一種經尿液檢測前列腺癌的標誌物tRF-Thr-TGT-4-M2及其應用

2024-04-15 06:37:05

一種經尿液檢測前列腺癌的標誌物trf-thr-tgt-4-m2及其應用
技術領域
1.本發明涉及分子生物學檢測技術領域，尤其涉及一種經尿液檢測前列腺癌的標誌物trf-thr-tgt-4-m2及其應用。


背景技術：

2.2016年nature genetics雜誌報導了trna是一種高豐度的、廣泛存在的、被動參與的mrna解碼器及蛋白翻譯元件。trna通過其反密碼子與mrna的密碼子結合而顯著影響生物學過程和疾病進展。同時，trna在體液中高豐度存在的特點使其成為臨床應用的生物標誌物，可被運用到腫瘤增殖、轉移的檢測中。隨後有人報導了trf和tirna是在特定的細胞/組織中或者在細胞受到脅迫等特定條件下，由特定的核酸酶[如dicer、血管生成素(ang)]在trna的環上剪切，產生的特定大小的小片段rna。trf和tirna屬於一類小的非編碼rna，被統稱為tsrna。trf分為trf-1,trf-2,trf-3,trf-5和i-trf；tirna分為5
′
tirna和3
′
tirna。成熟的trna經剪切後轉變為trf和tirna，trf和tirna在抑制蛋白質合成、調節基因表達、啟動病毒逆轉錄酶和調節dna損傷反應中發揮重要作用，可視為trna的功能單位。
[0003]
目前對於前列腺癌細胞增殖檢測的方法通常採取血清psa檢測來評判。但在廣泛應用的過程中發現此檢測方法特異性差與敏感性不足，不能區分前列腺重度炎症及提示早期前列腺癌細胞增殖。雖然還有超聲、核磁共振等檢測方法作為補充，但這些方法仍具有上述不足之處。因此尋找敏感性高、特異性強的標誌物檢測前列腺癌細胞增殖，已成為醫學研究的熱點。


技術實現要素：

[0004]
本發明的目的在於提供一種經尿液檢測前列腺癌的標誌物trf-thr-tgt-4-m2及其在檢測前列腺癌細胞增殖中的應用。
[0005]
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0006]
本發明提供了一種檢測前列腺癌的標誌物trf-thr-tgt-4-m2，所述標誌物的核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0007]
本發明還提供了一種檢測所述的標誌物的引物，，所述引物包括如seq id no:2所示的上遊引物和如seq id no:3所示的下遊引物。
[0008]
本發明還提供了一種所述的標誌物或所述的引物在製備檢測前列腺癌的試劑或試劑盒中的應用。
[0009]
優選的，所述試劑或試劑盒的檢測樣本包括前列腺細胞株、新鮮前列腺組織、新鮮穿刺前列腺組織、新鮮尿液、新鮮前列腺按摩液或血液。
[0010]
本發明還提供了一種經尿液檢測前列腺癌的試劑盒，所述試劑盒包括所述的引物。
[0011]
本發明可通過檢測尿液中trf-thr-tgt-4-m2相對表達量，評判前列腺癌細胞的增
殖水平。trf-thr-tgt-4-m2的核苷酸序列如seq id no:1所示，屬於trf-5c類型。
附圖說明
[0012]
圖1為trf-thr-tgt-4-m2基因在前列腺癌組織和前列腺正常組織中的表達情況。
具體實施方式
[0013]
下面結合實施例對本發明提供的技術方案進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。
[0014]
實施例1
[0015]
本實施例以新鮮尿液為檢測樣本。尿液排出體外時經過尿道前列腺部，因此對尿沉渣進行相關檢測具有一定的意義。2021年10月至2022年1月期間，收集揚州大學附屬醫院有前列腺疾病臨床症狀表現患者晨起第一次排尿，收集後立即進行以下操作處理。
[0016]
1.勻漿
[0017]
取上述受檢者晨起第一次排尿的中段尿液200ml，隨即4℃下6000轉/分鐘離心20分鐘，收集尿沉渣備用。加入tri reagent試劑反覆吹打使細胞裂解，每克沉渣使用1ml tri reagent試劑，並避免在加入tri reagent試劑進行裂解前清洗細胞，因為清洗會很可能導致mrna的降解。
[0018]
2.兩相分離
[0019]
勻漿後樣本於25℃孵育5分鐘，以便核酸蛋白複合體完全解離。然後按照每1ml的tri reagent試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿(上海化學試劑有限公司)，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒後，25℃孵育3分鐘。4℃下12000轉/分鐘離心15分鐘。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層和上層的無色的水相。rna全部被分配於水相中。水相的體積大是勻漿時加入的tri reagent試劑的60％。
[0020]
3.rna沉澱
[0021]
將水相轉移到新離心管中。水相與異丙醇(上海化學試劑有限公司)混合以沉澱其中的rna，異丙醇的加入量按照每個樣本勻漿時加入1ml tri reagent試劑加入0.5ml異丙醇。混勻後30℃孵育10分鐘後，於4℃12000轉/分鐘離心10分鐘。此時離心前不可見的rna沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。
[0022]
4.rna清洗
[0023]
移去上清液，加入75％乙醇(以depc水配製，depc水購自上海浦予工業科技有限公司)，清洗rna沉澱。75％乙醇的加入量按照每個樣本勻漿時加入1ml tri reagent試劑加入1ml 75％的乙醇。振蕩後，4℃7500轉/分鐘，離心5分鐘。
[0024]
5.重新溶解rna沉澱
[0025]
去除乙醇溶液，空氣中乾燥rna沉澱10分鐘，切勿真空離心乾燥。操作過程中注意rna沉澱不要完全乾燥。溶解rna時，先加入1ml無rna酶的水用槍反覆吹打幾次，然後60℃孵育10分鐘。獲得的rna溶液保存於-70℃。
[0026]
6.對照樣本rna的抽提
[0027]
從對照樣本人前列腺增生細胞系(bph-1細胞系，購自上海賓穗生物科技有限公司)細胞中抽提rna。
[0028]
加入800μl的tri reagent試劑至1ml對照樣本中，樣本裂解後，重複步驟2至步驟5的操作。此外，在加異丙醇沉澱rna前，加10μg的無rna酶的糖原作為水相載體。為降低溶液粘度，在加氯仿前先將樣本兩次過26號針頭以剪切基因組dna。兩相分離後糖原留在水相中並和rna共沉澱。只要糖原濃度不高於4mg/ml，不會影響cdna的合成，同樣也不會對pcr過程產生影響。
[0029]
7.rna質量檢測
[0030]
採用紫外吸收測定法，使用nd-1000測定rna濃度和純度，測量前先用溶解rna用的depc水1μl凋零處理測量基座表面，然後rna檢測操作方法如下：
[0031]
a)滴加1μl rna樣本至測量基座的表面。
[0032]
b)液滴會自動在上下基座之間形成液柱並自動完成測定，rna濃度及質量的各種參數將在電腦中自動生成文件。
[0033]
c)一次測定完成後，用柔軟的擦鏡紙擦去上下基座表面上的樣本液，便可進行下一個樣本的測量。
[0034]
d)測定結果(電腦自動生成的excel和jpeg文件附於實驗報告文件夾中)：
[0035]
濃度測定：
[0036]
260nm處讀值為1表示40ng rna/μl。樣品rna濃度計算公式為：a
260
(讀數)
×
40ng/μl。具體計算示例如下：
[0037]
rna溶於20μl depc水中，取1μl用於測定，測得a
260
＝65.003
[0038]
rna濃度＝65.003
×
40ng/μl＝2600.12ng/μl
[0039]
取1μl用來測量以後，剩餘樣品rna為19μl，剩餘rna總量為：19μl
×
2600.12ng/μl＝49.4μg
[0040]
純度檢測：
[0041]
rna溶液的a
260/a280
的比值是一種rna純度檢測方法，比值範圍1.8到2.1。即使比值超出這個範圍，rna樣品也一樣可以用於一些普通實驗中如northern雜交，rt-pcr和rna酶保護實驗。
[0042]
實施例2
[0043]
rna前處理與cdna合成
[0044]
本實施例用到的試劑rtstar
tm
trftirna pretreatment kit(cat#as-fs-005)、rtstar
tm
first-strand cdna synthesis kit(3』and 5』adaptor)(cat#as-fs-003)購自美國arraystar生物公司；其他試劑均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
[0045]
1.3』末端去乙醯化處理
[0046]
(1)按照下表1配置去乙醯化反應液：
[0047]
表1去乙醯化反應液配置
[0048]
rna5μgdeacylationreaction緩衝液(5
×
)3ulsuperase
·
in
tm
rnase抑制劑1μl無核酸酶水變量總體積加至15μl
[0049]
(2)渦旋混合，37℃孵育40分鐘。
[0050]
(3)加入19μl deacylation stop緩衝液，渦旋混合，室溫孵育5分鐘，終止去乙醯化反應。
[0051]
2.去除3
』‑
cp與添加5
』‑
p
[0052]
(1)將上一步驟的反應液置於冰上，依次加入下表2中的試劑：
[0053]
表2試劑
[0054]
terminalenzymereaction緩衝液(10
×
)5μl10mmatp5μlterminalenzymemix3u(1μl)無核酸酶水5μl總體積/樣本加至50μl
[0055]
(2)渦旋混合，37℃孵育40分鐘。
[0056]
(3)70℃孵育5分鐘以終止反應。
[0057]
(4)重新抽提rna。
[0058]
3.去甲基化處理
[0059]
(1)配製去甲基化反應液：
[0060]
表3去甲基化反應液配置
[0061][0062][0063]
(2)進行去甲基化反應：在37℃水浴鍋中孵育2小時，然後加入40μl無核酸酶水與10μl demethylation stop緩衝液(5
×
)，終止去甲基化反應。
[0064]
(3)重新抽提rna。
[0065]
4.連接3
′
接頭
[0066]
(1)在200μl無rna酶的pcr管中依次加入下列試劑：
[0067]
表4試劑
[0068]
無核酸酶水變量樣本rna2μl3』adaptor0.5μlrnaspike-in0.5μl總體積加至3.5μl
[0069]
(2)在熱循環儀中70℃孵育2分鐘，然後將pcr管移至冰上。
[0070]
(3)添加下列反應試劑：
[0071]
表5反應試劑
[0072]3』
ligationreaction緩衝5μl3』ligationenzymemix1.5μl總體積加後變為10μl
[0073]
(4)在熱循環儀中25℃孵育1小時。
[0074]
5.反轉錄引物(reverse transcription primer)雜交
[0075]
反轉錄引物可與多餘的3』接頭雜交，從而將單鏈dna接頭轉化為雙鏈dna分子。如果總rna起始量為100ng，將反轉錄引物用無酶水1：2稀釋。
[0076]
(1)向上一步步驟(4)的pcr管裡加入下列試劑：
[0077]
表6試劑
[0078]
無核酸酶水2.3μlreversetranscriptionprimer0.5μl總體積加後變為12.8μl
[0079]
(2)在熱循環儀中依次75℃孵育5min，37℃孵育15min，25℃孵育15min。
[0080]
6.連接5
′
接頭
[0081]
(1)在20μl無核酸酶水中重懸5』接頭。注意：如果總rna起始量為100ng，將5
′
接頭用無核酸酶水1:2稀釋。
[0082]
(2)在單獨的無核酸酶的200μlpcr管中加入0.6μl的5』接頭。(n為實驗所處理的樣本數目)在熱循環儀中70℃孵育2分鐘，然後立即在冰上冷卻。注意：將剩餘的5』重懸接頭儲存在-80℃冰箱。為了避免rna降解，請在接頭變性後30分鐘內使用接頭。
[0083]
(3)向上一步步驟(1)中的pcr管中依次加入下列反應物，充分混合。
[0084]
表7反應物
[0085][0086]
熱循環儀25℃孵育1小時。
[0087]
7.反轉錄反應
[0088]
(1)在無核酸酶的200μlpcr管加入下列反應物：
[0089]
表8反應物
[0090][0091][0092]
(2)熱循環儀50℃孵育1小時，然後立即在冰上冷卻，反應產物可直接用於pcr擴增反應。
[0093]
實施例3
[0094]
實施例2合成的cdna用於實時定量pcr檢測
[0095]
試劑2
×
pcr mastermix(as-mr-006-5)購自美國arraystar生物公司；引物設計軟體是primer 5.0；quantstudio
tm
5real-time pcr system(applied biosystems)購自美國應用生物系統公司。
[0096]
1.製備用於繪製標準曲線的梯度稀釋dna模板
[0097]
(1)針對標記物基因和管家基因，選擇一確定表達該基因的cdna模板進行pcr反應：
[0098][0099]
輕彈管底將溶液混合，5000轉/分鐘短暫離心，設置pcr反應：95℃，10min；40個pcr循環(95℃，10秒；60℃，60秒(收集螢光))。
[0100]
(2)pcr產物與100bp dnaladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測pcr產物是否為單一特異性擴增條帶。
[0101]
(3)將pcr產物進行10倍梯度稀釋：設定pcr產物濃度為1，分別稀釋為1
×
10-1
，1
×
10-2
，1
×
10-3
，1
×
10-4
，1
×
10-5
，1
×
10-6
，1
×
10-7
，1
×
10-8
，1
×
10-9
，這幾個梯度濃度的dna。
[0102]
2.進行realtime pcr反應
[0103]
(1)將合成的cdna樣本配置realtime pcr反應體系。體系配置如下：
[0104][0105][0106]
輕彈管底將溶液混合，5000轉/分鐘，離心5分鐘。
[0107]
(2)加樣
[0108]
a.將8μl混合液加到384-pcr板對應的每個孔中。
[0109]
b.再加入對應的2μl cdna。
[0110]
c.小心粘上sealing film封口膜，並短暫離心5分鐘。
[0111]
c.在設置pcr程序前將準備好的pcr板放在冰上。
[0112]
將上述384-pcr板置於realtime pcr儀上進行pcr反應。
[0113]
所有的指標均按以下程序進行：
[0114]
95℃，10min；40個pcr循環(95℃，10秒；60℃，60秒(收集螢光))。
[0115]
為了建立pcr產物的熔解曲線，擴增反應結束後，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；並從60℃緩慢加熱到95℃(儀器自動進行-ramp rate為0.075℃/秒)。
[0116]
3.結果與計算
[0117]
樣本目的基因和管家基因分別進行realtime pcr反應。根據繪製的梯度稀釋dna標準曲線，樣本目的基因和管家基因的濃度結果直接由機器生成。樣本目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣本此基因的校正後的相對含量。
[0118]
4.待測基因以內參校正
[0119]
實時定量pcr時待測樣本和對照樣本的加樣量均為2μl，然而由於受rna濃度定量誤差和rna逆轉錄效率誤差等的影響，各樣品的2μl體積的cdna其含量並不完全相同，為校正此差異，使用管家基因u6(不同樣品間表達量基本恆定)作為內參，以樣品待測基因的值除以此樣本內參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。
[0120]
5.實時定量pcr使用引物列表
[0121]
表9實時定量pcr使用引物列表
[0122][0123][0124]
6.樣本前列腺癌增殖結果評判
[0125]
檢測樣本與對照樣本經上述操作步驟處理後，均可得到組織中trf-thr-tgt-4-m2的相對含量，結果如圖1所示。
[0126]
從圖1可以看出，檢測樣本中trf-thr-tgt-4-m2相對含量明顯高於對照樣本中trf-thr-tgt-4-m2相對含量，提示前列腺癌細胞處於增殖狀態。
[0127]
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。