減少或消除轉基因傳播的方法和組合物的製作方法

2023-10-27 13:24:42 1

專利名稱：減少或消除轉基因傳播的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及在進行減數分裂且其中花粉或精子可異型雜交的轉基因真核生物中轉基因的生產，維持和控制；該生物包括轉基因動物，植物細胞，植物組織和整株植物。更具體的說，本發明涉及通過雄性和/或雌性配子或配子體控制轉基因傳播。本發明的遺傳構建體和方法學提供了控制轉基因不希望的傳播的能力。另外，本發明還提供了富集分散的和/或穩定的轉座事件的植物基因組或任何其它真核生物基因組的工具和方法學。
背景技術：
所有出版物和專利申請在此作為參考文獻引用，其程度相同於各單獨的出版物或專利申請作為參考文獻引用時具體和單獨所示的程度。
轉基因農作物和生物技術的應用顯著改變著全世界的種子和農用化學品貿易。商業上重要的農作物的種子已被遺傳改造成對除草劑和害蟲，特別是昆蟲害蟲有抗性。根據美國農業部的調查(2000年6月)，2000年遺傳改良的玉米，大豆和棉花分別在大約25％，54％和61％的各農作物的總美國田地上生長。
在商業上重要的農作物植物中異源性性狀的自由傳播是目前全世界且特別是農業社會內的主要憂慮。轉基因花粉不希望的散播無意中傷害了有益的昆蟲且可能導致轉基因傳播到親緣植物種類中引起食品汙染和產生除草劑及殺蟲劑抗性的雜草種類。
生物技術工業的興趣在於將諸如對乾旱，昆蟲，疾病，鹽度，霜凍和除草劑的耐受性的性狀轉移進栽培植物中，它可賦予優於野生型植物的適應優勢。已知一些農作物種類與野生型種類具有雜交親和性且很可能這些性狀會通過有性雜交無意中轉移到野生雜草近親中，導致可能的經濟和生態學危害。由於大多數飼料和草皮草類進行了相對較小的馴化且在某些情況下甚至可認為是雜草(例如，百慕達草(bermudagrass))，這種遺傳轉化的植物的最終釋放和使用存在較大問題的可能性很高。一般來說，由於飼料草類不是高度馴化的，具有雜草特性，且具有高度異型雜交力，在轉基因飼料草類的最終釋放中可能遇到具體困難。
在商業上重要的農作物植物中防止異源性狀發生不希望的傳播的方法將會是非常需要的。如果可以實現這點，異源性狀的遺傳洩露將得到控制且可消減這些性狀向不希望的受體的傳播。因此，存在對這樣的遺傳系統的需要，即它對含有轉基因的雄性或雌性配子體進行選擇，從而防止，消除或減少異源性狀的不希望的傳播。具體來說，需要的遺傳系統允許非轉基因(即，野生型)配子體傳播而防止來自相同植物的轉基因(即，異源性)配子體傳播。
因此，本發明的目的是提供在商業上重要的農作物植物中控制，減少或消除異源性狀發生不希望的傳播的重組核酸構建體和方法。
發明概述本發明涉及用於控制植物中異源性狀傳播的遺傳構建體和方法。通過提供對含有自殺基因的雄性或雌性配子進行選擇的與自殺基因可操作相連的性別-特異性啟動子實現控制。自殺基因座稱為「配子體自殺性狀」(GST)(

圖1A)。通過將目的轉基因與在性別-特異性啟動子控制下的自殺基因相連，有效地消除，減少或防止轉基因向後代傳播，因為不會產生攜帶GST的配子。
在一個方面，本發明可以說廣義地由與目的轉基因連接的在花粉特異性啟動子控制下的自殺基因組成。可將轉基因複合體導入初始植物基因組中且可選擇轉基因複合體半合子的植物。只有半合子植物產生的花粉缺乏轉基因複合體，因為它與自殺基因物理連鎖。由於不產生含有轉基因複合體的花粉從而防止了由轉基因複合體編碼的異源性狀的自由傳播。
本發明的第二個方面是基於將GST放在緊鄰轉座子以產生在子代細胞中選擇性富集分散轉座事件，因為只有那些缺乏GST基因座的配子有活力。由於從活配子產生的子代細胞部分將發生了轉座事件，因此實現了分散轉座事件的選擇性富集，因為轉座子必須不再與GST連鎖(GST破壞了那些遺傳GST基因座的配子)(圖1B)。
因此，本發明提供了可用於排除GST轉基因複合體和用於選擇未連鎖的轉座的遺傳系統。通過使用GST與任意轉基因，可完全排除GST與相連的轉基因兩者的雄性傳播(或在雌性配子體特異性啟動子自殺基因構建體的情況下的雌性傳播)(圖2)。
本發明提供了含有與自殺基因可操作相連的雄性配子或雌性配子特異性啟動子的核酸構建體，其中所述啟動子和所述自殺基因組合與目的基因相連。
本發明提供了含有與自殺基因可操作相連的雄性配子或雌性配子特異性啟動子的核酸構建體，其中啟動子和自殺基因的組合與目的基因相連。本發明還提供了這樣的核酸構建體，其中啟動子選自花粉特異性啟動子和胚珠特異性啟動子。本發明還提供了這樣的核酸構建體，其中自殺基因選自芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因。本發明也提供了這樣的核酸構建體，其中目的基因選自編碼除草劑抗性，抗生素抗性，殺蟲劑抗性，固氮，改進營養和纖維素含量的核酸。
本發明提供的核酸構建體含有與選自芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因的自殺基因可操作相連的花粉特異性啟動子或胚珠特異性啟動子；其中該啟動子和自殺基因的組合與選自編碼除草劑抗性，抗生素抗性，殺蟲劑抗性，固氮，改進營養和纖維素含量或其它感興趣的農學性狀的基因的目的基因相連。
本發明提供了減少或消除植物中轉基因座的雄性傳播的方法，包括a)用雄性配子特異性啟動子與自殺基因可操作相連的核酸構建體轉化植物細胞，其中所述啟動子和所述自殺基因組合與異源多核苷酸相連；b)繁殖所述轉化植物細胞，通過減數分裂產生缺乏所述轉基因座的雄性配子。
本發明還提供了減少或消除植物中轉基因座的雄性傳播的方法，包括
a)用花粉特異性啟動子與自殺基因可操作相連的核酸構建體轉化植物細胞；i)其中所述自殺基因選自芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因；ii)其中所述啟動子和所述自殺基因組合與異源多核苷酸相連；iii)其中所述異源多核苷酸選自編碼除草劑抗性，抗生素抗性，殺蟲劑抗性，固氮，改進營養和纖維素含量的DNA；b)繁殖所述轉化植物細胞，通過減數分裂產生缺乏所述轉基因座的雄性配子。
本發明還提供了減少或消除植物中轉基因座的雌性傳播的方法，包括a)用雌性配子特異性啟動子與自殺基因可操作相連的核酸構建體轉化植物細胞，其中所述啟動子和所述自殺基因組合與異源多核苷酸相連；b)繁殖所述轉化植物細胞，通過減數分裂產生缺乏所述轉基因座的雌性配子。
本發明還提供了減少或消除植物中轉基因座的雌性傳播的方法，包括a)用胚珠特異性啟動子與自殺基因可操作相連的核酸構建體轉化植物細胞；i)其中所述自殺基因選自芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因；ii)其中所述啟動子和所述自殺基因組合與異源多核苷酸相連；iii)其中所述異源多核苷酸選自編碼除草劑抗性，抗生素抗性，殺蟲劑抗性，固氮，改進營養和纖維素含量的DNA；b)繁殖所述轉化植物細胞，通過減數分裂產生缺乏所述轉基因座的雌性配子。
本發明還提供了由本發明的方法產生的轉化植物細胞，其中轉化的植物細胞是核酸構建體半合子。
本發明提供的核酸構建體含有與自殺基因可操作相連的雄性配子或雌性配子特異性啟動子，其中所述啟動子和所述自殺基因組合與一個轉座因子相連。本發明還提供了這樣的核酸構建體，它進一步包含一個和多個轉座酶基因。本發明還提供了這樣的核酸構建體，它進一步包含一個或多個目的基因。本發明還進一步提供了這樣的核酸構建體，其中目的基因與轉座因子相連。
本發明提供了核酸構建體，其中花粉特異性啟動子或胚珠特異性啟動子與選自芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因的自殺基因可操作相連；其中所述啟動子和所述自殺基因組合與轉座子相連，其中所述轉座子含有選自編碼除草劑抗性，抗生素抗性，殺蟲劑抗性，固氮，改進營養和纖維素含量的基因的選擇標記。本發明還提供了這樣的核酸構建體，其中啟動子選自花粉特異性啟動子和胚珠特異性啟動子。本發明還提供了這樣的核酸構建體，其中自殺基因選自芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因。
本發明提供了在植物細胞子代群體中富集分散轉座事件的方法，包括a)用上述核酸構建體的任意一種核酸構建體轉化植物細胞以產生轉化的植物細胞；b)繁殖所述轉化植物細胞，通過減數分裂產生富集分散轉座事件的植物細胞子代。
本發明還提供了這樣的方法，它包括分離富集分散轉座事件的植物細胞子代的附加步驟。本發明還提供了含有分散轉座事件的植物細胞和植物，特別是該植物細胞和植物是該核酸為半合子。
本發明提供的核酸構建體含有第一啟動子，其中第一啟動子是與自殺基因可操作相連的雄性配子或雌性配子特異性啟動子，且還含有編碼轉座酶的核酸和編碼轉座子的核酸。本發明還提供了這樣的核酸構建體，其中該轉座子包含與選擇標記可操作連接的第二啟動子，其中選擇標記不是自殺基因。
本發明提供了核酸構建體，其中花粉特異性啟動子或胚珠特異性啟動子與選自芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因的自殺基因可操作相連；其中所述啟動子和所述自殺基因組合與編碼轉座酶的核酸相連，其中與編碼轉座酶的所述核酸相連的所述啟動子和所述自殺基因組合包含一個轉基因座，該基因座還包含一個轉座子；其中所述轉座子含有編碼選自除草劑抗性，抗生素抗性，殺蟲劑抗性，固氮，改進營養和纖維素含量的一個成員的多核苷酸序列。本發明提供了這樣的核酸構建體，其中啟動子選自花粉特異性啟動子和胚珠特異性啟動子。本發明還提供了這樣的核酸構建體，其中自殺基因選自芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因。本發明還提供了這樣的核酸構建體，其中該轉座子含有編碼選自除草劑抗性，抗生素抗性，殺蟲劑抗性，固氮，改進營養和纖維素含量的一個成員的多核苷酸序列。
本發明還提供了在植物細胞子代群體中富集穩定分散的轉座事件的方法，包括a)用本發明的核酸構建體轉化植物細胞以產生轉化的植物細胞；b)繁殖所述轉化植物細胞，通過減數分裂產生富集穩定分散的轉座事件的植物細胞子代。
本發明還提供了這樣的方法，它還包括分離富集穩定分散的轉座事件的植物細胞子代的步驟。本發明還提供了由該方法分離的植物細胞和由該植物細胞產生的植物。
本發明提供了含有本發明的核酸構建體的載體以及含有本發明的載體的宿主細胞，重組植物細胞和轉基因植物。更具體的說，本發明提供了該核酸構建體為半合子的細胞和轉基因植物。
通過閱讀本文提供的說明書和附圖，本發明的其它目的，優點和特徵對本領域的技術人員將是顯而易見的。
附圖的簡要描述結合附圖閱讀時，將會更好地理解前面的概述以及下面的本發明的詳細描述。為了舉例說明本發明，在附圖中顯示了目前優選的實施方案。然而，應理解本發明不限於所示的精確排列和工具。
在附圖中圖1A顯示了例證性的GST(配子體不育性狀)構建體，其中花粉特異性啟動子與自殺基因可操作相連。GST構建體可以與目的基因物理相連以形成轉基因複合體。GST構建體用於防止或消除目的基因的傳播。
圖1B顯示了例證性的與轉座因子和轉座酶源連接的GST構建體。該構建體可用於富集穩定分散的轉座子的植物細胞子代群體。
圖2顯示了從減數分裂產物排除轉基因複合體和選擇分散型轉座的一般化策略。
圖3A和3B顯示了GST構建體的示意圖。
圖4A和4B分別顯示了pYU904和pYU905構建體的示意圖。
圖5顯示了pYU846轉座酶構建體的示意圖。
詳細描述除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常的理解具有相同的含義。儘管相似於或相當於本文所述任何方法和材料可在本發明的實踐或試驗中使用，但仍然描述了優選的方法和材料。
從上面所述可預料到本發明的工具和方法可應用於產生配子的所有植物。該植物包括，但不限於，飼料草類，草皮草類，飼料豆類，蔬菜，田間農作物，樹和觀賞花卉。
定義本文使用的術語「等位基因」是指一種基因的幾種替代形式中的任意一種。
本文使用的術語「農作物植物」是指為任何商業目的而生長的任意植物，包括，但不限於下列目的種子生產，乾草生產，觀賞用途，水果生產，漿果生產，蔬菜生產，油類生產，蛋白質生產，飼料生產，動物放牧，高爾夫球場，草坪，花卉生產，風景美化，侵蝕控制，綠色肥料，改良土壤耕作/健康，生產藥品/藥物，生產食品添加劑，菸草產品，紙漿生產和木材生產。
本文使用的術語「雜交授粉」或「雜交育種」是指將一株植物上的一朵花的花粉施加(人工或自然)到另一株植物花的胚珠(柱頭)上的方法。
本文使用的術語「栽培種」是指由園藝或農學技術產生的且正常情況下在野生群體中沒有發現的植物變種，株系或品種。
術語「分散的轉座事件」是指轉座子發生移動使得它不再與轉座子送出位點(供體位點)相連(即緊鄰)。
術語「雌性」是指產生胚珠的植物。雌性植物一般在受精後產生種子。稱為「雌性植物」的植物可含有雄性和雌性性器官。另外，「雌性植物」可天然(例如，雌雄異體種類)或由於去雄(例如，經過去掉雄蕊)而僅含有雌性性器官。
本文使用的術語「子代」是指在特定親代之後的任何細胞，組織或生物體世代。親本交配產生的世代是第一子代(稱為「F1」和「F1」)，而F1個體雜交產生的世代是第二子代(稱為「F2」和「F2」)。
術語「配子」是指生殖細胞，其細胞核(通常和細胞質)與相似來源但性別相反的另一配子的細胞核融合形成合子，該合子具有發育成新個體的潛力。配子是單倍體且分化成雄性和雌性。
術語「基因」是指與生物學功能相關的任意DNA片斷。因此，基因包括但不限於編碼序列和/或其表達所需的調控序列。基因也可包括不表達的DNA片斷，例如形成其它蛋白質的識別序列的DNA片斷。基因可從各種來源獲得，包括從感興趣的來源克隆或根據已知的或推測的序列信息合成，且可包括設計成具有所需參數的序列。
本文使用的術語「基因型」是指單個細胞，細胞培養物，組織，植物，或植物群體的遺傳組成。
本文使用的術語「半合子」是指與單倍體細胞或生物中的基因，異配性別中的性連鎖基因，或二倍體細胞或生物中其配對片斷已缺失的染色體片斷上的基因一樣，基因僅在基因型中存在一次的細胞，組織或生物體。
「異源多核苷酸」或「異源核酸」或「外源性DNA片斷」是指從特定宿主細胞之外的來源產生的多核苷酸，核酸或DNA片斷，或者，如果來自相同來源，從其原始形式進行了修飾。因此，宿主細胞中的異源基因包括對特定宿主細胞是內源性的但進行了修飾的基因。因此，該術語是指對該細胞是外源的或異源的，或者對該細胞是同源的但在宿主細胞核酸內通常沒有發現該元件的位置上的DNA片斷。表達外源DNA片斷產生外源多肽。
「異源性狀」是指由外源性DNA片斷，異源多核苷酸或異源核酸賦予轉化的宿主細胞或轉基因生物的表型。
本文使用的術語「雜合子」是指至少在一個基因座上存在不同等位基因(給定基因的類型)的二倍體或多倍體的個體細胞或植物。
本文使用的術語「雜合的」是指在特定基因座上存在不同的等位基因(給定基因的類型)。
本文使用的術語「純合子」是指在一個或多個基因座上具有相同等位基因的個體細胞或植物。
本文使用的術語「純合的」是指在同源染色體片斷的一個或多個基因座上存在相同等位基因。
本文使用的術語「雜種」是指一個或多個基因有區別的親本之間雜交產生的任何個體細胞，組織或植物。
本文使用的術話「近交」或「近交系」是指相對純種的品系。
本文使用的術語「品系」用於廣泛包括，但不限於從單親植物經過組織培養技術無性繁殖的一群植物或者由於家系來自共同的親本而在遺傳上非常相似的一群近交植物。如果植物是(a)從該品系的材料再生的初級轉化體(T0)植物；(b)具有由該品系的T0植物組成的家系；或(c)由於共同的祖先而在遺傳上非常相似(例如，經過近交或自交)，那麼該植物稱為「屬於」該特定品系。在這種情況下，術語「家系」表示植物的譜系，例如，對於實行的有性雜交，使得在雜合子(半合子)或純合子情況下的一種基因或基因組合可賦予該植物所需的性狀。
本文所用的術語「基因座」(複數「多基因座」)是指遺傳上限定的任何位點。基因座可以是一個基因，部分基因，或具有某些調控作用且可被不同序列佔據的DNA序列。
術語「雄性」是指產生花粉粒的植物。「雄性植物」一般是指產生配子用於受精卵的性別。稱為「雄性植物」的植物可含有雄性和雌性性器官。另外，「雄性植物」可天然(例如，在雌雄異體種類中)或由於去雌(例如，經過去掉子房)而僅含有雄性性器官。
本文使用的術語「大量選擇」是指選擇個體植物且從其種子集合繁殖下一代的選擇形式。
本文使用的術語「核酸」或「多核苷酸」是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。除非另有限定，該術語包括含有與對照核酸具有相似的結合特性且與天然存在的核苷酸以相似的方式進行代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另有說明，特定的核酸序列也隱含包括其保守修飾的變異體(例如，簡併密碼子取代)和互補序列以及詳細表示的序列。具體地說，通過產生用混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代一個或多個選定的(或全部)密碼子的第三個位置的序列可實現簡併密碼子取代(Batzer等，(1991)，Nucleic Acid Res.195081；Ohtsuka等，(1985)J.Biol.Chem.2602605-2608；Cassol等，(1992)；Rossolini等，(1994)Mol.Cell.Probes 891-98)。術語核酸可與基因，cDNA，和基因編碼的mRNA互換使用。
如本文所用，一個DNA片斷當放在與另一DNA片斷具有功能關係的位置時稱為「可操作相連」。例如，信號序列的DNA如果作為參與多肽分泌的蛋白前體表達時與編碼該多肽的DNA可操作相連；啟動子或增強子如果刺激序列的轉錄時與該編碼序列可操作相連。一般來說，可操作相連的DNA序列是連續的，對於信號序列，連續的和在閱讀相中都需要。然而，增強子不必與其控制轉錄的編碼序列連續。通過以方便的限制性位點或以插入其位置的銜接子或接頭進行連接反應可實現連接。
本文使用的術語「開放傳粉」是指自由接觸一些基因流的植物群體，相反，封閉傳粉存在對基因流的有效屏障。
本文使用的術語「開放傳粉種群」或「開放傳粉變種」是指正常情況下能進行至少一些異花授粉的植物，選擇的標準是它們可表現出變異但也具有一個或多個該種群或變種區別於其它的種群或變種的基因型或表型特徵。對異花傳粉無障礙的雜種是開放傳粉種群或開放傳粉變種。
本文使用的術語「胚珠」是指雌性配子體，而術語「花粉」是指雄性配子體。
本文使用的術語「胚珠特異性啟動子」廣義上是指在胚珠形成和/或發揮功能必須的植物細胞或組織中選擇性調控核酸序列的表達和/或在植物胚珠形成期間限制核酸序列的表達的核酸序列。
本文使用的術語「花粉特異性啟動子」廣義上是指在花粉形成和/或發揮功能必須的植物細胞或組織中選擇性調控核酸序列的表達和/或在植物花粉形成期間限制核酸序列的表達的核酸序列。
本文使用的術語「表型」是指個體遺傳組成(即，基因型)與環境之間相互作用產生的個體細胞，細胞培養物，植物，或植物群體的可觀察的特徵。
本文使用的術語「植物」是指整株植物，植物器官(例如，葉，莖，根，等)，種子和植物細胞及其後代。可在本發明方法中使用的植物種類一般與適合於轉化技術的高等植物種類一樣廣泛，包括單子葉植物和雙子葉植物。
本文使用的術語「啟動子」是指涉及結合RNA聚合酶以啟動轉錄的DNA區域。
本文使用的術語「重組體」是指用重組DNA進行了轉化的細胞，組織或生物體。原始重組體命名為「R0」或「R0」。R0自交產生的第一轉化世代命名為「R1」或「R1」。
本文使用的術語「自交不親和」是指交配或授粉後，雄性配子和雌性配子不能實現受精，而它們分別能夠與繁殖群體的其它配子在相似的交配和授粉後結合(Mather，J.Genet.25215-235(1943))。
本文使用的術語「自花傳粉」或「自花受粉」是指將一株植物的一朵花上的花粉(人工或天然)施加到相同植物的相同或不同花上的胚珠(柱頭)上。
本文使用的術語「穩定分散的轉座事件」是指不再進行進一步的轉座，例如第二次轉座事件的分散的轉座。
本文使用的術語「自殺基因」是指表達產物對於表達該自殺基因的細胞是致死的任何基因。
本文使用的術語「綜合種」是指特定的一組無性系或種子繁殖的品系互交產生的一組後代。綜合種可含有雜交，自交和近交受精產生的種子的混合物。
本文使用的術語「轉化」是指將核酸(即，核苷酸多聚體)轉移進細胞。本文使用的術語「遺傳轉化」是指將DNA，特別是重組DNA轉移並摻入細胞中。
本文使用的術語「轉化體」是指進行了轉化的細胞，組織或生物體。原始轉化體命名為「T0」或「T0」。T0的自交產生第一轉化的世代，命名為「T1」或「T1」。
本文使用的術語「轉基因」是指以保證其功能的方式插入生物體，宿主細胞或載體中的核酸。
本文使用的術語「轉基因體」是指通過各種轉化方法之一接受了外源或修飾基因的細胞，細胞培養物，生物體，植物，和植物子代，其中外源或修飾基因來自與接受該外源或修飾基因的植物或生物體種類相同或不同的種類。
本文使用的術語「轉座酶」是指催化轉座事件的一種酶或多種酶，或者更一般地說，是一種分子或多種分子。
本文使用的術語「轉座事件」是指轉座子從供體位點向靶位點的移動。
本文使用的術語「轉座子」是指一種遺傳因子，包括但不限於可從一個染色體位點移動到另一位點的DNA或RNA片斷。
本文使用的術語「變種」是指種的亞分類，由該種內在形態或功能上不同於其它相似的一批個體的一群個體組成。
本文使用的術語「載體」廣義上是指編碼外源核酸的任何質粒或病毒。該術語也應解釋為包括幫助將核酸轉移進病毒粒體或細胞中的非質粒和非病毒複合物，例如，聚賴氨酸複合物等。載體可以是適合於作為傳遞載體用於將核酸或其突變體傳遞給細胞的病毒載體，或者載體可以是適合於相同目的的非病毒載體。用於將DNA傳遞給細胞和組織的病毒和非病毒載體的例子是本領域熟知的且在例如，Ma等，(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9412744-12746)中已有描述。病毒載體的例子包括，但不限於重組牛痘病毒，重組腺病毒，重組逆轉錄病毒，重組腺伴隨病毒，重組鳥類痘病毒等(Cranage等，1986，EMBO J.53057-3063；1994年8月18日公開的國際專利申請號WO94/17810，1994年10月27日公開的國際專利申請號WO94/23744)。非病毒載體的例子包括但不限於脂質體，DNA的多胺衍生物等。
本發明的綜述本發明描述了為了消除轉基因座(目的基因)的傳播破壞雄性或雌性配子體(小孢子或大孢子)的構建體和方法。在一個實施方案中，小孢子的破壞使用與合適的自殺基因融合的花粉特異性啟動子或通過使用不能通過一種性別傳播的遺傳突變進行遺傳改造。
當是半合子時，通過將目的基因與在雄性或雌性特異性啟動子控制下的自殺基因連接實現消除轉基因座的傳播。該構建體稱為「配子體自殺性狀」(GST)，它誘導局限於小孢子或大孢子的細胞死亡，從而有效減少或消除與GST連接的目的基因的傳播。由於GST/轉基因構建體是半合子的，所以50％的花粉粒是有活力且無轉基因的。因此可控制轉基因的傳播而允許發生授粉以便實現受精並最終獲得種子供應種植或食品應用。由於許多植物產生過度充足的花粉，因此對於大多數植物種類而言損失50％所產生的花粉不會對結實結果有不利影響。例如，玉米(Zea mays)在7天的花期中高峰期一株植物每天產生107個之多的花粉粒(Coe等，玉米遺傳性，見玉米和玉米改良。第3版，編輯Sprague等，(1988)，第81-258頁)。
消除轉基因座的雄性傳播也可用作富集分散的和/或穩定的轉座事件的新策略。通過構建含有轉座因子和/或轉座酶基因以及「配子體自殺性狀」(GST)的「轉基因複合體」可實現這點。GST誘導局限於小孢子的細胞死亡，嚴重減少鄰近染色體區域和其它轉基因，包括轉基因複合體內的轉座子(供體因子)和/或轉座酶基因的雄性傳播。
當雄性親本中的轉基因複合體是雜合體時，大約50％的小孢子受到破壞，從而防止轉基因複合體的雄性傳播和極大地減少了連鎖的轉座因子的雄性傳播。轉座子供體位點和附近轉座的消除對於含有未連鎖的轉座和與供體轉基因複合體重組的轉座因子的花粉具有富集淨效應。
通過在轉座因子內包括除草劑選擇標記基因可容易地在後代中選擇依然存在的轉座事件。GST也可與轉座酶源物理連接以消除含有轉座酶源的配子。這種排列可防止轉座酶源傳播到配子中，從而穩定在後代中的插入。
所有這三種成分，即自殺基因或突變，轉座酶源和轉座子可構建成一個單元以提供產生分散的，穩定轉座的有效方法。破壞小孢子的一個替代策略是使用大孢子自殺性狀改造胚珠半不育性以消除轉基因複合體的雌性傳播。I.核酸A.啟動子有許多合適啟動子的傑出例子可在植物中啟動花粉特異性表達。在諸如玉米，水稻，西紅柿，菸草，擬南芥屬，芸苔屬及其它的許多植物種類中已經鑑定了花粉特異性啟動子(Odell，T.O.等，(1985)，自然，313810-812；Marrs，K.A.等，(1993)Dev Genet，Vol.14/127-41；Kim，(1992)Transgenic Res，Vol.1/4188-94；Carpenter，J.L.，等，(1992)Plant Cell Vol.4/5557-71；Albani，D.等，(1992)Plant J.2/3331-42；Rommens，C.M.，等，(1992)，Mol.Gen.Genet.，Vol.231/3433-41；Kloeckener-Gruissem，等，(1992)Embo J，Vol.11/1157-66；Hamilton，D.A.等，(1992)，Plant Mol Biol，Vol.18/2211-18；Kyozuka，J.，等，(1991)，Mol.Gen.Genet.，Vol.228/1-240-8；Albani，D.等，(1991)Plant Mol Biol Vol.16/4501-13；Twell，D.等，(1991)Genes Dev.5/3496-507；Thorsness，M.K.等，(1991)Dev.Biol Vol.143/1173-84；McCormick，S.等，(1991)Symp Soc Exp Biol Vol.45229-44；Guerrero，F.D.等，(1990)MolGen Genet Vol 224/2161-8；Twell，D.等，(1990)Development Vol.109/3705-13；Bichler，J.等，(1990)，Eur J Biochem Vol.190/2415-26；van Tunen，等，(1990)，Plant Cell Vol 2/5393-401；Siebertz，B.等，(1989)Plant Cell Vol 1/10961-8；Sullivan，T.D.等，(1989)Dev Genet Vol 10/6412-24；Chen，J.等，(1987)，Genetics Vol 116/3469-77)。花粉特異性啟動子的一些其它例子可在GenBank中找到。還有一些啟動子在美國專利號5,086,169；5,756,324；5,633,438；5,412,085；5,545,546和6,172,279中提供。
也有一些其它的真核性別特異性啟動子適用於本發明。該例子包括小鼠精母細胞特異性Pgk-2啟動子(Ando等，(2000)Biochem.Biophys.Res.Comm.272/1125-8)；PACAP睪丸特異性啟動子(Daniel等，(2000)Endocrinology，141/31218-27)；小鼠mSP-10精細胞特異性啟動子(Reddi等，(1999)Biology of Reproduction，61/51256-66)；小鼠精子特異性啟動子(Ramara等，(1998)J.Clin.Invest.102/2371-8)；小鼠和大鼠Hlt啟動子(vanWert等，(1996)J.Cell.Biochem.60/3348-62)；人PRM1，PRM2和TNP2精細胞特異性啟動子(Nelson等，(1995)DNA Sequence 5/6329-37)；果蠅屬exu性別特異性啟動子(Crowley等，(1995)Molec.Gen.Genet.248/3370-4)；小鼠睪丸ACE啟動子(Zhou等，(1995)Dev.Genet.16/2201-9)；大鼠GHRH精子發生特異性啟動子(Srivastava等，(1995)Endocrinology 136/41502-8)；果蠅屬精巢特異性啟動子(Lankenau等(1994)Mol.Cell.Biol.14/31764-75)；精母細胞特異性hst70基因啟動子(Widlak等，(1994)Acta Biochim.Polonica41/2103-5)；和小鼠Prm-1精細胞特異性啟動子(Zambrowicz等，(1993)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90/115071-5)。
對於本發明，如果任何啟動子對一種性別(雄性或雌性)具有特異性且在減數分裂I期後當同源染色體分離進不同細胞時能特異性啟動基因表達，那麼該啟動子是合適的。例如，在減數分裂II的四分體時期，導致花粉成熟的小孢子有絲分裂後，成熟花粉粒，或在萌發花粉粒時的基因表達將適合於本發明。
B.自殺基因配子體自殺性狀(GST)的一個方面是直接表達自殺基因以殺死不需要的減數分裂產物。其表達導致細胞死亡的基因的例子包括，但不限於，已在文獻中描述的那些基因，包括芽孢桿菌RNA酶(Custers，J.B.，等，(1997)PlantMol Biol Vol.35/6689-99；Yazynin，S.，等，(1999)FEBS Lett Vol.452/3351-4；Goldman，M.H，等，(1994)Embo J Vol.13/132976-84，1994)，雄花穗種子2(tasselseed2)(DeLong，A，等，(1993)Cell Vol.74/4757-768)，和白喉毒素A基因(Day，C.D.，等，(1995)Development Vol.121/92887-95)。由於自殺基因的表達局限於減數分裂I期後，因此當轉基因是半合子且正常情況下在減數分裂中分離時僅可剔除50％的配子。活配子不會遺傳自殺基因。
根據本發明的另一方面，使用反義RNA技術抑制花粉或卵的發育能力所必需的一個或多個基因的表達也可實現半不育。該技術在下面進行更詳細的討論。
另外，也可使用不能通過一種性別傳播的突變，例如花粉不傳播的缺失以實現半不育。
自殺基因的具體例子包括，但不限於下列基因雄花穗種子2(ts2)，遺傳和分子證據顯示ts2是雄花穗和小穗中消除雌蕊所必需的。ts2在雌蕊細胞中的表達與核完整性喪失和細胞死亡同時發生。還不清楚ts2基因產物在細胞死亡途徑中如何發揮作用。根據其與短鏈醇脫氫酶的相似性，特別是與羥基類固醇脫氫酶的相似性，建立了兩種可能的理論。ts2產物可能代謝一種細胞活力必需的底物，也許是類固醇。另外，TS2的作用可能導致形成激活細胞死亡反應的信號分子。(Calderon-Urrea等，(1999)Development，126435)。
白喉毒素A鏈(DTA).白喉毒素A鏈(DTA)抑制蛋白質合成，Greenfield等，Proc.Natl.Acad.，Sci.USA，806853(1983)；Palmiter等，Cell，50435(1987)。
果膠酸裂解酶pelE.來自菊歐文氏菌EC16的果膠酸裂解酶pelE降解果膠，引起細胞裂解。Keen等，J.Bacteriology，168595(1986)。
T-urf13(TURF-13).T-urf13(TURF-13)來自cms-T玉米線粒體基因組；該基因編碼破碎線粒體或原生質膜的稱為URF13的多肽。Braun等，Plant Cell，2153(1990)；Dewey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，845374(1987)；Dewey等，Cell，44439(1986)。
Gin重組酶.Gin重組酶來自噬菌體Mu，該基因編碼在植物細胞中表達時引起基因組重排和細胞活力喪失的位點特異性DNA重組酶。Maeser等，Mol.Gen.Genet.，230170-176(1991)。
吲哚乙酸-賴氨酸合成酶(iaaL).來自丁香假單胞菌的吲哚乙酸-賴氨酸合成酶(iaaL)編碼將賴氨酸偶聯到吲哚乙酸(IAA)上的酶。當它在植物細胞中表達時，由於經過偶連從細胞中去掉了IAA而引起發育改變。Romano等，Genes and Development，5438-446(1991)；spena等，Mol.Gen.Genet.，227205-212(1991)；Roberto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，875795-5801。
芽孢桿菌RNA酶.來自解澱粉芽孢桿菌的核糖核酸酶，也稱為芽孢桿菌RNA酶，它消化表達它的那些細胞中的mRNA，導致細胞死亡。Mariani等，Nature 347737-741(1990)；Mariani等，Nature 357384-387(1992)。
CytA毒素基因.來自蘇芸金芽孢桿菌以色列亞種的CytA毒素基因編碼一種殺蚊的和溶血的蛋白質。當它在植物細胞中表達時，由於細胞膜破裂而引起細胞死亡。McLean等，J.Bacteriology，1691017-1023(1987)；E11ar等，美國專利號4,918,006(1990)。
在其它真核生物中用作自殺基因的合適的細胞死亡基因包括人PDCD9(程序性細胞死亡9)和Gallus gallus編程性細胞死亡蛋白前體p52(Carim等，(1999)Cytogenetics and Cell Genetics(瑞士)87/1-285-8)；C.Elegans程序性細胞死亡基因CED-3和EGL-1(Hengartner等，(1999)54213-22)；編碼C.elegans CED-3ICE的哺乳動物同源物的基因(白介素-1β-轉化酶)(Kondo等，(1998)Investigative Ophthalmology Visual Science 39/132769-74)；編碼ICE-樣蛋白酶Ich-1L，CPP32β，Mch2α和Mch3α的基因(Kondo等，(1998)58/5962-7)；或哺乳動物細胞死亡基因Nedd2(Kumar等，(1997)Leukemia 11 Suppl 3385-6)。
C.轉基因和異源核酸使用重組DNA方法學成功導入植物的基因包括，但不限於那些編碼下列性狀的基因種子貯存蛋白，包括修飾的7S豆類種子貯存蛋白(美國專利號5,508,468，5,559,223和5,576,203)；除草劑耐受性或抗性(美國專利號5,498,544和5,554,798；Powell等，Science 232738-743(1986)；Kaniewski等，Bio/Tech.8750-754(1990)；Day等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 886721-6725(1991))；植酸酶(美國專利號5,593,963)；對細菌，真菌，線蟲和昆蟲害蟲的抗性，包括由Bt基因賦予的對鱗翅目昆蟲的抗性(美國專利號5,597,945和5,597,946；Hilder等，Nature 330160-163；Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，869871-9875(1989)；Perlak等，Bio/Tech.8939-943(1990))；凝集素(美國專利號5,276,269)；和花色(Meyer等，Nature 330677-678(1987)；Napoli等，Plant Cell 2279-289(1990)；van der Krol等，Plant Cell 2291-299(1990))。
其中特別感興趣的是賦予對除草劑抗性的基因。其例子包括，但不限於下列基因(i)抑制生長點或分生組織的除草劑，例如imidazalinone或磺醯脲類。在這一類型中舉例性的基因編碼突變的ALS和AHAS酶，例如，分別參見Lee等，EMBO J.71241(1988)，和Miki等，Theor.Appl.Genet.80449(1990)。
(ii)草甘膦(glyphosate)(分別由突變的5-enolpyruvl-3-phosphikimate合成酶(EPSP)和aroA基因賦予抗性)和諸如glufosinate的其它膦醯基化合物(phosphinothricin乙醯轉移酶(PAT)和吸水鏈黴菌phosphinothricin乙醯轉移酶(bar)基因賦予抗性)，和pyridinoxy或phenoxy proprionic acids和cycloshexones(ACCase抑制劑的編碼基因賦予抗性)。參見例如，Shah等的美國專利號4,940,835，它公開了可賦予草甘膦抗性的EPSP類型的核苷酸序列。編碼突變的aroA基因的DNA分子可按ATCC保藏號39256獲得，且該突變基因的核苷酸序列在Comai的美國專利號4,769,061中公開。Kumada等的歐洲專利申請號No.0 333 033和Goodman等的美國專利號4,975,374公開了賦予對諸如L-phosphinothricin的除草劑的抗性的谷醯胺合成酶基因的核苷酸序列。phosphinothricin-乙醯轉移酶基因的核苷酸序列在Leemans等的歐洲申請號No.0 242 246中提供。De Greef等，Bio/Technology761(1989)描述了表達編碼phosphinothricin乙醯轉移酶活性的嵌合bar基因的轉基因植物的生產。賦予對phenoxy proprionic acids和諸如稀禾定(sethoxydim)和haloxyfop的cycloshexones的抗性的基因的例子有Marshall等，Theor.Appl.Genet.83435(1992)所述Acc1-S1，Acc1-S2和Acc1-S3基因。編碼phosphinothricin乙醯轉移酶的鏈黴菌屬bar基因在玉米植物中的表達導致對除草劑phosphinothricin或glufosinate具有耐受性(美國專利號5,489,520，本文引用以供參考)。
對於某些目標種類，優選不同的抗生素或除草劑選擇標記。常規用於轉化的選擇標記包括賦予對卡那黴素和相關抗生素抗性的nptII基因(Messing Vierra，Gene 19259-268(1982)；Bevan等，Nature 304184-187(1983))，賦予對除草劑phosphinothricin抗性的bar基因(White等，Nucl AcidsRes 181062(1990)，Spencer等，Theor Appl Genet 79625-631(1990))，賦予對抗生素潮黴素抗性的hph基因(Blochinger Diggelmann，Mol Cell Biol 42929-2931)，和賦予對氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))。
使用從苜蓿和非苜蓿種類分離的許多不同基因已經產生了轉基因苜蓿植物，這些基因包括但不限於下列基因與報導基因gusA融合的早期結瘤素基因的啟動子(Bauer等，The Plant Journal 10(1)91-105(1996)；早期結瘤素基因(Charon等，Proc.Natl.Acad.of Sci.USA 94(16)8901-8906(1997)；Bauer等，Molecular Plant-Microbe Interactions 10(1)39-49(1997))；NADH-依賴型穀氨酸合酶(Gantt，The Plant Journal 8(3)345-358(1995))；三種凝集素基因之一的啟動子-gusA融合體(Bauchrowitz等，The Plant Journal 9(1)31-43(1996))；與CaMV啟動子融合的海洋軟體珊瑚Renilla reniforms的螢光素酶(Mayerhofer等，The Plant Journal 7(6)1031-1038(1995))；Mn-過氧化物歧化酶cDNA(McKersie等，Plant Physiology 111(4)1177-1181(1996))；編碼蘇芸金芽孢桿菌δ-內毒素的合成cryIC基因(Strizhov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(26)15012-15017(1996))；葡聚糖酶(Dixon等，Gene 179(1)61-71(1996)；Masoud等，Transgenic Research 5(5)313-323))；和葉衰老基因(美國專利號5,689,042)。
使用重組DNA技術成功轉移進三葉草的基因包括，但不限於下列基因Bt基因(Voisey等，出處同上)；新黴素磷酸轉移酶II(Quesbenberry等，出處同上)；豌豆凝集素基因(Diaz等，Plant Physiology 109(4)1167-1177(1995)；Eijsden等，Plant Molecular Biology 29(3)431-439(1995))；植物激素應答啟動子GH3(Larkin等，Transgenic Research 5(5)325-335(1996)；來自向日葵的種子白蛋白基因(Khan等，Transgenic Research 5(3)179-185(1996))；編碼酶phosphinothricin乙醯轉移酶的基因，編碼對Basta除草劑抗性的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，新黴素磷酸轉移酶和α-澱粉酶抑制劑(Khan等，出處同上)。
感興趣的其它轉基因包括，但不限於那些編碼木質素含量，纖維素含量，固氮作用，改良的營養，顏色，維生素含量和重組產生的疫苗或與其相關的基因。
D.位點特異性重組系統將DNA序列定向插入特定DNA座位而得以排除作為轉化過程副產品發生的DNA序列隨機插入的方法和構建體在美國專利號5,527,695和6,114,600中描述。排除這些隨機插入的一種方式是使用位點特異性重組酶系統。一般來說，位點特異性重組酶系統由三個元件組成兩對DNA序列(位點特異性重組序列)和一種特異性酶(位點特異性重組酶)。位點特異性重組酶僅能催化兩個位點特異性重組序列之間的重組反應。
可使用許多不同的位點特異性重組酶系統，包括但不限於噬菌體P1的Cre/lox系統，酵母的FLP/FRT系統，噬菌體Mu的Gin重組酶，大腸桿菌的Pin重組酶，和pSR1質粒的R/RS系統。兩個優選的位點特異性重組酶系統是噬菌體P1的Cre/lox和酵母的FLP/FRT系統。在這些系統中，重組酶(Cre或FLP)與其各自的位點特異性重組序列(分別為lox或FRT)特異性相互作用以顛倒或切除插入序列。用於這兩個系統之一的序列相對較短(lox為34bp且FRT為47bp)。目前酵母的FLP/FRT系統是優選的位點特異性重組酶系統，因為正常情況下它在真核生物(酵母)中發揮功能且已被充分鑑定。據認為FLP/FRT系統的真核來源允許FLP/FRT系統在真核細胞中比原核位點特異性重組酶系統更有效地發揮功能。
已證實FLP/FRT重組酶系統在植物細胞中有效地發揮功能。在玉米和水稻原生質體中對FLP/FRT系統性能進行的實驗表明FRT位點結構和存在的FLP蛋白的量影響切除活性。一般來說，短的不完全FRT位點導致切除產物的累積比全長FRT位點更高。位點特異性重組系統在玉米原生質體中催化分子內和分子間反應，表明該系統可用於DNA切除以及整合反應。重組反應是可逆的且該可逆性損害了以任一方向反應的效率。改變位點特異性重組序列的結構是一種補救該情況的方法。位點特異性重組序列可按這樣的方式進行突變，即重組反應產物不再作為逆反應的底物被識別，從而穩定整合或切除事件。
E.載體在植物中表達外源DNA的表達單元如上所述，本發明的一些實施方案使用表達單元(或表達載體或系統)在植物中表達外源性提供的核酸序列。產生用於植物的表達單元/系統/載體的方法在本領域中是熟知的且可容易地適用於本發明。按照本文提供的概要技術人員可容易地在本方法中使用任何合適的植物/載體/表達系統。
用於調控蛋白質表達的表達控制元件可以是正常情況下發現與該編碼序列相連的表達控制元件(同源表達元件)或者可以是異源表達控制元件。同源和異源表達控制元件的種類在本領域中是已知的且可容易地用於製備在本發明中使用的表達單元。例如，轉錄起始區可包括各種冠癭胺基酸起始區的任一種，例如，在根癌土壤桿菌Ti質粒中發現的章魚氨酸，甘露氨酸，胭脂氨酸等。另外，也可使用植物病毒啟動子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動子以控制植物中的基因表達。最後，也可使用諸如prolifera啟動子，果實特異性啟動子，Ap3啟動子，熱休克啟動子，種子特異性啟動子，等的植物啟動子。最優選的啟動子是在雄性或雌性配子中最具有活性的啟動子。
配子特異性啟動子，組成型啟動子(例如CaMV或Nos啟動子)，器官特異性啟動子(例如西紅柿的E8啟動子)或誘導型啟動子的任一種一般可使用本領域已知的標準技術與蛋白質或反義分子的編碼區相連。經過使用諸如轉錄終止子和/或增強子元件的補充元件可進一步優化表達單元。
因此，為了在植物中表達，除了蛋白質序列外，表達單元一般還含有植物啟動子區，轉錄起始位點和轉錄終止序列。在表達單元的5』和3』端一般包含單一限制酶位點以便允許容易地插入先前存在的載體中。
在異源啟動子/結構基因或反義組合的構建中，啟動子優選位於離異源轉錄起始位點的距離與在其天然環境中它離轉錄起始位點的距離大約相同。然而，正如本領域已知的，容許在該距離上有一些變化而不喪失啟動子功能。
除了啟動子序列外，表達盒也可含有結構基因下遊的轉錄終止區以提供有效終止。終止區可從與啟動子序列相同的基因獲得或者可從不同基因獲得。如果由結構基因編碼的mRNA需要進行有效加工，通常也可向載體構建體中加入指導RNA多聚腺苷化的DNA序列。多聚腺苷化序列包括但不限於土壤桿菌屬章魚氨酸合成酶信號(Gielen等，EMBO J，3835-846(1984))或胭脂氨酸合成酶信號(Depicker等，Mol.and Appl.Genet.1561-573(1982))。
所得的表達單元連接進適合於高等植物轉化的載體中或者包含在該載體中。該載體一般也可含有選擇標記基因，可由此在培養基中鑑定轉化的植物細胞。通常，標記基因編碼抗生素抗性。這些標記包括對G418，潮黴素，博萊黴素，卡那黴素和慶大黴素的抗性。轉化植物細胞後，以其在含有特定抗生素的培養基中生長的能力可鑑定具有該載體的那些細胞。一般也可包含細菌或病毒來源的複製序列以允許將該載體克隆進細菌或噬菌體宿主中，優選包含廣譜宿主範圍的原核複製原點。也應包含細菌選擇標記以允許選擇攜帶所需構建體的細菌細胞。合適的原核選擇標記也可包括對諸如氨苄青黴素，卡那黴素或四環素的抗性。
正如本領域已知的，在該載體中也可存在編碼附加功能的其它DNA序列。例如，在土壤桿菌屬轉化中，也可包含T-DNA序列用於隨後轉移進植物染色體中。
本發明的序列也可與諸如表達序列標籤(ESTs)，表位或螢光蛋白標記各種等其它核酸分子融合。
ESTs是基因片斷，一般長300至400個核苷酸，從互補-DNA(cDNA)克隆的3』或5』端測序。由一個法國人和一個美國人的合作組已經產生了接近30,000個擬南芥的ESTs(Delseny等，FEBS Lett.405(2)129-132(1997)；擬南芥資料庫，http//genome.www.stanford.edu/Arabidopsis)。對於來自大型EST資料庫的基因表達模式分析的討論可參見，例如，M.R.Fannon，TIBTECH 14294-298(1996)。
生物學上相容的螢光蛋白探針，特別是來自水母Aequorea victoria的自身組裝綠色螢光蛋白(GFP)改革了對細胞，分子和發育生物學的研究，因為它們允許在活細胞中看見生化事件(Murphy等，Curr.Biol.7(11)870-876(1997)；Grebenok等，Plant J.11(3)573-586(1997)；Pang等，Plant Physiol.112(3)(1996)；Chiu等，Curr.Biol.6(3)325-330(1996)；Plautz等，Gene 173(1)83-87(1996)；Sheen等，Plant J.8(5)777-784(1995))。
使用定點誘變已經形成了一種密碼子修飾的GFP的更可溶的形式，稱為可溶性修飾的GFP(smGFP)。當導入擬南芥屬時，與密碼子修飾的GFP相比觀察到更強的螢光，暗示smGFP『更亮』，因為它更多地以可溶性和有功能的形式存在(Davis等，Plant Mol.Biol.36(4)521-528(1998))。經過融合編碼GFP和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因，研究者可產生一組雙功能報導基因構建體，可優化該構建體用於在包括擬南芥屬的植物中的瞬時和穩定表達系統中(Quaedvlieg等，Plant Mol.Biol.37(4)715-727(1998))。
Berger等(Dev.Biol.194(2)226-234(1998))報導了擬南芥屬下胚軸表皮細胞的GFP標記系的分離。GFP-融合蛋白已被用於定位和鑑定了許多擬南芥屬基因，包括狔腳6孖犪腳6嫪沽姿(GGPP)(Zhu等，Plant Mol.Biol.35(3)331-341(1997)。
失能基因有效的失能修飾的一個例子是在基因的起始處出現的產生翻譯閱讀移碼的單核苷酸缺失。該移碼使基因失能，導致無表達的基因產物，從而破壞該基因的功能性蛋白質生產。例如，如果未修飾的基因編碼一種蛋白酶，如果破壞該蛋白酶基因的調控區或編碼區則可能破壞該基因的蛋白酶生產。
除了通過缺失核苷酸引起翻譯閱讀移碼的失能基因外，通過可有效防止DNA編碼的蛋白質形成的包括在基因DNA內進行核苷酸的插入，取代，倒位或易位的其它技術進行失能修飾也是可能的。
通過使用特異性較小的方法失能基因也在本領域的技術人員的能力範圍內。特異性較小的方法的例子是使用諸如羥胺或亞硝基胍的化學誘變劑或使用諸如γ射線或紫外照射的放射誘變隨機突變基因。該突變株可能意外含有失能基因以致該基因不再能夠產生在任何一個或多個結構域有功能的蛋白質。通過常規篩選技術可檢測所需失能基因的存在。對於進一步的指導，參見美國專利號5,759,538。
反義編碼載體使用反義構建體，包括原位產生反義序列抑制植物中的表達的方法在例如，美國專利號5,107,065；5,254,800；5,356,799；5,728,926；和6,184,439中描述。後兩個專利的標題是「用於雜交種子生產的授粉控制的反義基因系統」。
可用於抑制植物中內源基因表達的其它方法也可在本方法中使用。例如，在雙螺旋基因的必需區形成三股螺旋可用於該目的。允許設計合適的單鏈參與者的三聯體密碼在本領域中也是已知的。(參見H.E.Moser，等，Science 238645-650(1987)和M.Cooney，等，Science 241456-459(1988))。含有嘌呤鹼基鏈的控制序列中的區域是特別有吸引力的靶。伴隨光致交聯形成的三股螺旋在例如，D.Praseuth，等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 851,349-1,353(1988)中描述。II.轉化A.植物轉化為了用常規方法導入一個所需基因或一組基因，需要進行兩個品系之間的有性雜交，然後重複雜種後代與一個親本之間的回交直到獲得具有所需特性的植物。然而，該方法局限於可有性雜交的植物且轉移除了所需基因之外的基因。
重組DNA技術通過允許植物遺傳學家鑑定和克隆諸如對昆蟲害蟲抗性的所需性狀的特定基因並將這些基因導入已經有用的植物品種中使得植物研究人員可以繞過這些限制。一旦將外源基因導入植物中，那麼該植物可在常規植物育種計劃中使用(例如，譜系繁殖，單種子家系育種計劃，交互反覆選擇)以產生還含有目的基因的後代。
基因可使用同源重組以定點方式導入。同源重組允許在內源基因上進行定點修飾，因此可改正遺傳性或獲得性突變，和/或可將新改變設計進基因組中。
植物中的同源重組和定點整合在美國專利號5,451,513；5,501,967和5,527,695中討論。
B.轉化方法生產轉基因植物的方法是本領域的普通技術人員所熟知的。現在轉基因植物可通過各種不同的轉化方法生產，該方法包括但不限於電穿孔；顯微注射；微粒轟擊，也稱為粒子加速或生物飛彈(biolistic)轟擊；病毒介導的轉化；和土壤桿菌屬介導的轉化(參見，例如美國專利號5,405,765；5,472,869；5,538,877；5,538,880；5,550,318；5,641,664；5,736,369和5,736369；Watson等，Recombinant DNA，Scientific American Books(1992)；Hinchee等，Bio/Tech.6915-922(1988)；McCabe等，Bio/Tech.6923-926(1988)；Toriyama等，Bio/Tech.61072-1074(1988)；Fromm等，Bio/Tech.8833-839(1990)；Mullins等，Bio/Tech.8833-839(1990)；和Raineri等，Bio/Tech.833-38(1990))。
通過許多這類方法已經生產了轉基因苜蓿植物，該方法包括但不限於土壤桿菌屬介導的轉化(Wang等，Australian Journal of Plant Physiology 23(3)265-270(1996)；Hoffman等，Molecular Plant-Microbe Interactions 10(3)307-315(1997)；Trieu等，Plant Cell Reports 166-11(1996))和粒子加速(美國專利號5,324,646)。
使用土壤桿菌屬介導的轉化在三葉草中已經成功地實現了轉化(Voisey等，Biocontrol Science and Technology 4(4)475-481(1994)；Quesbenberry等，Crop Science 36(4)1045-1048(1996)；Khan等，Plant Physiology 105(1)81-88(1994)；Voisey等，Plant Cell Reports 13(6)309-314(1994))。
在許多飼料和草皮草類中也已經報導了遺傳轉化(Conger B.V.GeneticTransformation of Forage Grasses in Molecular and Cellular Technologies forForage Improvement，CSSA Special Publication No.26，Crop Science Society ofAmerica，Inc.E.C.Brummer等編輯，1998，第49-58頁)。它們包括鴨茅(Dactylisglomerata L.)，葦狀羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)，紅羊茅(Festuca rubraL.)，草地羊茅(Festuca pratensis Huds.)，多年生黑麥草(Lolium perenne L.)，爬行翦股穎(Agrostis palustris Huds.)和小糠草(Agrostis alba L.)。
通過原生質體直接吸收DNA和通過用DNA包裹的微粒轟擊細胞或組織在這些飼料和草皮草類中實現了成功的基因轉移。在兩種情況下，轉移後進行整體植物再生。大量研究聚焦在開發和改進轉化方法上且使用了編碼葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的報導基因uidA和賦予對基於phosphinothricin的除草劑的耐受性的選擇標記bar。通過聚合酶鏈式反應(PCR)技術，對轉錄的RNA的Northern雜交分析，對可溶性蛋白質(基因產物)的Western印跡分析，和對總基因組DNA的Southern印跡雜交已經提供了轉化的證據。III.半合子性使用土壤桿菌屬轉化方法形成的轉基因植物一般在一個染色體上含有單個基因，儘管多個拷貝是可能的。該轉基因植物稱為對於加入的基因是半合子的。這種植物更精確的名稱是獨立的分離子，因為各轉化的植物代表了單個T-DNA整合事件(美國專利號6,156,953)。轉基因座一般通過存在和/或不存在轉基因來鑑定。一個等位基因相應於不存在轉基因的雜合子基因型也命名為半合子(美國專利號6,008,437)。
假定是正常的半合子，自交導致在第一代自交重組體，也稱為R1或R1代中最大程度的基因型分離。R1代是由自交原始重組體株系，也稱為R0或R0代產生的。由於各插入基因作為顯性等位基因起作用，在不存在連鎖且假定對於耐受性表達只需要一個半合子插入時，一個插入將分離成3∶1，兩個插入分離成15∶1，三個插入分離成63∶1，等。因此，需要繁殖相當少的R1植物以發現至少一種抗性表型(美國專利號5,436,175和5,776,760)。
如上所述，半合子轉基因再生植物的自花授粉應產生相當於F2的子代，其中大約25％應是純合子轉基因植物。自花授粉和F2代與未轉化的對照植物的測交可用於鑑定純合子轉基因植物和維持該品系。如果起始獲得的用於再生植物的後代來自異花傳粉，那麼，純合子轉基因植物的鑑定需要另外產生自體授粉(美國專利法5,545,545)。IV.半不育和遺傳性不育過濾A.配子體不育性狀(GST)GST可由兩個或三個元件組成性別特異性啟動子，自殺基因和任選的轉座子和/或轉座酶的編碼區。正常情況下，GST構建體以轉錄終止子元件終止。包含轉座子或轉座酶源對於選擇分散轉座的應用是特有的且對於消除轉基因傳播的目的不是必須使用的。
可使用的性別特異性啟動子包括但不限於來自玉米，水稻，西紅柿，菸草，擬南芥屬和芸苔屬的花粉特異性啟動子。一些其它的例子可在GenBank中找到。啟動子必須對一種性別(雄性或雌性)是特異性的且在同源染色體分離進不同細胞的減數分裂I期後特異性地啟動基因表達。
自殺基因用於殺死不需要的減數分裂產物。自殺基因包括但不限於芽孢桿菌RNA酶，雄花穗種子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因。使用自殺基因的兩個選擇包括1)使用反義RNA技術抑制對花粉或卵活力所必需的基因的表達；或2)不能通過一種性別傳播的突變，例如不進行花粉傳播的缺失。這兩種選擇都可用於實現半不育。
B.半不育和遺傳性不育過濾本發明人使用術語「半不育」和「遺傳性不育過濾」表達這樣的概念，即由於自殺基因表達局限於減數分裂I期後，當GST基因座是半合子且在減數分裂中正常分離時只有50％的配子被清除。這是由於這樣的事實，即當GST基因座以單個拷貝存在於基因組中(半合子狀態)時，自殺基因將傳播到大約一半的減數分裂產物中，導致50％的不育率。如果花粉特異性啟動子與自殺基因可操作地相連，那麼遺傳GST的花粉將不能存活。
產生50％的活花粉對於分散轉座的回收和/或防止轉基因傳播而不顯著影響雄性生育力是必需的。
C.配子體半不育本發明描述了使用諸如花粉半不育的配子體「半不育」技術產生消除遺傳了特定轉基因複合體的配子的「遺傳性不育過濾」。將花粉特異性啟動子插入GST中防止了在遺傳該轉基因複合體的花粉中與GST連接的轉基因的傳播。
該轉基因複合體也可含有轉座因子和/或轉座酶基因的發送位點。在這種情況下，轉基因複合體伴隨著轉座子供體位點和/或轉座酶的清除對消除鄰近的轉座同時富集與轉基因複合體重組或在整個基因組中分散(不再與GST相連)的轉座事件具有淨效應。該方法學克服了有助於大多數分散轉座定位的轉座子誘變策略的一些通常的局限。本發明極大地改進了通常使用的實現轉座子分散的負選擇標記(Sundaresan，V.，等，(1995)Genes Dev.9/141797-810；Tissier，A.F.等，(1999)The Plant Cell Vol.111841-1852)。而且，使用遺傳性不育過濾來消除轉座酶源的傳播可穩定子代中新轉座的元件，從而排除了妨礙突變鑑定的體細胞的或第二次的轉座事件。
半不育性狀及其相關的轉座子和/或轉座酶的特性依賴於自殺基因，啟動子，轉座子系統，和物種的選擇而詳細區別。然而應強調半不育性的相同基礎技術可用於在可以有性繁殖的單子葉植物和雙子葉植物的許多植物中，在諸如玉米，水稻，大豆，小麥，燕麥，大麥的物種中和在諸如動物和真菌的非植物系統中回收轉座。另外，清除小孢子的一個替代策略是通過構建大孢子自殺性狀消除轉基因複合體的雌性傳播。
半不育性狀用於消除攜帶諸如轉座子發送位點和/或轉座酶基因的特定染色體區的減數分裂產物(配子)。這種「遺傳性不育過濾」用於消除轉基因複合體的雄性或雌性傳播。該消除方法對富集未連鎖的(分散的)轉座因子或從發送位點重組的元件具有淨效應；也可用於同時消除諸如轉座酶基因的其它基因的傳播，從而穩定子代中的轉座。為了實現半不育，本發明包含許多優選的方法。一種方法依賴於指導自殺基因的小孢子特異性表達以殺死不需要的小孢子。通過使用與合適自殺基因融合的諸如花粉特異性啟動子的特異性啟動子，從而僅殺死遺傳了該基因融合體的減數分裂產物可完成該方法。對於半合子狀態中的單拷貝轉基因，這代表了50％的配子。由於花粉的生產極大地過量，因此將花粉生育力降低50％對隨後的種子生產沒有嚴重影響。
本發明與產生半不育相關的方面不同於本領域已知的致力於實現全部雄性不育用於雜交種子生產的早先方法。在這些方法中，目標是實現完全雄性不育以有利於雜交種子的商業生產。這通常涉及在孢子體中或在所有小孢子中表達自殺基因。例如，在絨氈層細胞中表達芽孢桿菌RNA酶導致全部雄性不育(Beals，T.P.等，(1997)The Plant Cell.Vol.91527-45)。在雜交種子生產中，花粉半不育不足以實現所需結果，即雄性不育(雌性)親本的異型雜交。如果小孢子特異性自殺基因及其相關元件以單拷貝存在於基因組中(半合子狀態)，那麼自殺基因將遺傳給大約一半的減數分裂產物，導致平均50％的半不育，一種商業上不能接受的雜交種子生產的活花粉生產率。對於本發明，50％的活花粉生產對於回收分散轉座和/或防止轉座酶傳播是必須和重要的。因此，配子體不育性狀用作清除不需要的基因組而同時允許其它基因組(非轉基因和含有轉座因子而不存在供體元件和/或轉座酶基因的基因組)傳播的過濾器。在一個實施方案中，本發明利用這種「遺傳不育性過濾器」消除含有轉座子發送位點和/或轉座酶源的轉基因複合體。V.育種方法開放性傳粉群體.諸如黑麥的農作物，許多種玉米和甜菜，草本草類，諸如苜蓿和三葉草的豆類，和諸如可可樹，椰子，油棕櫚和一些橡膠的熱帶樹農作物的開放性傳粉群體的改良基本上依賴於改變基因頻率以固定良好的等位基因而維持高度(但遠沒有達到最大)雜合性。在該群體中均一性是不可能的且在開放性傳粉品種中純合類型(trueness-to-type)是該群體作為一個整體的統計學特徵而不是單個植物的特性。因此，開放性傳粉群體的異質性與近交系，克隆和雜種的同質性(或基本上同種)形成對照。
種群改良方法自然分成兩類，基於純表型選擇，正常情況下稱為混合選擇的方法，和基於測試後代的選擇方法。種群間改良利用了開放性繁殖種群的概念；它允許基因從一個種群漂移到另一種群。一個種群(栽培種，株系，生態型，或任何生殖質源)中的植物與來自其它種群的植物通過天然(例如，風媒)或者通過人工或者通過蜜蜂(通常是Apis mellifera L.或Megachilerotundata F.)雜交。通過從兩種來源分離具有所需性狀的植物進行選擇以改良一種(或者有時是兩種)種群。
基本上有兩種主要的開放性傳粉種群的改良方法。第一種是通過選定的選擇程序全體改變種群的情況。結果是改良的種群通過以分離狀態在其自身群體內隨機交配可無限繁殖。第二種方法中，綜合品種達到與種群改良相同的最終結果但其自身不能進行類似的繁殖；它必須從親本株系或克隆重新構建。用於改良開放性傳粉種群的這些植物育種方法是本領域的技術人員熟知的且常規用於改良異花傳粉植物的育種方法的綜述在許多課文和文章中提供，包括Allard，Principles of Plant Breeding，John Wiley Sons，Inc.(1960)；Simmonds，Principles of Crop Improvement，Longman GroupLimited(1979)；Hallauer和Miranda，Quantitative Genetics in Maize Breeding，Iowa State University Press(1981)；和Jensen，Plant Breeding Methodology.John Wiley Sons，Inc.(1988)。
混合選擇.在混合選擇中，選擇所需的個體植物，收穫，種子不經過子代測試被混合以產生下一代。由於選擇僅基於母系親本，對傳粉不作控制，混合選擇等同於有選擇的隨機交配形式。如上所述，混合選擇的目的是增加種群中優等基因型的比例。
合成型.綜合品種通過在許多基因型之間雜交選擇在所有可能的雜種組合中較好的結合能力來產生，隨後通過開放性傳粉維持該品種。不論親本是否是(或多或少是近交的)種子繁殖的品系，在一些糖甜菜和菜豆(Vicia)或克隆中，在草本草類，三葉草和苜蓿中，原則上沒有區別。根據一般結合能力選擇親本，有時通過測交或頂交，更通常地是通過多向雜交。親本種子株系可以有意地進行近交(例如，通過自交或近親雜交)。然而，即使親本不有意近交，在品系維持期間品系內的選擇保證了發生一些近交。當然，克隆親本保持不變和高度雜合。
合成型是直接從親本種子生產劃分給農場主還是必須首先進行一個或兩個循環的增殖依賴於種子生產和種子所需的等級。在實踐中，草類和三葉草一般增殖一次或兩次且因此與原始合成型隔了相當多的世代。
儘管有時使用混合選擇，後代測試一般優選多向雜交，因為其操作簡單且與目標明顯關聯，即在合成型中利用一般組合能力。
進入合成型的親本株系或克隆的數目可廣泛變化。在實踐中，親本株系的數目從10到幾百，平均100-200。預期從100或更多克隆形成的廣譜合成型在種子繁殖期間比窄譜合成型更穩定。
雜種.雜種是不同基因型的親本之間雜交產生的個體植物。商品雜種現在廣泛用於許多農作物，包括玉米(玉蜀黍)，高梁，糖甜菜，向日葵和花椰菜。雜種可用許多不同的方法形成，包括兩個親本的直接雜交(單交雜種)，單交雜種與另一親本的雜交(三方或三重雜交雜種)，或者兩個不同雜種的雜交(四方或雙雜交雜種)。
嚴格地說，野外繁殖(即，開放性傳粉)的群體中的大多數個體都是雜種，但該術語通常專用於這樣的情況，即親本是其基因組對於將它們確定為不同的種或亞種為足夠清楚的個體。雜種可以是可育或者是不可育的，這取決於兩個親本基因組中的定性和/或定量區別。雜種優勢，或雜種活力通常與雜合性增加相關，它導致雜種的生長，存活，和生育的活力比用於形成該雜種的親本品系增大。最大雜種優勢通常通過雜交兩個遺傳上不同的高度近交系來實現。
雜種的生產是一種開發成熟的工業，它涉及親本株系和雜交這些品系產生的雜種的分離生產。對於雜種生產方法的詳細討論，參見例如，Wright，Commercial Hybrid Seed Production 8161-176，In Hybridization of Corp Plants，出處同上。VI.轉座子和轉座因子轉座子是能從供體染色體位點向相同染色體或不同染色體上的靶位點轉座(移動)的遺傳元件。轉座子通過插入編碼序列，內含子和啟動子中引起突變，通常完全消除靶基因的活性。轉座子引起的突變通常由隨後從基因中切除該轉座子而不穩定。轉座子的切除和整合需要一種或多種蛋白質，統稱為「轉座酶」。編碼其自身轉座酶源的轉座子稱為自主因子。提供另一位置的轉座酶可轉座不編碼轉座酶但含有終止序列，通常是轉座所需的反向重複序列的轉座子(非自主因子)。
A.Ds元件在一個優選的實施方案中，包含Ds元件以便含有轉座必需的終止序列(Coupland，G.，等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869385-8；Chatterjee，S.等，(1995)Mol Gen Genet.249281-8)，用於增強子缺失的與GUS報導基因融合的最小啟動子(-47 CaMV 35S啟動子)；在相反方向上，含有與增強螢光的，二元光譜GFP基因融合的剪接受體位點(Haseloff，J.，等，(1997)ProcNatl Acad Sci USA.942122-7；Haseloff，J.，等，(1999)Methods Mol Biol.122241-59；Haseloff，J.(1999)Methods Cell Biol.58139-51)用於基因捕獲目的。該Ds元件可用於篩選相對於靶基因轉錄在一個插入方向的增強子陷阱或者在另一方向的基因陷阱。使用Ds的第二個實施方案取代了在Ds元件一端的轉錄激活物以產生獲得功能的突變。兩種元件都含有位點特異性重組的lox P位點(Osborne，B.I.，等，(1995)7687-701；Medberry，S.L.，等，(1995)Nucleic Acids Res.23485-90；Qin，M.，等，(1994)Proc Natl Acad Sci USA 911706-10)和用於除草劑(Finale)的bar基因(Thompson，C.J.，等，(1986)EMBOJ.62519-23)用於組織培養和土壤選擇。Finale是glufosinate除草劑的註冊商標。
B.植物中的轉座子和插入突變的用途轉座子在細菌，真菌，植物和動物基因組的遺傳分析和功能性基因組分析中具有巨大實用性。在植物中，遺傳改造的轉座子已被成功導入一些物種中(作為綜述，參見Sundaresan，V.(1996)Trends Plant Sci.Vol.1184-190)，包括水稻(Izawa，T.等，(1997)Plant Mol Biol Vol.35/1-2219-29)，菸草，擬南芥屬，萵苣和一些其它物種。一些研究者提出了巧妙的方法以增強回收轉座事件的效率，包括對轉座的正選擇方法(Fedoroff，N.V.等，(1993)PlantJ.Vol.3273-289；Honma，M.A.等，(1993)Proc Natl Acad Sci USA Vol.90/136242-6)，對未連鎖的元件的選擇(Tissier等，(1999)The Plant Cell Vol.111841-1852；W.R.Sundaresan，等，(1995)Genes Dev.9/141797-810)，在整個基因組中分散的發送位點(Cooley，M.B.等，(1996)Mol Gen Genet Vol.252/1-21 84-94，Knapp，S.等，(1994)Mol Gen Genet Vol.243/6666-73；Osborne，B.I.等，(1991)Genetics Vol.129/3833-44；Takken，F.L.等，(1998)Plant J Vol.14/4401-11，Thomas，C.M.等，(1994)Mol Gen Genet Vol.242/5573-85；van der Biezen，E.A.等，1996 Mol Gen Genet Vol.251/3267-80)和向元件中加入諸如增強子和基因陷阱的特徵(作為綜述，參見Sharknes，W.C.，(1990)Biotechnology 8827-831；W.R.；Sundaresan，等，(1995)Genes Dev 9/141797-810)和轉錄激活(Fritze，K.等，(1995)Methods Mol Biol Vol.44281-94；Kakimoto，T.，(1 996)Science Vol.274/5289982-5；Kardailsky，I.，等，(1999)Science Vol.286/54461962-5)。
儘管在轉座子應用中產生了巨大進展，但它們仍然局限於功能性基因組分析。轉座通常發生在染色體內，且通常發生在供體和靶位點之間的短物理距離內(Moreno，M.A.等，(1992)Genetics Vol.131939-956；Athma，P.等，(1992)Genetics Vol.131199-209)。這種限制意味著大多數新插入發生在圍繞具有許多發現在整個基因組中隨機分散的較小元件的供體位點(發送位點)的區域。其次，轉座過程通常不受控制，導致出現很多不遺傳給後代的體細胞插入，和與生殖遺傳事件不一致的發育早期轉座。不能控制在體細胞中和暫時性的轉座可導致由於體細胞和生殖突變事件之間不相符而產生的目的基因假陽性插入的高背景。
C.目前回收分散轉座的背景技術方法目前可利用兩種方法部分克服非分散轉座的限制。一個方法利用了遍及基因組的第一分散轉座子發送位點。然而，該方法需要大量轉基因起始品系以實現廣泛的基因組覆蓋度。分散轉座事件的第二種方法是採用負選擇標記，例如iaaH，pehA，R404，或胞嘧啶脫氨酶基因以對含有轉座子和/或轉座酶的供體位點進行選擇。對供體元件的選擇也對鄰近(連鎖的)的轉座進行了選擇導致富集未連鎖的轉座。在擬南芥屬中已使用負選擇以回收未連鎖的Ds和Spm轉座(W.R.；Sundaresan，等，(1995)Genes Dev.9/141797-810；Tissier，A.F.，等，(1999)The Plant Cell Vol.111841-1852)且兩個負選擇標記以除草劑前體的轉化為基礎(O′keefe，D.P.等，(1994)Plant Physiol Vol.105473-482；Dotson，S.B.等，(1996)The Plant Journal Vol.10/2383-392)，它是一種理論上適用於土壤選擇的方法。
然而，使用負選擇標記對大量獨立轉座的回收強加了嚴重的限制。首先，一些這類標記需要使用以組織培養為基礎(W.R.；Sundaresan，等，(1995)Genes Dev.9/141797-810)的轉座(Fedoroff，N.V.等，(1993)Plant J.Vol.3273-289)，它是一種給回收大量分散轉座的方法增加了大量的花費和時間的勞動密集型過程。第二，負選擇以化學試劑排除攜帶連接元件或轉座酶或者兩者的後代為基礎(Tissie r，A.F.，等，(1999)The Plant Cell Vol.111841-1852；W.R.；Sundaresan，等，(1995)Genes Dev.9/141797-810)。當種子數量有限時，後代排除可能會成問題。例如，在諸如水稻(Orza sativa)的一種主要自花傳粉物種的植物中，異型雜交單調且耗時，極大地限制了容易獲得的後代數目。因此，如果轉座率低且未連鎖的轉座代表了少數轉座事件時，使用負選擇回收分散轉座將是昂貴且不現實的。例如，由於轉座率為1-5％，50％發生減數分裂分離，且僅30％是未連鎖轉座，因此通過異型雜交回收10,000個轉座需要評估幾百萬株後代植物。最後，使用諸如除草劑前體的負選擇試劑具有嚴重的環境影響且由於使用化學試劑需要選擇大量攜帶分散轉座的後代而花費昂貴。而且，大多數這類化學試劑未批准野外使用。VII.轉座酶花表達的轉座酶與使用轉座子進行誘變，基因標記和功能性基因組分析相關的另一限制是對轉座過程缺乏發育上和時間上的控制。在大多數情況下，在其自身啟動子控制下或在組成型啟動子控制下的轉座酶基因表達發生在植物的生長發育期間。轉座酶源的營養性表達導致體細胞轉座。只有當這些體細胞譜系隨後產生大孢子或小孢子時才將這些轉座遺傳給後代(生殖性轉座)。由於兩個原因這是有問題的。一個原因是發生在生長性或早期生殖性發育期間的轉座可以進行克隆繁殖且隨後傳遞進許多配子中，導致在後代中回收到大量非獨立性元件。當功能基因組分析或基因標記需要大量獨立轉座時這是不希望的。第二，體細胞轉座通常不包括產生配子的譜系，例如發生在表皮細胞譜系或終端營養性結構中的那些轉座。這些轉座從未進行減數分裂遺傳且因此在後代中回收不到。這樣是有問題的，因為這些體細胞事件可在組織DNA樣品中作為突變被假性鑑定，而在後代中回收不到。當突變篩選是基於樣品化學的PCR時尤其有問題(Tissier，A.F.，等，(1999)ThePlant Cell Vol.111841-1852；McKinney，E.C.，等，(1995)Plant J.Vol.8613-622；Krysan，P.J.等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.938145-8150；Frey，M.等，(1997)Science Vol.277696-699)。
在本發明的另一實施方案中，為了最小化體細胞轉座的問題，將轉座酶基因置於花特異性啟動子的控制下，該啟動子在花的表皮下細胞譜系中啟動基因表達導致產生小孢子和大孢子。該啟動子包括在諸如隱花基因(agamous)，無花瓣基因(apetala)1，無花瓣基因2，無花瓣基因3，雌蕊基因(pistillate)的基因中發現的那些啟動子，和在諸如玉米和水稻的其它植物物種中發現的其同系物。例如，無花瓣基因3的啟動子啟動發育中的花分生組織的花瓣和萼片原基細胞中報導基因的表達。在ap3啟動子控制下的轉座酶表達導致轉座局限於花發育，且當在產生小孢子的細胞譜系中發生時，這些事件將遺傳給下一代。以該方法控制轉座具有兩種效應1)它關閉體細胞轉座；和2)當從許多不同的花分生組織產生花粉時它導致大量獨立的轉座。因此，可取樣體細胞組織而不需考慮體細胞轉座或二級轉座，各花分生組織變成轉座事件的獨立來源。VIII.水稻-一種模式植物系統A.美國和全世界的水稻農業大約一半的世界人口主要從水稻獲取熱量。全世界每年的生產水平超過4億公噸，在超過2億公頃的土地上生長(不記名的(2000)美國農業部世界農業供給和需求估計。美國農業部農業市場服務處。
發明者史蒂芬·L·德拉波塔, 瑪麗亞·A·莫雷諾 申請人:耶魯大學