包含纖連蛋白結合蛋白或纖連蛋白結合肽的疫苗組合物的製作方法

2023-10-18 08:19:54

專利名稱：：包含纖連蛋白結合蛋白或纖連蛋白結合肽的疫苗組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結合結構域；以及至少一種iscom基質複合物和/或脂質體和/或至少一種脂質和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質和至少一種皂苷可處於複合物、溶液或者懸液之中。另外，本發明還涉及其在製備抗包含至少一個纖連蛋白結合結構域的微生物的疫苗中的用途。本發明還涉及其部件中包括至少兩個區室的試劑盒，其中一個區室包含至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或纖連蛋白結合肽，其包含至少一個纖連蛋白結合結構域，並且另一個區室包含使用說明和/或iscom基質複合物和/或iscom複合物和/或脂質體。此外，本發明涉及動物疫苗接種的方法。
背景技術：
：SA是一種病原體，其幾乎在所有哺乳動物物中引起疾病。SA是在牛、綿羊和山羊物種中的重要病原體，其在遍及全世界的乳業養殖類包括牛、綿羊和山羊(家畜)在內的飼養中引起疾患以及很大的經濟損失。SA誘發的乳腺炎也許是獸醫領域中單個最重要的經濟負面因素，這是由於其致病性造成的，包括嚴重的急性和疼痛炎症、慢性和持久性病況以及難於高效治療，這主要基於因抗性導致淘汰而可能無用的抗生素。替代方案是接種疫苗，但是迄今為止沒有發現高效的疫苗，疫苗接種可以構成對抗由SA引發乳腺炎的基礎。有幾種病原性因子對於期望的抗SA感染保護性疫苗需要克服。例如，SA將抗原"隱藏"在對於感染和其存活所必需的細胞中。此外，SA具有操縱宿主免疫系統以輔助細菌生存的能力。這種複雜的情形是不能獲得抗乳腺炎的高效SA疫苗的一個原因。操縱並可以下調宿主免疫應答的SA組分包括分泌產物比如a-和(5-毒素、殺白細胞素。同樣涉及細胞結合組分比如超抗原和蛋白質A。細菌躲藏其感染的宿主免疫系統的必需結構的實例是纖連蛋白結合蛋白(FnBp)或者外部纖維蛋白因子(Ebf)，其對於SA粘附至組織例如傷口是必需的。已經從不同的革蘭氏陽性細菌中分離並表徵了幾種識別粘性基質分子的纖連蛋白結合性微生物表面組分。已經克隆並測序了來自金黃色葡萄球菌(""/^/ococcws做m/s)(Signasetal.,"NucleosidesequenceofthegeneforafibronectinbindingproteinfromStaphylococcusaureus:Useofthispeptidesequenceinsynthesisofbiologicallyactivepeptides,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:699-703，1989)、釀膿鏈球菌(5^印tococcws/;"gertes1)(Talayetal""Fibronectin國bindingproteinofStreptococcuspyogenes:Sequenceofthebindingdomaininvolvedinadherenceofstreptococcitoepithelialcells,"Infect.Imm叫60:3837-3844，1992.;Hanskyetal.Infect.Immun.，60:5119-5125,1992)和停乳鏈球菌(5"加/^occms辦sgfl/flWae)(Lindgrenetal，"Twodifferentgenescodingforfibronectin-bindingproteinsfrom5^ep^cflcc"sdysgalactiae—thecompletenucleotidesequencesandcharacterizationofthebindingdomains,"Eur.J.Biochem,214:819-827，1993.)的編碼識別粘性基質分子的纖連蛋白結合性微生物表面組分的基因。所推導的M^列顯示出它們具有非常相似結構構造的60-100kDa蛋白質。N端信號序列的後面是一長段獨特序列，在某些情況中其被兩拷貝約30個JL&酸長的片段中斷。配體結合位點',位於富含脯氨酸結構域的N端，據信其將所述蛋白質錨定於細胞壁中。該結構域後接著是作為細胞壁把向信號的序列LPXTGX(Schneewindetal"Science,268:103-106，1995.etal"1995)，一段代表跨膜單元的疏水殘基以及含有一簇正電荷殘基的短C端細胞質結構域。無乳鏈球菌(iS^cptococcMS"^i/flf"Zfle)和乳房鏈球菌(iS^eptococcMS1w6m's1)以及凝固酶陰性葡萄球菌具有相似的纖連蛋白結合裝置並且對牛和綿羊物種中的乳腺炎特別相關。凝固酶陰性葡萄球菌也具有FnBp並引發乳腺炎。在這些識別粘性基質分子的微生物表面組分上的主要纖連蛋白結合位點由重複3-4次的30-42個胺基酸長的基序所組成，並且多數重複單元含有共有序歹1(Lindgrenetal"1993loccit;McGavinetal""FibronectinreceptorsfromStreptococcusdysgalactiaeandStaphylococcusaureus:Involvementofconservedresiduesinligandbinding,"J.Biol.Chem.268:23946-23953，1993.)。該結構域由重複3或4次的、37-40個胺基酸的單元所組成(USP6，685，943的圖1)。因此，基於粘附功能並且更作為細M逸作用靶標來作為主要的抗SA保護機制，FnBp是配製抗包括SA在內的幾種革蘭氏陽性細菌的保護性疫苗的重要粘附蛋白(抗原)。重要的是，FnBp存在於來自革蘭氏陽性細菌比如釀膿鏈球菌(5^印toccMS/^"ge"^)和/或停乳鏈球菌(flfj^a/flcftVie)和無乳鏈球菌(iS^e/7勿coccwsflgfl/acftW)和乳房鏈球菌(5^印to"cc"sw&n's)和凝固酶陰性葡萄球菌的許多分離林中。其中接近100%的SA分離林。疫苗不但用於保護牛以抵抗由SA感染引起的乳腺炎，而且用於包括A^內的幾乎所有受由SA引發感染所影響的動物物種。根據幾種因素，包括地方株和臨床情況，疫苗抗原的組成可以在抗革蘭氏陽性細菌包括SA感染和SA所引起疾病的疫苗中有變化。粘附至纖連蛋白介導感染過程中的重要和常見因素，並且這種蛋白質存在於幾乎所有SA分離株中。阻斷粘附和中和是通過抗體由IgGl實現的作用，然而IgG2a對於作為抗SA的主要免疫保護性機制的吞噬作用是重要的。鑑於SA也是細胞內寄生物的事實，免疫系統的細胞介導分支(CMI)是重要因素。已有充分的文獻記栽iscom系統強力增強CMI尤其是細胞毒性T細胞殺傷受感染細胞例如感染SA的細胞。因此，基於iscom技術的佐劑製劑具有誘發幾種免疫保護性機制的能力。包含FnBp的iscom已經才艮道過(A7cAwso/！Nelsonetal,2000，Symposium,StresaItaly,Proceedings,426-4319)。FnBp被慘入iscom基i中從而與完整抗原一起形成iscom。然而Nelson的iscom製劑不具有足夠的免疫原性並且不能用於疫苗，這在一定程度上是由於該製劑只誘導很短持續期的免疫性。基於iscom基質或脂質體(matrixorliposome)作為佐劑的本發明提供好得多的免疫性(見本發明中實施例5的比較)。此外，根據本發明的疫苗製劑更好地適於大規模生產，因為本發明中應用的iscom技術只需要向疫苗抗原懸液中加入iscom基質。現已證實iscom技術非常適於製備抗革蘭氏陽性細菌、包括金黃色葡萄球菌SA在內以及尤其是抗牛物種中乳腺炎的疫苗組合物。
發明內容本發明涉及一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結合結構域；以及至少一種iscom基質複合物和/或脂質體和/或至少一種脂質和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質和至少一種皂苷可處於複合物、溶液或者懸液中。另外，本發明涉及其在製備抗包含至少一個纖連蛋白結合結構域的微生物的疫苗中的用途。本發明還涉及其部件中包括至少兩個區室的試劑盒，其中一個區室包含至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或纖連蛋白結合肽，其包含至少一個纖連蛋白結合結構域，並且另一個區室包含使用說明和/或iscom基質複合物和/或iscom複合物和/或月旨質體。》匕夕卜，本發明涉及個體疫苗接種的方法。通過以下的表和圖來闡明本發明。表l:l用纖連蛋白結合蛋白(FnBp)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自4矣選疫苗間隔4周皮下免疫兩次。表2:1用破傷風類毒素(TT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周皮下免疫兩次。表3:1用白喉類毒素(difteritoxiod)(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周皮下免疫兩次。表3:1用白喉類毒素(difteritoxiod)(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周皮下免疫兩次。圖1:1用含於各種佐劑製劑中的FnBp第二次免疫Balb/C小鼠之後，對纖連蛋白結合蛋白(FnBp)的lgGl和IgG2亞類的血清抗體應答。圖2:1用含於各種佐劑製劑中的TT第二次免疫Balb/C小鼠之後，在IgGl和lgG2亞類中所測量的對破傷風類毒素(TT)的血清抗體應答。圖3:1用含於各種佐劑製劑中的白喉類毒素(DT)第二次免疫Balb/C小鼠之後，對白喉類毒素(DT)的lgGl和IgG2亞類的血清抗體應答。圖4:1至4:4在進入噴乳期之前，用iscom基質作為佐劑的FnBp初次免疫10隻小母牛，分別經陰道內(ivag)途徑(4:1)(圖中顯示3隻動物中的一隻)；或者經鼻內(i.n.)實施初次免疫(4:2)(圖中顯示3隻動物中的一隻)，或者經皮下(s.c.)施用(4:3)(圖中顯示4隻動物中的1隻)。3至4周後並且在哺乳期開始以後對所有組經皮下實施第二次免疫。用ELISA通過測量如圖中所示的總Ig、IgGl、IgG2和IgA來分析血清和乳清中的抗體應答。圖5:1以iscom基質作為佐劑用FnBp間隔6周疫苗接種兩次的4-7月齡的5隻小牛中對纖連蛋白結合蛋白(FnBp)的抗體應答。記錄第一次免疫之後IgM和總IgG類型的免疫應答。第二次免疫後，i己錄IgGl和IgG2亞類的抗體應答。圖5:2在用各種製劑(見下)間隔6周疫苗接種兩次的4-7月齡小牛中對a(A)和(J(B)毒素的抗體應答。通過毒素中和試驗測量抗體應答。每組中的5隻小牛按下述進行免疫組A:以iscom基質作為佐劑的FnBp組B:在第一次免疫時應用FnBp加上金黃色葡萄球菌(SA)以及a和P毒素並用iscom基質作為佐劑,其後只應用FnBp組C:在兩次免疫中均應用FnBp和SA再加上a和p毒素並用iscom基質作為佐劑組D:在兩次免疫中均應用SA以及a和p毒素並用iscom基質作為佐劑組E:未免疫的對照圖6在用纖連蛋白結合蛋白(FnBp)並補充金黃色葡萄球菌(A)細胞或者a和(3毒素(B)疫苗接種的1-2歲齡小牛中的抗體應答。試驗疫苗用iscom基質佐劑。在IgM、總IgG、IgGl和IgG2類和亞類中測量抗體應答。發明詳述本發明涉及一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結合蛋白(FnBp)、和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽，所有這些都包含至少一種纖連蛋白結合結構域，以及至少一種iscom基質複合物和/或脂質體和/或至少一種脂質和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質和至少一種皂苷可處於複合物、溶液或者懸液之中。所述組合物可用於製備抗革蘭氏陽性菌比如金黃色葡萄球菌(5"鄉^y/。coccMsflw"ws).酉良腺鏈球菌(iftr印toc0""s/7"^wes1)、停乳鏈球菌(5^e/toc0ccMS咖艱a/fl"iW),無乳鏈球菌(5^e/^coccwsagfl/a"/"e)和乳房鏈永菌(5^印^^ccwsw&A)以及凝固酶陰性葡萄球菌的疫苗。可以應用全長的纖連蛋白結合蛋白以及截短的蛋白質或者肽，只要其包含至少一個纖連蛋白結合結構域或表位。對於截短的蛋白質，我們了解是已缺失一個或多個胺基酸的天然存在或合成產生的全長蛋白質。可以缺失非FnBp結合區中的一個或多個胺基酸。也可以缺失來自FnBp結合結構域的氛基酸。不過，應當至少有一個FnBp結合結構域或表位未受影響。優選所述截短的蛋白質或肽包含一或多個來自革蘭氏陽性細菌的纖連蛋白結合蛋白結合結構域，尤其是來自金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌。纖連蛋白結合結構域可以選自來自金黃色葡萄球菌的纖連蛋白結合蛋白A或B的D結構域，比如DU和D1-D4結構域；來自停乳鏈球菌的纖連蛋白結合蛋白A的A結構域，比如AU和Al-A3結構域；來自停乳鏈球菌的纖連蛋白結合蛋白B的B結構域，比如B1-B3結構域；以及來自釀膿鏈球菌纖連蛋白結合蛋白的結構域，比如Pl-P4結構域(見USP6,685,943的圖1)。金黃色葡萄球菌的FnBp結合結構域也描述於SignSsetal.:(1989)Nucleotidesequenceofthegenefibronectin隱bindingproteinfrom5"似/^盧"ccwsftwrn/s:Useofthispeptidesequenceinthesynthesisofbiologicallyactivepeptides.iVoc.7Vflf/y4cfl^/.5"c/.t/5^4，Vol:86pp.699-703。所述截短蛋白質或肽可以在一個或多個FnBp結合結構域例如上述D、A、P結構域的上遊或者下遊包含1-200、優選1-100比如1-50、比如1-20個胺基酸。所述截短蛋白質和肽可以是天然存在的胺基酸序列或者是合成產生的，或者通過雜交DNA技術產生。這些FnBp結合結構域中的一種或多種或者包含一個或多個上述FnBp結合結構域的幾個重複單元可以根據本發明來產生和應用。在USP6，685，943中描述了如何獲得天然存在的和合成產生的FnBp結合結構域。對Fn-結合結構域或表位的鑑定在本領域中是普遍公知的。例如，可以使用Hopp的方法，如U.S.Pat.No.4,554,101中所教導的，其教導基於親水性來鑑定和製備胺基酸序列的表位。也能夠應用在其它幾個文獻中描述的方法、以及基於其的軟體程序來鑑定表位核心序列(見，例如，JamesonandWolf,1988;Wolfetal"1988;U.S.Pat.No.4,554,101)。隨後可以通過應用肽合成或者重組技術將這些"表位核心序列"的胺基酸序列很容易的摻入肽中。通常，所述結構域或者表位的大小不是特別關鍵，只要它至少大到足以結合FnBp即可。根據本發明公開內容所預期的最小有用核心序列通常在約至少5個胺基酸長的水平，更優選10或50個胺基酸長水平的序列。可以應用一個或多個FnBp結構域或表位。鑑定表位核心序列的方法對於本領域技術人員是已知的，例如，如U.S.Pat.No.4,554,101中所述，其教導基於親水性來鑑定和製備胺基酸序列的表位。此外，有許多電腦程式可用來預測蛋白質的抗原性部分(見例如，JamesonandWolf，1988;Wolfetal.，1988)。計算機化的肽序列分才斤禾呈序(例如，DNAStar7軟體，DNAStar,Inc.，Madison,Wis.)也可用來設計根據本發明公開內容的合成FnBp，以及源於FnBp的表位和表位類似物。就此來說，通過製備包括表位/免疫原性核心序列的合成肽可以實現特別的益處。這些表位核心序列可被鑑定為多肽的親水性和/或可移動區域或者包括T細胞基序的區域。為確認蛋白質或者肽或者與其生物功能等價物具有免疫交叉反應性，本發明所公開肽的一種或多種表位也是直接的主題。應用特異性分析法，例如單個建議表位序列的特異性分析，或者應用更一般性篩選，例如對隨機產生合成肽或者蛋白質片段庫的篩選，能夠很容易地對此進行確定。所述篩選分析可用來鑑定等效抗原或者交叉反應抗體。無論如何，原則是相同的，即，基於對抗體和抗原之間結合位點的竟爭。可利用的適當的竟爭性分析包括基於免疫組織化學分析、ELISA、RIA、Western或者斑點印跡等的方案。在任何竟爭性分析中，一種結合組分，通常是已知元件比如源於FnBp的肽、或者已知抗體，將會用檢測標籤進行標記，並且通常保留未標記的待測組分將會被用來檢測它們降低結合於相應反應性抗體或抗原的標籤的量的能力。可以依照實施例、實施例1之前的概述和實施例1中所述獲得可用於根據本發明用途中的肽。為了更好的純化所述截短的蛋白質或肽，它們可以通過DNA工程和編碼對可用於分離的物質具有親和性的胺基酸序列的插入序列來產生。例如可以分別引入6組氨酸；一個或多個正電胺基酸；和/或蛋白質A的與螯合(Ni-或Co-)物質結合的zz(z)區；離子交換物質和免疫親和物質。這些方法在本領域中是公知的。纖連蛋白結合蛋白、包含至少一個纖連蛋白結合結構域的截短纖連蛋白結合蛋白以及纖連蛋白結合肽可以從上述任何細菌的細菌細胞中分離。它們也可以從細菌的分泌產物中分離。此外，根據公知技術，所述抗原可以作為來自細菌細胞、真菌或者來自哺乳動物細胞的rDNA產物而產生。它們也可以在載體系統中產生；或者用所謂的DNA疫苗免疫之後或者作為本領域公知的所謂RNA疫苗進行免疫之後在體內產生。它們也可以作為融合蛋白並且是例如來自細菌細胞的rDNA產物而產生；作為融合蛋白並且是來自真菌細胞的rDNA產物而產生；作為融合蛋白並且是來自哺乳動物細胞的rDNA產物而產生；或者在來自細菌細胞的栽體系統中作為融合蛋白而產生；在來自真菌細胞的載體系統中作為融合蛋白而產生；在來自哺乳動物細胞的栽體系統中作為融合蛋白而產生。此外，所述融合產物可以是蛋白質與來自革蘭氏陽性細菌諸如金黃色葡萄球菌，釀膿鏈球菌，停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌的碳水化合物莢膜抗原之間的偶聯體，或者所述融合蛋白質產物可以是兩個蛋白質之間的偶聯體，其中至少一個蛋白質為來自任何上述微生物的細菌蛋白質比如金黃色葡萄球菌蛋白質。所述纖連蛋白結合蛋白和/或截短的纖連蛋白結合蛋白和/或纖連蛋白結合肽可以整合入脂質體中或者與iscom基質或脂質體(matrixorliposome)相混合或者結合於脂質體或者iscom基質。在本發明組合物中的iscom基質複合物包含至少一種糖苷和至少一種脂質。所述脂質至少是固醇比如膽固醇並且還任選是磷脂醯膽鹼。所述基質對共施用的抗原性物質具有免疫增強效應，見EP0436620Bl並且可以根據本專利的描述來產生。所述組合物iscom、基質複合物和/或脂質體也可以包含一種或多種其它免疫調節性(佐劑活性)物質，而不必是皂苷，例如脂多糖(LPS)、脂質A或脂質A衍生物、CT或LT以及它們的亞片段或者其衍生物，例如，LTB、LTA、CTB、CTA或CTA1-DD。所述iscom基質可以是一種或多種iscom基質顆粒或者其6納米環的任何亞片段。可以使用這些iscom基質、顆粒或亞片段的任何混合物。根據EP9600647-3(PCT/SE97/00289)所述，可以使用一種或多種抗原以及可以使用轉運和過客抗原。所用脂質尤其見本申請人的專利EPO109942Bl中尤其是第3頁以及專利EP0436620Bl中第7頁第7-24行描述的那些。尤其可使用固醇比如膽固醇和磷脂比如鱗脂醯乙醇胺和磷脂醯膽鹼。可以使用結合於細胞結合組分的含脂質受體，比如包括作為神經節苷脂GM1的霍亂毒素受體在內的糖脂，以及巖藻糖化的血型抗原。所述細胞結合組分隨後能夠作為粘液靶向分子發揮作用並且通過它們與包含它們的複合物簡單混合而結合於所述含脂質的物質。iscom複合物包含這些受體，受體描述於WO97/30728中。在EP0109924Bl中描述了可用的糖苷。優選皂苷和三闢皂普(triterpensaponins)。它們可以是來自皂樹(5""/o履"'"Molina)的原始4C取物形式(Dalsgaard，K.(1974)，Arch.GesamteVirusforsch,44,243.)、或者其任何亞組分，如PCT/US/88101842toKensiletal.，Kensil,CA.etal.(1991)，J.Immunol,146,431,Kersten,GF.A.etal.(1990)."AspectsofIscoms.Analytical,PharmaceuticalandAdjuvantProperties;Thesis,UniversityofUtrecht、EP0362279B2和EP0555276Bl中所述。才艮據本發明的一個方面，所述iscom基質複合物包含含皂苷混合物的QuilA粗製或原始提取物或其半純4匕形式比如QuillajaPowderExtract(Berghausen,USA)、QuillajaUltraPowderQPUF300、QuillajaUltraPowderQPUF1000或者Vax-Sap(所有三種都來自NaturalResponses,Chile)。根據本發明的另一方面，所述iscom基質複合物包含至少一種純化的糖苷比如來自QuilA的皂苷組分。才艮據本發明的純化皂苷組分可以是WO96/11711描述的A、B和C組分，EP0436620描述的B3、B4和B4b組分，EP03632279B2描述的組分QA1畫22，Q-VAC(Nor-Feed,ASDenmark)，0"/〃"y"MolinaSpikoside(IsconovaAB,UppsalaSciencePark,75183，Uppsala,Sweden)。可以4吏用EP03632279B2的糹且分QA-l-2-3-4畫5畫6-7-8-9國10誦ll-12-13畫14-15-16-17-18-19-20-21和22,尤其可以使用QA國7、17-18和21。它們是根據EP03632279B2、尤其是在第6頁以及在第8和9頁的實施例1中所述而獲得。優選使用亞組分A和C。在整個說明書和權利要求中，使用術語"一種來自皂樹(07/fl>Molina)的皂苷組分"作為對皂樹(0w///"_/Vi5"fl/w/i"nVi)的純化*或確定的皂苷組分或者基本純組分的通稱。重要的是，所述組分不含有很多對當4吏用iscom混合物或主要包含一種組分的iscom基質時所獲得良好結果有負面影響的任何其它組分。如果期望的話，所述皂苷製備物可以包括少量的其它化合物比如其它皂苷或其它佐劑物質，所述少量例如最高40%重量，比如最高30%重量、最高25%重量、最高20%重量、最高15%重量、最高10%重量、最高7%重量、最高5%重量、最高2%重量、最高1%重量、最高0.5%重量、最高0.1%重量。根據本發明的組合物可以包含至少兩種iscom複合物的混合物，其選自iscom基質複合物，每種複合物主要包含一種不同的來自皂樹的皂苷組分，如WO2004/004762(PCT/SE03/01180)中所述。在優選使用的基質混合物中，皂樹組分和QuilC組分分別摻入不同的iscom複合物或基質。如上所述，分別基於皂樹的組分A和C含量，可以使用不同iscom複合物的重量％的任何組合。所述混合物可以包含O.l比99.9%重量、5比95%重量、10比90%重量、15比85%重量、20比80%重量、25比75%重量、30比70%重量、35比65%重量、40比60%重量、45比55%重量、40比60%重量、50比50%重量、55比45%重量、60比40%重量、65比35%重量、70比30%重量、75比25%重量、80比20%重量、85比15%重量、90比10%重量、95比5%重量的包含皂樹之組分A(如本文定義)的iscom基質複合物，並且在每一區間情況下其餘是最高至100%的包含皂樹之組分C(如本文定義)的iscom基質複合物，其中以所述iscom基質複合物中皂樹之組分A和C總含量來計算。所述混合物可以包含從75%至99.5%重量的組分A和0.5%至25%重量的組分C。優選地，所述混合物包含從卯％至99%重量的組分A和1%至10%重量的組分C。一種特別優選的製備物包含約91%至98%重量的組分A和約2%至9%重量的組分C，尤其是約92%至96%重量的組分A和約4%至8。/。重量的組分C，其中以所述iscom基質複合物中皂樹之組分A和C總含量來計算。任意組合使用上述所有區間。根據本發明可施用製劑的動物物種的實例是伴侶動物比如貓、狗、馬、鳥比如鷚鵠，重要經濟物種比如家畜，例如牛類物種，豬、綿羊、山羊。優選使用超過50%重量的組分C與任何其它組分相組合，並且尤其是與組分A相組合。因此可以使用從50.5至99.5%重量的C和0.5至49.5%重量的A。根振本發明的一個實施方案，所述iscom基質複合物包含QuilA的組分A以及至少一種如WO2005/002620(PCT/SE2004/001038)中所述的其它佐劑。這種iscom複合物和Iscom基質複合物可以包含佔組分A和C總重50至99.9%的QuilA之片段A和0.1至50。/。的片段C和/或組分B和/或QuilA的其它組分或衍生物，其中可以將所述不同的糖苷成分整合入、偶聯在或混合於相同或不同的複合物或iscom基質顆粒。也可以將包含至少一個纖連蛋白結合結構域的截短的纖連蛋白結合蛋白和/或纖連蛋白結合肽整合入、偶聯於或混合於脂質體中。脂質體可以依照以下所述來製備Gregoriadis,G，McCormack,Obrenovic,M..Perrie,Y.andSaffie,R.InVaccineAdjuvants,PreparationMethodsandReseachProtocols.(2000)Ed.O'HaganD.,pp137-150.脂質體可用作免疫佐劑和疫苗載體。它們也可以被整合入、偶聯於或者混合於和/或至少一種脂質和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質和至少一種皂苷可以處於複合物、溶液或懸液之中。優選地，在此所述複合物不是iscom形式。可以考慮所述包含至少一個纖連蛋白結合結構域的纖連蛋白結合蛋白、截短的纖連蛋白結合蛋白和纖連蛋白結合肽作為抗原。根據本發明的組合物可以包含至少一種另外的抗原。根據本發明的一個實施方案，所述的至少一種另外的抗原是以革蘭氏陽性細菌全細胞形式的抗原。在本發明的另一個實施方案中，所述抗原是抗原性成分，比如來自細菌細胞或者分泌產物比如a和p溶血素，尤其是來自革蘭氏陽性微生物的那些。從中獲得這些全細胞和抗原性成分的革蘭氏陽性細菌可以是金黃色葡萄球菌、s良膿鏈球菌，停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌，和凝固酶陰性葡萄球菌。金黃色葡萄球菌細胞意思是指葡萄球菌屬的金黃色組。相應的s良膿鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌、和凝固酶陰性葡萄球菌表示所述屬的各個組。這也將適用於從中獲得FnBp結合蛋白、肽或者結構域的微生物。粘附素可以選自聚集因子(clumpingfactor,clf)、外部纖維蛋白結合蛋白(externalfibrinbindingprotein,efb)、針對纖維蛋白原的A和B粘附素、凝固酶(coagulase，coa)、結合於纖維蛋白原的纖維蛋白原結合蛋白A、附著於纖維蛋白原的纖連蛋白結合蛋白(FnBp)A和B、結合於膠原的膠原蛋白結合蛋白(cna)、結合於彈性蛋白的彈性蛋白結合蛋白(ebpS)、結合於細胞外基質蛋白的MHC類似物蛋白(map或eap)、涉及細胞內粘附和生物膜形成的多糖細胞內粘附素(pia)、涉及可能逃過宿主防禦的蛋白質A(spa)、抗吞噬作用分子的莢膜多糖(例如l、5、8和13型)(cap)、或iTechoidacid。成孔因子(poreformingfactors)可以被外泌，並且可以選自a國溶血素、p-溶血素、y-溶血素、s-溶血素、涉及宿主細胞裂解的磷脂酶c(plc)、涉及組織侵入的彈性蛋白酶(sepA)、和涉及組織侵入的透明質酸酶(hysA)。所有提及的組分可以是分離自細菌細胞的蛋白質或者碳水化合物、外泌產物、rDNA產物或者作為rDNA產物表達的融合產物、載體系統中的產物或融合蛋白，所謂的DNA或RNA疫苗，只要它們使用本發明的佐劑系統即可。根據本發明的另一實施方案，所述抗原可以是下調免疫系統的抗原性成分，比如超抗原、莢膜抗原、內毒素、外毒素和細胞外酶。這些外毒素和細胞外酶可以選自腸毒素A至E、H(sea-e,h)、毒素休克症候群毒素-l(tst)(與超抗原一起逃避宿主防禦的特性)、剝脫毒素AB(eta，efb,etb)(逃避宿主防禦)、脂肪酶(geh)(逃避宿主防禦)、Panton-Vallentine殺白細胞素(lukF，lukS)(裂解宿主吞噬細胞)、葡萄球菌激酶(sak)(逃避宿主防禦)。上面提及的抗原性成分可以在來自世界不同地區的所述屬的組中在物種之間有所差異。上面有關截短的纖連蛋白結合蛋白和/或纖連蛋白結合肽來源的信息也可適用於所述組合物可以包含的至少另外的抗原。根據本發明的組合物還可以包含藥用可接受載體、稀釋劑、賦形劑或者添加劑。所述藥物組合物可以是無菌注射水性或油性懸液的形式。該懸液可以根據公知技術應用那些合適的分散劑或溼潤劑和助懸劑進行配製，如上所述。所述無菌注射製備物也可以是在無毒胃腸外可接受稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸液，例如1,3-丁二醇的溶液。可應用的可接受載體和溶劑中有水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、不揮發性油通常用作溶劑或者懸浮介質。為此目的，可以應用任何品牌的不揮發性油，包括合成的單-或二甘油酯。此外，脂肪酸比如油酸也可用於所述注射製備物中。所述溶液或懸液也能夠包含至少一種以下佐劑無菌稀釋劑比如注射用水、鹽水、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其它合成溶劑，抗細菌劑比如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯，抗氧化劑比如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，螯合劑比如乙二胺四乙酸，緩衝劑比如醋酸鹽、杼檬酸鹽或磷酸鹽，以及滲透壓調節劑比如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外製劑可以封裝於由玻璃或塑料製成的安瓿、可棄型注射器或多劑量容器。通式I的化合物可經胃腸外施用。本文中使用的術語胃腸外的意思包括有關無針注射-射流注射的輸注技術的皮下注射、靜脈內、肌內、皮內注射。所述組合物可以是適於包含用於接種例如200隻牛的幾百劑量的射流注射器用的疫苗組合物形式。根據本發明的組合物還可以包含影響乳房的抗原組合物比如凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌樣細菌包括克雷伯氏菌屬(f/WwV//"spp.)和大腸埃希氏菌(五."//)。本發明也涉及所述組合物用於製備疫苗的用途。所述疫苗意圖用於任何哺乳動物比如人，動物比如牛、綿羊或山羊。本發明尤其涉及用於牛、綿羊和山羊動物抗乳腺炎的疫苗接種。本發明尤其涉及用於牛的包含來自金黃色葡萄球菌的抗原並混有iscom基質的乳腺炎疫苗。所述基質優選產自粗製QuilA或者半純化的QuilA。牛可以在產犢之前進行一次疫苗接種並在產犢之前或之後(優選之後)的一個月進行加強接種。小母牛可以在產犢之前施用兩次，優選可能在產犢之後接著施用第三次。本發明的一個實施方案涉及根據權利要求l的組合物，其包含選自毒素和/或來自微生物的全細胞的至少另外一種抗原，所述微生物尤其是革蘭氏陽性細菌比如金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌。因此，所述組合物可以包含毒素或全細胞或兩者都包含。已證明的是，對於超過一歲齡的小母牛而言，當所用的根據本發明的組合物添加來自革蘭氏陽性細菌尤其是來自上述任一種比如金黃色葡萄球菌的全細胞和/或毒素時獲得更佳的免疫效果。本發明還涉及部件的試劑盒，其中一個區室包含至少一種纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結合結構域，以及另一個區室包含使用說明和/或至少一種iscom基質複合物和/或脂質體。上述革蘭氏陽性微生物種，比如來自葡萄球菌屬金黃色組的金黃色葡萄球菌，可以在世界不同區域之間有所差異。所述試劑盒的一個區室可以包含根據本發明的iscom基質複合物或脂質體。該區室可以包含一種或多種來自革蘭氏陽性微生物例如葡萄球菌屬金黃色組的抗原。另一區室可以包含來自可對某些區域有特異性的革蘭氏陽性微生物例如來自葡萄球菌屬金黃色組的抗原，例如這種特異性可以基於莢膜抗原。這兩類抗原可以整合入脂質體，結合於脂質體或iscom基質複合物或者與iscom基質複合物或脂質體相混合。由於上述革蘭氏陽性微生物比如來自葡萄球菌屬金黃色組的金黃色葡萄球菌可以誘發下調免疫系統的抗原以及不下調免疫系統的抗原，所以能夠有益地將在不同製劑中的這些不同類型的抗原施用於動物體的不同部分，以增加免疫之後每種成分的效用。由此試劑盒可以包含至少一個包含至少一種下調免疫系統之抗原的區室和包含至少一種不下調免疫系統之抗原的另一區室。所述組合物和試劑盒也可以包含抗生素。當動物具有上述微生物的亞臨床或臨床感染時，這可以是有用的。抗原性物質的量可以根據所用物質和微生物以及待處理個體而變化。對於小動物，低劑量是0.1jig至100ng;對於大動物，低劑量範圍是10jig至1000ng，尤其是10jig至300ng，所述這些不是限制性界限。對人而言，劑量範圍是ljtg至200ng，但這不是限制性界限。本發明也涉及用於哺乳動物比如人尤其是家畜的疫苗接種方法，其中向所述動物施用一種組合物，該組合物包含至少一種纖連蛋白結合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽，其中它們包含至少一個纖連蛋白結合結構域，以及至少一種iscom基質複合物和/或脂質體。保護性乳腺炎疫苗的免疫方案可以如下進行對於將進入哺乳期的小母牛實施兩次間隔5-8周的皮下免疫。在產犢前約10天完成最後免疫。之後推薦在預計產犢之前10-14天進行每年一次的免疫。在母牛具有亞臨床或臨床SA乳腺炎的情況下，將推薦在幹奶期中實施兩次間隔2-3周的疫苗接種並聯合用抗生素治療母牛，即免疫和抗生素聯合治療。所有關於所述纖連蛋白結合蛋白、包含至少一個纖連蛋白結合結構域的截短的纖連蛋白結合蛋白和/或纖連蛋白結合肽、脂質、糖普以及除所述纖連蛋白結合蛋白或肽之外的其它添加抗原的信息進行必要的變更後涉及本發明的所有實施方案。本發明已經結合某些公開實施方案進行了描述，技術人員可以預見到沒有具體提及的但仍在所附權利要求範圍內的其它實施方案、變化或者組合。所有在本文中引用的參考在此以其整體通過參考併入本文中。本文中使用的表述"包含"應被理解為包括但不限於所列的事項。本發明將通過以下非限制性實施例進行進一步的闡述。實施例關於實施例的一般信息材料佐劑Al(OH)3-用於動物和人的傳統佐劑。其佐劑作用仍然沒有被完全了解。與沒有佐劑相比，抗體應答被增強，但是該應答強烈偏向於TH2。對細胞應答沒有或者有很低的佐劑作用。AI(OH)3、Allhydrogel來自BrenntagAG^De證ark。Iscom基質佐劑基質-O-由含有全範圍不同皂樹皂苷分子的半純化皂樹皂苷(Quillajasaponin)製備。其佐劑作用強烈並且包括體液和細胞免疫應答。基質-C由皂樹皂苷的一種純化組分(組分-C)製備。它具有強效的佐劑活性(Johansson,MandL6vgren-Bengtsson，KVaccine17,2894-2900)。其毒性比基質-Q要低很多。基質-OWT由皂樹皂苷的另一種純化組分(組分-A)製備。其佐劑作用被描述為低於基質-C(PCT/SE2004/001038)，但似乎對細胞免疫應答有很強作用。基質-QWT顯示出在與佐劑活性相關的劑量中是基本無毒的並且在所有檢測過的動物中有非常好的耐受性。基質-MIX—是基質-OWT和基質-C的混合物(由17%基質《和83%基質-QWT所組成)。相似的混合物顯示出對單一抗原發揮出高的令人驚奇的佐劑作用(WO2004/004762，PCT/SE2004/001038)。所有基質佐劑製劑來自IsconovaAB,Uppsala，Sweden。抗原福馬林處理過的破傷風類毒素(TT)得自TheStateSerumInstitute,Copenhagen,Denmark。TT是一種重要的免疫原性抗原。在實施例中應用較高劑量(2.51f)和低劑量(0.5Lf)。對於該特定批次，1Lf的毒素相當於x微克蛋白質。重組白喉類毒素(DT)來自Sigma。在實施例中應用l微克的劑量。纖連蛋白結合蛋白(FnBp)由CrosslinkLtdBudapestHungary製造，是FnBpAShort(396bp，與NC—002951.2的FnBpA具有100%—致性)和FnBpBShort(396bp,與NC002951.2的FnBpB具有95%—致性和來自BiostaproABUlltunaallen2B75651Uppsala,Sweden)的混合物並且是包括16kD纖連蛋白結合結構域的DNA片段，其中所述纖連蛋白結合結構域包括3個DD重複，其包括非免疫結果所必需的半胱氨酸N末端。l卯ng的該構建體與1mgiscom基質/劑量混合。ELISA小鼠血清通過常規間接ELISA在各個樣本中測量血清中的抗原特異性抗體。用溶於50mMpH9.6碳酸鹽緩衝液的濃度為1fig/ml的單個抗原包被微滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)並在+4n過^L在與樣品一起孵育之前，所述板在室溫(r.t.)下用添加2V。(w/v)脫脂奶粉的PBS-T(含0.05%Tween的磷酸鹽緩沖液)(PBS-T/M)封閉1小時。板子依次與在PBS-T/M中連續稀釋的待檢血清以及偶聯HRP的兔抗小鼠IgG(Dakocytomation，Denmark)—起孵育。對於IgG亞類的測量，用偶聯HRP的山羊抗小鼠IgGlHRP(Serotec,Norway)或者用偶聯HRP的山羊抗小鼠IgG2aHRP(Serotec，Norway)與連續稀釋的待檢血清一起孵育。通過與底物緩衝液(K畫blue,SVANOVA,Upppsala，Sweden)—起孵育使酶反應顯4象，通itia入50nl的2MH2S04^10分鐘後終止該反應，並且在450nm處讀取吸光度。用PBS-T進行所有洗滌。在PBS-T/M中根據使用說明稀釋偶聯物。在滴定曲線線性部分通過內插法計算效價並表示為產生1.0吸光度時血清稀釋度的倒數。牛血清和乳通過常規間接ELISA在個體血清(乳)樣品中測量血清和乳中的抗原特異性抗體。用溶於50mMpH9.6碳酸鹽緩衝液的濃度為1pg/ml的FnBp包被微滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)並在+4"C過夜。在與樣品一起孵育之前，所i^L在室溫(r.t.)下用添加10。/。(w/v)馬血清的PBS-T(含0.05%Tween的磷酸鹽緩衝液)(PBS-T/H)封閉2小時。板子依次與在PBS-T/H中連續稀釋的待檢血清(乳)以及偶聯HRP的綿羊抗牛IgG(Serotec，Norway)—起孵育。對於IgG亞類的測量，用偶聯HRP的綿羊抗牛IgGl(Serotec,Norway)或者用偶聯HRP的綿羊抗牛IgG2HRP(Serotec,Norway)、用偶聯HRP的綿羊抗牛IgA(Serotec，Norway)與連續稀釋的待檢血清一起孵育。通過與底物緩衝液(K-blue,SVANOVA，Upppsala，Sweden)—起孵育使酶反應顯像，通過加入50pi的2MH2S04在10分鐘後終止該^^應並且在450nm處讀取吸光度。用PBS-T進行所有洗滌。在PBS-T/H中根據使用說明稀釋偶聯物。在滴定曲線線性部分通過內插法計算效價並表示為產生lo吸光度時血清稀釋度的倒數。抗葡萄球菌抗體使用商品ELISA(金黃色葡萄球菌抗體檢測試劑盒，WMRD，Pullman,WA,USA)測量血清和乳中的抗葡萄球菌抗體。實施例1纖連蛋白結合結構域的製備克隆纖連蛋白結合蛋白由CrosslinkLtd.Budapest,Hungary實施項目由CrosslinkLtd.的FerencFel傷l(U撰寫才艮告由ISCONOVA,Uppsala,Sweden的Prof.BrorMorein定製內容介紹piA.克隆在C末端具有6-His標籤的全長形式plp3B.克隆在C末端具有6-His尾的短形式介紹本項目的目的是克隆並表達來自金黃色葡萄球菌的FNBP基因a.)在C末端具有6-His標籤的全長形式用於蛋白質製備；b.)在C末端具有6-His尾的短形式用於連接佐劑；引起牛乳腺炎的菌林由ISCONOVALtd.，Uppsala,Sweden提供。然而，沒有獲得該菌林的序列信息。A.克隆在C末端具有6-His標籤的全長形式在金黃色葡萄球菌中，兩種類型的基因編碼纖連蛋白結合蛋白質，即FNBPA和FNBPB基因。我們在NCBIDataBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中調查了有關FNBP的信息並找到8個金黃色葡萄球菌菌林的序列。在這8個菌林的FNBP基因中只有80%的一致性。為了確保能以全長(除了信號序列之外)擴增我們菌株的FNBP基因，我們必須選擇既擴增A又擴增B的引物。製備來自金黃色葡萄球菌的靶DNA通過常規方法製備來自金黃色葡萄球菌的基因組DNA並用作PCR反應中的模板。幸運地是，A和B基因的長度有200bp差異。因此，在長電泳凝膠中分開這兩種PCR產物是可能的。分離A基因產物並用於l^的步驟中。1.50ml金黃色葡萄球菌培養物(OD600=2)被離心並在2x25ml洗滌緩沖液(150mMNaCl,50mMTrisHC1[pH:7.5)中洗滌兩次。2.細胞被重懸於5ml裂解緩衝液A(10mMEDTA，50mMTrisHC1[pH:7.5，0.1mg/ml溶菌酶)並在室溫下保持15分鐘。3.加入5ml裂解緩衝液B(2%SDS,50mMTrisHC1[pH:7.4,0.025mg/ml蛋白酶K)。懸液在55匸下孵育過夜。4.用l體積苯酚提取懸液，接著用1體積氯仿+異戊醇進行提取。5.用2.5體積乙醇沉澱DNA並用玻璃^i拌。用70o/。乙醇洗滌DNA並在Eppendorf管中乾燥。6.DNA被重懸在250微升TE緩衝液中。在接下來的步驟中，我們用不同的限制性內切酶消化這兩種PCR產物以選擇其中沒有切割位點的PCR產物。它們能夠確保在末端克隆而不破壞插入片段。我們發現三種不切割FNBPA的限制性內切酶BamHI、HindIII和Xhol。我們決定繼續用FNBPA，並用BamHI和HindIII進行克隆，而用Xhol在C末端添加His標籤。用於擴增的引物在其5'末端具有上面的切割位點(粗體文本)CGGGATCCT.GCAGCATCAGAACAAAAGACAACTACAGTKNBPaRGTAAGCTTATGCTTTGTGATTCTTTTTATTTCTGCGTAAFNBP基因的擴增擴增、克隆並通過測序確認來自期望菌林的全長FNBPA基因。為了使隨後的純化更有效率，基因的膜結合結構域(M)和跨細胞壁結構域的重複和非重複部分(Wl和W2)#皮去除。有關所述結構域的說明見文章SignSsetal.:(1989loc.cit.)Ncol和上面提及的Xhol限制性內切酶適於本目的。在所設計的引物中FnBpNcoCGGGATCCATGGCATCAGAACAAAAGACAACTACAGT(引物起點在以下參考序列中第2572388位〉ref]NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength=2809422)FnBpD4GAGCTCGAGTGGCACGATTG(5AGGTGTTGTATCTTCT(引物起點在以下參考序列中第2569863位>ref|NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength-2809422)實施以下步驟1.100微升擴增溶液含有10微升10xPCR緩沖液,每種引物(10pmol/jil母液)各IO微升，400孩餺爾dNTP和5UPfu酶。2.擴增實施30個循環，每一循環包括變性(94"C45秒)、退火(65匸l分鐘)和聚合(72"C2分鐘)。3.在瓊脂糖凝膠中檢查PCR產物並用SingleSamplePCRCleanupMontagePCRFilterUnits(Millipore)進行純化。PCR產物的克隆將FNBP基因克隆入pET21d載體。6-His標籤的密碼子以及隨後的終止密碼子位於pET21d載體中Xhol切割位點之後。因而，所表達的蛋白質在C末端將包含6-His標籤。誘導後實施8小時的表達。表達後細胞用超聲進行處理並離心。在SDS-PAGE上用考馬斯藍染色對產物進行檢測，其中有或沒有Ni-NTA瓊脂柱上的製備物。與未經誘導的培養物相比，表達是明確的。實施以下步驟1.PCR產物被重懸在40jilNEB2緩衝液中並在37匸下用Ncol和Xhol限制性內切酶消化2小時。2.用MontageGelExtractionKit(Millipore)從凝膠中純化消化後片段。3.在50nl反應溶液中將純化的DNA克隆入pET21d載體中Ncol/Xhol位點。用11U連接酶將載體和插入物連接過夜。4.質粒用2.5體積乙醇進行沉澱，重懸，並根據供應商使用說明經電穿孑L(Bio-Rad)將其引入雄埃希氏菌BL21菌林。5.在LB培養基中培養克隆並通過Ncol/Xhol消化接著凝膠電泳來檢驗載體中FNBPA基因的插入。6.適宜的栽體再次轉化入大腸埃希氏菌BL21菌林，在LB培養基中進行20個30ml平行培養。在OD600=1時用1mMIPTG誘導細胞。B.克隆在C末端具有6-His尾的短形式用以下引物克隆所述短形式。Ncol限制酶和Xhol限制酶的切割位點用粗體字母表示。BGFCGGGATCCATGGAAGGTQGCCAAAATAGCGGTAACCAGT(引物起點在以下參考序列中第2570270位>reflNC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength=2809422)BGRGAGCTCGAGAGGTGTTGTATCTTCTTCAATCGTTTGTTG(引物起點在以下參考序列中第2569875位>ref!NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL,completegenomeLength=2809422)用這些引物所製得的PCR產物被克隆入pET21d載體並在BL21(DE3)Star細胞中表達。6-His標籤的密碼子和隨後的終止密碼子位於pET21d載體中Xhol切割位點之後。因而，所表達的蛋白質在C末端將包含6-His標籤。誘導後實施8小時的表達並且在Ni-NTA柱上純化表達產物以及在SDS-PAGE凝膠中顯像。與未經誘導的培養相比，表達是明確的。按下述製備較大量的所述蛋白質。用FNBP(AB)BL21(DE3)Star菌株生產FNBP培養培養基4升LB+2g/L葡萄糖+100ng/mlAmp，在37匸直至OD1.5，降低溫度至30"C,在OD2-2.5時用1mMIPTG誘導5小時。下遊通過離心沉澱培養物重懸於緩衝液中10mMTris，pH8，150mMNaCl通過離心沉澱，重懸於40ml25mMTrispH8超聲處理10次，每次30秒，每次之間暫停l分鐘。添加PMFS至5mM終濃度。以20000g沉澱25分鐘。保留上清液。重懸沉澱於40ml25mMTrispH8。如上進行超聲處理。添加PMFS至5mM終濃度。將上清液與之前的上清液混合。總體積約卯ml。將上清液施加於用超聲緩沖液(25mMTrispH8)平衡的10mlNi-NTA瓊脂柱(具有5-10mg蛋白質/ml凝膠的結合能力)。用l體積超聲緩沖液洗滌。用2體積25mMTrisHC1pH:6.8，250mlNaCl洗滌。用1體積25mMTrisHC1pH:8，8M尿素洗滌。用2體積超聲緩沖液洗滌。用200mM。米唑pH7進4亍洗脫。添加TCA至10%終濃度，在4t:放置l小時。沉澱蛋白質。添加0.2ml1MTrisHC1pH8並用TE緩沖液補充至1ml。在超聲器中以水浴溶解蛋白質。(任選為了傳送，可以用硫酸銨來沉澱蛋白質。)如下所述，由CrosslinkLtd.Budapest,Hungary以相同的策略構建相應的FnBpA蛋白質並交付一三個各含2mg蛋白質的管。在Ni-NTA柱上純化蛋白質。最後步驟是用硫酸銨沉澱並離心以產生沉澱。待作事項在弱緩衝液中進行。優選用帶水浴的超聲器，這促進溶解並且沒有泡沫累積。在PD-10柱(Amersham)上去除鹽。——個含3.1mg蛋白質的管。與其它3個管一樣，但是沒有離心。待作事項將管在4"C下放置1小時。以15,000g或更高離心20分鐘。移除上清液。實施如上W目同的步驟。所述蛋白質是在末端具有His標籤的FnBpA和FnBpB基因的混合物。分子量是16kDa。FnBpA1MEGGQNSGNQSFEEDTEEDBCPKYEQGGNIVDIDFDSVPQIHGQN^GNQSF50FnBpB1MEGGQNSGNQSFEEDTEEDKPKYEQGGNIVDIDFDSVPQIHGQN^GNQSF5051EEDTEKDKPKYE;gGGN工IDIDFDSVPHIHGFNKHTEIIEEDTNKDKP^YQ10051EEDTEKDKPKYE^GGNIIDIDFDSVraiHGFNKHTEIIEEDTNKDKP^VfQ100101FGGHNSVDFEEDTIiP^SGgNEGQQTIEEDTTPliEHHHHHH*142101FGGHNSVDFEEDTIjP^VSG^NEGQQTIEEDTTPIjEHHHHHH*142產物用於實施例6和7中所進行的試驗,根據相同的策略由BiostaprosAB產生相應的FnBpA蛋白質。製備兩個分別在N和C末端有Cys的兩種構建體。每種各50%的混合物用於實施例2-5。FNBPCys-NMACEGGQNSGNQSFEteDTEEDKPKYEQGGNWDIDFDSWQIHGQ服GNQSFEEDTEKDKPKYEHGGNHDIDFDSVPHIHGFNKHTEIIEEDTOKDKPSYQFGGHNSVDFEEDTLPKVSG0NE6QQTIEEDTTPGFNBPCys^CEDTEKDKPKYEHGGNHDIDFDSWHIHGFNKHrEnEEDTNKDKPSYQFGGHNSVDFEEDTLPKVSGQNEGQQTIEEDTTPCG實施例2介紹金黃色葡萄球菌(SA)對於大多數哺乳動物物種來說是引起創傷中、乳腺中急性和慢性感染或者引起人醫院感染的病原體，所述創傷包括由外科治療而引起的創傷。SA經常對抗生素具有抗性，一種選擇是至少用於預防的疫苗，儘管已有許多嘗試用包括全細胞、毒素、多糖和粘附因子來配製疫苗，但是迄今為止還沒有有效的疫苗。為了成功製得抵抗有引起慢性感染傾向之病原體的疫苗製劑，當應用非複製性抗原時，佐劑系統的輔助是必要的。因此，作為疫苗抗原受關注並測試的SA的很多成分包括粘附因子、碳水化合物(多糖)和毒素都已失敗，這也許是由於缺少所涉及物種能夠接受的合適的佐劑。在此實施例中，我們選擇了粘附因子即纖連蛋白結合蛋白(FnBp)，其被認為可以阻斷粘附但可能更重要的在於其是吞噬作用的靶標，前提是如果誘導了促進這種活性的FnBp的恰當抗體(調理性抗體)。此外，基於iscom技術，已經用多種佐劑製劑，包括對敏感性物種可接受的佐劑製劑，來補充FnBp。因此，不同的動物物種需要不同的佐劑製劑，包括不同的皂苦。例如牛類物種(bovinespecies)對QuilA或Q-WAC類型的半純化皂苷有非常良好的反應，這對其它物種來說也許是有毒性的。其它動物物種例如貓或小鼠或人有不同程度的敏感性並且需要幾乎無毒的製劑例如QMIX(QV-MIX,瑞典專利申請0202110-3-QV-MIXPCT/SE03/001180)或者QWT製劑(QWT，瑞典專利申請0301998-1PCT/SE03/00586)，或者組分C-基質製劑(ref)。後者被用於獸醫學中以;5LA臨床試驗中。其目種中IgG2a，而IgGl可能促進抗-粘附和中和效應。在本實施例中分析這些免疫學特性。應注意的是，對於如果不是全部也是大部分哺乳動物物種來說，SA是重要的病原體，並且由乳腺炎疫苗產生的結果已經對在包括人在內的其它物種中SA引發疾病產生了影響。根據幾種因素，包括地方林和臨床情況，疫苗抗原的組成可以在抗SA感染和SA所引起疾病的疫苗中有變化。粘附至纖連蛋白介導感染過程中的重要因素，並且這種蛋白質存在於幾乎所有SA分離林中。粘附阻斷和中和作用是通過抗體由IgGl實現的作用，而lgG2a對於作為抗SA的主要免疫保護性機制的吞噬作用是重要的。所提及的亞類反映鼠免疫球蛋白系統，而例如IgG2a相當於人的IgG3。通過反映Thl和Th2應答的IgG免疫球蛋白類型之間的平衡來分析小鼠中對用QWT-基質製劑作為佐劑的強候選疫苗FnBp的免疫應答。試驗方案依照表l:l中所述免疫18g雌性Balb/c小鼠。根據早先有關免疫原性的試驗來確定抗原劑量。選擇不誘導高應答的低劑量，以便於察看所添加佐劑的影響。用任一種所述FnBp佐劑製劑在小鼠尾根處經皮下(s.c.)並間隔4周對所述小鼠進行免疫。在第3周和第6周釆集用於血清檢測的血樣。所有動物接受1ngFnBp並且佐劑成分是組1無佐劑；組2Al(OH)3;組3基質誦Q6組4基質-Q2ng。第6周時IgGl和lgG2亞類的抗原特異性抗體應答被顯示在圖1:1中。通過ELISA測量抗體水平並表示為在y軸上讀出的稀釋曲線陡峭部分在OD450的稀釋度(101og)(圖1:1)。結果第一次免疫後無佐劑的和以氫氧化鋁為佐劑的FnBp幾乎不誘導可檢測的血清抗體應答。以任何iscom佐劑製劑為佐劑的各種FnBp製劑誘導針對FnBp的可檢測應答。第二次免疫之後(圖1:1)IgGl應答在用以iscom基質為佐劑的FnBp免疫的小鼠組中是很高的(>101og4)。在給予基質-Q或者給予基質MIX的小鼠組中很高，小鼠個體之間的效價分布沒有多少差距，然而在給予基質C製劑中FnBp的小鼠組中4艮高。用氫氧化鋁佐劑的FnBp與用其它佐劑的FnBp製劑;J目比，IgGl血清抗體水平應答明顯更低，4且在個體動物之間ELISA效價呈很大的離散分布。用無佐劑製劑免疫的小鼠具有低IgGl應答。第二次免疫之後(圖1:1)IgG2a應答在用以iscom基質為佐劑的FnBp免疫的小鼠組中是很高的(>101og4)。在給予基質-Q或者基質MIX的小鼠組中很高，小鼠個體之間的效價分布沒有多少差距，然而在給予基質C製劑中FnBp的小鼠組中其分布卻很寬。用無佐劑FnBp或者用氫氧化鋁佐劑的FnBp免疫的小鼠應答具有幾乎不可檢測的IgG2a血清抗體水平。討論很清楚的表明iscom製劑有能力調節包括TH1和TH2類型免疫應答在內的平衡的免疫應答，這對於誘導抵抗持久性和慢性感染的保護作用是必須的。迄今為止在SA疫苗中所用的佐劑製劑還缺少這種能力。結論對SA和FnBp來說兩種感興趣的製劑是適於大型動物比如牛的基質Q和幾乎沒有副作用並且例如適於貓和人的不同顆粒中的低毒基質C和基質A。這兩種製劑誘導高水平的和平衡的IgGl和IgG2反應。實施例3介紹抗SA疫苗可以包括或者甚至需要各種疫苗成分，包括全細胞、毒素、多糖和粘附因子，其中每一種都有助於免疫保護作用。在本實施例中用如實施例2中的不同佐劑製劑檢驗破傷風類毒素(TT)以研究它們對毒素的免疫增強作用。試驗方案依照表2:1中所述免疫18g雌性Balb/c小鼠。根據早先有關免疫原性的試驗但又不誘導非常高應答來確定抗原劑量，以便於察看所添加佐劑的影響。用任一種所述TT佐劑製劑在小鼠尾根處經皮下並間隔4周對所述小鼠進行免疫。在第3周和第6周採集用於血清檢測的血樣。所有動物接受0.5Lf/劑量並且佐劑成分是組l無佐劑；組2Al(OH)3;組3基質-Q6ng;組4基質-Q2jig。第6周時IgGl和IgG2亞類的抗原特異性抗體應答被顯示在圖2:1中。通過ELISA測量抗體水平並表示為在Y軸上讀出的稀釋曲線陡峭部分在OD450的稀釋度(101og)(圖2:1)。結果第一次免疫後無佐劑的和以氫氧化鋁為佐劑的TTi秀導可檢測的血清抗體應答，正如用各種以任何iscom製劑為佐劑的TT製劑一樣。第二次免疫之後(圖2:1)IgGl應答在包括無佐劑的TT在內的所有小鼠組中是很高的(>101og4)。在給予以iscom基質製劑為佐劑的TT的小鼠組中觀察到稍微更高的抗TT抗體水平並且在小鼠個體之間效價分布很少展開。第二次免疫之後(圖2:1)IgG2a應答在用以iscom基質為佐劑的TT免疫的小鼠組中是很高的(>101og5)。在給予以基質Q或基質MIX為佐劑的TT組中的小鼠所作應答具有最高的IgG2a水平並且在小鼠個體之間效價分布很少展開。用無佐劑TT或以氫氧化鋁為佐劑的TT免疫的小鼠所作應答沒有或者幾乎沒有可檢測的IgG2a血清抗體水平。討論TT對於Th2型應答有很強的抗原性能力。氫氧化鋁也調節針對Th2型的免疫應答。該實施例表明iscom製劑克^L了TT的強免疫調節作用並且能夠誘導對於該毒素的平衡的Thl-Th2應答。對於抗誘導慢性或持久性感染的病原體的疫苗來說重要的是，控制該病原體調節宿主中免疫應答的內在能力，這對於弱佐劑來說是不能實現的。結論該實施例表明iscom製劑有能力調節"強毒素抗原"免疫應答為平衡的免疫應答，這對於實現免疫保護可能是必需的。對於SA以及其它病原體來說，毒素是重要的致病性因素，因此可能需要獲得強效的疫苗。實施例4SA產生大量的毒素，其中一些具有強免疫原性，另一些具有相對弱的免疫原性。它們中任何一種都可能是獲得非常寬保護能力的疫苗所需要的疫苗抗原。相比較TT而言，白喉類毒素(DT)是相對弱的抗原。在該實施例中，用如實施例2和3所示的不同佐劑製劑來檢驗弱抗原以探究它們對DT型毒素的免疫增強作用。試驗方案依照表3:1中所示免疫18g雌性Balb/c小鼠。根據早先有關免疫原性的試驗但又不誘導非常高應答的原則來確定抗原劑量，以便於察看所添加佐劑的影響。用任一種所述DT佐劑製劑在小鼠尾根處經皮下(s.c.)並間隔4周對所述小鼠進行免疫。在第3周和第6周採集用於血清檢測的血樣。所有動物接受1jigDT並且佐劑成分是組1無佐劑；組2Al(OH)3;組3基質-Q6ng;組4基質-Q2ng。第6周時IgGl和IgG2亞類的抗原特異性抗體應答被顯示在圖3:1中。通過ELISA測量抗體水平並表示為在Y軸上讀出的稀釋曲線陡峭部分在OD450的稀釋度(101og)(圖3:1)。結果第一次免疫後只有用以基質MIX製劑為佐劑的DT免疫的小鼠具有可檢測的血清抗體應答。第二次免疫之後(圖3:1)IgGl應答在用以氫氧化鋁以及基質混合為佐劑的DT免疫的小鼠中最高(>101og3.5)。第二次免疫之後(圖3:1)IgG2a應答在用以基質MIX為佐劑的DT免疫的小鼠組中是很高的(約lOlog4)，其具有最高的抗體應答水平，即比其它組中小鼠高出幾乎50倍或更高的效價，並且效價分布範圍較窄。用無佐劑DT或者用以氫氧化鋁為佐劑的DT免疫的小鼠沒有或幾乎沒有可檢測的IgG2a血清抗體應答水平。討論DT是一種比TT(實施例3)弱的抗原，並且無佐劑DT甚至在兩次免疫之後沒有誘導可檢測的IgGl或IgG2，即既沒有Th2型應答也沒有Thl型應答。調節Th2型免疫應答的氫氧化鋁使對DT的應答增強到易於檢測到的IgGl水平。本實施例表明iscom製劑增強並且也調節針對DT的免疫應答至Thl和Th2之間平衡的應答。尤其是"低毒"基質MIX對於刺激IgGl和IgG2都是高效的，即強效並平衡的免疫應答。因此，iscom製劑能夠高效調節對強抗原以及弱抗原的免疫應答。結論實施例2和3表明iscom製劑高效增強並調節毒素的免疫應答，無論這些毒素是弱抗原還是強抗原，並且驅動例如偏向於Th2的毒素抗原趨於平衡的Thl-Th2應答。這樣的能力在可由SA抗原製劑構成的複雜抗原系統中是重要的。實施例5用以iscom基質為佐劑的金黃色葡萄球菌粘附因子FnBp的免疫接種試驗進行小規模現場試驗在Kungs汪ngen(KJL)，一個屬於AgricultureUniversityUppsala的農場中實施疫苗接種試驗，以在天然宿主即牛類物種中檢驗抗金黃色葡萄球菌(SA)的潛在疫苗。在奶牛中以及在相關物種綿羊和山羊中，當它們被用來進行乳品生產時，乳腺炎是嚴重問題。在乳品科學和生產中任何有經驗的人員，包括乳場生產人員、負責動物健康的獸醫以及需要高質量乳來生產不同乳製品的工廠，都充分認識到乳腺炎問題。為了控制乳腺炎的情況，通過主要用抗生素處理來加強而改進農場管理是第一選擇。SA是引起相關乳房病患和經濟問題最重要的病原體。尤其嚴重的問題是SA經常具有抗生素抗性，並且由於沒有治療方法而必須剔除受影響動物。抗生素治療乳腺炎的替代方案是免疫預防劑即使用疫苗。儘管有許多的嘗試，但是市場上沒有高效乳腺炎疫苗。開發乳腺炎SA疫苗的嘗試仍是徒勞無功的並且在嘗試開發在不同情形中針對其它物種的SA疫苗中也是如此，例如抗狗療病或者抗人醫院感染。因此，高效的抗SA乳腺炎疫苗將從疾患中挽救受影響動物並且在經濟上對於乳場、對於乳品工業以及對於它們的消費者都具有極好的作用。選擇粘附因子，纖連蛋白結合蛋白質(FnBp)，是因為它存在於幾乎100%的SA分離林中。在早先的試驗(Nelsonetal.1991)中，FnBp被摻入iscom中。用這種SA乳腺炎試驗性疫苗獲得了有希望的結果。相反地，繼續試驗沒有獲得所期望的結果並且該計劃由此而被停止。失敗的原因是由於免疫性短暫並且也可能是由於在乳腺中的不充分免疫應答。本疫苗接種試驗的目標是研究進一步開發用基於iscom技術的製劑為佐劑的FnBp疫苗的可能性。關注點是引起全身性和局部性免疫應答的最佳施用模式，其中在血清中測量全身性應答，在乳腺中測量局部性應答。因此，為了獲得對於候選疫苗潛力的更好預測，對來自乳房的局部分泌物(乳清)也實施免疫學分析。對免疫應答的評價包括血清和乳清中的抗體應答，其包括IgGl、IgG2和IgA應答，還調查抗體對SA細胞吞噬作用的增強。IgG2促進吞噬作用，這是抗SA的最重要防禦機制。局部產生的IgA抗體也是在黏膜表面中抵抗侵入者的重要防禦因子。應注意的是，先前的試驗沒有分析乳腺中的免疫應答，很可能是因為之前的疫苗在乳清中沒有誘導明確可檢測的免疫應答，這種應答將令人信服地支持該試驗。已經認識到大體積乳的稀釋作用會掩藏在乳腺中引起的免疫應答。疫苗試驗方案以及材料和方法較大蛋白質的16kD片段的纖連蛋白結合蛋白質(FnBp)片段包括負責粘附纖連蛋白的DD區。所述多肽在大腸埃希氏菌中表達並且從BiostaproAB獲得。它與早先的基於較短69-80kD蛋白質的產物(Nelsonetal.1991)不同。此外，在早先的產物中，FnBp被摻入iscom基質中從而形成iscom。在本試驗性疫苗中，所述疫苗的製備不涉及將FnBp包括在基質中從而形成iscom的步驟。避免摻入過程的好處在於提供更簡單和更經濟的生產系統。因此，本發明製劑在兩個方面不同於早先所檢驗的FnBpiscom4吳選疫苗。Iscom基質由IsconovaAB提供。細菌學檢驗乳樣品的細菌學檢驗在7Vfl&》Am/FWcVmo^/"W似^(SVA)的乳腺炎實驗室中進行。試驗方案抗原FnBp選擇在大腸埃希氏菌中生產的rDNA產物，這是根據早先的積極經驗(Nelsonetal-)，但是構建體更短。最好用確定抗原輔助免疫學評價。將進入其第一哺乳期的10隻小母牛用作試驗動物以儘可能避免早先SA感染的經歷，這更可能在較高齡牛中發生，這會使對疫苗接種難以進行免疫學評價。三種不同的施用模式被檢驗。因為乳房是一種具有很大黏膜區的器官，據此認為黏膜免疫在乳腺中是重要的。與例如人和豬相比，在牛中沒有腸乳腺聯繫(個人通信Holmberg)，即疫苗抗原的口服施用(即在消化道中)將在豬的乳腺中誘發免疫應答但在牛中卻不會。在本試驗中使用兩種黏膜施用模式，即通過鼻內(i.n.)或通過陰道內(i.vag.)途徑施加初始劑量。這些初始免疫(priming)模式的作用與在上乳腺區域中經皮下免疫的初始免疫進行比較。3至4周後經皮下途徑對所有動物施用第二劑量。使用這樣的免疫方式的目的在於探究是否在上呼吸道區或生殖道與乳腺之間存在聯繫。對免疫保護重要的是，黏膜(局部)免疫應答以及在乳腺中誘發正確類型的抗體類型。免疫方案包括在產犢前2-4周實施初始免疫。三隻動物通過鼻內(i.n.)施用、三隻動物通過陰道內(i.vag.)施用模式和四隻動物在上乳腺區經皮下途徑實施初始免疫。在乳腺定位的淋巴結引流處在上乳腺區(supramammalregion)中通過皮下模式在產犢後對所有動物實施第二次免疫。採樣.如圖(4:1至4:2)中所示，在第一次免疫時和隨後定期開始時釆集用於血清和免疫學分析的血液。對用於細菌學和免疫學分析的乳清的採集在分娩後開始，接下來如對血液所述。細菌學分析在SVA進行並且僅有一次從經鼻內途徑初始免疫的一個動物的乳樣品中分離到SA。它恰好是在第二次免疫之前。免疫學分析包括測量ELISA中的抗體應答(見上)。詳細的結果顯示在圖4:1至4:4中。吞噬作用分離和純化白細胞從牛血中分離和純化白細胞通過Ficoll離心方法進行，參見以下描述Guidryetal1993JDairySci76:1285-1289和Leeetal2005CanJVetRes69:11-18。細胞被重懸在Hanks^i^溶液(HBSS)中，檢查其活力，並將其濃度調節至10xl(^細胞/ml。所選的金黃色葡萄球菌菌林首先培養在瓊脂平板上並且隨後在胰蛋白腖大豆肉湯(TSB)(最少IOOml)中在37X:下培養18小時。通過在60t:水浴中孵育30分鐘殺死細菌。用鹽水洗滌3次後，細菌懸液在540nm處光密度為2.0時被調節至1:10的稀釋度。細菌的FITC標記才艮據Leeetal2005CanJVetRes69:11-18的描述進行。FITC標記的細菌在含0.15mM釣、1mM鎂和0.1%明膠的巴比妥緩衝鹽溶液(GVBS)中洗滌3次，在540nm處OD為1.350時按1:10稀釋度來確定其濃度並且最後在-80"C下以1ml等分將其保存在GVBS中直至應用。吞謹作用;FITC標記的細菌被融化並在2.4A超聲處理30秒，並且濃度被調節至1x109/ml。根據Leeetal2005CanJVetRes69:11-18的描述，用在兩次免疫之前和之後收集的未經稀釋或者在HBSS中1/4稀釋的50nl待;^r血清孵育細菌懸液和細胞。對照包括在HBSS中孵育的細菌懸液，以及沒有血清與的細胞懸液一起孵育的細菌懸液。在4予細振蕩下在37匸孵育30分鐘。通過加入含0.02%EDTA的冰冷鹽水來停止吞噬作用。在顯微鏡下檢查之前，用1。/。亞甲藍處理細胞以淬滅額外的細胞螢光。在螢光顯微鏡下對最少200個細胞實施檢測並且確定細胞與細菌的比例。結果經陰道內途徑(圖4:1)實施初始免疫的動物顯示出低的或者沒有血清抗體應答。在乳清中，第一次免疫接種後記錄到抗FnBp抗體，以lgG2和IgA亞類為主。在加強免疫之前沒有收集乳樣品，因為在產犢之前沒有乳產生。在經皮下強化免疫之後，在血清和乳中抗FnBp的抗體應答持續期4艮短並且以IgG2和IgA為主。在來自經鼻內途徑實施初始免疫的動物的血清中檢測不到或幾乎檢測不到應答(圖4:2)。在乳清中所記錄的抗FnBp的抗體主要為IgG2和IgA亞類。經陰道內模式給予初始免疫的所有動物都有應答。在經皮下加強免疫之後，在血清和乳清中動物之應答具有明確的抗體升高。最高應答是lgG2和IgA亞類。抗體水平朝向試驗期結束時而下降。經皮下模式施用進行初始免疫和加強免疫的動物在血清和乳清中獲得了IgGl和甚至更高水平的IgG2以及也很高的IgA(圖4:3)。加強免疫後血清和乳清中高水平的IgGl和甚至更高水平的IgG2以及也高水平的IgA指示局部在乳房中和循環血液中保護性免疫的質量。重要的是，血清抗體在整個試驗周期即7-10個月中持續。同樣，乳清抗體水平在試驗周期中持續即高達8個月，i^明本試驗性疫苗接種將覆蓋整個哺乳期，這對於保護性乳腺炎疫苗是重要的。對來自經皮下途徑免疫兩次的組中牛的血清進4亍吞喧作用測量。與細菌和在第一次免疫之前收集的血清一起孵育30分鐘後，有30%的PMN細胞顯示出吞噬作用。與細菌和第二次免疫後收集的血清一起孵育30分鐘後，有增加至51%的PMN細胞顯示出吞喧作用。有4。/。PMN細胞與細菌但無血清一起孵育時顯示出吞噬作用。不經與細菌和第二次免疫後收集的血清一起孵育有2%的PMN細胞顯示出吞嗟作用。討論抗體應答在其類型和亞型的分布對於獲得最佳的免疫保護作用是極其重要的。一般認為IgG2抗體對於對抗SA感染具有最大的重要性，因為該亞型促進對細菌的吞噬作用。所有形式的免疫接種既促進乳清中也促進血清中IgG2和IgA的FnBp特異性抗體。在來自經陰道內和鼻內初始免疫動物的血清和乳清中具有相當低水平的抗體應答。意料之外的是，通過應用以iscom基質為佐劑的FnBp進行兩次皮下免疫，其在血清和乳腺分泌物中誘導了高抗體水平，其中包括IgGl、IgG2和IgA亞型。這些程度和性質的免疫應答還沒有在先前使用SA疫苗或任何其它疫苗的牛乳腺中被顯示出。同樣，在血清中這些Ig亞類也被記錄。與早先檢驗過的短持續期的試驗性疫苗(Nelsonetal.1991)相比，皮下施用模式誘導長期持續並且更優的免疫應答(圖4D)。特別受關注和有價值的是在乳腺中的強效免疫應答，這在先前所檢驗的抗SA候選疫苗中沒有描述。來自功能性吞噬作用檢驗的結果突出表明誘發了重要的免疫保護特性。iscom基質的強效免疫增強作用是沒有預料到的並且其通iti^免FnBp多肽與iscom基質偶聯的步驟而有利於高效的疫苗生產。有兩種纖連蛋白結合蛋白質FnBpA和FnBpB，它們具有相似的構成。Nelsonetal所用的構建體由60-65kD的蛋白質組成，其與來自葡萄球菌蛋白A的兩個IgG結合結構域相偶聯從而形成融合蛋白zzFnBpA以及zz-FnBpB,其中zz-FnBpB包含推測的T細胞表位，zzFnBpA與包含推測T細胞表位的另一部分相連而形成zz-FnBpA-T。這些多肽與iscom相偶聯(L6vgren，K.，Lindmark，J"Pipkorn，R.andMorein，B(1987)J.Immunol.Methods98.)。我們已經使用了這些多肽並發現它們被片段化。對於Nelson構建體限制性的一個原因，我們認為是由於這種片段化的趨勢所引起的。本發明的16kDFnBp片段更加穩定並且包^進與纖連蛋白結合的重要的DD區重複片段。結論在兩次皮下免疫之後，補充iscom基質製劑的截短型FnBp構建體在乳腺和血清中誘導高水平的高質量免疫應答。所期望的疫苗在牛乳腺中誘導抗SA感染的免疫保護作用具有強的免疫學標準。該技術能實現對於所期望疫苗重要的高效生產系統。實施例6全SA細胞以及a和|3溶血素對針對FnBp和毒素的免疫應答的作用SA引起慢性和持續的感染，其通迚基於"掩蔽"感染和對從宿主免疫系統中存活所必要成分的能力而由病原體的固有特性所促進。此外，引起持續和慢性感染的病原體具有指導宿主免疫反應從而允許其持續的能力。SA包含大量具有免疫調節特性的不同組分並且不合適的組合物可以引起針對包括在疫苗組合物內的一種或所有抗原的低免疫應答。如上所述，有許多可作為SA候選疫苗的組分。首先的策略是應用分離自病原體的組分或由細胞(在此為大腸埃希氏菌)表達作為分離林疫苗抗原所產生的組分。第二種方法是應用強效的佐劑，在本情況中為iscom基質。疫苗組分的一個有希望類別是毒素。在來自乳腺炎的SA分離抹中非常頻繁地鑑定出a和p溶血素(對於p溶血素，在100%情況中)，這種事實^f吏得它們成為強有力的候選疫苗。這兩種毒素都是外泌產物並且能夠從SA生長的培養液中收集。在本試驗中，如材料和方法中的安排，SA細胞與含a和p溶血素的培養液在疫苗組合物中與FnBp混合以探究在該組合物中FnBp和所述毒素的免疫原性。材料和方法試驗方案。才艮據下面的免疫方案，對位於瑞典南部6vedsKloster的4-7個月大的25隻小牛以4周間隔實施3次免疫。由RolandM6Uby教授領導的KarolinskaInstitutetMTC細菌學部生產並友好提供SA細*與含a和p溶血素的培養液。如下表所述，在頸側肩胛骨前部經皮下用200fig的FnBp或者FnBp和108金黃色葡萄球菌細胞/劑量以及a和p溶血素各50照的混合物實施免疫。所有疫苗製劑用1mg/劑量的iscom基質作為佐劑。劑量體積是2ml。抗動物組檢驗5FnBp和毒素5FnBp和毒素5FnBp和毒素5FnBp和毒素E/PBSPBSPBS5FnBp和毒素Fn:FnBp，S:金黃色葡萄球菌細胞以及a和p溶血素，PBS:磷酸鹽緩沖液為了獲得有關免疫應答達到最高限度的額外信息，以及有關反覆免疫後可能的抑制的信息，實施了笫三次免疫。如上所述，通過ELISA對血清實施針對FnBp抗體應答的評價。我們需要了解SA全細胞+毒素對FnBp是否具有支配作用即抑制抗FnBp的免疫應答。在由RolandM611by教授領導的KarolinskaInstitutetMTC細菌學部實施針對a和p溶血素的中和試驗。結果在本實施例中，小牛的年齡小於l歲，並且它們對補充SA細胞以及a和p溶血素的FnBp不產生應答或者產生的應答只具有非常低的抗體效價。通過ELISA測量的關於組1的針對FnBp的免疫應答顯示在圖5:1中。在第一次免疫後，僅在組l中只用FnBp以及用iscom基質作為佐劑的FnBp免疫的動物產生IgM以及IgG抗體應答。在第一次加強免疫後，在單獨用FnBp接種的動物中記錄到IgM、IgGl和IgG2應^r有明顯的增加。在用包含FnBp和金黃色葡萄球菌細胞以及a和(5溶血素的組合物進行初次免疫的動物中，沒有動物顯示出針對FnBp的免疫應答(未顯示)。第三次免疫後進行檢驗。針對a和p溶血素的免疫應答在功能性即毒素中和試驗中進行測量。該結果顯示在圖5:2中。第一次免疫後，在用包含SA細胞和毒素的疫苗組中即B、C和D組的動物中記錄到低IgG應答。在第二次免疫時抗體水平下降。第二次免疫後，已接受兩劑量毒素的動物即組C和D中的動物產生具有高中和效價的應答。討論本試驗表明金黃色葡萄球菌細胞與a和p溶血素的混合物抑制針對FnBp的免疫應答。相比較而言，所有動物產生抗a和p溶血素的高中和抗體的應答。不清楚的是，是否毒素或者培養液中其它產物或者全細胞或者兩者的組合引起這種下調。在本試驗中的動物年齡小於一歲。在後來的試驗中，所述動物超過一歲最大兩歲並且接受或者補充SA細胞或者補充a和(J溶血素的FnBP,這些動物產生針對FnBp的高水平抗體應答(見實施例7)。在本試驗中注意到的抑制似乎是基於主動免疫應答即具有記憶性，因為組B中的動物對第二次施用沒有作出應答。相比較而言，a和p溶血素在所有試驗的疫苗抗原組合中誘導強免疫應答，這提示毒素和FnBp的組合是相容的並且可行的疫苗組合物。全SA細胞在疫苗組合物中的可能應用需要進一步研究。實施例7的結果指出當SA細胞或者a和p溶血素包含在所述疫苗製劑中時，年齡較大的小牛或母牛對疫苗抗原可能不對疫苗抗原有抑制反應。結論先前的試驗已經顯示用iscom基質為佐劑的FnBp在牛類物種中具有高度免疫原性，這在本實施例中被證實。在本實施例中，當FnBp同時補充SA細胞以及a和p溶血素時，對FnBp的免疫應答^皮下調。可以從實施例7中總結出，當測量抗FnBp的抗體應答時，聯合FnBp與a和p溶血素的疫苗組合物具有高免疫原性，並且FnBpSA細胞的聯合疫苗也是如此。可以想到，在用FnBp並補充SA細胞以及聯合a和p溶血素對較年輕動物進行免疫觀察到有抑制，而對於超過一歲的牛則不產生抑制反應。實施例7在實施例6中，我們已經觀察到在試驗性疫苗中a和p溶血素與全SA細胞的混合物下調針對第三組分即FnBp的免疫應答。因為a和(5溶血素以及全SA細胞都包括在內，不清楚是毒素與細胞中的一種或另一種或者其組合負責這種抑制作用。在本實施例中，通過將FnBp與毒素或全SA細胞進行組合，進一步研究了各自的抑制、相容性或增強作用。為此目的，如材料和方法中所述來實施試驗。所有的試驗疫苗都用iscom基質為佐劑。材料和方法試驗方案根據下面的免疫方案，對位於瑞典Uppsala東部MostaFarm的1-2歲齡的15隻小牛以6周間隔實施2次免疫。由RolandM611by教授領導的KarolinskaInstitutetMTC細菌學部生產並友好提供SA細菌以及含a和p溶血素的培養液。如下表所述，在頸側肩胛骨前部經皮下用200ng的FnBp或者FnBp與1S金黃色葡萄球菌細胞/劑量的混合物或者FnBp與a和p溶血素各50jig的混合物實施免疫。所有的疫苗製劑用1mg/劑量的iscom基質為佐劑。劑量體積是2ml。免疫方案抗動物組檢驗A/FnBpFnBp5FnBp和毒素B/SA+FnSA+Fn5FnBp和毒素C/Tox+FnTox+Fn5FnBp和毒素D/PBSPBS5FnBp和毒素Fn:FnBp，S:金黃色葡萄球菌，Tox:a和P溶血素，PBS:磷酸鹽緩沖溶液結果通過ELISA測量的針對FnBp的免疫應答顯示在圖6:1中。在第一次免疫後三周，所有動物產生的應答具有相當高的抗FnBp抗體效價，其中包括所有檢驗的免疫球蛋白類型，即IgM、IgGl和IgG2。根據這種初級免疫應答，所有積累的經驗告訴我們，第二次免疫後將會產生IgG亞型應答的顯著增加。第二次免疫的數據正在處理中。討論本試驗顯示金黃色葡萄球菌細胞以及a和p溶血素的混合物分離開地不抑制針對FnBp的免疫應答。在實施例6中清楚的顯示毒素組分或者培養液中其它產物與全細胞聯合，下調所有檢驗的免疫球蛋白類型中的免疫應答。在實施例6中所證明的抑制似乎是基於包括免疫記憶細胞的主動免疫應答。在實施例6中也表明a和p溶血素在所有疫苗抗原組合中誘導強免疫應答，這提示毒素和FnBp的組合是相容的和可行的疫苗組合物。來自本實施例的結果表明，在疫苗組合物中使用全SA細胞是可能的，條件是在實施例6的某些組中檢驗的疫苗抗原組合物中引起抑制的因子被鑑定並從含全細胞的期望疫苗組合物中排除。應當注意，針對補充SA細胞以及a和p溶血素的FnBp的抗體應答是低的，it^明針對FnBp的免疫應答被抑制。應該注意，實施例6中小牛的年齡小於一歲，而實施例7中的動物年齡較大即l-2歲。較年輕的動物可能還具有未發育完全的免疫系統或者不由FnBp抗體反映的母體抗體。在很多製劑中，以iscom基質為佐劑的試驗疫苗已包括FnBp和毒素(見實施例3和4)。在小鼠模型中，引發了針對FnBp以及針對所包含毒素的非常強效的免疫應答。因此，所積累的結果有力地表明，包含粘附因子和其它成分並以iscom製劑為佐劑的期望疫苗製劑可i秀導強免疫應答。結論當FnBp或者與毒素或者與全SA細菌細胞相混合時，在將i^V哺乳期年齡的動物中誘導抗FnBp的高抗體水平。因此，基於幾種抗原成分的SA疫苗是可行的。表l:l用纖連蛋白結合蛋白質(FnBp)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周經皮下克疫兩次tableseeoriginaldocumentpage45低毒製劑由在分開顆粒中的0.6ng基質-C+3.4jig基質-A的混合物組成。表2:1用破傷風類毒素(TT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周經皮下免疫兩次tableseeoriginaldocumentpage45低毒製劑由在分開顆粒中的0.6pg基質-C+3.4照基質-A的混合物組成。表3:1用白喉類毒素(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周經皮下免疫兩次tableseeoriginaldocumentpage45低毒製劑由在分開顆粒中的0.6pg基質-C+3.4fig基質-A的混合物組成。權利要求1.一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結合結構域，以及至少一種iscom基質複合物和/或脂質體和/或至少一種脂質和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質和至少一種皂苷可處於複合物、溶液或者懸液之中。2.根據權利要求l的組合物，其中所述纖連蛋白結合蛋白、截短蛋白和/或肽包含一個或多個纖連蛋白結合結構域，其來自金黃色葡萄球菌(5yfl/;^v/0coccwsflM^ws)、酉良腺鏈球菌(iftfr/7tococc"s/7jogew^s")和停乳鏈球菌(5^CptoCOCCMSfl^S^fl/fl"/fl^)、無專L鏈球菌(iftf^p&COCCWSflg"/fl"/"e)和乳房鏈球菌(5^eptoo"wsw&n、)以及凝固酶陰性葡萄球菌。3.根據權利要求l-2中任一項的組合物，其中所述纖連蛋白結合結構域選自來自金黃色葡萄球菌的纖連蛋白結合蛋白A或B的D結構域、來自停乳鏈球菌的纖連蛋白結合蛋白A的A結構域、來自停乳鏈球菌的纖連蛋白結合蛋白B的B結構域、和來自釀膿鏈球菌纖連蛋白結合蛋白的P結構域。4.根據權利要求l-3中任一項的組合物，其中纖連蛋白結合蛋白、和/或截短的纖連蛋白結合蛋白和/或纖連蛋白結合肽被整合入脂質體中或者與iscom基質或脂質體相混合或者偶聯於脂質體或iscom基質上。5.根據權利要求l-4中任一項的組合物，其還包含至少一種另外的抗原。6.根據權利要求5的組合物，其中所述抗原是來自微生物的全細胞和/或抗原性成分的形式，所述微生物尤其是金黃色葡萄球菌、S良膿鏈球菌，停乳鏈球菌，無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌。7.根據權利要求5-6中任一項的組合物，其中所述抗原性成分選自不下調免疫系統的成分比如粘附素和成孔因子，以及下調免疫系統的成分比如超抗原、莢膜抗原、內毒素、外毒素和細胞外酶。8.根據權利要求7的組合物，其中所述粘附素選自聚集因子(clf)、外部纖維蛋白結合蛋白(efb)、針對纖維蛋白原的A和B粘附素、凝固酶(coa)、結合於纖維蛋白原的纖維蛋白原結合蛋白A、附著於纖維蛋白原的纖連蛋白結合蛋白(FnBp)A和B、結合於膠原蛋白的膠原蛋白結合蛋白(cna)、結合於彈性蛋白的彈性蛋白結合蛋白(ebpS)、結合於細胞外基質蛋白的MHC類似物蛋白(map或eap)、涉及細胞內粘附和生物膜形成的多糖細胞內粘附素(pia)、涉及可能逃脫宿主防禦的蛋白質A(spa)、抗吞噬作用分子的莢膜多糖(1、5、8和13型)(cap)、或Techoidacid。9.根據權利要求7的組合物，其中所述成孔因子選自a-溶血素、p-溶血素、y-溶血素、5-溶血素、涉及宿主細胞裂解的磷脂酶c(plc)、涉及組織侵入的彈性蛋白酶(s印A)和涉及組織侵入的透明質酸酶(hysA)o10.根據權利要求7的組合物，其中所述外毒素和細胞外酶選自腸毒素A國E、H(sea-e,h)、涉及靠超抗原和特性逃避宿主防禦的毒素休克症候群毒素-1(tst)、涉及逃避宿主防禦的剝脫毒素AB(eta、efb、etb)、涉及逃避宿主防禦的脂肪酶(geh)、涉及宿主吞噬細胞裂解、逃避宿主防禦的Panton-Vallentine殺白細胞素(lukF、lukS)、涉及逃避宿主防禦的葡萄球菌激酶(sak)。11.根據權利要求1-101中任一項的組合物，其中所述iscom基質複合物包含一種或多種來自QuilA的糖苷片段。12.根據權利要求11的組合物，其中至少兩種來自QuilA的糖苷片段是結合於不同iscom基質顆粒中的複合物。13.根據權利要求11-12中任一項的組合物，其中所述iscom複合物包含QuilA的亞片段A和/或亞片段C。14.根據權利要求1-10中任一項的組合物，其中所述iscom複合物包含粗製QuilA。15.根據權利要求1-14中任一項的組合物，其還包含至少一種影響乳房的抗原比如乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、克雷伯氏菌屬(/ir/AwW/flspp.)和大腸埃希氏菌(co/z)。16.根據權利要求1-15中任一項的組合物，其還包含製藥可接受的栽體、稀釋劑、賦形劑或添加劑。17.根據權利要求1-16中任一項的組合物在製備抗包含至少一個纖連蛋白結合結構域的微生物比如金黃色葡萄球菌.釀膿鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌的疫苗中的用途，尤其是其用於哺乳動物比如人、牛、綿羊或山羊，並且優選抗金黃色葡萄球菌。18.包括至少兩個區室的部件試劑盒，其中一個區室包含至少一種纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結合結構域，並且另一個區室包含使用說明和/或至少一種iscom基質複合物和/或脂質體。19.根據權利要求18的部件試劑盒，其還包含至少一種下調免疫系統的抗原和/或至少一種不下調免疫系統的抗原、和/或來自微生物的全細胞，由此所述至少一種不下調免疫系統的抗原、和所述至少一種下調免疫系統的抗原和/或所述全細胞可以置於用於在不同位點施用的不同區室中。20.根據權利要求18的部件試劑盒，其中一個區室包含至少一種來自地域性或局部性發生的金黃色葡萄球菌的抗原。21.根據權利要求18-21中任一項的部件試劑盒，其還包含抗生素。22.—種對個體接種疫苗的方法，其中向所述個體施用含有包含至少一個纖連蛋白結合結構域的至少一種纖連蛋白結合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽、以及至少一種iscom基質複合物和/或脂質體的組合物。全文摘要本發明涉及一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結合結構域；以及至少一種Iscom基質複合物和/或脂質體和/或至少一種脂質和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質和至少一種皂苷可處於複合物、溶液或者懸液之中。另外，本發明也涉及其在製備抗包含至少一個纖連蛋白結合結構域的微生物的疫苗中的用途。本發明也涉及其部件中包括至少兩個區室的試劑盒，其中一個區室包含至少一種截短的纖連蛋白結合蛋白和/或纖連蛋白結合肽，其包含至少一個纖連蛋白結合結構域，並且另一個區室包含使用說明和/或Iscom基質複合物和/或iscom複合物和/或脂質體。此外，本發明涉及用於個體疫苗接種的方法。文檔編號A61K39/39GK101107009SQ200680002650公開日2008年1月16日申請日期2006年1月20日優先權日2005年1月20日發明者卡塔琳娜·龍隆德,卡林·勒夫格倫-本特松,卡洛斯·巴斯丘南,吉爾·埃克斯特倫,布羅·莫雷因,比吉塔·弗羅姆格倫申請人:伊斯克諾瓦公司