一種融合蛋白及其編碼基因與其在抗植物真菌病害中的應用的製作方法
2023-10-27 20:26:32 1
專利名稱：一種融合蛋白及其編碼基因與其在抗植物真菌病害中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種融合蛋白及其編碼基因與其在抗植物真菌病害中的應用。
背景技術：
真菌病害是植物病害中研究最早和種類最多，其中可以為害植物的近3萬種，很多都可以造成嚴重的危害。因此通過基因工程手段獲得廣譜抗真菌的種質將極大的促進農業生產及消除病害的防治時施用農藥帶來的環境汙染。
植物對病原菌的免疫可以分為兩個層次第一層為病原相關分子模式，(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)激發的免疫性 (PAMP-triggeredimmunity, PTI),即植物通過細胞表面模式識別受體(pattern recognitionreceptors, PRRs)對病原菌的PAMPs進行分子識別，從而啟動植物的防衛反應，這種反應被定義為植物的基礎抗(basal disease resistance),也稱為基礎免疫(basal immunity);第二層為病原菌效應子激發的免疫性(effector triggered immunity, ETI),即有些毒性強的病原菌通過產生效應子(effectors)來抑制PTI,從而突破植物的第一道防線，而植物又進化出新的分子受體(例如R基因編碼的NBS-LRR蛋白質) 以偵察病原菌效應子並啟動第二道防衛反應。數億年來，病原菌的侵染和植物的防衛交替進行，促進了病原菌和植物基因組的共進化。Brutus等認為PAMPs在病原菌中都是基本的、 保守的成分，因此與效應子激發的免疫反應相比較，由PAMPs所引起的基礎免疫反應將可能獲得更廣譜與持久的抗性。
真菌幾丁質也是一種PAMPs分子，目前已從水稻中分離出結合幾丁質的模式識別受體基因CEBiP，其編碼的跨膜糖蛋白含有兩個胞外LysM結構域，但是缺乏胞內激酶域， 而水稻中的另一個幾丁質識別受體OsCERKI卻是一個跨膜受體激酶，並與CEBiP協同進行幾丁質識別信號傳導。Chen等詳細分析了水稻幾丁質識別受體OsCERKI在成熟、運輸、質膜定位及識別幾丁質信號等方面的蛋白網絡。
Xa21是一個受體激酶(receptor-like kinases, RLKs),在體內通過識別並結合細胞外受體的相應功能區，引起受體的磷酸化，從而激發其下遊一系列信號的傳導。有意思的是，Xa21還可以通過更換其胞外受體結構域，識別相應的配體激發Xa21所引起的防衛反應。He等把油菜素內酯酯(Brassinosteroids, BR) BRII的LRR-JM結構域與XA21的絲氨酸/蘇氨酸激酶重組構建了一個嵌合受體的信號傳導系統。當用油菜素內酯處理水稻細胞株時，這個嵌合受體可以引發與XA21相同的植物防衛反應。選用幾丁質有強結合能力的受體與Xa21構建嵌合受體，不僅可能獲得對稻瘟病更強的抗性，還可能獲得對其他真菌更廣譜的抗性。OsCERKI是水稻中另一個幾丁質識別受體,Shimizu等通過研究認為OsCERKI比 CEBIP在幾丁質的信號傳導過程發揮著更為重要的作用。因此通過OsCERKI的識別幾丁質的受體區結構域與M21的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域重組構建的嵌合基因的轉基因植株可能獲得對真菌的廣譜抗性。發明內容
本發明的一個目的是提供一種融合蛋白及其編碼基因。
本發明提供的一種融合蛋白，名稱為0sCERKl_Xa21 ;是如下(a)或(b)
(a)由序列表中序列3所示的胺基酸序列組成的蛋白質；
(b)將序列表中序列3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列3衍生的蛋白質。
上述融合蛋白中，所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多於十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
編碼上述蛋白的多核苷酸也是本發明保護的範圍。
上述多核苷酸是如下(1)-(4)中任種的DNA分子
(I)序列表中序列I所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關蛋白的DNA分子；
(4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物抗病性相關蛋白的DNA分子。
上述嚴格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然後用 2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。
序列表中序列I所示的DNA分子包括蔗糖合酶I啟動子、水稻幾丁質識別受體 OsCERKI和Xa21的胞內結構域；序列表中序列I所示的DNA分子的編碼基因為序列表中的序列2 ;該基因編碼的蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列3。
含有上述多核苷酸的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的範圍。
上述重組載體為將編碼上述蛋白的多核苷酸插入表達載體中，得到表達上述蛋白的重組載體。上述重組載體具體為將序列表中的序列I插入PCAMBIA1300的Kpn I和SalI 位點間得到的載體。
擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發明保護的範圍。
上述蛋白、上述多核苷酸或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調節植物抗病性中的應用也是本發明保護的範圍；
在上述應用中，所述調節植物抗病性為提高植物抗病性；所述病為由真菌引起的病；所述由真菌引起的病具體為稻瘟病或紋枯病；所述稻瘟病的病原菌具體進一步為稻梨孢菌(Pyricularia oryae Cav.);所述紋枯病的病原菌具體進一步為立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani Kiihn)；
在上述應用中，所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物進一步具體為水稻。
本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
本發明提供的方法，為將編碼上述蛋白的多核苷酸導入目的植物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物的抗病性高於所述目的植物。上述方法中，所述病為由真菌引起的病；所述由真菌引起的病具體為稻瘟病或紋枯病；所述稻痕病的病原菌具體進一步為稻梨孢菌(Pyricularia oryae Cav.);所述紋枯病的病原菌具體進一步為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)。上述方法中，編碼上述蛋白的多核苷酸通過上述的重組載體導入目的植物；所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物進一步具體為水稻。本發明的實驗證明，本發明發現了一種融合蛋白，將含有該融合蛋白的編碼基因的片段通過植物表達載體導入水稻中，獲得轉基因水稻；接種真菌紋枯病病原菌或稻瘟病 病原菌，發現轉基因水稻具有高度抗性；說明可以利用本發明的融合蛋白培育廣譜抗真菌的水稻，對農業生產具有重要意義。
圖I為部分轉0sCERKl_Xa21水稻的分子檢測圖2為部分轉0sCERKl_Xa21水稻抗紋枯病與稻瘟病鑑定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、融合蛋白及其編碼基因與含有編碼基因的載體的構建I、鹿糖合酶I啟動子的獲得以水稻品種明恢63(記載在如下文獻中謝華安.明恢63的選育與利用，福建農業學報,1998, 13⑷1-6 ;公眾可從海南大學和中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)為實驗材料，提取其葉片總DNA，以此DNA為模板，以SpecialF-KpnI (5 』gggagctcctccttcattttcagtgcaaatg 3 ')和SpecialR-BamHI(5，gggtaccccaatggtggtcagagacgag 3 』 )為引物，PCR擴增水稻蔗糖合酶I啟動子片段(命名為pRSUSl)。PCR反應條件先94°C預變性4min ;然後94°C變性45S ;56°C退火45S ;72°C延2min，共29個循環；最後72°C延伸IOmin0對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約1700bp左右的片段。回收該1700bp左右的片段，連接到T-easy載體(購於Promega公司，產品號A1360)上，獲得重組載體命名為T-pRSUSl。對T-pRSUSl進行測序；1700bp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列I自5』末端第1-1727位核苷酸，即為蔗糖合酶I啟動子。2、水稻幾丁質識別受體OsCERKI胞外結構域片段的獲得提取水稻品種臺北309(記載在如下文獻中曹孟良.農桿菌介導的水稻高效遺傳轉化體系的建立；湖南農業大學學報，1999，25 (5) =349-356 ;公眾可從海南大學和中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)，以下也稱為野生型水稻，葉片所提取總RNA，反轉錄成cDNA,以此 cDNA 作為模板 OsCERKlF-BamHI (5 ; TAGGATCCATGGAAGCTTCCACCTCCCTC 3 ;)與 OsCERKlR-BamHI (5 ; TAGGATCCTATGATATACAAGAAGATGGC 3 ;)為引物，PCR 擴增水稻幾丁質識別受體OsCERKI片段(命名為OsCERKI )。
PCR反應條件 先94°C預變性4min ;然後94°C變性45S ;56°C退火45S ;72°C延lmin，共29個循環；最後72°C延伸IOmin0
對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約800bp左右的片段。回收該800bp左右的片段，連接到T-easy載體上，獲得重組載體命名為T_0sCERKl。對T-OsCERKI進行測序，SOObp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列I自5』末端第1728-2513位核苷酸所示，為幾丁質識別受體OsCERKI片段。3、水稻抗白葉枯病基因Xa21胞內結構域片段的獲得以中國科學院遺傳與發育生物學研究所翟文學課題組擁有的攜有Xa21基因組DNA的質粒pDBXa21 (記載在如下文獻中夏志輝等.無選擇標記和載體骨幹序列的Xa21轉基因水稻的獲得，生物工程學報，2006, 22 (2) =213-218 ；公眾可從海南大學和中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)作為模板，Xa21F-BamHI(5 ; TAGGATCCCACAAGAGAACTAAAAAGGG 3 ')與 Xa21R_SalI(5 ;ATGTCGACGTGAGTCAAGTAGAGACATG3 ;)為引物，PCR擴增Xa21的胞內結構域片段(命名為Xa21)。PCR反應條件先94°C預變性4min ;然後94°C變性45S ;56°C退火45S ;72°C延3min，共29個循環；最後72°C延伸IOmin0對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約2700bp左右的片段。回收該2700bp左右的片段，連接到T-easy載體上，獲得重組載體命名為T_Xa21。對T_21進行測序，2700bp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列I自5』末端第2514-5199位核苷酸，為Xa21的胞內結構域片段。4、重組載體的構建將T-pRSUSl與適用於農桿菌轉化的雙元載體pCAMBIA1300(購於CAMBIA公司)分別用KpnI和BamHI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳回收1700bp左右的pRSUSl片段和9K左右的pCAMBIA1300大片段，經連接、轉化、鑑定後獲得重組質粒命名為pCAMBIA1300-pRSUSl ；再用BamHI 分別單酶切 T-OsCERKI 和 pCAMBIA1300_pRSUSl，回收 800bp 左右的OsCERKI片段和10. 7Kb左右的pCAMBIA1300_pRSUSl載體片段，經連接、轉化、鑑定方向後獲得重組質粒命名為 pCAMBIA1300-pRSUSI-OsCERKI ；用BamHI和Sal I分別雙酶切載體T_Xa21，回收2700bp左右Xa21片段與11. 4Kb的pCAMBIA1300-pRSUSI-OsCERKI的載體大片段，經連接、轉化、鑑定方向後獲得重組質粒命名為p0sCERKl-Xa21，為重組載體。經過測序，重組載體P0sCERKl-Xa21為將序列I所示的核苷酸插入pCAMBIA1300的Kpn I和Sal I位點間得到的載體。上述序列I所示的DNA分子包括蔗糖合酶I啟動子、水稻幾丁質識別受體OsCERKI和Xa21的胞內結構域；其中，蔗糖合酶I啟動子為序列表中序列I自5』末端第1-1727位核苷酸；水稻幾丁質識別受體OsCERKI為序列表中序列I自5』末端第1728-2513位核苷酸；Xa21的胞內結構域為序列表中序列I自5』末端第2514-5199位核苷酸。序列I所示的DNA分子的編碼基因0sCERKl_Xa21為序列表中的序列2 ;該基因編碼的蛋白命名為融合蛋白0sCERKl-Xa21 ;該融合蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列3。實施例2、轉0sCERKl_Xa21水稻的獲得及功能鑑定
I、轉 OsCERKI-Xa21 水稻的獲得將重組載體P0sCERKl-Xa21轉入農桿菌LBA4404 (寶生物工程(大連)有限公司產品號D9115)中，得到LBA4404/p0sCERKl-Xa21 (提取質粒，送去測序，質粒為p0sCERKl-Xa21，則含有該質粒的農桿菌為 LBA4404/p0sCERKl_Xa21 )。將重組農桿菌LBA4404/p0sCERKl-Xa21導入到水稻臺北309 (簡寫成TP309)中，得到Ttl代轉0sCERKl-Xa21水稻；轉基因方法參照Toki S的快速轉化方法(TokiS等.2006. Early infection of scutelIum tissue with Agrobacterium allowshigh-speedtransformation of rice. Plant. J. 47 (6) :969-76);具體如下I)、預培養 (I)去殼種子用70%乙醇浸30秒，無菌水衝洗2-3次； (2)30% NaClO(原液為有效氯 10% )浸 30min ；(3)重複步驟2，無菌水衝洗3-5次；(4)滅菌後的種子接種於N6D培養基上，32°C持續光照培養5天。2 )、農桿菌侵染及轉化苗篩選(I)帶相應載體的農桿菌 LBA4404/p0sCERKl-Xa21 在 YEB+Rif (25_50mg/L) +Kan(50mg/L)培養基上28°C暗培養2_3天，挑單菌落於3_5mLYEB+Kan+Rif培養基中，28°C暗搖床中培養約24 - 36h至OD=O. 6左右，取500uL接於50mLAAM培養基中，過夜培養至 0D600 約 0. I ;(2)愈傷浸於農桿菌菌液中，120rpm輕輕晃動約20min，然後靜置IOmin ;倒掉菌液，將愈傷置於無菌濾紙上吸去多餘菌液，吹乾；(3)愈傷接於N6D-As (添加IOOuM的乙醯丁香酮)培養基，培養基上預先墊一層浸有AAM (0. 5毫升即可)的無菌濾紙；(4)25 °C 共培養 3 天；(5)共培養後的愈傷先用無菌水衝洗2-3次用，再用含500mg/L羧苄的無菌水衝洗2-3次，並用之浸泡30分鐘左右(若浸染愈傷的菌液濃度0D600>0. 1，可將浸泡時間增加到I小時左右，30分鐘左右更換一次)，以徹底去除農桿菌；(6)無菌濾紙上吸去水分，並吹乾，接種於含50mg/L潮黴素B和400mg/L羧苄的N6D培養基上32°C持續光照培養兩周；(7)將生長旺盛的愈傷轉移到含50mg/L潮黴素B和250mg/L羧苄的RE-III培養基上32°C持續光照培養誘導分化。愈傷變綠後很快就會分化出幼苗；98)轉移分化出的幼苗至含50mg/L潮黴素B和200mg/L羧苄的HF培養基上誘導生根，得到Ttl代轉0sCERKl-Xa21水稻。以Ttl代轉0sCERKl_Xa21水稻為模板，以hptF和hptR為引物進行PCR擴增檢測潮黴素基因hpt是否整合到水稻基因組；以Xa21SF和Xa21SR為引物進行PCR擴增檢測目標基因片段是否整合到水稻基因組；hptF5' -TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'；hptR 5' -TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'；Xa21SF:5' -CTACATGAACTGATGGAGGAG-3'；Xa21SR:5' -CCATACTCTGTTTGAGCAGGA-3'。
結果如圖I所示，其中，A圖為潮黴素基因hpt的PCR分子鑑定；B圖為目標基因的鑑定；1-13為Ttl代轉OsCERKI-Xa21水稻，Positive CK (陽性對照)為重組載體p0sCERKl-Xa21，陰性對照為TP309對照；可以看出，圖IA中得到845bp且對應的圖2B中得到574bp為陽性轉基因植株，共獲得38個陽性Ttl代轉0sCERKl-Xa21水稻。
採用同樣的方法將空載體PCAMBIA1300接種到野生型水稻中，得到轉空載體水稻。2、轉0sCERKl_Xa21水稻的抗病性研究將10個陽性Ttl代轉0sCERKl_Xa21水稻後代和水稻臺北309對照(也稱為野生型水稻)，移栽到海南大學農學院基地，每個株系100株，隨機分成2組，實驗組和對照組，每組設3個小區。以轉空載體水稻為對照。I)稻瘟菌培養及接種方法稻痕病的病原菌為子囊菌亞門Magnaporthe grisea (Hebert) Barr,其無性世代為半知菌亞門真菌灰梨孢屬Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.;有性態為稻梨孢菌Pyricularia oryae Cav.。接種稻梨孢菌(Pyricularia oryae Cav. )ZB15(記載在如下文獻中譚向紅等.秈稻品種地谷抗稻瘟病基因的遺傳，遺傳學報，2000，27(8) =701-705 ;公眾可從海南大學和中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)於米糠培養基上(米糠40g/L，瓊脂粉15g / L，PH 7.0)，置於25-28°C培養一周，待菌絲長滿整個培養皿後，用無滅塗布器刮擦菌絲，然後用無菌沙布蓋住培養皿，25-28°C光下培養3天誘導產孢，鏡檢發現有大量孢子產生時，用無菌水把孢子洗脫下來，調節稻瘟病原菌孢子懸浮液濃度至IO5個孢子/ mL。通過注射法將稻瘟病原菌孢子懸浮液接種到植株中，接種5d當病斑長度明顯而穩定時進行調查，每一植株調查三個分蘗。實驗重複三次，結果取平均值。上述植株分別為10個陽性Ttl代轉OsCERKI-Xa21水稻、10個水稻臺北309對照(也稱為野生型水稻；TP309)和10個轉空載體水稻。觀察表型，結果如圖2A所示，10個水稻臺北309接種稻瘟病菌後均產生病斑，且約有20%(平均值)的葉面積被病斑覆蓋；10個陽性Ttl代轉P0sCERKl-Xa21水稻中有4個株係為無病斑(對應圖2A陽性Ttl代轉P0sCERKl-Xa21水稻株號的1、3、4、5號)；另有3株株系只有少量病斑(對應圖2A陽性Ttl代轉P0sCERKl-Xa21水稻株號的2、6、7號)，不超過5%(平均值)的葉面積被病斑覆蓋；可以看出陽性Ttl代轉P0sCERKl-Xa21水稻對稻瘟病高度抗性。野生型水稻與轉空載體水稻的結果無顯著差異。2)紋枯病菌培養及接種方法紋枯病的病原菌為擔子菌亞門真菌的瓜亡革菌Thanatephoruscucumeris(Frank)Donk.,其無性態為立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kiihn,屬半知菌亞門真菌。接種立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)C30 (記載在如下文獻中陳夕軍等.水稻紋枯病寄主-病原物互作鑑別品種與菌株的篩選，植物病理學報，2009，39 (5)514-520 ;公眾可從海南大學和中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)接種在PDA培養基上(馬鈴薯300g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15-20g/L，PH 7. 0)，置於28°C培養至菌絲長滿整個培養皿後，再切開0. 3*0. 3cm的小菌塊置於裝有新鮮的PDA培養基上(每皿3塊)，然後將剪成0. 8-1. Ocm的無菌木質牙籤，鋪放在已經放置了菌塊的PDA培養皿上，接菌培養3天，待菌絲密集地布滿培養皿時，田間用鑷子將短牙籤嵌入植株自上向下第3葉葉鞘內側，使葉鞘包莖狀態不變.並在相應的葉片上做好標記。每株接種3個莖杆。上述植株分別為10個陽性Ttl代轉OsCERKI-Xa21水稻、10個水稻臺北309 (也稱為野生型水稻)和10個轉空載體水稻。紋枯病接種結果如圖2B所示，10個水稻臺北309接種紋枯病菌後均產生病斑，且在葉鞘上的病斑離接種部位的長度超過8cm (平均值)；10個陽性Ttl代轉P0sCERKl-Xa21水稻中有I個株係為無病斑(對應圖2B陽性Ttl代轉P0sCERKl-Xa21水稻的I號)；5個株系只有少量病斑(對應圖2B陽性Ttl代轉P0sCERKl-Xa21水稻的2、3、4、5、7號)，在葉鞘上的病斑離接種部位的長度都在Icm以下；可以看出陽性Ttl代轉P0sCERKl-Xa21水稻對紋枯病菌高度抗性。野生型水稻與轉空載體水稻的結果無顯著差異。
權利要求
1.一種融合蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列3所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列3衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求I所述蛋白的多核苷酸。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特徵在於所述多核苷酸是如下(I)-(4)中任一一種的DNA分子 (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)序列表中序列2所示的DNA分子； (3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關蛋白的DNA分子; (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物抗病性相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述多核苷酸的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特徵在於 所述重組載體為將編碼權利要求I所述蛋白的多核苷酸插入表達載體中，得到表達權利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
7.權利要求I所述蛋白、權利要求2或3所述多核苷酸或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調節植物抗病性中的應用； 所述調節植物抗病性具體為提高植物抗病性；所述病為由真菌引起的病；所述由真菌引起的病具體為稻瘟病或紋枯病；所述稻瘟病的病原菌具體進一步為稻梨孢菌(Pyricularia oryae Cav.);所述紋枯病的病原菌具體進一步為立枯絲核菌(Rhizoctoniaso Iani Kiihn)； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物進一步具體為水稻。
8.一種培育轉基因植物的方法，為將編碼權利要求I所述蛋白的多核苷酸導入目的植物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物的抗病性高於所述目的植物。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述病為由真菌引起的病；所述由真菌引起的病具體為稻瘟病或紋枯病；所述稻瘟病的病原菌具體進一步為稻梨孢菌(Pyriculariaoryae Cav.);所述紋枯病的病原菌具體進一步為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特徵在於 編碼權利要求I所述蛋白的多核苷酸通過權利要求4或5所述的重組載體導入目的植物； 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物進一步具體為水稻。
全文摘要
本發明公開了一種融合蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供的融合蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列2衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明發現了一種融合蛋白，將含有該融合蛋白的編碼基因的片段通過植物表達載體導入水稻中，獲得的轉基因水稻；接種真菌紋枯病病原菌或稻瘟病病原菌，發現轉基因水稻具有高度抗性；說明可以利用本發明的融合蛋白培育廣譜抗真菌的水稻，對農業生產具有重要意義。
文檔編號A01H5/00GK102978178SQ20121048911
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者夏志輝, 翟文學, 李明容, 曹玉鑫, 花龍, 黃惜 申請人:海南大學, 中國科學院遺傳與發育生物學研究所