針對菸草黑脛病的生防細菌及用量的篩選方法
2024-03-01 17:34:15
專利名稱：針對菸草黑脛病的生防細菌及用量的篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種針對菸草黑脛病的生防細菌及用量的篩選方法，屬於作物病害生物防治技術領域。
背景技術：
隨著社會的發展，人們對吸菸給身體帶來的危害越來越關注，對菸葉生產過程中化肥和農藥的施用量的控制越來越強烈，大量的研究表明，菸草的許多病害可以通過生防細菌來防治；且利用生防細菌防治植物病害是今後發展的重點方向；生防細菌防治植物病害的一個難點是高效生防細菌的篩選。現有生防細菌菌株的選取往往通過以下步驟實現的，採用培養皿對峙培養法篩選具有抑菌圈效果的細菌，然後再活體盆栽驗證其防病效果， 這種方法往往工作量大、速度慢、需要大量的試驗材料和勞動量，其周期一般為90天以上， 嚴重製約了生防細菌菌株的選取。同時許多生防細菌在離體平板上對病原菌具有抑制效果，而在活體上卻沒有防治效果；而有一些拮抗細菌在活體上有很好的防治效果，而在離體平板上卻沒有活性，因此採用培養皿對峙培養法篩選拮抗細菌存在許多漏洞，有一定機率會使好的生防細菌遺失，不利於植物病害生物防治的發展。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種篩選準確率高、工作量小、速度快、成本低的針對菸草黑脛病菌的生物防治細菌及用量的篩選方法，可以克服現有技術的不足。本發明的技術方案是針對菸草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法包括以下步驟
a、在一組以上的培養皿內培養無菌煙苗，直至煙苗兩片子葉完全展開；
b、在步驟a的基礎上，向培養皿中添加具有生防潛力的未知菌株培養液進行保護活性篩選；或在a步驟的基礎上，向培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液進行治療活性篩選；
C、待煙苗和具有生防潛力的未知菌株培養液一起培養M小時後，向培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液；或待煙苗和菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液一起培養24 小時後，向培養皿中施加具有生防潛力的未知菌株培養液；
d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天後通過觀察煙苗的發病情況來檢測添加的具有生防潛力的未知菌株培養液的防治效果，選出能夠防治菸草黑脛病的生防菌株。具有生防潛力的未知菌株是通過以下步驟得到的
a、從菸草種植大田的菸草染病區域中選該區域中無染病煙株的土壤和菸葉；
b、採用細菌傳統NA培養基，從所選取的土壤、葉片中分離不同顏色、形態、生長速率的細菌，將這些細菌再次劃線純培養；
c、b步驟所得單菌落菌株在NB液體培養基中震蕩過夜得具有生防潛力的未知菌株。所用的培養皿直徑為90mm。
在每個培養皿中添加的菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液的數量為ImlX IO5個/ ml ο在得到生防菌株後，將其配成細菌菌懸液，並將濃度分別為10 Cfu-IO9 cfu的細菌菌懸液加入到煙苗培養皿中，7天後通過觀察煙苗的發病情況來判斷對最佳的生防菌株和生防細菌的最佳防病濃度。濃度為10 Cfu-IO9 cfu的生防細菌培養液按濃度被分為5-20份添加到煙苗培養皿中，通過防病效果來篩選得到最佳細菌用量。所述的生防細菌為可以為現有已知的化學殺菌劑。在培養皿中鋪設有濾紙
與現有技術比較，本發明通過在培養皿內濾紙上種植無菌煙苗作為生防細菌篩選的活體對象，這樣就可利用活體對象直接對所選取的未知細菌是否具有生防效果進行篩選。同現有篩選方法相比，本法具有以下優點1、本篩選方法避免了培養皿對峙培養法篩選，這樣不僅可以節約大量人力、物力和時間；而且可以避免一些在離體平板上沒有效果，而在活體上有效果菌株的漏選；2、活體篩選在培養皿中的培養周期一般為7天，只需待兩片子葉完全展開即可使用，相對現有的活體盆栽驗證更加省時、省力，節約空間，且在培養皿中的活體生長環境可以更好的保持一致，使得試驗數據更加準確；3、因活體煙苗是栽種在培養皿內濾紙上的，使得整個試驗所需的空間大幅度減小，這樣可以同時對多種生防細菌進行篩選，且每組可以有多個重複，進一步提高試驗的準確性，可以在短暫的時間裡篩選大量的未知細菌菌株；4、本方法篩選生防細菌所花費的時間為一般為20天左右，費用為10元左右， 相對現有的篩選方法可以節約時間70天，費用300元左右。在篩選出生防細菌後，對生防細菌的使用量也可直接採用活體進行測定，採用此方法選取合適的用量相對現有使用量篩選方法它簡便、快速、工作量少、高效、同時篩選結果準確可靠，可以在短暫的時間對大量生防細菌的用量完成測試，且此方法也可以應用於化學殺菌劑用量的測定。
具體實施例方式實施例1 以菸草黑脛病為例來詳細說明本生防細菌的篩選，其步驟如下
a、在一組以上的培養皿內濾紙上種植無菌煙苗，一組培養皿的數量一般為3個，每皿種植煙苗(品種紅花大金元)12株，所用的培養皿直徑為90mm，在培養皿中添加營養液，時間一般為5-7天，待煙苗兩片子葉完全展開即可達到活體試驗的標準；
b、在得到活體試驗用的煙苗後，向培養皿中添加具有生防潛力的未知菌株培養液進行保護活性篩選；具有生防潛力的未知菌株是通過以下步驟得到的
(1)、從菸草種植大田的菸草染黑脛病區域中選該區域中無染黑脛病的煙株的土壤和菸葉；
(2)、採用細菌傳統NA培養基，從所選取的土壤、葉片中分離不同顏色、形態、生長速率的細菌，將這些細菌再次劃線純培養；
(3)、(2)步驟所得單菌落菌株在NB液體培養基中震蕩過夜得具有生防潛力的未知菌株。能夠防治菸草黑脛病的細菌菌株的獲得可在活體煙苗培養期間完成；
C、待煙苗和具有生防潛力的未知菌株培養液一起培養M小時後，向培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液，在每個培養皿中添加的菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液的數量為Iml X IO5個/ml。d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天後通過觀察煙苗的發病情況來檢測施加的具有生防潛力的未知菌株的防治效果，篩選出防治菸草黑脛病的生防菌株。在得到菸草黑脛病的生防菌株後，在NB培養液中培養獲得細菌懸浮液，並將濃度分別為10 Cfu-IO9 Cfu的細菌懸浮液添加到煙苗培養皿中，黑暗條件培養M小時後，在培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液，7天後通過觀察煙苗的發病情況來判斷生防細菌的最佳防病濃度。為減少試驗量，濃度為10 Cfu-IO9 cfu的生防細菌懸浮液按濃度可分為5-20份，如按9份來分，可將等體積的濃度為10、IO2、103、IO4、……IO9Cfu的生防細菌懸浮液加入到煙苗培養皿中，7天後確定效果最好的濃度範圍。實施例2 以菸草黑脛病為例來詳細說明化學殺菌劑甲霜靈防治此病害的濃度篩選，其步驟如下
a、在一組以上的培養皿內濾紙上種植無菌煙苗，一組培養皿的數量為7個，每培養皿內種植12株煙苗，所用的培養皿直徑為90mm，在培養皿中添加營養液，時間一般為5_7天， 待煙苗兩片子葉完全展開即可用於藥劑濃度的篩選；
b、配製25、12. 5,6. 25,3. 125、1. 5625,0. 78、0mg/L 系列濃度的甲霜靈藥液；
向培養皿中施加帶黑脛病病菌的遊動孢子懸浮液；在每個培養皿中施加的菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液的數量為ImlX IO5個/升。C、向煙苗培養皿中添加Iml不同濃度的甲霜靈藥液，待煙苗和藥液一起培養12小時後，向培養皿內濾紙上添加Iml X IO5個/ml的菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液，上述條件下繼續培養7天，通過觀察煙苗的發病情況來檢測不同濃度甲霜靈對菸草黑脛病的預防效果(保護活性測定)；
待煙苗和帶黑脛病病菌的遊動孢子懸浮液一起培養24小時後，向培養皿中施加含抗黑脛病性能的菌株培養液；
d、方法同c 一樣，待煙苗和菸草黑脛病病菌的遊動孢子懸浮液一起培養12小時後，向煙苗培養皿中添加Iml不同濃度的甲霜靈藥液，繼續培養7天，通過觀察煙苗的發病情況來檢測不同濃度甲霜靈對菸草黑脛病的治療效果(治療活性測定)。實施例3 以菸草黑脛病為例來詳細說明本生防細菌的篩選，其步驟如下
a、在一組以上的培養皿內濾紙上種植無菌煙苗，一組培養皿的數量一般為3個，每皿種植煙苗(品種紅花大金元)12株，所用的培養皿直徑為90mm，在培養皿中添加營養液，時間一般為5-7天，待煙苗兩片子葉完全展開即可達到活體試驗的標準；
b、在得到活體試驗用的煙苗後，向培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液進行治療活性篩選；
c、待煙苗和菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液一起培養24小時後，向培養皿中施加具有生防潛力的未知菌株培養液；具有生防潛力的未知菌株是通過以下步驟得到的
(1)、從菸草種植大田的菸草染黑脛病區域中選該區域中無染黑脛病的煙株的土壤和菸葉；
(2)、採用細菌傳統NA培養基，從所選取的土壤、葉片中分離不同顏色、形態、生長速率的細菌，將這些細菌再次劃線純培養；(3)、(2)步驟所得單菌落菌株在NB液體培養基中震蕩過夜得具有生防潛力的未知菌株。能夠防治菸草黑脛病的細菌菌株的獲得可在活體煙苗培養期間完成；
d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天後通過觀察煙苗的發病情況來檢測施加的具有生防潛力的未知菌株的防治效果，篩選出防治菸草黑脛病的生防菌株。在得到菸草黑脛病的生防菌株後，在NB培養液中培養獲得細菌懸浮液，並將濃度分別為10 Cfu-IO9 Cfu的細菌懸浮液添加到煙苗培養皿中，黑暗條件培養M小時後，在培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液，7天後通過觀察煙苗的發病情況來判斷生防細菌的最佳防病濃度。為減少試驗量，濃度為10 Cfu-IO9 cfu的生防細菌懸浮液按濃度可分為5-20份，如按9份來分，可將等體積的濃度為10、IO2、103、IO4、……IO9Cfu的生防細菌懸浮液加入到煙苗培養皿中，7天後確定效果最好的濃度範圍。
權利要求
1.一種針對菸草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法，其特徵在於該方法包括以下步驟a、在一組以上的培養皿內培養無菌煙苗，直至煙苗兩片子葉完全展開；b、在步驟a的基礎上，向培養皿中添加具有生防潛力的未知菌株培養液進行保護活性篩選；或在a步驟的基礎上，向培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液進行治療活性篩選；C、待煙苗和具有生防潛力的未知菌株培養液一起培養M小時後，向培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液；或待煙苗和菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液一起培養M 小時後，向培養皿中施加具有生防潛力的未知菌株培養液；d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天後通過觀察煙苗的發病情況來檢測添加的具有生防潛力的未知菌株培養液的防治效果，選出能夠防治菸草黑脛病的生防菌株。
2.根據權利要求1所述的針對菸草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法，其特徵在於 具有生防潛力的未知菌株是通過以下步驟得到的a、從菸草種植大田的菸草染病區域中選該區域中無染病煙株的土壤和菸葉；b、採用細菌傳統NA培養基，從所選取的土壤、葉片中分離不同顏色、形態、生長速率的細菌，將這些細菌再次劃線純培養；c、b步驟所得單菌落菌株在NB液體培養基中震蕩過夜得具有生防潛力的未知菌株。
3.根據權利要求1所述的針對菸草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法，其特徵在於 所用的培養皿直徑為90mm。
4.根據權利要求3所述的針對菸草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法，其特徵在於 在每個培養皿中添加的菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液的數量為ImlX IO5個/ml。
5.如專利要求1-4所述的針對菸草黑脛病的生物防治細菌用量的篩選方法，其特徵在於在得到生防菌株後，將其配成細菌菌懸液，並將濃度分別為10 Cfu-IO9 Cfu的細菌菌懸液加入到煙苗培養皿中，7天後通過觀察煙苗的發病情況來判斷對最佳的生防菌株和生防細菌的最佳防病濃度。
6.根據權利要求5所述的針對菸草黑脛病的生防細菌用量的篩選方法，其特徵在於 濃度為10 Cfu-IO9 cfu的生防細菌培養液按濃度被分為5-20份添加到煙苗培養皿中，通過防病效果來篩選得到最佳細菌用量。
7.根據權利要求5所述的針對菸草黑脛病的生防細菌用量的篩選方法，其特徵在於 所述的生防細菌可以為現有已知的化學殺菌劑。
8.根據權利要求1所述的針對菸草黑脛病的生防細菌用量的篩選方法，其特徵在於 在培養皿中鋪設有濾紙。
全文摘要
本發明公開了一種針對菸草黑脛病的生防細菌及其用量的篩選方法，該方法包括以下步驟a、在培養皿內濾紙上培養無菌煙苗，b、在步驟a的基礎上，向培養皿中添加具有生防潛能的細菌培養液；c、待煙苗和具生防潛能的細菌菌懸液一起培養24小時後，向培養皿中添加菸草黑脛病菌的遊動孢子懸浮液；d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天後通過觀察煙苗的發病情況來檢測添加的具生防潛力細菌的防治效果，篩選出能夠防治菸草黑脛病的生防細菌。本發明同傳統方法相比，具有許多優點，它簡便、快速、工作量少、高效、同時篩選結果準確可靠，可以在短暫的時間裡從大量未知細菌中篩選出具有生防功能的細菌。
文檔編號C12R1/645GK102277408SQ201110231990
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月15日 優先權日2011年8月15日
發明者夏海乾, 李文紅, 汪漢成, 王晶君, 石俊雄 申請人:貴州省菸草科學研究所