一種培養羊水細胞的無血清培養基及其製備方法與流程
2024-03-27 22:39:05 1
本發明屬於細胞培養基技術領域，具體涉及一種培養羊水細胞的無血清培養基及其製備方法。
背景技術：
產前診斷是優生學的重要組成部分，它是建立在遺傳諮詢基礎上通過產前檢測胎兒健康情況，對患有嚴重遺傳病、先天畸形的患兒可以及早採取措施，減少人群中有害基因積累，以減少患兒出生，提高人口素質，因此，具有十分重要的意義。產前診斷目前主要有孕早期絨毛組織取材、孕中期羊水和臍帶血、孕婦外周血分離胎兒細胞及植入前診斷等方法，但孕中期羊水細胞檢查仍是最主要的診斷方法。
羊水穿刺檢查的合適對象為高齡(大於34歲)、不良接觸史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色體異常兒分娩史、夫妻之一核型異常、B超示畸型、家族性連鎖遺傳病史、近親婚配等的孕婦。其中，高齡孕婦是主要檢查對象。羊水細胞培養後通過染色體顯帶技術，能夠辨別三體綜合症、平衡易位、倒位以及性染色體異常等染色體方面的疾病。成功的羊水細胞培養，除需要嚴格的實驗操作技術和經驗外，培養基的組成也是非常關鍵的。羊水細胞可能是胎兒皮膚、消化道、呼吸道及泌尿生殖道脫落的細胞，其中只有小部分是有活力的細胞(約0.1％),而活力細胞又以貼壁型細胞為主。如何能促其在體外培養中貼壁增殖，是成功培養羊水細胞的關鍵因素。
中國專利申請CN102618493A公開了一種羊水與絨毛細胞培養基，包含下列組分：基礎培養基，胎牛血清，生長因子，抗氧化劑、抗生素和緩衝系統。中國專利申請CN105039244A公開了一種低血清羊水細胞培養基，在基礎培養基RPMI1640/αMEM按1：1混合的基礎上，添加包括以下組分：胰島素、鹼性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、牛血清白蛋白、氫化可的松、α生育酚、NaHCO3、檸檬酸鐵、吐溫80、乙醇胺、油酸、亞油酸以及胎牛血清，其中，胎牛血清添加含量佔低血清培養羊水細胞的無血清培養基總體積不超過1％。
目前，對於羊水細胞的體外培養有的含有血清，含有血清的培養基無法規避動物血清中的異源體，如果使用動物血清培養基培育出來的細胞，會存在人體異源體排斥和衝突。有的培養基雖然不含有血清，但是存在培養成功率低，培養周期長等問題。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種培養羊水細胞的無血清培養基。本發明提供的培養羊水細胞的無血清培養基不含血清，避免了使用血清導致的異種成分引起的排斥現象，能更迅速有效地增加體外增殖的羊水細胞克隆數目和細胞增殖速度，大大縮短了羊水細胞培養周期，獲得更多的分裂相染色體數目。
本發明的技術方案是：
一種培養羊水細胞的無血清培養基，包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物14-38μg/mL，香菇多糖8-16μg/mL，人血白蛋白1-3mg/mL，胰島素0.4-0.8μg/mL，表皮生長因子24-35ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物5-12mg/mL，維生素B 30-40μg/mL，硬脂酸8-12μM，L-穀氨醯胺1-2μM，棕櫚酸5-8μM。
一種培養羊水細胞的無血清培養基，優選的方案是，包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物25μg/mL，香菇多糖12μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，胰島素0.6μg/mL，表皮生長因子30ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物7mg/mL，維生素B 36μg/mL，硬脂酸10μM，L-穀氨醯胺1.5μM，棕櫚酸6μM。
優選地，所述基礎培養基為DMEM或F12培養基。
另外，本發明還提供了所述培養羊水細胞的無血清培養基的製備方法，步驟如下：
S1向基礎培養基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，攪拌均勻，靜置20-40分鐘，加入酵母抽提物、香菇多糖、人血白蛋白、胰島素、表皮生長因子、維生素B、硬脂酸、L-穀氨醯胺和棕櫚酸，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為5-10％的氫氧化鈉溶液，調節培養基的pH至7.0-7.5，即得。
優選地，所述步驟S1靜置30分鐘。
優選地，所述步驟S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為7％的氫氧化鈉溶液。
優選地，所述步驟S2調節培養基的pH至7.2。
本發明提供的培養羊水細胞的無血清培養基，包括基礎培養基和添加劑，加入的添加劑包括：酵母抽提物、香菇多糖、聚乳酸-乙醇酸共聚物、維生素B等。本發明提供的培養羊水細胞的無血清培養基搭配合理，各成分間相互協調，共同作用，能夠更迅速有效地增加體外增殖的羊水細胞克隆數目和細胞增殖速度，大大縮短了羊水細胞培養周期，獲得更多的分裂相染色體數目。
與現有技術相比，本發明提供的培養羊水細胞的無血清培養基具有以下優勢：
(1)本發明提供的培養羊水細胞的無血清培養基不含血清，避免了使用血清導致的異種成分引起的排斥現象。
(2)本發明提供的培養羊水細胞的無血清培養基，能更迅速有效地增加體外增殖的羊水細胞克隆數目和細胞增殖速度，大大縮短了羊水細胞培養周期。
(3)本發明提供的培養羊水細胞的無血清培養基能夠在較短的時間內，獲得更多的分裂相染色體數，能夠滿足臨床檢測的要求。
(4)本發明提供的是一種無動物源性成分、成分確定的培養羊水細胞的無血清培養基，可以有效保證產品批次的質量穩定性，有利於產品標準化。
具體實施方式
以下通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這並非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的範圍之內。
本發明所用酵母抽提物可購自武漢信之德生物科技有限公司，食品級，DMEM培養基可購自Gibco公司，F12培養基可購自Gibco公司，香菇多糖可購自河南青甲貿易有限公司，食品級，聚乳酸-乙醇酸共聚物可購自上海納頓化工科技有限公司，型號LH050。
實施例1、一種培養羊水細胞的無血清培養基
所述培養羊水細胞的無血清培養基，包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物14μg/mL，香菇多糖8μg/mL，人血白蛋白1mg/mL，胰島素0.4μg/mL，表皮生長因子24ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物5mg/mL，維生素B 30μg/mL，硬脂酸8μM，L-穀氨醯胺1μM，棕櫚酸5μM。
所述基礎培養基為F12培養基。
製備方法：
S1向基礎培養基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，攪拌均勻，靜置20分鐘，加入酵母抽提物、香菇多糖、人血白蛋白、胰島素、表皮生長因子、維生素B、硬脂酸、L-穀氨醯胺和棕櫚酸，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為5％的氫氧化鈉溶液，調節培養基的pH至7.0，即得。
實施例2、一種培養羊水細胞的無血清培養基
所述培養羊水細胞的無血清培養基，包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物38μg/mL，香菇多糖16μg/mL，人血白蛋白3mg/mL，胰島素0.8μg/mL，表皮生長因子35ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物12mg/mL，維生素B 40μg/mL，硬脂酸12μM，L-穀氨醯胺2μM，棕櫚酸8μM。
所述基礎培養基為DMEM培養基。
製備方法：
S1向基礎培養基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，攪拌均勻，靜置40分鐘，加入酵母抽提物、香菇多糖、人血白蛋白、胰島素、表皮生長因子、維生素B、硬脂酸、L-穀氨醯胺和棕櫚酸，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為10％的氫氧化鈉溶液，調節培養基的pH至7.5，即得。
實施例3、一種培養羊水細胞的無血清培養基
所述培養羊水細胞的無血清培養基，包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物25μg/mL，香菇多糖12μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，胰島素0.6μg/mL，表皮生長因子30ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物7mg/mL，維生素B 36μg/mL，硬脂酸10μM，L-穀氨醯胺1.5μM，棕櫚酸6μM。
所述基礎培養基為DMEM培養基。
製備方法：
S1向基礎培養基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，攪拌均勻，靜置30分鐘，加入酵母抽提物、香菇多糖、人血白蛋白、胰島素、表皮生長因子、維生素B、硬脂酸、L-穀氨醯胺和棕櫚酸，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為7％的氫氧化鈉溶液，調節培養基的pH至7.2，即得。
對比例1、一種培養羊水細胞的無血清培養基
所述培養羊水細胞的無血清培養基，包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物25μg/mL，銀耳多糖12μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，胰島素0.6μg/mL，表皮生長因子30ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物7mg/mL，維生素B 36μg/mL，硬脂酸10μM，L-穀氨醯胺1.5μM，棕櫚酸6μM。
所述基礎培養基為DMEM培養基。
製備方法與實施例3類似。
與實施例3的區別在於，將香菇多糖替換為銀耳多糖。
對比例2、一種培養羊水細胞的無血清培養基
所述培養羊水細胞的無血清培養基，包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物25μg/mL，香菇多糖12μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，胰島素0.6μg/mL，表皮生長因子30ng/mL，聚乙烯醇7mg/mL，維生素B 36μg/mL，硬脂酸10μM，L-穀氨醯胺1.5μM，棕櫚酸6μM。
所述基礎培養基為DMEM培養基。
製備方法與實施例3類似。
與實施例3的區別在於，將聚乳酸-乙醇酸共聚物替換為聚乙烯醇。
試驗例一、本發明培養羊水細胞的無血清培養基對羊水細胞的培養效果
1、試驗對象：本發明實施例1-3所得培養羊水細胞的無血清培養基，以及對比例1和對比例2所得培養羊水細胞的無血清培養基。
2、試驗方法：
羊水細胞培養：收集羊水樣品(為17-22周齡之間的羊水樣品，每份0.5mL，共10mL)，混合均勻，得到檢測用羊水細胞收集樣品Ⅰ，比較不同培養基的培養效果。細胞培養、製片方法按以下步驟進行：
(1)在無菌條件下取羊水各2.0mL/管，共5管；
(2)以1500r/min室溫離心10分鐘；
(3)在無菌操作臺上吸去上清液，每管留0.5mL，吸管打散細胞。製成細胞懸液，再加入4.5mL培養基入管內，吸管輕混勻，移至25cm2方形一次性培養瓶中置含5％CO2的37℃溫箱飽和溼度行開放式培養；
(4)6天後鏡下觀察，可見成纖維樣或上皮細胞生長，當細胞生長旺盛，在貼壁細胞層的背景上出現圓形細胞時，此時換相應新鮮的羊水培養基5mL，48小時後，如細胞生長狀況好，加入秋水仙素0.05ug/mL(20ug/mL，7號針頭垂直豎加2滴)5h，進行細胞學處理；
(5)收穫細胞：倒出瓶中細胞液入10mL離心管，用0.85％NaCl溶液衝洗細胞壁兩遍，0.25％胰酶消化5分鐘，待細胞面出現肉眼可見皺形改變時即用吸管吹打下細胞，1500r/min室溫離心10分鐘，去上清，約留0.5mL；
(6)低滲：加入37℃0.075M KCl 5mL，吸管吹打，37℃水浴5分鐘；
(7)預固定：加入1.5mL甲醇：冰醋酸＝3：1固定劑，輕混勻，37℃水浴5分鐘，1500r/min室溫離心10分鐘；去上清留0.5mL；
(8)固定：加入3：1固定劑8mL，輕混勻，37℃水浴10分鐘，1500r/min室溫離心10分鐘；去上清，留0.5mL；
(9)重複固定：同上。1500r/min室溫離心10分鐘，去上清，視管底細胞量滴入固定劑；
(10)滴片、烤片：每片2滴，75℃烤箱烘烤3小時；
(11)培養結束，染色體製片前統計細胞克隆總數，包括有分裂相的克隆總數，以及有效克隆的大小；製備染色體後統計分裂相細胞數目；
(12)羊水細胞收集樣品Ⅰ培養7天後收穫，進行染色體製片。
3、實驗結果
本發明實施例1-3所得培養羊水細胞的無血清培養基，以及對比例1和對比例2所得培養羊水細胞的無血清培養基對羊水細胞的培養效果如表1所示。
表1：不同培養基對羊水細胞的培養效果比較
註：克隆大小判斷標準為：在100倍倒置顯微鏡下判斷觀察，克隆≥1個視野判斷為大克隆；克隆≤1/2個視野則判斷為小克隆；介於兩者之間的為中等克隆。總克隆數＝有分裂相的總克隆數+無分裂相的克隆數。
從表1可以看出，在相同的培養時間內，與對比例1和對比例2所得培養基相比，本發明實施例1-3所得培養基對羊水細胞的培養效果無論從總克隆數，還是分裂相細胞數目都有了大幅度提高。