針對C型肝炎病毒e1e2複合體的抗體、hcv顆粒的組合物和藥物組合物的製作方法

2023-10-10 02:50:59 2

針對C型肝炎病毒e1e2複合體的抗體、hcv顆粒的組合物和藥物組合物的製作方法
【專利摘要】本發明涉及針對HCV的新構象抗體以及更特別地涉及單克隆抗體。本發明還涉及易於被所述抗體識別的顆粒的組合物，以及涉及包含它們的藥物組合物。本發明還涉及HCV有包膜的亞病毒顆粒或純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒，以及製備它們的方法。
【專利說明】針對C型肝炎病毒E1E2複合體的抗體、HCV顆粒的組合物和藥物組合物
[0001]本申請為申請號為200480008734.9，申請日為2004年3月31日的同名申請的分
案申請。
[0002]本發明涉及抗HCV的新構象(conformational)抗體以及更特別地涉及單克隆抗體。本發明還涉及易於(liable)被所述抗體識別的顆粒的組合物，以及涉及包含它們的藥物組合物。本發明還涉及HCV有包膜的亞病毒顆粒或純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒，以及製備它們的方法。
[0003]C型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎和肝硬化的主要原因，並且可導致肝細胞癌。世界範圍內約200百萬人慢性感染HCV，這種疾病已經作為一種嚴重的全球健康問題顯現出來。HCV是一種有包膜的RNA病毒,屬於黃病毒科的肝炎病毒屬。其基因組是9.6kb正極性單鏈RNA，具有作為內部核糖體進入位點起作用的5』非翻譯區(UTR)，編碼大約3，000個胺基酸的多蛋白(polyprotein)的單一可讀框以及3』 UTR(Bartenschlager等，2000)。這種多蛋白在翻譯同時和之後通過宿主細胞肽酶切割產生包括核心蛋白及包膜糖蛋白El和E2的結構蛋白，以及通過病毒蛋白酶產生非結構蛋白(NS) 2-5B (Bartenschlager等,2000)。與相關的正鏈RNA 病毒類似，通過負鏈RNA中間體的方式發生複製並且由NS蛋白催化，其形成質膜附著的複製酶複合體。
[0004]患者血漿樣品中存在的HCV顆粒的水平低以及缺乏支持有效HCV複製或顆粒裝配的細胞培養系統妨礙了表徵與病毒體相關的糖蛋白。當前關於HCV包膜糖蛋白的知識是基於利用病毒或非病毒表達載體的細胞培養物瞬時表達試驗。這些研究已經顯示了 El和E2糖蛋白相互作用形成複合體(DubuissonJOOO中的綜述)。存在非離子去汙劑時，檢測到兩種形式的E1E2複合體:通過非共價相互作用穩定的E1E2異二聚體和異質的二硫鍵連接的聚集物，後者被認為代表錯誤摺疊的複合體。以前，通過用合成肽或重組抗原免疫已經獲得了包膜糖蛋白特異性抗體。然而，構象敏感性E2反應性單克隆抗體(mAb) (H2) 一其識別被認為是HCV糖蛋白異二聚體的天然萌芽前(prebudding)形式的非共價連接的E1E2異二聚體一不與血清來源的HCV RNA陽性顆粒反應(Deleersnyder等，1997)。此外，W092/07001公開了通過用從感染的黑猩猩中提取的HCV顆粒製劑免疫小鼠而製備的抗體，然而這些抗體未曾在天然HCV顆粒(B卩，源自感染患者)上進行測試。此外，W000/05266公開了從感染患者B細胞製備的抗體，然而這些抗體是根據它們結合重組E2蛋白的能力選擇的。因此，所有這些抗體的應用都有限，或者用於診斷目的，或者用於治療或預防目的，因此它們是用非天然HCV或其部分生產或選擇的，而且未顯示出可與天然HCV顆粒相互作用。
[0005]缺乏含有足夠量和濃度的天然有包膜的HCV顆粒的HCV製劑，是迄今為止無法獲得易於識別天然HCV顆粒的抗體的原因之一。實際上，血漿樣品中低水平的HCV顆粒使表徵和顯現觀察這種病毒變得困難。先前已經顯示了在感染的急性期從自然感染患者的血漿中回收的病毒在蔗糖中具有大約1.06g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。相比之下，體外複製後從細胞培養物中回收的HCV在蔗糖中具有1.12g/ml的浮力密度(Yoshikura等，1996)。最後，從慢性感染個體中回收的HCV在蔗糖中具有大約1.17g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。血清來源病毒的低密度歸因於其結合血清低密度脂蛋白(Thomssen等，1992)。已經顯示高密度病毒與抗原一抗體複合物中結合到病毒的抗體有關(Kanto等，1995)。儘管有這些數據，但是仍然沒有表明這些不同HCV群的蛋白組成，以及是否低密度級分(〈1.0g/ml)含有包膜、RNA和核殼作為完整病毒體。
[0006]因此，本發明的一個目的是提供與天然HCV顆粒反應的抗體。
[0007]本發明的另一方面是提供天然HCV顆粒的組合物，其量和濃足以允許有效免疫抗體產生動物。
[0008]本發明的另一方面是提供缺乏感染性，易於用作藥物組合物的活性物質的特定HCV組合物。
[0009]發明詳述
[0010]本發明涉及能特異性結合天然HCV病毒包膜的構象抗體。
[0011]措辭「構象抗體」指識別具有由其分子環境所限定的三維結構的表位的抗體。
[0012]措辭「特異性結合」意思是抗體結合到基本上僅在形成天然HCV病毒包膜的元件之一上發現的表位，也就是說，基本上不存在抗體與除形成天然HCV包膜的元件外的元件的結合。例如,可通過本領域技術人員公知的方法檢驗抗體的結合特異性,如Western印跡實驗，其中生物樣 品在凝膠上通過電泳遷移，然後轉移到膜上並且與所述抗體共孵育，其然後通過二抗檢測。如果實質上所檢測的所有電泳條帶都含有靶化合物或其部分，則稱所述抗體「特異性結合」所述生物樣品中包含的靶化合物。
[0013]「HCV」意思是「C型肝炎病毒」，其具體描述於Choo等(1989，1991)中。HCV特別地包括RNA、由核心蛋白構成的衣殼以及包含脂質和蛋白特別是糖蛋白的包膜。
[0014]「HCV病毒包膜」由脂質和蛋白特別是糖蛋白如HCV蛋白El和E2構成(Clarke，1997)。
[0015]「天然的」意思是HCV，或其部分，是如同在生物樣品中發現的，可能地是如同從生物樣品中分離的以及一如果需要的話一純化的。這種樣品可以是感染HCV的患者的血液、血漿或者血清。特別地，「天然的」指HCV，或其部分，其不是通過重組方法，或者通過使用細胞系或動物生產的，並且不同於在例如Schalich等(1996), Blanchard等,(2002)或W092/07001中所描述的HCV元件。
[0016]本發明更特別地涉及能特異性結合天然HCV E2蛋白的構象抗體。
[0017]HCV E2 特別地描述於 Dubuisson(2000)和 Op De Beeck 等(2001)中。其作為多蛋白(3012個胺基酸)產生，經過切割產生E2 (384到714位胺基酸)。
[0018]措辭「特異性結合」意思是抗體結合基本上僅在HCV E2蛋白上發現的表位，或其部分。特別地，在其中抗體一 E2複合物與其它蛋白共同存在的競爭試驗中，不能將該抗體從HCV E2蛋白上脫離下來。
[0019]措辭「天然HCV E2蛋白」意思是該蛋白是如同在感染HCV患者的生物樣品中發現的，特別地天然HCV E2蛋白不是重組蛋白。
[0020]本發明涉及如上所定義的構象抗體，其能夠中和患者中的HCV感染。
[0021]「中和HCV感染」意思是該抗體能夠改善感染HCV患者的健康，例如，可通過血液、血漿或血清中檢測到的HCV的減少得到證實，或者該抗體能預防個體被HCV感染。
[0022]可在模型動物中監測所述抗體中和HCV感染的能力，如黑猩猩或小鼠，特別是人源化小鼠，其慢性感染HCV，或者其在所述抗體存在時首先感染(primo-1nfected) HCV。所監測的抗體應當能夠分別誘導減少HCV相關的病毒血症或者預防HCV感染。
[0023]本發明涉及如上所定義的構象抗體，能夠沉澱在其共價或非共價形式下的HCVE1E2複合體。
[0024]HCV E1E2複合體可以是非共價的，也就是說，El和E2通過弱鍵的方式結合，如氫鍵，離子鍵，範德瓦耳斯鍵或疏水鍵；或所述複合體可以是共價的，也就是說El和E2通過共價鍵的方式結合，例如二硫鍵。在Deleersnyder等(1997)中特別地描述或提出了 E1E2複合體的共價和非共價形式。
[0025]「沉澱」意思是抗體可致使HCV E1E2複合體不溶。例如可根據Dubuisson和Rice (1996)所述發生沉澱。
[0026]本發明涉及如上所定義的構象抗體，能夠特異性結合天然HCV El蛋白。
[0027]特別地在Dubuisson (2000)和 Op De Beeck 等(2001)中描述了 HCV E1。其作為多蛋白產生(3012個胺基酸)，經過切割產生El (192到383位胺基酸)。
[0028]措辭「特異性結合」意思是抗體結合基本上僅在HCV El蛋白上發現的表位，或其部分。特別地在其中抗體一 El複合物與其它蛋白一起存在的競爭試驗中，不能將該抗體從HCV El蛋白上脫離下來。
[0029]措辭「天然HCV El蛋白」意思是蛋白如在感染HCV患者的生物樣品中發現的，特別是該天然HCV El蛋白不 是重組蛋白。
[0030]本發明更具體地涉及構象抗體,能夠特異性結合天然HCV El蛋白，結合天然HCVE2蛋白，並且能沉澱在其共價或非共價形式下的HCVE1E2複合體。
[0031]本發明涉及如上所定義的構象抗體，能夠特異性結合由至少下列序列之一構成的表位:
[0032]HCV蛋白El的297到306位胺基酸；
[0033]HCV蛋白E2的480到494位胺基酸；
[0034]HCV蛋白E2的613到621位胺基酸。
[0035]根據本發明的抗體能夠結合:
[0036]-呈現(presenting)包含HCV蛋白El的297到306位胺基酸的肽的分子，對應以下序列:RHWTTQGCNC(SEQ ID NO:1);和 / 或
[0037]-呈現包含HCV蛋白E2的480到494位胺基酸的肽的分子，對應以下序列:PDQRPYCffHYPPKPC(SEQ ID NO:2);和 / 或
[0038]-呈現包含HCV蛋白E2的613到621位胺基酸的肽的分子，對應以下序列:YRLffHYPCT(SEQ ID NO:3)
[0039]可通過合成含有任何前述序列的肽以及通過本領域技術人員公知的方法例如ELISA或EIA測定抗體結合所述合成肽的能力,檢驗所述抗體與至少一種前述序列的結合。
[0040]首字母縮略詞「ELISA」意思是酶聯免疫吸附測定。
[0041]首字母縮略詞「EIA」意思是酶免疫測定。
[0042]本發明涉及如上所定義的構象抗體，能夠特異性結合由下列序列中的每一個構成的表位:
[0043]HCV蛋白El的297到306位胺基酸；[0044]HCV蛋白E2的480到494位胺基酸；
[0045]HCV蛋白E2的613到621位胺基酸。
[0046]根據本發明的抗體能夠結合呈現表位的分子，所述的表位包含:
[0047]-包含HCV蛋白El的297到306位胺基酸的肽，對應下列序列:RHWTTQGCNC(SEQID NO:1);和
[0048]-包含HCV蛋白E2的480到494位胺基酸的肽，對應下列序列:PDQRPYCffHYPPKPC(SEQ ID NO:2);和
[0049]-包含HCV蛋白E2的613到621位胺基酸的肽，對應下列序列:YRLWHYPCT(SEQ IDNO:3)。
[0050]可通過本領域技術人員公知的方法，例如ELISA或EIA，通過測定抗體結合一種分子，特別是包含序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO:1)的蛋白，結合一種分子，特別是包含序列roQRPYCWHYPPKPC (SEQ ID NO:2)的蛋白，以及結合一種分子，特別是包含序列YRLffHYPCT (SEQ ID NO: 3)的蛋白的能力，檢驗所述抗體與包含每種前述序列的表位的結
八
口 ο
[0051]本發明涉及 如上所定義的構象抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
[0052]措辭「單克隆抗體」意思是所述抗體實質上僅結合一個表位，或結合所述表位的部分。
[0053]可從來源於永生化抗體分泌細胞例如雜交瘤的單克隆細胞系獲得單克隆抗體。
[0054]單克隆細胞系來源於獨特細胞的培養。
[0055]可根據例如Kohler和Milstein (1975)或者根據Buttin等(1978),通過抗體分泌細胞如B細胞與永生細胞的融合生產雜交瘤。
[0056]根據本發明的另一個方面，如上所定義的單克隆抗體由根據布達佩斯條約的規定於 2003 年 3 月 19 在 CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為 CNCM 1-2983 的雜交瘤分泌。
[0057]所述單克隆抗體特別地結合天然HCV病毒包膜，結合天然HCV E2蛋白，結合天然HCV El蛋白，並且能夠沉澱在其共價或非共價形式下的HCV E1E2複合體，並能夠結合由至少一種或者由所有上述定義序列構成的表位。所述的單克隆抗體此後特別地稱作D32.10。
[0058]根據本發明的另一個方面，如上所定義的單克隆抗體由根據布達佩斯條約的規定於 2003 年 3 月 19 在 CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為 CNCM 1-2982 的雜交瘤分泌。
[0059]所述單克隆抗體特別地結合天然HCV病毒包膜並且結合HCV E2蛋白。所述單克隆抗體此後特別地稱作D4.12.9。
[0060]本發明也涉及根據本發明抗體的片段或衍生物。本發明抗體的片段特別地包括Fab、F(ab』)2或scFv (單鏈Fv)片段，其對於本領域技術人員來說是公知的。本發明抗體的衍生物包括一如果適當的話一人源化抗體。人源化抗體例如可以是嵌合抗體，其中一如果適當的話一用人抗體的相應部分例如Fe片段置換根據本發明抗體的部分。可選擇地，可將根據本發明的抗體的互補決定區(CDR)移植到人抗體，例如根據在美國專利5，824，307中所述。
[0061]根據另一個實施方案，本發明涉及根據布達佩斯條約的規定於2003年3月 19 在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, InstitutPasteur, Paris, France)保藏的登錄號為CNCM 1-2983的雜交瘤。
[0062]根據另一個實施方案，本發明涉及根據布達佩斯條約的規定於2003年3月 19 在 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, InstitutPasteur, Paris, France)保藏的登錄號為CNCM 1-2982的雜交瘤。
[0063]根據另一個實施方案，本發明涉及包含至少一種上述所定義的抗體作為活性物質和藥學上可接受載體的藥物組合物。
[0064]藥學上可接受的載體特別是如在Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版/Mack Publishing C0.中所定義。
[0065]可在上述定義的組合物中包括其它化合物，特別是抗病毒化合物，如其它抗HCV抗體及其片段或衍生物、幹擾素、RNA聚合酶抑制劑、蛋白酶抑制劑或解旋酶抑制劑。
[0066]可以單劑量或多劑量施用上面所提到的藥物組合物。假設是單劑量，該組合物可包括從每公斤體重約0.1mg抗體到每公斤體重約Ig抗體，特別地從約lmg/kg到約IOOmg/kg。假設是多劑量，可以每天每公斤體重約0.1mg抗體到每天每公斤體重約Ig抗體的劑量，特別是從約lmg/kg/天到約100mg/kg/天,施用該組合物。
[0067]根據另一個實 施方案，本發明涉及至少一種如上所定義的抗體用於製備診斷、預防或治療HCV感染的藥物的用途。
[0068]可使用根據本發明的抗體用於檢測傾向於含有HCV的生物樣品中的HCV病毒顆粒。可從感染HCV或者處於受HCV感染危險的患者中獲得這些樣品,特別地包括血液、血眾或血清樣品。本領域技術人員公知的用抗體檢測病毒的任何方法，如ELISA或EIA，可以以本發明的抗體應用。
[0069]可使用根據本發明的抗體用於製備向感染或未感染HCV的患者施用以中和HCV感染的藥物。可通過預防HCV接觸靶細胞進行HCV感染中和，例如通過使抗體結合包膜分子，如El或E2，其結合靶細胞膜受體，從而阻止HCV —靶細胞結合。
[0070]可向感染HCV的患者施用該抗體以防止HCV病毒顆粒感染細胞，特別是肝細胞，或者促進免疫系統細胞捕獲包被所述抗體的HCV。
[0071]可特別地在移植手術之前、期間或者之後，向接受移植器官特別是肝臟的患者施用該抗體，以中和可能在移植的器官中含有的HCV病毒顆粒。
[0072]本發明也涉及能結合至少一種上述所定義抗體的有包膜的病毒顆粒。
[0073]措辭「有包膜的病毒顆粒」特別地代表HCV病毒體，或者HCV病毒體的一部分，其含有包膜，所述包膜包含脂質和/或蛋白，特別是糖蛋白，在小葉中結合(associated inleaflets)。
[0074]本發明也涉及結合有包膜病毒顆粒的抗體，所述病毒顆粒能結合至少一種上述所定義抗體。
[0075]根據另一個實施方案，本發明涉及來源於人血液、血漿或血清最初樣品的HCV病毒顆粒的組合物，其中HCV RNA拷貝的濃度比其來源的人血液、血漿或血清最初樣品中的HCV RNA拷貝的濃度高約100到1000倍，特別是高於約IO7個拷貝/ml。[0076]高濃度的根據本發明的組合物允許用所述的組合物有效免疫動物。
[0077]HCV RNA 特別是 HCV 基因組 RNA。
[0078]可通過RT — PCR,特別是定量RT — PCR測量樣品的HCV RNA含量，例如用AmpIicor? HCV Monitor?, Roche Diagnostics (Young 等，1993)。
[0079]可選擇地，也可使用NASBA (基於核酸序列的擴增)技術(Damen等，1999)測量樣品的HCV RNA含量。
[0080]可以以所述樣品中HCV RNA分子的拷貝數目表示樣品的HCV RNA含量，一個拷貝等於一個國際單位(UI)。
[0081 ] 樣品的HCV RNA含量指示所述樣品中所含有的HCV病毒體的量。
[0082]含有高於約IO7個拷貝/ml的HCV RNA的組合物允許用所述組合物有效地免疫動物。
[0083]本發明更具體地涉及如上所定義的組合物，其中HCV RNA拷貝的數目是從每毫克蛋白約IO8到約IO9UI。
[0084]通過本領域技術人員公知的方法評價組合物的蛋白含量，特別是通過Lowry測定(Lowry 等，1951)如 Biorad 蛋白測定(Biorad Laboratories) ?
[0085]這種測量代表組合物的特異活性，其指示組合物的純度；每毫克蛋白中HCV RNA拷貝數目越高，含有HCV的 組合物的純度就越高。
[0086]本發明進一步涉及如上所定義的組合物，其中所述組合物的體積是從約0.1ml到約 IOml0
[0087]約0.1ml到約IOml的組合物體積相當於含有至少IO6HCV RNA拷貝的上述所定義
的組合物。
[0088]這種組合物對於動物的免疫有用。例如，如在實施例中所描述的，對小鼠的有效免疫需要施用含有高於約IO6HCV RNA拷貝的HCV病毒顆粒組合物。
[0089]根據另一個實施方案，本發明涉及分離的實質上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的HCV有包膜的亞病毒顆粒。
[0090]術語「分離的」意思是顆粒已經從其天然環境中提取出來，特別地其已經與其它HCV病毒顆粒或其含有HCV RNA和/或HCV核心蛋白的部分分離。
[0091]措辭「實質上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白」意思是含有上述所定義的亞病毒顆粒的溶液含有如用 Amplicor? HCV Monitor?, Roche Diagnostics (Young 等，1993)測量的低於 104UI/ml 的 HCV RNA,以及如用 Ortho-Clinical Diagnostics 試驗(Aoyagi 等，1999)測量的低於lpg/ml的核心蛋白。
[0092]例如可用由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的抗體，此後稱作D32.10，或者由在CNCM保藏的登錄號為1-2982的雜交瘤所分泌的抗體，此後稱作D4.12.9，通過EIA或ELISA試驗評估包膜的存在。
[0093]措辭「HCV有包膜的亞病毒顆粒」意思是該顆粒實質上上僅含有HCV病毒體的包膜部分，也就是說脂質和蛋白，特別是糖蛋白，在小葉中結合。迄今分離的HCV病毒顆粒含有HCV RNA和/或HCV核心蛋白。
[0094]本發明更具體地涉及如上所定義的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒，其中所述亞病毒顆粒易於結合任何上述所定義的抗體。[0095]可通過本領域技術人員公知的幾種方法,例如免疫沉澱、ELISA、EIA或Western印跡，評價上述所定義的亞病毒顆粒與本發明抗體的結合。
[0096]根據另一個實施方案，本發明涉及包含純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，所述純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒含有HCV RNA、HCV核心蛋白以及HCV包膜，並易於結合上述所定義的任何一種抗體。
[0097]本發明更特別地涉及包含純化的天然HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。
[0098]措辭「HCV有包膜的完整病毒顆粒」意思是HCV病毒體含有HCV基因組RNA、HCV核心蛋白以及HCV包膜。在現有技術中一直沒有關於含有這三種成分的HCV病毒顆粒的報導。 [0099]可通過使用如上所定義的方法評估是否存在HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV包膜。
[0100]術語「純化的」意思是上述所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒已經與其它化合物，如HCV有包膜的亞病毒顆粒分離。特別地，例如可通過電子顯微鏡術評價組合物含有比HCV有包膜的完整病毒顆粒少90%的HCV有包膜的亞病毒顆粒。
[0101]可通過本領域技術人員公知的幾種方法，例如免疫沉澱、ELISA、EIA或Western印跡評價上述所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒與根據本發明的抗體的結合。
[0102]根據另一個實施方案，本發明涉及製備HCV病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟:
[0103]對從HCV感染患者的澄清的血眾取出法(clarified plasmapheresis)得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0104]在水溶液中重懸富集HCV的沉澱以獲得HCV病毒顆粒的組合物。
[0105]可以以例如約190，OOOg到約220，OOOg,優選地210，OOOg的速度，進行超速離心約3小時到約5小時，優選地4小時。
[0106]優選的離心條件導致病毒顆粒沉澱，如HCV病毒顆粒，而不沉澱在澄清的血漿中含有的其它化合物。
[0107]術語「血漿取出法」意思是將患者的血液進行過濾以獲得血漿，而將血液的剩餘部分重新注射回患者。
[0108]術語「澄清 的」意思是將從血漿取出法獲得的血漿以低速特別地以3000g離心30分鐘。
[0109]超速離心前血漿取出法的最初的體積有利地是大約I升。
[0110]根據另一個實施方案，本發明涉及HCV病毒顆粒的組合物，如根據上面所提到的製備HCV病毒顆粒的組合物的方法所獲得的。
[0111]根據另一個實施方案，本發明涉及製備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟:
[0112]-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0113]-在水溶液中重懸富集HCV的沉澱；
[0114]-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉澱，以將重懸的富集HCV的沉澱的組成成份(element)根據它們的密度分成級分(fraction)；
[0115]-回收實質上不含HCVRNA、實質上不含HCV核心蛋白以及含有能結合以上定義為D32.10或D4.12.9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。
[0116]在蔗糖密度梯度中重懸的富集HCV的沉澱的超速離心可以從約190，OOOg到約220，000g，優選地210，000g，進行約40小時到約50小時，優選地48小時，蔗糖梯度可有利地是從約10%到約60% w/w、從約20到約50%w/w、從約25%到約45%w/w，或者從約30%到約 45%w/w。
[0117]檢驗所獲得的所有級分是否存在HCV RNA、HCV核心蛋白和/或能結合D32.10或D4.12.9的顆粒。
[0118]當通過Amplicor? HCV Monitor?, Roche Diagnostics (Young 等，1993)測量的HCV RNA的含量少於約104UI/ml時，稱該級分實質上不含有HCV RNA。
[0119]當通過Ortho-Clinical Diagnostics 試驗(Aoyagi 等，1999)測量的 HCV 核心蛋白的含量少於約lpg/ml時，稱該級分實質上不含有HCV核心蛋白。
[0120]使用的單克隆抗體特別地是由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體D32.10。
[0121]如果顆粒能在以下EIA試驗中被檢驗為陽性，則稱該顆粒能夠結合上面所提到的單克隆抗體:
[0122]用從KT1到10_4稀釋的不同級分包被96孔聚苯乙烯平板(Falcon;BectonDickinson France S.A, Le Pont de Claix)。在 4°C過夜孵育平板,然後用含有 5%(w/v)牛血清蛋白(BSA)的 Tris- NaCl (TN)緩衝液(20mM Tris-HCl, ρΗ7.5 和 IOOmM NaCl)飽和。將在TN/BSA緩衝液和50%正常人血清(NHS)的混合液中以5μ g/ml的濃度稀釋的mAb D32.10加到每個孔中，並在37°C孵育2小時。用偶聯辣根過氧化物酶(HRPO)的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab』)2片段(1/5，000稀釋；Immunotech)以及用鄰苯二胺(OPD)和過氧化氫(H2O2)作為底物，檢測結合的抗體。用ELISA讀板器(MRX，Dynex)在450nm或在490nm測定光密度(OD)0當超過截止值(相當於陰性對照的均值乘以2.1)時，則認為結果是陽性的。
[0123]回收的級分特別地具有大約1.13到1.15g/ml的蔗糖密度。
[0124]可選擇地，首先檢驗該級分中是否存在能結合D32.10和/或D4.12.9的顆粒，如果實質上不存在這種顆粒，則不進行其它的檢驗，如果存在這種顆粒，則然後進行HCV RNA檢驗和/或HCV核心蛋白檢驗。
[0125]根據另一個實施方案，本發明涉及HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，如根據上述製備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法所獲得的。
[0126]根據另一個實施方案，本發明涉及製備純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟:
[0127]對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0128]在水溶液中重懸富集HCV的沉澱；
[0129]在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉澱，以將重懸的富集HCV的沉澱的組成成份根據它們的密度分成級分；
[0130]回收含有每毫升從約5.1O5到約IO6UI的HCV RNA、每毫升從約50到約IOOpg的HCV核心蛋白，以及含有能結合以上定義為D32.10或D4.12.9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。[0131]在蔗糖密度梯度中重懸的富集HCV的沉澱的超速離心可以從約190，OOOg到約220，000g，優選地210，000g，進行約40小時到約50小時，優選地48小時，蔗糖梯度可有利地是從約10%到約60% w/w、從約20到約50%w/w、從約25%到約45%w/w或者從約30%到約 45%w/w。
[0132]如上所示測量HCV RNA含量、HCV核心蛋白含量以及顆粒的結合能力。
[0133]所使用的單克隆抗體特別地是由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體D32.10。
[0134]通過這種方法獲得的組合物特別地含有純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒並且特別地實質上缺乏HCV有包膜的亞病毒顆粒。特別地，例如其可通過電子顯微鏡術評價組合物含有比HCV有包膜的完整病毒顆粒少90%的HCV有包膜的亞病毒顆粒。
[0135]所回收的級分特別地具有大約1.17到1.21g/ml的蔗糖密度，更特別地具有大約1.17 到 1.20g/ml、大約 1.19 到 1.21g/ml、大約 1.17 到 1.19g/ml 或者大約 1.19 到 1.20g/ml的蔗糖密度。
[0136]可選擇地，首先檢驗級分中是否存在HCV RNA,如果存在高於IO5拷貝/ml的HCVRNA,則然後進行HCV核心蛋白的檢驗,如果存在高於50pg/ml的核心蛋白，則然後檢驗是否存在能結合D32.10和/或結合D4.12.9的顆粒；如果存在少於IO5拷貝/ml的HCV RNA,則不進行其它檢驗。
[0137]根據另一個實施方案，本發明涉及純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，如根據上述相應的方法所獲得的。
[0138]本發明也涉及製備由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體的方法，包括下列步驟:
[0139]-用本發明的HCV病毒顆粒的組合物，或者如根據本發明所製備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，並回收所產生的抗體；
[0140]-在所產生的抗體中，根據它們結合在上面所提到的HCV病毒顆粒的組合物中含有的HCV病毒顆粒的能力選擇單克隆抗體。
[0141]可如下獲得HCV病毒顆粒的組合物:[0142]-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0143]-在水溶液中重懸富集HCV的沉澱以獲得HCV病毒顆粒的組合物。
[0144]可用如上述所定義的間接EIA檢驗對所產生的抗體進行選擇，用本發明的HCV病毒顆粒的組合物包被平板。
[0145]根據另一個實施方案，本發明涉及製備由在CNCM保藏的登錄號為1-2982的雜交瘤所分泌的單克隆抗體的方法，包括下列步驟:
[0146]-用本發明的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，或者如根據本發明製備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，以及回收所產生的抗體；
[0147]-在所產生的抗體中，根據它們結合在上面所提到的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物中含有的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體。
[0148]可如下獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物:
[0149]-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0150]-在水溶液中重懸富集HCV的沉澱；
[0151]-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉澱，以將重懸的富集HCV的沉澱的組成成份根據它們的密度分成級分；
[0152]-回收含有每毫升從約5.1O5到約IO6UI的HCV RNA、每毫升從約50到約IOOpg的HCV核心蛋白，以及含有能結合以上定義為D32.10或D4.12.9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。
[0153]可如上所述進行選擇步驟。
[0154]根據另一個實施方案，本發明涉及製備針對HCV特別是HCV有包膜的亞病毒顆粒的單克隆抗體的方法，包括下列步驟:
[0155]-用本發明的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，或者根據本發明所製備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，並回收所產生的抗體；
[0156]-在所產生的抗體中，根據它們結合在上面所提到的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物中含有的HCV有包膜的亞病毒顆粒的能力選擇單克隆抗體。
[0157]可如下獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物:
[0158]-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0159]-在水溶液中重懸富集HCV的沉澱；
[0160]-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉澱，以將重懸的富集HCV的沉澱的組成成份根據它們的密度分成級分；
[0161]-回收實質上不含HCVRNA、實質上不含HCV核心蛋白，以及含有能結合以上定義為D32.10或D4.12.9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。
[0162]可如上所述進行選擇步驟。
[0163]本發明更特別地涉及針對本發明的HCV有包膜的亞病毒顆粒的抗體。
[0164]本發明也涉及包含至少一種針對HCV有包膜的亞病毒顆粒的抗體作為活性物質以及藥學上可接受載體的藥物組合物。
[0165]根據另一個實施方案，本發明涉及藥物組合物，其包含作為活性物質的如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒，或者包含如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，以及藥學上可接受的載體。
[0166]可向藥物組合物中添加另外的佐劑，例如在Remington’s PharmaceuticalSciences第16版/Mack Publishing C0.中所定義,佐劑可以是例如不完全弗氏佐劑、招鹽
或氫氧化鋁。
[0167]例如可以以包含從Img到Ig的HCV有包膜的亞病毒顆粒的單劑量施用組合物。
[0168]根據另一個實施方案，本發明涉及如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的用途，或者包含如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的用途，用於誘導抗所述HCV有包膜的亞病毒顆粒或抗如上所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒的免疫反應。
[0169]措辭「誘導免疫反應」意思是可激活分泌抗HCV病毒顆粒的抗體的B細胞或者可激活破壞感染HCV的細胞的T細胞。[0170]根據另一個實施方案，本發明涉及如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的用途，或者包含上述所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的用途，用於製備診斷、預防或治療HCV感染的藥物。
[0171]可使用HCV有包膜的亞病毒顆粒，根據本領域技術人員公知的方法，在免疫測定如EIA、ELISA中，評估是否存在針對HCV的抗體。
[0172]可使用HCV有包膜的亞病毒顆粒用於製備抗C型肝炎的疫苗，特別是治療性疫苗。
[0173]措辭「治療性疫苗」意思是該疫苗能改善感染HCV患者的情況，例如通過誘導產生抗HCV的抗體。
[0174]附圖的簡要說明
[0175]圖1A、圖 1B、圖 1C、圖1D 和圖1E
[0176]圖1A、1B、1C、1D和IE表示抗體沉澱的35S標記細胞的溶胞產物的十二烷基硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS - PAGE)。泳道1、2、3、4、5、6和7分別對應於抗體C9.19.16、C2.22.1、D32.10、D3.20.12X7.24.19X7.14.41 和 Cl.9.3。MW 對應於分子量標準參照物。在凝膠的右邊給出與分子量標準參照物對應的條帶的大小。如果可能，在凝膠的左邊將條帶鑑定為El、E2或Agg (對於聚集的)。
[0177]圖1A表示抗體 沉澱的35S標記的對照細胞的溶胞產物的SDS — PAGE,在還原條件下。
[0178]圖1B表示抗體沉澱的35S標記的表達HCV El蛋白的細胞的溶胞產物的SDS —PAGE，在還原條件下。
[0179]圖1C表示抗體沉澱的35S標記的表達HCV E2蛋白的細胞的溶胞產物的SDS —PAGE，在還原條件下。
[0180]圖1D表示抗體沉澱的35S標記的表達HCV E1E2蛋白的細胞的溶胞產物的SDS —PAGE，在還原條件下。
[0181]圖1E表示抗體沉澱的35S標記的表達HCV E1E2蛋白的細胞的溶胞產物的SDS —PAGE，在非還原條件下。
[0182]圖2
[0183]圖2表示HCV病毒顆粒的Western印跡，使用D32.10單克隆抗體，在非還原和還原條件下。從左到右，M代表分子量標準參照物，在非還原條件下，在凝膠的左邊指示其條帶的大小(以kDa表示)，泳道I代表使用D32.10單克隆抗體在非還原條件下HCV病毒顆粒的Western印跡，第二個泳道M代表在還原條件下的分子量標準參照物，泳道2代表使用D32.10單克隆抗體在還原條件下2，5 μ g HCV病毒顆粒的Western印跡，泳道3代表使用D32.10單克隆抗體在還原條件下5μ g HCV病毒顆粒的Western印跡。在凝膠的右邊,指示泳道3的幾個條帶的大小(以kDa表示)，一些對應於HCV蛋白E2 (60和68)或者對應於HCV 蛋白 El (34 和 31)。
[0184]圖3A 和圖 3B
[0185]圖3A和圖3B表示經受糖苷酶A (圖3A)和內切糖苷酶H (圖3B)去糖基化的HCV病毒顆粒的Western印跡。
[0186]在圖3A中，泳道M代表分子量標準參照物，在凝膠的左邊指示其條帶中3個的大小(以kDa表示)；泳道1、2、3和4分別代表糖苷酶濃度為20、10、5和OmU/ml。在凝膠的右邊，指示HCV蛋白E2和El的位置，以及蛋白El的主要去糖基化形式(El*)的位置和對應於El或E2的去糖基化形式的幾個條帶的大小(以kDa表示)，以及E2的主要去糖基化形式(41*)。
[0187] 在圖3B中，泳道M代表分子量標準參照物，在凝膠的左邊指示其條帶中4個的大小(以kDa表示)；泳道I和2分別代表無內切糖苷酶H進行的對照去糖基化實驗和存在內切糖苷酶H時進行的去糖基化實驗。在凝膠的右邊代表對應於E2和El的完全糖基化形式以及對應於E2 (50、48、46和42kDa)和El (28和24kDA)的去糖基化形式的主要條帶。通過星號標記E2 (50*)和El (28*)的佔優勢的去糖基化形式。
[0188]圖4
[0189]圖4表示通過對HCV病毒顆粒製劑的蔗糖密度梯度離心所得到級分的表徵。已經測量了 3個參數，HCV RNA含量、HCV核心蛋白含量以及對D32.10單克隆抗體的反應性。水平軸代表接受表徵的級分的編號。左邊的垂直軸代表HCV RNA濃度(xl05UI/ml)和通過間接EIA測量(在450nm的OD)的對D32.10反應性的測量值。右邊的垂直軸代表HCV核心蛋白濃度(以pg/ml表示)。與黑點對應的曲線代表級分對D32.10的反應性，與白色三角形對應的曲線代表級分核心蛋白含量，虛線代表級分HCV RNA含量。
[0190]圖5A、圖 5B 和圖 5C
[0191]圖5A、圖5B和圖5C分別代表HCV病毒顆粒製劑、HCV有包膜的完整病毒顆粒製劑以及HCV有包膜的亞病毒顆粒製劑的透射電子顯微鏡照片。
[0192]在圖5A中，水平條代表200nm長的刻度。較大的圓形成分代表HCV有包膜的完整病毒顆粒，較小的圓形成分代表HCV有包膜的亞病毒顆粒。
[0193]在圖5B中，水平條代表50nm長的刻度。圓形成分代表HCV有包膜的完整病毒顆粒。
[0194]在圖5C中，水平條代表50nm長的刻度。圓形成分代表HCV有包膜的亞病毒顆粒。
[0195]圖6
[0196]圖6表示使用D4.12.9單克隆抗體的HCV病毒顆粒的Western印跡。泳道M代表分子量標準參照物，在凝膠的左側和右側指示其4個條帶(75、50、37、25)的大小(以kDa表示)。泳道I和2代表分別用糖苷酶A和用內切糖苷酶H消化HCV病毒顆粒的結果，泳道3和4代表用蛋白酶胰蛋白酶和V8蛋白水解消化HCV病毒顆粒的結果，泳道5代表用NP —40溶解的結果，在泳道6中沒有進行先前的處理。在凝膠的右邊，指示未消化的E2蛋白的兩種主要形式(68和48) (WkDa表示)，在凝膠的左邊表示E2的主要去糖基化形式(E2*)。
[0197]圖7
[0198]圖7表示對HCV病毒顆粒製劑的蔗糖密度梯度離心所獲得級分的基於D4.12.9的表徵。除了級分對D4.12.9的反應性，還測量了級分核心蛋白含量。水平軸代表接受表徵的級分的編號。右邊的垂直軸代表通過間接EIA (在450nm的OD)測量的對D4.12.9反應性的測量值。左邊的垂直軸代表HCV核心蛋白濃度(以pg/ml表示)。與黑色正方形對應的曲線代表級分對D4.12.9的反應性，與黑色菱形對應的曲線代表級分核心蛋白含量。
[0199]圖8A、圖 8B 和圖 8C
[0200]圖8A、圖8B和圖8C表示3種生物素化肽，分別包含第290 — 317位胺基酸(圖8A)、第417 — 500位胺基酸(圖8B)以及第605 — 629位胺基酸(圖8C)，對健康個體(11份血清，在水平軸上編號為Tl到Tll)和HCV感染患者(44份血清，在水平軸上編號為Al到A44)的55份血清的免疫反應性。垂直軸代表通過ELISA (在490nm的OD值乘以1000)測定的血清對三種肽的反應性。白色條形代表健康個體的血清的反應性，灰色條形代表感染患者的血清的反應性。水平線代表截止值，在其之上的血清反應被認為是陽性。在圖8A中，截止值是0.691，在圖8B中是0.572，在圖8C中是0.321。
[0201]圖9A 和圖 9B
[0202]通過Ortho Clinical Diagnostics的總HCV核心抗原測定對HCV-Fan沉澱和來自上述I型的從30到45%蔗糖梯度的級分中的HCV核心蛋白進行定量(圖9A)並通過Western印跡進行分析(圖9B)。(圖9A)以1:2稀釋檢驗所有級分。檢驗1:25、1:50和1:100稀釋的HCV-Fan沉澱，發現含有332pg/ml。所有稀釋都用TNE緩衝液進行。截止值是1.4pg/ml。(圖9B)對HCV-Fan沉澱和來自30 — 45%蔗糖梯度的第4、8、12和13級分進行SDS-12.5%PAGE。使用抗核心、7G12A8、2G9A7和19D9D6單克隆抗體的混合物(每種5 μ g/ml)檢測HCV核心蛋白。使用Amersham的ECL Plus系統使印跡顯影。左邊的數字指示以千道爾頓(kDa)表示的標準參照物(M)的分子量,右邊指示HCV核心蛋白。
[0203]圖10
[0204]通過定量RT — PCR Amplicor HCV Monitor test version2.0 (RocheDiagnostics)在所有來自最初10到60%蔗糖梯度的級分中分析HCV RNA。根據生產商的使用說明進行檢驗。通過使用QS國際單位(IU)計算每個PCR的結果，其對每批都是特異的，並且以IU HCV RNA/ml表示。
[0205]圖1lA 和圖1lB
[0206]通過電子顯微鏡術(EM)對血清來源的HCV有包膜的顆粒進行分析。通過使用MAbD32.10 (5 μ g) (a、b、c和d組)或不相關的Mab Ce組)對HCV-Fan沉澱(2 μ g)進行免疫沉澱，通過超速離心沉澱後的免疫複合物吸附到格柵上並用1%乙酸雙氧鈾(pH4.5)染色。使用JE0L100CX電子顯微鏡觀察該製劑。(圖11A)顆粒直徑(用nm表示)有些變化，對156個病毒顆粒(VPs)繪製直方圖。顆粒大小分布顯示在35nm處集中的峰。(圖11B)電子顯微鏡照片。a、b、c和e組中的條帶指示50nm。
[0207]圖12A 和圖 12B
[0208]用D32.10免疫沉澱、在格柵上吸附以及染色後，通過電子顯微鏡術分析來自蔗糖梯度峰I (圖12A)和2 (圖12B)的HCV — Fan顆粒。(圖12A)對41個病毒顆粒繪製直方圖。在峰I中佔主要的種類(85.4%)是直徑約20nm的球形顆粒，所謂的《小顆粒》。(圖12B)對89個病毒顆粒繪製直方圖。峰2中最普遍的形式(77.5%)平均直徑約41nm。峰2似乎在大小上有點更不均勻，並且主要由直徑35和50nm的顆粒組成，所謂的《大顆粒》。條形指7j\ 50nmo
[0209]圖13
[0210]有包膜的HCV顆粒的間接免疫金標記。將用D32-10-免疫複合物(HCV沉澱，20 μ g ；MAb D32.10，5 μ g)包被的顯微鏡格柵與作為二抗的1:50稀釋的偶聯山羊抗小鼠IgG的膠體金顆粒(IOnm)孵育。根據IgG的空間位阻(在EM中約15nm),僅有少數金顆粒可鑑定抗體結合。在病毒顆粒外沒有觀察到金顆粒。在所有圖形中的條形都指示20nm。[0211]圖14A、圖 14B、圖 14C 和圖 14D
[0212]圖14A和14B表示來自基因型Ib的分離物HCV — L的富集HCV的沉澱在蔗糖密度梯度(10%到60%)中等密度離心的結果。
[0213]圖14A表示離心後所獲得級分(水平軸)的密度(左側的垂直軸，g/ml)和E1E2-D32.10反應性(右側的垂直軸，A49(lnm)。
[0214]圖14B表示第6、8、10、12和14級分的Western印跡，使用抗ElE2MAb D32.10。左側的數字指示以千 道爾頓(kDa)表示的標準參照物(M)的分子量，右側指示HCV El和E2蛋白。
[0215]圖14C和14D表示來自基因型la/2a的分離物HCV — Fan的富集HCV的沉澱在蔗糖密度梯度(10%到60%)中等密度離心的結果。圖14C表示離心後所獲得級分(水平軸)的密度(左側的垂直軸，g/ml)和E1E2-D32.10反應(右側垂直軸，A49(lnm)。
[0216]圖14D 表示第 6、8、10、12 和 14 級分的 Western 印跡，使用抗 ElE2MAb D32.10。
[0217]對於EIA，將每個級分稀釋1/10000 (圖4A和4C)，對於Western印跡每個泳道使用5μ I所選級分(圖4B和4D)。通過折光測定法測定級分的密度並以g/ml表示。在490nm測定吸光度(A)。當超過截止值(對應於陰性對照(至少3個值)的均值乘以2.1)時，則認為EIA的結果是陽性的。使用Amersham的ECL Plus系統顯示印跡。
[0218]圖15A、圖 15B 和圖 15C
[0219]HCV - Fan 沉澱在 I 型 30 到 45%蔗糖梯度(2ml30%、3ml35%、3ml40%、2ml45%)中的等密度離心(圖15A)。將來自蔗糖梯度(30 — 45%)峰I (級分8)和2 (級分12和13)的顆粒個別單獨地進行第二次平衡離心(分別是圖15B和15C)。將峰I在2型30到45%蔗糖梯度(3ml30%、3ml35%、2ml40%、2ml45%)中進行離心(圖15B)。將峰2在3型30到45%蔗糖梯度(2ml30%、2ml35%、3ml40%、3ml45%)中進行離心(圖15C)。通過折光測定法測定級分的密度，以g/ml表示。如前面所述通過間接EIA分析E1E2-D32.10反應性。
[0220]實施例1
[0221]獲得針對天然HCV病毒包膜的單克隆抗體
[0222]HCV病毒顆粒製備
[0223]為了獲得良好供應的病毒材料，通過血漿取出法進行HCV病毒顆粒的純化。所選擇的患者在由於丙型病毒性肝硬化而進行部分肝移植後，發展成慢性活動性C型肝炎，12個月後與高丙球蛋白血症相關的多發性骨髓瘤是血漿置換的原因。患者表現出血清轉氨酶(ALT/AST)水平異常升高，並且抗HCV抗體陽性。患者對所有HBV和HIV標記均陰性。最初材料的HCV RNA含量是6xl05拷貝/ml (Amplicor?HCV Monitor?, Roche Diagnostics, Meylan, France),基因型是 lb(INN0_LIPA 試驗,Innogenetics, Gent, Belgium)。
[0224]使用澄清的血漿取出法通過在4°C，210，OOOg連續兩次超速離心4小時製備富集HCV 的沉澱。在 Iml Tris-NaCl-EDTA(TNE)緩衝液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.5，IOOmmoI/LNaCl, I mmol/L EDTA) (240倍濃度)中重懸最終的沉澱，並貯藏在_80°C。這種材料的HCVRNA含量是3xl07拷貝/ml (Monitor, Roche),蛋白濃度是5mg/ml (即，每毫克蛋白約IO7個HCV RNA 拷貝)。
[0225]雜交瘤製備[0226]為了產生單克隆抗體(mAb)，用處於完全弗氏佐劑中的100 μ g (IO6個HCV RNA拷貝)HCV-沉澱的材料接種BALB/c小鼠，I周后用處於不完全弗氏佐劑中的100 μ g病毒接種。三隻經免疫的小鼠產生較高的抗HCV的血清抗體效價，通過間接酶免疫測定(EIA)檢測。三周後，用50yg處於磷酸緩衝鹽水(PBS)中的病毒對小鼠進行強化。5天後重複注射，3天後取出脾，通過Buttin等(1978)所描述的操作與X63骨髓瘤細胞融合。使用免疫原作為固相(5 μ g/ml)以及偶聯過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab』)2片段(Amersham, France)作為顯示二抗(Petit等，1987)，通過間接EIA篩選雜交瘤培養物上清液中是否存在HCV特異性抗體。稀釋液含有50%正常人血清(NHS)以消除針對可能與HCV病毒顆粒相關的NHS蛋白的非特異性反應性。然後通過限制性稀釋再克隆對HCV產生最強信號(P/N>10)的雜交體並且進一步測定它們的特異性。選出7個克隆(C9.19.16、C2.22.1、D32.10、D3.20.12、C7.24.19、C7.14.41 和 Cl.9.3)，將 4 個克隆(D32.10、C2.22.1、C9.19.16 和 D3.20.12)通過注射到降植烷致敏的BALB/c小鼠中以產生腹水而進行增殖，然後通過用50%飽和的(NH4)2SO4沉澱，隨後在瓊脂糖凝膠一蛋白G(Pharmacia, France)中通過親和層析進行純化。以本領域技術人員公知的方法通過ELISA測定同種型。所分析的7個克隆產生IgGl同種型抗體。
[0227]單克隆抗體表徵
[0228]使用間接EIA評價上面所提到的單克隆抗體與病毒顆粒的相互作用。用從KT1到10_6稀釋(對應於100 μ g/ml到lng/ml)的HCV製劑(每毫升Img蛋白)包被96孔聚苯乙烯板(Falcon ;Becton Dickinson France S.A, Le Pont de Claix)。平板在 4°C過夜孵育，然後用含有 5%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的 Tris-NaCl (TN)緩衝液(20mM Tris-HCl, ρΗ7.5和IOOmM NaCl)飽和。將在TN/BSA緩衝液和50%正常人血清(NHS)的混合物中以5 μ g/ml濃度稀釋的mAb D32.10添加到每個孔中，並且在37°C孵育2小時。用偶聯辣根過氧化物酶(HRPO)的抗小鼠免 疫球蛋白的F(ab』)2片段(1/5，000稀釋；Immunotech)以及用鄰苯二胺(OPD)和過氧化氫(H2O2)作為底物，檢測結合的抗體。用ELISA讀板器(MRX，Dynex)在450nm測定光密度(0D)。當超過截止值(對應於陰性對照的均值乘以2.1)時，則認為結果是陽性的。所獲得的7種抗體的確識別病毒顆粒。
[0229]為了建立mAb的天然多肽特異性,使用免疫原作為抗原探針進行免疫印跡(Petit等，1987)。在還原條件下(2%SDS+5%2-ME)，在12.5%凝膠上進行十二烷基硫酸鈉(SDS) —聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉移到PVDF膜上後，對在50% NHS中稀釋的mAb (2到5 μ g/ml)作為一抗進行檢驗，通過與作為二抗的偶聯過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab』)2片段(1/10，000稀釋，IMMUN0TECH)孵育，檢測結合的IgG。通過Amersham的增強化學發光(ECL+)系統顯現條帶。
[0230]除了 D32.10外，所有被檢驗的mAb在還原條件下與HCV多肽呈陰性反應。值得注意的是除了 Cl.9.3和C7.24.19在EIA中與人IgG微弱地反應(大約是陰性值的5倍)外，所選的mAb既不與人血清白蛋白也不與免疫球蛋白(Ig)的Y或μ鏈反應。
[0231]還通過免疫沉澱檢查7種抗體的多肽特異性。根據以前所描述的方法(Dubuisson等，1996)用35S-Translabel (ICN)代謝性標記由表達HCV蛋白(El、Ε2或Ε1Ε2)的痘苗病毒重組體感染的 ifepG2 細胞。用在 IOmM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl,和 2mM EDTA 中的0.5%NP-40溶解細胞。沉澱用Laemmli樣品緩衝液處理並在還原或非還原條件下通過SDS-PAGE進行分析(D。所檢驗的單克隆抗體不顯示針對細胞成分的非特異性反應性，除了 C9.19.16(>200kDa)、D3.20.12 (在70,50和46kDa的3個強條帶)以及更微弱地，C2.22.l(70、50、46kDa)和D32.10 (多個非常弱的條帶)(圖1A,對照載體)。當兩個HCV糖蛋白分別表達時，所有抗體都特異性免疫沉澱El (_)和E2 (_)，以及當這些蛋白共表達時沉澱E1E2異二聚體(亂1￡)，。有趣地是，在非還原和還原條件下進行SDS-PAGE後的模式不同(圖1D、1E)。所有抗體都識別二硫鍵連接的E1E2聚集體，其在非還原條件下在凝膠的上部檢測到(_)。發現一種mAb，D32.10，主要與聚集體反應並且也與E1E2非共價連接的成熟複合體反應(圖1E,非還原條件)。通過Western印跡分析,所有mAb都不識別在異種系統中表達的變性的重組El或E2蛋白，提示它們識別HCV病毒顆粒上的構象表位。歸納起來，這些結果表明這些mAb特異性識別在天然血清來源的HCV病毒顆粒表面表達的二硫鍵連接的E1E2複合體。這非常有可能是由於它們與El和E2蛋白之間共享的構象表位反應。選擇與在其共價或非共價形式下的E1E2複合體相互作用的單克隆抗體D32.10用於進一步研究。
[0232]單克隆抗體D32.10抗原作圖
[0233]為了檢驗D32.10的HCV型特異性，根據已經描述的方法，用從10—1到10_6稀釋(對應於100 μ g/ml到lng/ml)的4種不同HCV製劑(每毫升I毫克蛋白)進行間接EIA。除了免疫原HCV製劑外，使用從同一患者中獲得的製劑，以及從患有慢性C型肝炎的2名不同患者中獲得的兩種其它製劑，其中一名患者已經發現在血清中攜帶不同的基因型，即HCVla和HCV2a。發現D32.10能識別所有四種HCV製劑，因此表明其能識別不限於免疫原Ib基因型的抗原決定簇。
[0234]為了評價D32.10的天然多肽特異性,進行Western印跡分析。使用未處理的富集HCV的沉澱作為抗原探針，以不同濃度，從0.1到lmg/ml。將抗原在還原或非還原條件下(2%SDS 5%2_巰基 乙醇(2-ME))在12.5%凝膠上進行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS - PAGE)。蛋白轉移到PVDF膜上後，使用在50% NHS中稀釋的mAb D32.10(2到
5μ g/ml)作為一抗進行免疫印跡。然後通過與作為二抗的偶聯過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab』)2片段(1/10，000稀釋；DAK0)孵育，檢測結合的小鼠IgG0通過Amersham的增強化學發光(ECL+)系統顯示蛋白條帶。根據以前Sato等(1993)所描述的方法對循環的HCV病毒體進行糖苷酶消化。用在IOOmM檸檬酸/磷酸緩衝液(pH6.0)中的5、10或20mU/ml的糖苷酶A (肽-N-糖苷酶A或PNGase A ；R0CHE)在37°C對富集HCV的沉澱(HCV-L，4μ g)處理18小時。也通過在37°C在含有內切糖苷酶H (Roche的endo H，5mU/μ I)、20mM二硫蘇糖醇(DTT)和0.l%Triton XlOO的50mM醋酸鈉緩衝液(pH5.5)中過夜孵育，對純化的HCV病毒顆粒進行去糖基化。除了省略酶外，使用與PGNase A消化或endo H消化相同的條件進行對照消化。然後用含有還原劑的電泳樣品緩衝液處理樣品並通過SDS-PAGE進行分析。
[0235]在圖2中顯示Western印跡實驗的結果。當在還原條件下(2%SDS/5%2_ME)分析相同樣品的兩個濃度(2.5和5 μ g，分別是泳道2和3)時，mAb D32.10識別68kDa的主要條帶和31kDa的另一條帶，分別對應於E2和El。然而，在非還原條件下，mAb32.10識別在凝膠的上部回收的二硫鍵連接的複合體(>200kDa)。這些高分子量條帶(⑩，泳道I)非常有可能對應於異二聚的E1E2複合體。[0236]已經顯示天冬醯胺連接的複合體類型糖鏈存在於HCV天然病毒體的表面(Sato等，1993)，因此檢查用不同濃度(20、10和5mU/ml)的糖苷酶(PNGase A)處理HCV製劑後D32.1OmAb識別HCV特異性蛋白的能力。如在圖3A (分別是泳道1、2和3)中所示，D32.10與El的去糖基化形式，特別是25kDa反應，其在最高酶濃度累積。去糖基化後可通過D32.10清楚地檢測到El相關產物，而處理後不能清楚地鑑定E2相關產物。內切糖苷酶H(endo H)消化允許研究在天然HCV病毒顆粒上表達的E1E2複合體對endo H切割的敏感性。如在釐迎中所示，對於E2 (從68到42kDa)和El (從34到24kDa)蛋白都觀察到分子量遷移，提示El和E2在血清來源的天然HCV病毒顆粒上具有複雜的糖基化，這可以解釋部分endo H抗性，如endo H抗性複合聚糖和敏感形式的混合物。
[0237]D32.10表位作圖
[0238]a.肽文庫的篩選
[0239]為了進一步表徵mAb D32.10識別的表位，使用該抗體篩選十二肽噬菌體展示文庫
[0240]Ph.D.-12?卩遼菌體展示肽文庫試劑盒購自New England BioLabs Inc.。這是一種與M13噬菌體的小外殼蛋白(pill)融合的組合肽12聚體。在pill的N末端表達所展示的肽12聚體。該文庫由約1.9xl09個電穿孔的序列構成，擴增一次在10 μ I所提供的噬菌體中產生約20個拷貝 的每個序列。根據生產商的使用說明，並作一些改動,進行3次生物淘選(biopanning)。簡而言之,將10 μ g生物素化的mAb D32.10偶聯到用40 μ g鏈黴抗生物素包被的35mm聚苯乙烯Petri平皿(Falcon)上。將平皿在4°C過夜孵育並用含有0.5%吐溫-20 的 50mM Tris, 150mM NaCl, ρΗ7.5 (TBS) (TBS-T)衝洗 6 次。在第一輪選擇中，允許來自最初文庫的4xl01(l個噬菌體與平皿結合的IgG在搖動的條件下在4°C反應4小時。通過用TBS - T重複衝洗除去未結合的噬菌體。然後用400 μ I洗脫緩衝液(0.1N HCl,用甘氨酸將PH調整到2.2，lmg/ml BSA)從平皿洗脫結合的噬菌體。用75μ IlM Tris-HClρΗ9.1中和後，然後根據使用手冊中的建議，通過感染20mll:100稀釋的大腸桿菌(E.coli)ER2537 (recA+菌株細胞)的過夜培養物，擴增洗脫的噬菌體。將培養物在37°C劇烈振蕩培養4.5小時。獲得上清液，並根據以前所描述的方法(Scott等，1990)用聚乙二醇(PEG)沉澱。在第二輪和第三輪選擇中，在添加到用10 μ g鏈黴抗生物素包被的35nm聚苯乙烯Petri平皿前，將來自前一輪的20%擴增噬菌體分別與終濃度為10和InM的生物素化mAbD32.10在4°C預先孵育過夜。接下來的操作與第一輪相同。然後克隆並擴增來自第三次生物淘選洗脫液的噬菌體，用於DNA測序和免疫分析。
[0241]對於DNA測序,根據Sambrook等(1982)所描述的方法從純化的曬菌體製備單鏈DNA。根據修改的Sanger (Sanger等，1977)法,使用BigDye?終止子循環測序Ready反應試劑盒(Perkin-Elmer),用 Applied biosystems DNA 測序儀(377A 型)測定基因 III 插入片段的核苷酸序列。用對應於PlII基因序列的引物5』 H0-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-OH3』 (SEQ ID NO:4)進行循環測序。從核苷酸序列推定插入片段的胺基酸序列。
[0242]對於上清液噬菌體的ELISA，用100 μ I溶於0.1M NaHCO3緩衝液(ρΗ8.6)，終濃度為100 μ g/ml的mAb D32.10或不相關的mAb包被成排ELISA平板孔。將平板在4°C過夜孵育，然後用含有5mg/ml BSA的0.1M NaHCO3緩衝液(pH8.6)封閉。在4°C孵育2小時後，用含有0.5%吐溫的TBS衝洗平板6次。向微量滴定平板的每個孔中添加每種噬菌體克隆的4倍系列稀釋液，終體積為100 μ I TBS-T,以每排第一個孔IO12個病毒體開始，以第12個孔2xl05個病毒體結束。將平板在室溫下振蕩孵育2小時，然後如上用TBS-T洗6次。在使用1:5，OOO稀釋的偶聯辣根過氧化物酶的抗M13mAb (Pharmacia)的夾心試驗中，檢測結合的噬菌體。使用含有(PD和H2O2的商業化顏色試劑盒(bioMerieux)使平板顯色。孵育10分鐘後，用ELISA讀板器在492nm讀取平板。對於每個噬菌體克隆稀釋液，結果以用所檢驗的抗HCV mAb獲得的值和用無關mAb獲得的值之間的差異表示。然後通過檢驗一式三份免疫反應克隆的最佳稀釋液證實結果。
[0243]對於測序分析，通過使用Mac Vector, Ver.4.5軟體(Kodak)將肽的胺基酸序列與HCV El和E2蛋白序列比較。基本上，用LFASTA程序檢測最高相似性的區域，其試驗性地搜索最佳的局部同一性(Pearson和Lipman, 1988)。
[0244]三輪選擇後，在指示特異性結合噬菌體的擴增的洗脫液中發現4%的噬菌體輸入。因此，隨機分離88個克隆，對它們的DNA進行測序並且推定插入片段的胺基酸序列。獲得了 48個不同序列，在幾個實例中發現了其中的一些序列。然而，當在ELISA試驗中檢驗它們與D32.10的免疫反應性時，其中沒有一個給出陽性信號，表明結合親和力太低以至於無法檢測到。將48個克隆序列與HCV El和E2的序列進行比較。分別有5個和3個序列顯示與位於292-305區和347-356區的El殘基相似(在表1中以粗體指示相似)，而分別有7個、4個和2個序列與E2位於481-501、610-631和685-698區的殘基共有一些相似性(在表2中以粗體指示相似)。
[0245]b.肽合成
[0246]為了評價在El和E2序列上這些不同定位的意義，複製El的291-315和347-356區以及E2的473-498、607-627和686-697區，作為偏移一位的重疊的合成十五肽，並檢驗它們與D32.10的免疫反應性。 [0247]在硝酸纖維素膜上使用9-芴基甲氧羰基胺基酸化學(Frank，1988)同時合成不同的肽序列。
[0248]產生適於免疫學檢測的納摩爾量的每種肽。根據以前所描述的方法(Jolivet-Reynaud, 1998)通過間接比色免疫測定分析抗體對膜結合肽的反應性。對應於具有抗體反應性的肽的點產生陽性藍色信號。通過顯示觀察估計點的強度並且用從O到5等級的相對強度表示。
[0249]用與292-305E1區對應的肽獲得強陽性信號，而347-356E1區沒有被D32.10識別。分別與E2區482-499和612-626對應的肽也與D32.10發生免疫反應，用E2區686-697沒有檢測到信號。在ELISA中El的292-306區以及E2的480-494和608-622區作為十五肽與D32.10相互作用。
[0250]通過使用重疊的十五肽，HCV El蛋白的297RHWTTQGCNC3°6(SEQ ID NO:1)區以及HCV E2 蛋白的 613YrlWHYPCT621 (SEQ ID NO:3)和徹PDQRPYCWHYPPKPC494 (SEQ ID NO:2)兩個區都與D32.10反應。在E2中所鑑定的這兩個區含有由Yagnik等(2000)提出的在E1E2的異二聚體化中涉及的相同基序WHYP。區分這些區域很困難，但是作為兩個非重疊區:479Gpdqrpyc486 (seq id no:26)和 487Whyppkpc494 (seq id no:27)分別結合 D32.10，這提示D32.10特異性識別每種八肽，因此識別整個序列(480-494)。
[0251]實施例2
[0252]血清來源HCV病毒顆粒的表徵和鈍化[0253]為了分離不同的HCV群，將最終的富集HCV的沉澱在蔗糖密度梯度(10到60%，w/w)中進行等密度離心(在4°C，210，OOOg離心48小時)。收集級分(0.6ml )，通過折光測定法測定每種級分的密度。通過定量RT — PCR(Amplicor Monitor, Roche)分析HCV — RNA含量，用Ortho — Clinical Diagnostics試驗測定HCV核心蛋白含量並通過間接EIA測定HCV病毒顆粒對mAb D32.10的抗原反應性。
[0254]除了用從KT1到10_4稀釋的不同級分包被孔，如上所述進行間接EIA。
[0255]鑑定了三個不同群(.1)。一個群(級分3到5)在1.06-1.08g/ml的蔗糖密度形成條帶，並且通過用D32.10的間接EIA所獲得的陰性結果證實實質上缺乏病毒包膜，但是含有HCV RNA (約2.105UI/ml)和HCV核心蛋白(從約2到4pg/ml)。這些似乎是無包膜的病毒顆粒。另一個群(圖中級分8到10)在1.14-1.15g/ml的蔗糖密度形成條帶，並且實質上缺乏HCV RNA (低於約IO4到105n/ml)和HCV核心蛋白(約lpg/ml)，但是含有高水平的對D32.10反應的顆粒(從約I到3.80D450nm單位)。這些HCV亞病毒顆粒似乎僅含有HCV病毒包膜。第三群(級分11到14)在1.20-1.21g/ml的蔗糖密度形成條帶，含有具有高水平HCV RNA (高於約5.1O5到106UI/ml)和HCV核心蛋白(從約2.5到8pg/ml)以及對D32.10反應(從約0.5到1.50D450nm單位)的顆粒。因此，這群實質上僅含有純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒。
[0256]通過D32.10免疫沉澱在富集HCV的沉澱(&D，以及在第二群(亂^￡)和第三群(_)中含有的病毒顆粒，並通過電子顯微鏡觀察。通過這種方法已經分析了幾種HCV病毒顆粒製劑。HCV有包膜的亞病毒顆粒表現為平均直徑約30nm (33.08nm)的球形顆粒(證5￡)，而HCV有包膜的完整病毒顆粒同樣表現為球形，但是平均直徑約50nm (48.72nm)(置5B)0
[0257]實施例2bis
[0258]血清來源的HCV病毒顆粒的表徵和鈍化
[0259]本發明人對感染患者血漿中存在的HCV病毒群還進行了另一項分析。
[0260]血清來源的HCV顆粒的純化
[0261]使用實施例1中所獲得的富集HCV的沉澱(HCV — L)用於物理化學、免疫學和形態學研究，以及來自另一個患者的血漿取出法的沉澱(HCV-Fan，基因型la/2a)，其顯示出患有慢性C型肝炎(CH - C)，具有與嚴重的皮膚脈管炎相關的II型冷球蛋白血症，需要定期血漿置換。如同對於HCV-L患者，後面的HCV-Fan患者顯示血清轉氨酶(ALT/AST)水平異常升高，抗HCV抗體陽性，對所有HBV和HIV標記陰性。
[0262]由此表徵了 7種製劑。它們在定量Amplicor HCV RNA Monitor試驗(Roche)中對於從 106UI/ml 到 2-3xl07UI/ml 的 HCV RNA (HCV-Fan, HCV-L)陽性，對應於 2.5xl06 拷貝 /ml 到 5-7.5xl07 拷貝 /ml。
[0263]為了分離不同HCV群，將最終的富集HCV的沉澱在蔗糖密度梯度(10到60%或者30到45%，w/w)中進行等密度離心(在4°C, 200, OOOg離心48小時)。收集級分(0.6ml)，通過折光測定法測定每種級分的密度。通過定量RT — PCR(Amplicor Monitor, Roche)監測HCV-RNA含量。如上所述，在固相上每種級分以不同稀釋度(1/10到1/10000)包被後，使用MAb D32.10通過間接EIA檢測HCV包膜(env)反應性。通過使用定量Ortho試驗和利用抗核心單克隆抗體混合物(7G12A8、2G9A7和19D9D6)的western印跡，測定HCV核心抗原(Jolivet-Reynaud 等，1998 ；Menez 等，2003)。
[0264]簡要地說，通過使用0rthoR trak-C? 試驗(Ortho-Clinical Diagnostics, Inc)測量在富集HCV的沉澱和在從蔗糖梯度中收集的每種級分中的總HCV核心抗原。Orthc/trak-C?試驗是一種定量免疫捕獲試驗，使用對HCV核心抗原的不同區域具有特異性的幾種單克隆抗體。該方法使用預處理步驟以使得樣品製劑游離、免疫複合，以及使病毒體相關抗原可以測定(Aoyagi 等，1999)。通過由 Roche Molecular System (Meylan, France)開發的定量RT — PCR, Amplicor? HCV Monitor?，評價HCV RNA。擴增步驟涉及單管、單酶(rTthDNA聚合酶)、單引物對組合的反轉錄和DNA聚合作用(Colucci和Gutekunst, 1997)。通過比色微孔平板試驗進行檢測。PCR樣品遺留汙染的控制包括AmpErase?，其已被摻入到試驗中用以滅活汙染的擴增的DNA(Longc)等，1990)。
[0265]首先將富集HCV的沉澱在蔗糖密度梯度(10%到60%)中進行等密度離心。通過上述間接EIA方法(圖14A和14C)和使用抗ElE2MAb D32.10(其特異性先前已在實施例1中詳細定義)的western印跡(圖14B和14D)調查是否存在顯示E1E2-D32.10反應性的有包膜的病毒顆粒。如在釐14A和14C中所示，在EIA (級分稀釋1/10000)中E1E2-D32.10反應性從級分9 (密度為1.12g/ml)到級分16 (密度為1.23g/ml)回收，峰在1.12和1.17g/ml之間，「肩」從1.18到1.23g/ml。在對應低密度複合物(1.006到1.10g/ml)的級分中沒有檢測到或者檢測到非常低的D32.10反應性(級分稀釋1/10)。用基因型Ib的分離物HCV - L (圖14A)和用基因型la/2a的分離物HCV-Fan (圖14C)獲得類似結果。將分離物HCV - L的一些級分(6、8、10、12、14)(圖14B)和分離物HCV-Fan的所有級分(4到18)進行SDS-PAGE並 用MAb D32.10進行western印跡。從級分8 (密度#1.10g/ml)到梯度的底部清楚地顯現E1E2-D32.10反應性。值得注意的是，在與1.17到1.20g/ml的密度對應的級分11、12和13中觀察到最強的E1E2反應件(圖14D)。在這些級分中可檢測到更高分子量(HMW)條帶，可能對應於在這種密度下形成條帶的病毒顆粒表面上存在的El和E2包膜糖蛋白的寡聚形式。在級分9 (密度為1.13g/ml)中觀察到針對E2和El兩者的另一強反應性，對應於EIA中的峰(圖14C)。所有血清來源的HCV製劑在蔗糖密度梯度(10到60%)中給出相同的E1E2-D32.10反應性平衡條帶分布圖。
[0266]為了進一步表徵有包膜的HCV群，將HCV-Fan沉澱在I型30到45%的蔗糖梯度(2ml30%、3ml35%、3ml40%、2ml45%)中進行等密度離心。在這些實驗條件下，如在麗IM中所示，可清楚地見到兩個E1E2-D32.10反應性峰。間接EIA顯示第一個窄峰(峰I)在約1.15g/ml密度處，第二個寬大峰(峰2)在約1.18g/ml到1.22g/ml密度處。將來自蔗糖梯度(30-45%)峰I (級分8)和2 (級分12和13)的顆粒單獨地進行第二次平衡離心。峰I在2型30到45%蔗糖梯度(3ml30%、3ml35%、2ml40%、2ml45%)中離心(圖15B)。僅有一個窄的E1E2抗原峰(峰I)遷移到1.13到1.14g/ml的密度(約32%蔗糖，級分5和6)。峰2在 3 型 30 到 45%蔗糖梯度(2ml30%、2ml35%、3ml40%、3ml45%)中離心(圖 15C)。主峰(峰 2)沉降更快，在約1.18g/ml密度處(對應於40%蔗糖)顯示最大E1E2抗原性。後面的E1E2抗原峰(峰2)顯示不對稱，向較低密度移動，並且與在1.14g/ml蔗糖密度形成條帶的E1E2群(峰I)輕微重疊，提示比前者E1E2抗原峰(峰I)更大的異質性(圖15B、15C)。
[0267]為了闡明在兩群E1E2包被病毒顆粒(峰I和峰2 )之間浮力密度的差異，通過OrthoHCV核心試駘(圖9A)和通過Western印跡(圖15B)檢駘h沐I型30到45%蔗糖梯度級分的HCV核心抗原。
[0268]簡要而言，使用HCV樣品作為抗原探針(I 一 5μ g/ml )，通過免疫印跡測定多肽特異性。在還原條件下(2%SDS+5%2-ME)在12.5%凝膠上進行十二烷基硫酸鈉(SDS) —聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉移到PVDF膜上後，使用在50% NHS中稀釋的抗ElE2MAbD32.10(2 到 5 μ g/ml)或抗-核心 MAb7G12A8、2G9A7 和 19D9D6 (各 5 μ g/ml)作為一抗，然後通過與作為二抗的偶聯HRPO的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab』)2片段(1/10，000稀釋；購自Immunotech)孵育,檢測結合的IgG。印跡用Amersham的增強化學發光(ECL Plus)系統顯色。
[0269]兩種實驗方法均顯示在大約1.17到1.19g/ml密度(40%蔗糖)的第二 E1E2抗原峰(峰2)中回收最大HCV核心抗原反應性。通過在Western印跡(圖9B)的分析,在最初的材料(HCV-Fan沉澱)和級分8到13中鑑定了 25kDa的HCV核心蛋白。也檢測到在50,75和150kDa的條帶，其可能對應於HCV核心基因編碼產物的寡聚體。通過定量RT-PCR Monitor試驗(Roche)，在來自最初10到60%蔗糖梯度的所有級分中分析HCV RNACS 10)。在1.055到1.075g/ml的密度以及在1.16到1.21 g/ml的密度出現兩個病毒RNA峰。後面峰的總效價是106IU/ml，對應於第二 E1E2抗原峰(峰2)。相比之下，級分9 (密度為1.13g/ml )，其對應於峰I，含有最低效價的HCV RNA。因此，峰2 (大約1.17到1.20g/ml)含有E1E2複合體、HCV核心蛋白、高效價HCV RNA並且可能代表完整病毒體。峰I (1.13到1.15g/ml)主要含有E1E2複合體，並且可能代表亞病毒顆粒(SVP)。低密度複合物(1.006到1.10g/ml)僅含有核心和HCV RNA，對應於裸核殼。
[0270]因此，使用本發明的D32.10單克隆抗體，已經分析了在慢性C型肝炎患者的血清中發現的最普遍類型的有包膜的病毒顆粒。通過濃縮的病毒材料在蔗糖梯度中的沉降，通過免疫測定和免疫印 跡分析蛋白組成(核心和包膜蛋白)，結合通過定量RT-PCR監測HCVRNA，分別鑑定了在1.13-1.15g/ml和1.17-1.21 g/ml兩種不同密度沉降的兩群E1E2包被的顆粒。第一群對應於含有El和E2包膜蛋白，但是缺乏核殼的亞病毒顆粒(SVP)。第二群可能對應於HCV病毒體，因為這些顆粒含有El和E2包膜蛋白、核心蛋白和高效價的HCVRNA。
[0271]血清來源HCV顆粒的形態學表徵
[0272]根據下列方法進行E1E2 (D32.10)-特異性單克隆抗體的免疫沉澱後HCV-Fan沉澱的電子顯微鏡術(免疫電子顯微鏡術或IEM)。
[0273]簡要而言，將血清來源的HCV製劑(2、20或200yg)或來自梯度的級分(0.1ml)與0.1ml MAb D32.10(5μ g)或同一同種型(IgGl)的無關單克隆抗體(F35.25，HBV抗-preSl)(Petit等，1989)混合。在37°C孵育I小時，然後在4°C孵育16小時。接著將混合物在IOml TNE緩衝液中稀釋並在48，OOOg離心I小時。將沉澱在0.1ml TNE緩衝液中重懸。將D32.10-免疫沉澱的HCV顆粒吸附5分鐘到glow-discharged Formvar/碳包被的cupron格柵上並用I %乙酸雙氧鈾(pH4.5)染色4分鐘。然後使用JE0L100CX電子顯微鏡(Imaging facility, Laennec Faculty, Lyon, France)觀察該製劑。對於間接免疫金標記，用作為二抗的山羊抗小鼠IgG膠體金顆粒的1:50稀釋液(直徑10nm;BioCell ResearchLaboratories)鮮育格棚。
[0274]對照實驗顯示製劑的大小不均勻隨著抗原:抗體比而變化(結果沒有顯示)。為了保持形態完整，HCV顆粒的分離過程僅涉及沉澱和蔗糖梯度離心。在這種實驗條件下，如在圖1lA中所示，獲得相對較好限定的顆粒大小分布圖。不對稱的峰集中在約35nm。這種大小(30到40nm)的顆粒佔大多數(56%)。基本上絕大多數顆粒(80% )直徑大於30nm，平均值為38.28nm(156個顆粒中的125個)，其中的20%在40到50nm之間(均值=43.61nm)，4%在50和60nm之間(均值=55.69nm)。所有顆粒中僅20%直徑小於30nm (均值=26.35nm)。電子顯微鏡照片(圖11B)顯示HCV顆粒以相對規則的光滑表面為特徵。圖1lB a和b組，例示了 HCV有 包膜的顆粒的大小不均勻性。圖1lB c組顯示直徑50nm的顆粒，d組顯示那些顆粒直徑35nm。在35nm的顆粒表面上出現相當同質的更高密度(圖11B, d組),而在50nm直徑的顆粒中央可清楚地觀察到更低密度的更亮區(圖11B，c組)。當使用無關的第一單克隆抗體時，通過IEM沒有觀察到顆粒(圖11B, e組)。對蔗糖梯度峰I和2的顆粒進行免疫沉澱、染色以及通過IEM講行分析(圖12A - 12B)。如在圖12A中所示，峰I中的絕大多數(85.4%)是直徑約20nm的球形顆粒(41個顆粒中有35個，平均值=20.6nm)。僅14.6%的顆粒直徑大於30nm，可能對應於與峰2的重疊。峰2似乎比峰I材料大小更不均勻(置12B)。然而，在這群中最普遍的形式(77.5%)的平均直徑約41nm (89個顆粒中有69個，均值=41.15nm)，其可能對應於整個HCV病毒體的直徑。在這種製劑中可見到一些較小的30nm直徑的顆粒(13.5%)，可能由於與峰I的重疊所致。異質的主要的較快沉降峰(峰2)主要由35和50nm直徑的大顆粒組成，而同質的次要的較慢沉降峰(峰I)主要由大約20nm直徑的小顆粒組成。總的說來，形態學研究表明兩種大小類別的E1E2包被的HCV顆粒共同存在於感染患者的血清中。通過間接免疫金標記(_)，所有球形有包膜的顆粒，先前通過IEM鑑定，都特異性固定IOnm金標記的二抗。
[0275]因此，通過用MAb D32.10的免疫一電子顯微鏡術，測定總的有包膜的群(富集HCV的沉澱)以及每種E1E2群各自的相對較好限定的顆粒大小分布。有包膜的HCV顆粒大小上不均勻，但是可容易地鑑定兩個不同大小類別的顆粒。多數種類由直徑從35nm到50nm變化的大顆粒構成，可能視包膜的晶格結構而定，對應於完整的含有衣殼的有包膜顆粒。另一種更同質的種類由直徑約20nm的小顆粒構成,對應於無衣殼的SVP。進一步鑑定結合MAbD32.10的所有這些顆粒並使用用抗小鼠IgG-金顆粒的間接標記，通過電子顯微鏡術觀察。
[0276]除了感染性的病毒體外還形成非感染性SVP是黃病毒感染的共同特徵(Russel等，1980)。已提出這些代表無衣殼的空病毒包膜(Mason等，1991)。其也發生在感染B型肝炎病毒(HBV)的細胞中，以及通過單獨表達包膜蛋白生產分泌的SVP (Laub等，1983)。這些顆粒小於病毒體。這證明這些蛋白在存在或缺乏核心時內在地能夠自我形成特異性微粒結構。這些顆粒裝配並經歷與整個病毒體相同的成熟過程，包括糖基化和碳水化合物加工。用這種重組包膜SVP的免疫顯示它們在動物模型中(Konishi等，1992 ；Heinz等，1995)和在人中(Leroux-Roels等，1994)是極好的保護性免疫原。
[0277]完整病毒體和SVP 與 MAb D32.10 的反應性顯示，El (297-306) -E2 (480-494)(613-621)構象表位以基本上相同的方式呈現在HCV病毒體和SVP的表面上。然而，在通過基因重組獲得並在異種系統:棒狀病毒/昆蟲細胞(Baumert等，1999)或反轉錄病毒/293T細胞(Bartosch等，2003)中生產的顆粒上缺乏在血清來源的病毒體和SVP上檢測到的這種表位，提示這種複合位點缺乏和/或存在於這些重組HCV顆粒表面上分開的難接近的區域上。前者HCV樣顆粒(HCV-LP)保留在ER中，後者HCV假顆粒(HCVpp)中僅有一小部分到達細胞表面。值得注意的是MAb D32.10既不與HSA也不與免疫球蛋白的Y或μ鏈反應。其能夠特異性免疫沉澱Ε1、Ε2以及Ε1Ε2異二聚體，當這兩種蛋白分別或者一起由痘苗病毒重組體在H印G2細胞中表達時。其因此主要與二硫鍵連接的聚集體反應，與Ε1Ε2非共價連接的成熟複合物的反應更微弱。然而，通過印跡分析，其不識別在這種異種系統中所表達的變性的重組El或Ε2蛋白。這有利於在血清來源的病毒表面上Ε1、Ε2和Ε1Ε2的排列，其不同於在重組HCV顆粒中發現的排列。天然結構依賴於裝配條件。如果在異種系統中缺乏調控獨特結構形成的條件，那麼當兩者都分離自感染患者的血清時，與SVP和病毒體表面的相似形成對照，VLP和HCVpp中二聚體的排列不相似。在重組亞病毒顆粒(RSP)和病毒體中，黃病毒包括蜱傳腦炎病毒(TBEV)的包膜蛋白(E)包裝的一個特別值得注意的特徵是，它們以頭到尾的取向平躺在病毒表面上(Ferlengi等，2001)。結構域III上的側表面，其具有Ig樣摺疊並參與受體結合，容易接近，而融合肽是一種內環(Rey等，1995)。因此，黃病毒通過受體介導的胞吞作用和在內體中低pH誘導的融合進入細胞(Rice, 1996)。據信正在裝配的顆粒通過經由ER或早期分泌途徑的中間區室的膜出芽而獲得其包膜。顆粒然後通過高爾基體外側網絡(TGN)被運輸到質膜，成熟並因此獲得複合糖。所有這些步驟對於病毒裝配都是關鍵的，並且在複製循環的許多階段中都起著決定性的作用。
[0278]出乎意料地，所有HCV顆粒似乎都顯示相似的生物物理屬性，無論它們來源為何。在昆蟲細胞中裝配的、來自HCV-J株cDNA或來自感染性克隆H77c的HCV-LP的蔗糖梯度沉降模式在蔗糖平衡梯度中是1.14到1.20g/ml (ffellnitz等，2002)。大多數顆粒的直徑是40到60nm。然而，在HCV-LP外表面的El和E2胞外域上存在的所有表位(ffellnitz等，2002)與MAb D32.10的El和E2特異性不同。因此，即使顆粒在蔗糖中以同一密度沉降，它們也具有不同的免疫反應性，其可能與不適當的轉運和/或摺疊有關，並且在細胞結合和感染性方面將明顯地導致不同的功能特性。
[0279]與血清有包膜的HCV顆粒相反，從感染HCV個體的血漿中分離的HCV核心顆粒似乎與在昆蟲細胞中所生產 的核殼樣顆粒相似。HCV核殼在CsCl梯度中1.32到1.34g/ml的密度形成條帶，並且在大小上非常不均勻，直徑從38到62nm (Mai I Iard等，2001)。所有這些顆粒都與抗核心MAb反應,但是不與通過用重組蛋白免疫所產生的抗El和抗E2MAb反應(Deleersnyder 等，1997 ；Dubuisson 等，1994)。
[0280]因此，不同類型的HCV相關顆粒(HCV-LP、血清HCV核殼、血清HCV病毒體)在大小和/或密度上具有一些相似之處，但是顯示不同抗原特性(E1E2複合體、有包膜的病毒體或無包膜核殼的不適當的或適當的摺疊)。因此，總之這證明具有好的免疫學工具對於分析HCV顆粒的真實抗原性質很重要，同樣地對於鑑定天然HCV病毒體也很重要。
[0281]根據這些數據和其它人的那些數據(Andre等,2002 ;Maillard等,2001),能獲得更多關於在慢性C型肝炎患者血清中循環的不同形式HCV相關顆粒的完整譜知識。蔗糖梯度中的低密度級分(1.06g/ml)含有衣殼樣結構，與脂蛋白結合形成脂一病毒一顆粒(LVP)，以及視個別變異而定與HCV RNA和免疫球蛋白結合(Andre等，2002)。LVP表現為直徑大於IOOnm的大顆粒,通過LDL受體結合肝細胞系(Andre等,2002)。從去汙劑處理的血清中分離的無包膜的HCV核殼在CsCl中的浮力密度是1.32到1.34g/ml，大小上不均勻(Maillard等，2001)，最近表明其顯示FyR樣活性(Maillard等，2004)，這可解釋含有HCVRNA的顆粒與「非免疫」抗體結合作為在蔗糖梯度中高密度(1.28到1.35g/ml)的HCV核心-1gG複合物。中間密度的級分，在1.13到1.21 g/ml之間，這裡鑑定為E1E2包被的HCV顆粒。假定的整個HCV病毒體(由核殼、脂膜以及兩個El和E2包膜糖蛋白構成)的平均密度(1.18到1.20g/ml)，與黃病毒的平均密度相似(Bradley等，1991)。從MAb D32.10的精細特異性推出的側麵包膜蛋白相互作用的假設也與來自TBEV的重組SVP和整個病毒顆粒的包膜的組織相似(Schalich等，1996)。最後，在感染HCV患者血清中存在僅含有E1E2包膜蛋白，顯示不同沉降性質(1.13到1.15g/ml)以及不同顆粒大小(~20nm)，但是與整個病毒顆粒具有相似抗原特徵的SVP，這支持HCV和黃病毒之間的一些相似性。
[0282]總之,通過使用新的MAb D32.10，第一次鑑定了:
[0283](i)HCV完整病毒體，含有HCV RNA和核心抗原，在其表面上表達E1E2包膜複合物，作為「大顆粒」，直徑35-50nm並在1.17-1.21 g/ml形成條帶；
[0284](ii)包膜SVP的HCV群，作為「小顆粒」，缺乏衣殼和HCV RNA,直徑20_30nm並在
1.13-1.15g/ml 形成條帶。
[0285]這種有包膜的顆粒可能因此代表研究HCV包膜糖蛋白結構一功能關係的相關模型，並且是接種方 法的極好候選物。另外，在不同組患者中以及在HCV相關疾病的不同階段進一步追蹤循環HCV顆粒的譜將會是有趣的。
[0286]實施例3
[0287]獲得針對純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的單克隆抗體
[0288]將在蔗糖密度梯度中進行等密度離心、含有純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的上面所提到的富集HCV沉澱的級分，用於製備單克隆抗體。將這種級分用於免疫小鼠並根據上述說明分離雜交瘤。由此獲得一種單克隆抗體，(D4.12.9)，其顯示出特異性識別天然HCV E2蛋白，在Western印跡實驗中(歷醜)，和天然HCV病毒顆粒，如在實施例2中證實的(圖7)。事實上，Ml顯示D4.12.9以與D32.10相似的方式識別HCV有包膜的亞病毒顆粒(級分8到11)和HCV有包膜的完整病毒顆粒(級分11到14)。
[0289]實施例4
[0290]來自感染患者的抗HCV抗體的表位表徵
[0291]通過使用包括它們本身的肽，評價El和E2衍生的與D32.10反應的肽序列(實施例I)對感染HCV患者的血清的免疫反應性。
[0292]生產El (第290-317位胺基酸)和E2 (第471-500位和第605-629位胺基酸)序列作為生物素化的合成肽，通過ELISA用11份健康個體的血清和44份感染HCV患者的血清(編為Al到A44)進行檢驗。
[0293]用100 μ I溶於0.1M碳酸鹽緩衝液(ρΗ9.6)，濃度為10 μ g/ml的鏈黴抗生物素在4°C過夜包被微量滴定平板孔，並用含有10%山羊血清的PBS在37°C封閉I小時。然後在加入100 μ I生物素化肽溶液(在PBS中10 μ g/ml)在37°C孵育2小時前，用含有0.05%吐溫-20的PBS洗滌平板三次。用PBS —吐溫新衝洗後，加入100 μ I在含有10%山羊血清的PBS —吐溫中1:50稀釋的檢驗血清，並且在37°C孵育2小時。再次用PBS—吐溫衝洗平板。然後加入在PBS—吐溫一山羊血清中1:5000稀釋的二抗一偶聯過氧化物酶的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)。平板在 37°C鮮育 I 小時，然後用 PBS —吐溫再衝洗一次。使用含有鄰苯二胺和過氧化氫的Biomerieux顏色試劑盒使平板顯色。孵育10分鐘後，用ELISA讀板器在492nm讀取平板。報告值是一式三份的平均0D。[0294]計算每種肽的截止識別(用HCV陰性血清獲得的均值+ 3倍標準偏差)。其允許證明44份HCV陽性血清中有6份產生抗El (第290-317位胺基酸)(圖8A)、44份中有6份產生抗E2 (第471-500位胺基酸)(歷巡)以及44份中有16份產生抗E2 (第605-629位胺基酸)(_￡)的陽性反應。血清A7、A14、A21、A33、A39和A40與這三種肽產生陽性信號，而E2 (605-629)也被10份更多血清識別。
[0295]在感染HCV患者血清中存在能與由D32.1OmAb識別的El和E2的三個區域同時反應的特異性抗體，強烈支持它們在循環的有包膜的HCV病毒顆粒表面的毗鄰以及它們在小鼠和在人中的免疫原性。
[0296]本發明包含下述內容:
[0297]1.能特異性結合天然HCV病毒包膜的構象抗體。
[0298]2.根據項目I的構象抗體，能夠特異性結合天然HCV E2蛋白。
[0299]3.根據項目I或2的構象抗體，能夠中和患者的HCV感染。
[0300]4.根據項目I到3中任何一項的構象抗體，能夠沉澱在其共價或非共價形式下的HCV E1E2複合體。
[0301]5.根據項目I到4中任何一項的構象抗體，能夠特異性結合天然HCV El蛋白。
[0302]6.根據項目I到5中任何一項的構象抗體，能夠特異性結合天然HCV El蛋白、結合天然HCV E2蛋白以 及能夠沉澱在其共價或非共價形式下的HCV E1E2複合體。
[0303]7.根據項目I到6中任何一項的構象抗體，能夠特異性結合由下列序列中的至少一種構成的表位:
[0304]-HCV 蛋白 El 第 297 到 306 位胺基酸(SEQ ID NO:1)；
[0305]-HCV 蛋白 E2 第 480 到 494 位胺基酸(SEQ ID NO: 2)；
[0306]-HCV 蛋白 E2 第 613 到 621 位胺基酸(SEQ ID NO:3) ?
[0307]8.根據項目7的構象抗體，能夠特異性結合由下列序列中的每一種構成的表位:
[0308]-HCV 蛋白 El 第 297 到 306 位胺基酸(SEQ ID NO:1)；
[0309]-HCV 蛋白 E2 第 480 到 494 位胺基酸(SEQ ID NO: 2)；
[0310]-HCV 蛋白 E2 第 613 到 621 位胺基酸(SEQ ID NO:3) ?
[0311]9.根據項目I到8中任何一項的構象抗體，其中所述的抗體是單克隆抗體。
[0312]10.根據項目I到9中任何一項的單克隆抗體，由2003年3月19日在 CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes,InstitutPasteur, Paris, France)保藏的登錄號為CNCM 1-2983的雜交瘤分泌。
[0313]11.根據項目I到9中任何一項的單克隆抗體，由2003年3月19日在 CNCM(Col lection Nationale de Culture de Microorganismes, InstitutPasteur, Paris, France)保藏的登錄號為CNCM 1-2982的雜交瘤分泌。
[0314]12.2003 年 3 月 19 日在 CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為 CNCM 1-2983 的雜交瘤。
[0315]13.2003 年 3 月 19 日在 CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)保藏的登錄號為 CNCM 1-2982 的雜交瘤。[0316]14.藥物組合物，包含至少一種項目I到11的抗體作為活性物質和藥學上可接受的載體。
[0317]15.至少一種項目I到11的抗體用於製備診斷、預防或治療HCV感染的藥物的用途。
[0318]16.能結合至少一種項目10或11的抗體的有包膜的病毒顆粒。
[0319]17.結合項目16的有包膜的病毒顆粒的抗體。
[0320]18.源自人血液、血漿或血清最初樣品的HCV病毒顆粒的組合物，其中HCV RNA拷貝的濃度比其來源的人血液、血漿或血清最初樣品中的HCV RNA拷貝濃度高約100到1000倍，特別是高於約IO7拷貝/ml。
[0321]19.根據項目18的組合物，其中HCV RNA拷貝數是從每毫克蛋白約IO8到約109Π。
[0322]20.根據項目18或19的組合物，其中所述組合物的體積是從約0.1ml到約IOml。
[0323]21.實質上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒。
[0324]22.根據項目21的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒，其中所述亞病毒顆粒易於結合項目I到11的任何抗體。
[0325]23.組合物，其包含純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒，所述純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒含有HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV包膜，並且易於結合項目I到11的任何抗體。
[0326]24.製備HCV病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟:
[0327]-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0328]-在水溶液中重懸富集HCV的沉澱以獲得HCV病毒顆粒的組合物。
[0329]25.HCV病毒顆粒的組合物，如根據項目24的方法獲得。
[0330]26.製備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟:
[0331]-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0332]-在水溶液中重懸富集HCV的沉澱；
[0333]-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉澱以將重懸的富集HCV的沉澱的組成成份根據它們的密度分離成級分；
[0334]-回收實質上不含HCVRNA、實質上不含HCV核心蛋白以及含有能結合權利要求10或11的單克隆抗體的顆粒的級分，特別是蔗糖密度為大約1.13到1.15g/ml的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。
[0335]27.HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，如根據項目26的方法獲得。
[0336]28.製備純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟:
[0337]-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉澱；
[0338]-在水溶液中重懸富集HCV的沉澱；
[0339]-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉澱以將重懸的富集HCV的沉澱的組成成份根據它們的密度分離成級分；
[0340]-回收含有每毫升從約5.1O5到約IO6UI的HCV RNA、每毫升從約50到約IOOpg的HCV核心蛋白，以及含有能結合權利要求10或11的單克隆抗體的顆粒的級分，特別是蔗糖密度為大約1.17到1.21 g/ml的級分，以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。
[0341]29.純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，如根據項目28的方法獲得。
[0342]30.製備項目10的單克隆抗體的方法，包括下列步驟:
[0343]-用根據權利要求18的HCV病毒顆粒的組合物，或者如根據權利要求24製備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，並回收產生的抗體；[0344]-在所產生的抗體中，根據它們結合在上面所提到的HCV病毒顆粒的組合物中所包含的HCV病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體。
[0345]31.製備項目11的單克隆抗體的方法，包括下列步驟:
[0346]-用根據權利要求23的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，或者如根據權利要求28製備的組合物免疫動物，特別是哺乳動物，並回收產生的抗體；
[0347]-在所產生的抗體中，根據它們結合在上面所提到的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物中所包含的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體。
[0348]32.藥物組合物，其包含項目21或22的亞病毒顆粒或者項目27的組合物作為活性物質，以及藥學上可接受的載體。
[0349]33.項目21或22的HCV有包膜的亞病毒顆粒或者項目27的組合物的用途，用於誘導針對所述HCV有包膜的亞病毒顆粒或者針對如在項目22中所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒的免疫反應。
[0350]34.項目21或22的HCV有包膜的亞病毒顆粒或者項目27的組合物的用途，用於製備診斷、預防或治療HCV感染的藥物。
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【權利要求】
1.肽，包含SEQID NO:2或SEQ ID NO:3定義的序列。
2.根據權利要求1的肽，由SEQID NO:2或SEQ ID NO:3定義的序列構成。
3.根據權利要求1或2的肽，其中所述的肽是生物素化的。
4.權利要求1-3中任一項的肽的用途，其用於檢測HCV感染的患者血清中特異性抗體的存在，所述特異性抗體能夠與由2003年3月19日保藏在CNCM(Collection Nationalede Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France),保藏登錄號為CNCM1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體所識別的El和E2的三個區域同時反應，其中所述的El和E2的3個區域分別由下述序列構成: -SEQ ID NO:1所示的HCV蛋白El第297到306位胺基酸； -SEQ ID NO:2所示的HCV蛋白E2第480到494位胺基酸；和 -SEQ ID NO:3所示的HCV蛋白E2第613到621位胺基酸。
5.檢測HCV感染患者血清中特異性抗體的存在的方法，所述特異性抗體能夠與由 2003 年 3 月 19 日保藏在 CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes, Institut Pasteur, Paris, France),保藏登錄號為 CNCM1-2983 的雜交瘤所分泌的單克隆抗體所識別的El和E2的三個區域同時反應，其中所述的El和E2的3個區域分別由下述序列構成: -SEQ ID NO:1所示的HCV蛋白El第297到306位胺基酸； -SEQ ID NO:2所示的HCV蛋白E2第480到494位胺基酸；和 -SEQ ID NO:3所示的HCV蛋白E2第613到621位胺基酸， 所述方法包括步驟: -將權利要求1 一 3中任一項的肽與所述血清接觸，以允許所述肽與任何存在於血清中的特異性抗體的複合體的形成；和 -檢測任何形成的複合體的存在。
6.權利要求5的方法，其中包括使用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗人IgG檢測任何形成的複合體的存 在。
7.權利要求5或6的方法，其中的肽是生物素化的，而且其中在接觸步驟之前，所述肽結合於用鏈黴親和素包被的固體表面。
【文檔編號】C07K14/18GK103965301SQ201410081619
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2004年3月31日 優先權日:2003年4月1日
【發明者】M-A·珀蒂, C·洛利夫雷-雷諾, C·特雷波 申請人:國家健康醫學研究所, 拜奧默裡克斯股份有限公司