ,2004, Appl Environ Microbiol. ；Pathak et al. ,2009, Environ Microbiol·)。國內也逐步開展起相關研究 (Liu et al. , 2009, Appl Microbiol Biotechnol·)。微生物生態學研究為更好的認識環境中微生物群落結構、變化以及微生物在其中 的活動提供了理論依據，而分子生物學方法的引入讓我們能更充分了解土壤中的微生物群 落。而這些方法的共同基礎，是從土壤中提取大量不含抑制物並且具有典型群落代表性的 微生物總DNA，這也是宏基因組文庫構建過程中至為關鍵的第一步。因此需要儘可能地使 所提取的基因組DNA具有代表性，保持較大片段以增加獲得完整的目的基因或基因簇的 可能，還要達到較高的純度以增加建庫效率。為了達到這些要求，很多實驗室致力於摸索 DNA提取的最佳條件，也有研究者將環境樣品經過有針對性地富集後再進行DNA提取，但富 集培養極可能會導致樣品中微生物多樣性的降低。通過設計根際箱系統獲得根際土壤可 用於提取土壤總DNA，但仍然難以完全排除根毛對微生物基因組DNA的影響。而採用一種 以Nycodenz為介質的高速密度梯度離心法，來回收和純化細菌細胞(Bertrand，et al., 2005，J Microbiol. ；Amalfitano，et al. ,2008, J Micobiol Meth.)則可獲得高純度的土 壤微生物DNA。這種「間接」的方法更適合提取未降解的DNA，因為細菌團處於Nycodenz介 質中從而限制了 DNA和土壤組分的接觸，對於去除粘性土壤中腐植酸和金屬離子等效果顯 著。雖然操作難度和成本較高，但可以得到濃度和純度很高，片段較大的基因組DNA，為後續的酶切操作和構建高質量的文庫奠定了很好的基礎。大豆作為一種重要的油料農作物，為我國食物的主要植物蛋白來源，同時又是具 高效「固氮作用」可用於改良土壤的植物。通過構建大豆根際微生物宏基組文庫，有助於比 較完整地闡述根際微生物群落的多種特徵。通過隨機挑取克隆並進行序列測定，來鑑定和 表徵根際範圍內微生物所有存在的基因，從而了解不可培養微生物新的代謝途徑、基因調 控因素、未知功能基因及對病原物具有抗性的基因等。因此通過構建根際土壤宏基因組文 庫並對部分克隆進行測序，有助於明確根際微生物群落(包括固氮菌群)結構、遺傳、功能 多樣性，深入探討其在改善土壤營養狀況中的作用機制，對於完整揭示整個土壤微生物群 落的生態過程和功能具有重要的應用價值。

發明內容
本發明需要解決的問題是構建一個能夠反映大豆根際微生物群落原位生態的宏 基因組文庫及獲得新的基因序列。(1)本發明的技術方案為通過高速密度梯度離心法獲得純淨但代表原位狀態 的根際微生物菌體細胞，提取基因組DNA後酶切回收2_8Kb的片段，與酶切並去磷酸化的 PUC19連接後，轉化大腸桿菌DH5 α菌株並通過藍白斑篩選，挑取陽性克隆組成一個含9504 個克隆的宏基因組文庫。隨機挑取4個陽性克隆並兩端測序，經Blast比對證實SM-2為新
序列。
本發明所提供的宏基因組文庫隨機挑選的克隆SM-I的全序列，是具有SEQID Nol的cDNA序列
cgcctggagcactacctgctggagcaaggccatgcggtgctcagcgcctcgtccctggag60
gcggcgctggaccatttgaactccgccgtggtgatcgacctgttcctgctcgatgaacag120
ctcgccggcccgcatagcgccgccatgctggtggaagcctgcctgccggtgcgcccgcgc180
atgcgcgtgctcggcctgtcttcctccaagCCgCgCgtgCtggacgacagcgcgccgtac240
ccggcgttactcaaacccattcgcctggacgaactggagcgggccatcgagttcaccctg300
cgctcgcccgccgtcacgccctggctggagtgctgatcatgttcgaagccgacctgcgtg360
aagcggcccaacgggtcgtggattacctggagcgccagcgcctgcgcctgctcaccgccg420
agtcctgcacgggcgggcacatcgccgcgctgctctccgccatccccggcagcgggcagg480
tgatggagggtggcctggtggtctattcgcccaccgccaagcgcgagctgCtCggCgtgg540
aggccatgtggctggaggacttcaacctcaccagcgtggaggtggcgcgggcgatggccg600
aggcggcgctgcgctacgagccggccaccgCCgtgCtggCggtgaccggcctgctggacg660
agaagggcaaggacggcatcccgcccggcaccgtctgcctggcctggggctatcgcatgc720
ccgatggcctggcgctgttcacccggcgcgtgcacttcaccggcgacgccgcgtggatgc780
gccaccagaccgtgcgccatgccctggaactgatccccgaatttcatcgcaggcgctggc840
ccggcgaacgccgctgacgcgcccgcgatgacgaagacggCgCCgCCgtCgctgcactgt900
gaaagcccggcctgacagcctgatccatgacaacagcgtgaactgagaggagacttgcga960
tgatgccatcgactgctgagacgaccaacg agctgtgagg aagctgctcg cgagtgagcg1020
aaaccaccgagcgcgcgtgaagaagcggacgactgtgcgccgcatcgagctggagctgac1080
ccagcacacgtccatcgaggaggagattttctacccggcg ctcaagcagg ccggcgagaa1140
ggacgacgcgcagatgtattacgaagccaaggaagagcaccgcaccgtggacgcgctggt1200
cctgccggacctgaagaagaccaagccggacagcgtcgagttcgccggccgggtcaaggt1260
gctcaaggaactgctggagcaccacatcgaggaagaagagcaggagatgttcccgcgcgc1320
cgaagagctgctggaccatccgacgctggagcgcctgggcgccgccatggcgcagctgaa1380
gaaggacatcaaggcgcagtgggatacgcgcgcggcctgattgcagcgggcagaaaaaag1440
cgaagccagggtgacctggcttcgcttttgtttcgggcgccgttcagtccgggttggcgc1500
tgcggctgcgttgcccgcccttgcgtccggcttcggacgcgcgttgcggatcgttcctga1560
aattgccgccgctgttgctgccgcctttcttgccggcttcggctgcgcgttgggggtctt1620
cggcgaagttgccttttccgcctcggtgttcggccatggtggttctcctgctacgggatg1680
ggttggcgggcacggggcccgccctggagtCCgtCgCCCCgccaggcgtggcgacgaaaa1740
aggcgccggggaacgacgcgtcaggcacgcagttcctggcgcacgccggccaggcggcgc1800
aggcggtcgccggcgaccacgatcttgcgctggcgatgcttgccgtggccgggctggaag1860
gtcggcagcgggatgcgcttggtgaacacgtccacctgttcttccggcagcgggccgcac1920
tcgaggatcaggtcgcgcttgatgcggccgatcaggtcgtccagcaactgCtggtg1976
本發明所提供的宏基因組文庫隨機挑選的克隆SM-2正向測序片段序列，是具有SEQID No2的DNA序列
agccatcacaaggcggcgttcgtgaccgactacttctgcacgggatcgtcgtgctcgaac60
gacgtcaattccctcacgccgcagcaagtcgattgggcgctggcctcatacgcgatcggc120
aatgagggcggcgaagacttgtacacctcaccgcacggcggatcgctgtactcgtaccgt180
tccgaatacgcaacgagctaCggCgCgCCgtgtagttcctatacgcaaccggcgagcagc240
atctacgaacgcaagttccaaggtgcgctcgtcgtggtcaatgcaagcggaagttcgtat300
ccgttcacgcttccgtcgggtcacacgtatcacgacatcgagggacaagcggtgagtaat360
ccgctgaatctcgggccggcaaccggatacgttctgcttacgagcaacggctgctcgtaa420
cttccggcctttagcgggcacatgaatcgcgcggcaatcagtgccgcgcgattcacggtc480
cggcaatcccgccgaagcagcgccgtaacatcgccgcgcgatgctgtgcggcatgaccgc540
cgatgcatcgCtgCtgCtggacggtgcagccggcaccgcatgtccgtcgatcgttcggac600
gctcaaccgttttggcccgcacgccgtcgattttgcgtaccgcttcggcaCgCgggtCgt660
tccgctcggtgcacaccaacggtacgatgaCgtttCggCggcgctcaagcgtttgaacgt720
ggacgtcgatgcgtggcccgCgCCgCCCgCcggattattcgtcgtcgaagagcgcacggt780
atatttgcgttcgcgcagcccgatgacggtagcgcacgaattcggacacgcgctcgattg840
cgcgctcggcggcggtgtctatcgttcgagtgtcgatccgcaattgcgcgcgcacttctc900
cgcgcgaagcgtacgtcacgccatacgcggcaccgggacgatgagtacttcgcgaggcta960
tcgcgcgtacgtgagatccacgatccgcgtcgtttgccaagcgcaacgggcgcgcgctac1020
ggcatcgattcgcaatgtcgcgtacgtcga ccgatctccg ccatggaaga tttcccgcca1080
本發明所提供的宏基因組文庫隨機挑選的克隆SM-2反向測序片段序列，是具有SEQID No3的DNA序列
cgcatcggccgggacgagtcctagttttcgcgcgacgtacgcagatccgactgtggggtg60
tcctgcgaaaagcatttcttgcgcgggcgtaaagatgcgcacgcgaacgtcgcaatcagg120
ctgcgtcgccggcaggaggaacgccgtttccgagaggttgagttcctgggcgatcttttg180
5
catgagatcgccgtcgatgccggacgcatcgacgaatacggctagcgggttgccttcgag240
cggcctttgcgtgaagacgtcgacaacgtgatagtgcagctccacaatcccagcgtacta300
CgCCCgCgggctaggctacgcctttggtgaaccgttgccacacggtgcgcggcagcgcat360
tctcgtccggctttccttcaagcgccttcaatagccgagcgtggaagttgcgcacgcctt420
cgcctccgcccggcgatgcgaccgcccacgaagaacacgccggcagatgttgcgcgacgc480
gtctgcgtgctgcggcggcttgcggctcggcgcagttcttcaagacgatcgcgaagagct540
gctcggagactcggtaggctgcatcgctcgtgcggatcgcactgcgcagggcatccgccc600
attgctgcgcggcgccggcatcggcgtgctgcgccgcaaaaagcgcgacggagaccggta660
cgccgtatcgccggttcaaatccaattgcgccgcgagctcgcgttcgtaggatcgccggt720
tcgctaaacccgtcgcgccatcgatctcccgcgggtccattttttgcgcggaatagaacg780
cgccgcccaagatcgttcccgaaacactcgcgaattcgctgacggcatgcgcctctttcg840
agtgtatcccatacgcggcgggatgcttgaccagaagcacgccgtaagcgCgCCgCCCtt900
gcatgatgggggccatcaccgtcgttccgatatgcgtgtgcggcgcgagcgctcggcgcg960
ttcatcgatggtcgaattgggccagattcg tcttacgctg tgcaacacgcgcgcggcagg1020
cctattcgcgggaagacgctgcccgcgcgcgttagtgcctgccgcgtactcggaattgga1080
cgacggcagtcgccttcgtattccgattgc acgcccgctg gcattggcttgctggaacga1140
gttgaaattccga1153
本發明所提供的宏基因組文庫隨機挑選的克隆SM-3正向測序片段序列，是具有SEQID No4的DNA序列
caccgctataccctggaaagcaccatggaagtgctcgccggcgaggccttcgacggctgg60
cagatcagcgagcacggcctgcgctaccagctggacctgggccgcaagcagaacaacggc120
ctgttcctcgacatgcgctacggccgccagtgggtgcaggccaacgccgcCgggCtgCgC180
gtgctcaacctgttcgcctacacctgtggcttctccgtggcggcgatggcCggCggtgCg240
cagaaggtagtcaacctcgacatggcccgcgccgcgctcagccgcgggcgcgacaaccac300
cgcctgaacggccacgacctgtcgaaggtgagcttcctcgaccacgacctgttcaagtcc360
tggggcaaggtgaagaaatccggcccgtacgacctgatcatcatcgacccgccgagcttc420
cagaaaggcagcttcgtcctcgacaaggactacgcccgcgtcctgcgccgcctgccggaa480
ctgctggacggcgccggcacCgtgCtggCCtgcgtgaacgacccggccgtgggcgtggac540
ttcctcctccagggcatggccgccgaagcgccgcaactgcgcttcgtcgagcgcctggaa600
aacccgccggagttcgccgatatcgaggaagacagtgggctgaaggcgctggtgtttcgg660
atggattgatccggcgagacagcgtggggcgtgaagagcgtccgtaggatggcgtggagc720
gaagcgatacccatcgatcctgcgcacctagccccatgggtatcgcaagctccaccccac780
ccattctacaagcgccccgtaagggcgg808
本發明所提供的宏基因組文庫隨機挑選的克隆SM-3反向測序片段序列，是具有SEQID No5的DNA序列
gttgccgaagaacagcaggcgcaggcggtcgcacagcggcgtggccaccagggtgtagag60
cgggtcgaggcccggataccagccggcgaacggctgtacctggtcgtggtaggcgtgcag120
gtgctcgtagagctcggccttcttcagcgcgccgcgcggcaggtcatcgcgaaagcgcgc180
gagcagttcgtccttgagcagcagcggcagcagttcttccagcgtgagcgggcaggcgtc240
gtccatccagcccagtgccagcagcggcgcggcggcgctgggaatgtcgccgatctccgc300
gtagctcagcttgccggcgcgaaaatgcggCCCCttgCgCatcaccagccgcaccagcag360
cgcccgcgagggcagcggcagcgcgcggaaatcggcgatgaagcgggcttcctcggcgtc420
gagcaggtcggcgtagcgttcgccgatccagtcgagggcgcggtggaagttggtcaggta480
gtagaggctggggtcgagcggcgcaagcatcggcgggcactggttttacatacagtgcca540
aggatggcgcgatgggggcttggccgcaagggttagcgcggcctttcatcgggatatgtc600
ttacgcccgacaccgatgctccatgtaggagcgccccatgggcgcggtcgcgggcatggc660
ccgctcctaccctgaactcctgcgcatggatcggccctcaccctggccctggctgcgcgc720
cccgctcagagggagaggggagcgtccggagcaggattaagccatggcgtcagccggcac780
gatcagcccctctcccctgggagagggttggggtgagtggatgctcacgcacccatattt840
ccagtccgtagggcgaataaccgttcacgggttatccgccgttcttgcgtcatggcgctg900
gtgaagcggaggctctgctcttcggtaaggag932
本發明所提供的宏基因組文庫隨機挑選的克隆SM-4正向測序片段序列，是具有SEQID No6的DNA序列
acactgtactgttttcttcaataaatgtggttgcgtagtgttctaaatgctcttccatca60
attgagttgcgcgcttttcatcgccttgttcaatggcatctaaaattgcacggtgttcat120
ctgccgaacaattattatgttttggaatttcatacaatccgaagtcctcg180
caataagcgtctgcaaataactggacatgatcgaattttgattagcttcaatcagcttta240
aatgaaattgacctgatagcttaatccactcagcccaatttccagctaaacgctctttag300
actcttgatcgaccaagcctcgaagctcacgctatgtgacttttgagcga360
gcttttttacagtggcaatttcaagcatgctgcgtgcttcQ-Q-Q-Q-Q-C C C tttgtttcat420
gagcactatgttttgcgatgagtgccccacgattgggctgaatttcastaaccttatcat480
gggcaagtttgacgaaaacacgtcttaacactcctcgcgttaccccaaatgcttcacaca540
aaggtgcttcaactaaacgtgcgccaggggcaagttgtcggcatctacaa600
tagcgttatatatatggtcatcaatttcatcattgctcatttctacggctttttttggtg660
cattcgatggcattgatttctccatttttattaatgcctcctctttttaaaactttatct720
aatgacaatagggtaagtttaacttaagcgttttggaatattgctctcattcccacagca780
actatgtgctgctgaacaattcaacaataaaccttaaaatatccacttatacatctaaat840
ttacttactt 3. 3.3.3.3.3.aattaagcatttctcattttataaatctgtctctgcatat900
C Cclclclclt C Ccltaccagtttaaatgactcataagcgctacttctaaatttgcataactttt960
gctcaattagattgtgcaac3. 3.3.3. 3. cacattggta cacatttaatttcatttctt1020
taagacggaaaacatgctgcctgaagtgactcatctagga agtgagtgtc agatgatata1080
ccgacgcatatgagctctta tgatgcaaaa ctggac1116
本發明所提供的宏基因組文庫隨機挑選的克隆SM-4反向測序片段序列，是具有SEQID No7的DNA序列
caacgccgtcaataacgattacgcctaactcgttttgtagctttagacac60
tacctgcacaccctaaaacaatcgcatcgcttttatcttcagcgagtgcttttttgcatt120
catctcgtatggttcgataagcatctgagtcaggaagctccaatttttcaacggcaatgt180
cacaagctcgaacatttttgcaaaatggcgtagccccatagcgttgagccagatgccagc240
tcatattcactgtgcgttgtaaggttgtcaccacactaaaaccggtactgacataacttg300
cagttcgcatagctgcttcggcaatcccaatcacaggtgccgaagtgatttcacgggcgg360
cataaagcgcaggatcaccaaaacaggcaatgatataggcatctacattttgctgttcac420
cttggcgaatttcctctaacacacctacggcacttagtgcttcatcataataactttcaa480
tcgttgcagggcccatttgaggactcaccgcaataatttgagtaccagaacctgcgacta540
tatttgctgatgcagcaattttttcagtcatgctttgagtggtattaggattaataatgt600
taattttcattgtacttttaccttagtcattgccgatttagcatgggcaagcggttggtt660
aagaaatcggtaaatgacaaaaccgaatcccatcccaataaaccatgtgaaattagccag720
cccagaaagttgcggtaaaagtacgcagagaataggaattaatgaagcaggaattaaggc780
ataaaaggcagagtggttataaccatttttgtaccaatacaaacctttagtatctaaggt840
atatagatcatccacttcgattttttgttttttaacgaggtaaaaatcgggcgagcaata900
caccaaaaagtggaccgataaatgcgcctaaaatatcatgttgtaatgatcacttgaggt960
￡Ι ￡1￡1￡Ι ￡1￡1￡Ι tccatggggtatgaaaattg aactactgctgcatcaatcc acccatgcgc1020
actagtttggctcgtgaaacatagaaaattcagccagtga ctagtagcga cattaatccg1080
atgtgccatcatagtcagctactcaatcacctaaggttatcagttgccaccat1133
所用的基因組DNA提取方法為細菌基因組DNA提取法，DNA和pUC19載體酶切時
使用的內切酶為I3St I，酶切後的DNA片段與載體連接時使用T4DNA Ligase0連接產物採 用CaC12轉化法轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。(2)本發明與現有技術相比，其有益效果是我們通過根際箱系統，收集大豆根際土壤樣本，使用高速密度梯度離心法分離、純 化獲得菌體細胞，從而得到大片段、高濃度、高純度的基因組DNA。既能代表大豆根際微生物 群落的原位狀態，又可無須純化直接進行後續的酶切等分子生物學操作，並且能夠有效排 除植物和微生物互作研究中植物根系殘留物對微生物基因組的影響。從構建的文庫中隨機 挑取克隆進行兩端測序後，經由生物信息學的方法證實存在未見報導過的新序列。因此，我 們構建的這個包含9504個陽性克隆的宏基因組文庫存在新的微生物基因序列，對於從生 態基因組的角度闡述大豆根際微生物群落生態及其功能具有重要意義和應用價值。


圖1用於獲得大豆根際土壤樣本的根際箱示意圖(Α為大豆生長區，B為根際區，C 和D為水)圖2高速密度梯度離心法回收得到的菌體細胞(Α為菌體細胞帶)圖3細菌基因組總DNA電泳4不同限制性內切酶酶切基因組DNA後效率比較電泳5基因組DNA酶切圖譜圖6與載體連接後的外源DNA轉化宿主細胞後藍白斑篩選圖7陽性克隆保存圖8克隆菌檢與質量驗證
具體實施例方式
8
實施例1、大豆根際土壤樣本的獲得與菌體回收通過在根際箱(圖1)中定期取樣，獲得大豆根際土壤樣本，置於-20°C冰箱備用。 利用高速密度梯度離心法回收菌體新鮮土壤樣品加入焦磷酸鈉緩衝液)，勻漿分散 土壤顆粒後低速離心(15°C，280g，aiiin)得到上清液，然後將上清液高速離心(IOOOOg)得 到菌泥沉澱。用0. 8%的氯化鈉溶液重懸後，將Nycodenz (Axis-shied Poc, Oslo, Norway) 溶液(8g/10ml)加入離心管底部託起泥漿，使用甩平轉子進行密度梯度離心G°C，14500g， 90min)。吸出白色的細胞層(菌體帶)(圖2)，用0. 8%的氯化鈉溶液稀釋後高速離心， 15000g,20min)獲得菌體沉澱。密度梯度離心法操作難度較高，但可以有效排除根際樣品中 根毛的影響，且為後續操作中得到高純度的基因組DNA提供保證。利用該菌體提取純化流 程獲得的菌體最終得率在30%以上，且獲得的菌體細胞在一定程度上代表了原始土壤中的 細菌群落結構多樣性，並能直接用於較大片段DNA分離提取，無需再純化。實施例2細菌基因組總DNA的提取與酶切按照細菌基因組DNA的提取方法，提取得到高純度、高濃度，可直接用於後續酶 切操作的基因組總DNA( > 23Kb)(圖3)。將得到的每份樣品的DNA分別測定濃度後，等 量混合作為一份總基因組DNA樣品進行後續操作。經稀釋測定濃度後，建立60ul酶切體 % :10XBuffer6y L, Pst I 或 EcoR I 或 Hind III (TaKaRa Biotech. Co. , Ltd. , Dalian, 01土皿)3111^，模板0嫩33111^，滅菌水補齊到60 μ L。經實驗證實，同等條件下酶切效率為 Pst I > EcoR I > Hind III (圖4)，故使用使用I^st I酶切(圖5)。回收目標片段範圍 為2-8Kb，為了提高大片段酶連和轉化效率，需要分開回收。一部分為2-5Kb，另一部分為 5-8Kb，分別回收純化備用。實施例3酶切片段與載體連接及轉化將使用Pst I 酶切後的 PUC19 載體(TaKaRa Biotech. Co.，Ltd.，Dalian, China) 去磷酸化後過Gel extraction kit中的純化小柱(Omega Bio-Tek，USA)純化，然後按比 例與酶切後的基因組DNA連接。酶連體系為=IOXiMDNALigase Buffer (TaKaRa Biotech. Co.，Ltd.，Dalian, China) 2 μ L, DNA 片段 12 μ L, pUC19 3 μ L, T4DNALigase 1 μ L,滅菌水補 平至20yL，16°C酶連過夜。實施例4挑取陽性克隆與菌檢驗證將含有約5ug外源DNA的連接產物，轉化DH5 α高效感受態細胞(Tiangen， Beijing，China)。每管連接產物QOul)轉化4管感受態細胞，復甦後每管菌液均勻分開塗 布2-3塊直徑12cm平板預先塗布X-Gal和IPTG(Amresco)。37°C培養12 16h後，藍 白斑法篩選含有重組質粒的陽性克隆(圖6)。共計轉化30管感受態細胞，塗布約80塊左 右平板，得到9504個陽性克隆(圖7)。每板隨機挑取5個克隆進行PCR菌檢(圖8)。完 整基因文庫應包含的克隆數目，預測公式為Ν= 1η(1-ρ)/1η(1- ·)。實施例5陽性克隆測序與功能分析隨機挑取陽性克隆兩端測序，得到的序列(SEQ ID Nol,SEQ ID No2，SEQ ID No3， SEQID No4，SEQ ID No5，SEQ ID No6)去除兩端引物後，進行BLAST-N鑑定分析。比對分析 表明，SM-2(SEQ ID No2)與已知序列同源性很低，為新序列。
權利要求
1.一種大豆根際土壤宏基因組文庫，其特徵是將提取的土壤微生物DNA進行酶切後獲 得的2-81Λ的DNA片段連接入pUC19載體後轉化大腸桿菌，通過藍白斑篩選獲得的9504個 陽性克隆。
2.根據權利要求1所述的大豆根際土壤宏基因組文庫的構建方法，其特徵是將土壤 樣本勻漿並經Nycodenz介質高速密度梯度離心後，獲得純淨的根際微生物菌體細胞，提取 DNA並酶切回收2-8Kb的目標片段，連接pUC19載體後轉化大腸桿菌，通過藍白斑篩選獲得 陽性克隆。
3.根據權利要求1所述的大豆根際土壤宏基因組文庫中的所有克隆在微生物資源開 發中的應用。
全文摘要
本發明屬於環境微生物學技術領域，具體涉及大豆根際土壤宏基因組文庫的構建及其應用，其特徵包括根際土壤樣本獲得、菌體細胞回收、細菌基因組DNA提取、DNA酶切及與pUC19連接、轉化大腸桿菌後藍白斑篩選得到陽性克隆，及構建成含9504個陽性克隆的宏基因組文庫，隨機挑取克隆測序並進行生物信息學分析。該發明在明確根際微生物群落(包括固氮菌群)結構、遺傳、功能多樣性具有重要的意義，並為深入探討其在改善土壤營養狀況中的作用機制、開發利用大豆根際土壤中的不可培養微生物資源及深入揭示整個土壤微生物群落的生態過程和功能提供重要的信息，具有重要的應用價值。
文檔編號C40B50/06GK102071471SQ20101061434
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者孔令如, 戚金亮, 李永春, 李愛倩, 楊永華, 楊統一, 湯程貽, 王焱, 黃惺祺 申請人:南京大學