一種新的微生物及其基因片段序列和應用的製作方法
2024-04-04 14:52:05
專利名稱：一種新的微生物及其基因片段序列和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從海洋或淡水水體微生物有益菌群中分離的新的放線菌，以及該放線菌的16SrRNA的基因序列和用途。
背景技術：
近年來，我國水產養殖業逐步從粗放式養殖過渡到集約化、規模化養殖，不僅增加了養殖的品種，而且大大提高了產量，豐富了人民的生活。但是由於集約化養殖規模不斷擴大，養殖水體汙染嚴重，養殖生態環境遭到破壞，導致水產動物的病害日益猖獗，嚴重製約了水產養殖業的發展。
長期以來，為防治病害的發生，化學藥物作為一種快速、有效、經濟的手段在我國得到大面積的廣泛應用，因此，水產動物病害防治主要依靠廣譜性抗菌素、消毒劑、重金屬鹽以及強氧化劑等，在生產上往往發生很多不利的因素，一是有些水產品由於長期使用抗菌素不但使病原菌產生耐藥性，增加了疾病防治的難度，而且藥殘損害消費者身體健康以及面臨水產品出口綠色貿易壁壘問題；二是大量使用消毒劑在殺滅病原菌的同時，也殺滅了水體中淨化水質的有益菌群、藻類等，嚴重破壞了水體微生物淨化系統，導致養殖水體日益惡化，嚴重破壞了生態環境。20世紀90年代以後我國引進了有效微生物菌群(EM)的基本技術，大量微生態製劑產品不斷出現，並作為某些化學藥物的替代品越來越廣泛地應用於水產養殖中，從微生態學觀點來防治病害發生，減少環境汙染，增進動物健康。但是微生態製劑的菌種往往局限於芽孢桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌和酵母菌等傳統菌種，這些菌種大多殺菌作用不強或無殺菌作用，且多數對常用抗生素敏感，雖然能在一定程度上或通過間接的方法來防治水產動物病害的發生，但其防治作用有限，治標不治本。
發明內容
針對現有技術中存在的問題與缺陷，本發明目的在於提供一種能夠產生抗菌物質或免疫增強活性成分，以防治水產動物疾病的發生，對藻類無殺滅作用，在水體中能夠大量地增殖，抑制水體中病原菌的繁殖以及分解水體中的有機物及殘餘餌料，消除致病微生物因子的滋生，改善養殖水體環境的新的放線菌。
實現上述發明目的的技術方案是一种放線菌DL2-F-5，分類命名是弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)，於2006年12月12日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，其保藏號為CCTCC M 206135。
本發明的另一目的是提供一種上述放線菌DL2-F-55菌株的16SrRNA基因片段序列。
本發明還有一目的是放線菌DL2-F-5菌株在水質改良劑和藥物組合物中的應用。
本發明還有一目的是放線菌DL2-F-5菌株作為添加劑動物飼料中的應用。
該株放線菌DL2-F-5是從大連海域海泥中，經分離、篩選獲得。
與現有技術相比，本發明的放線菌DL2-F-5菌株具有以下優點 1)放線菌DL2-F-5能夠產生抗菌物質或免疫增強活性成分，可以防治水產動物疾病的發生，並且對藻類無殺滅作用，避免了使用消毒劑或殺生劑對淨化水環境有益藻類的破壞； 2)在水體中放線菌DL2-F-5大量地增殖，抑制了水體中病原菌的繁殖以及分解了水體中的有機質，起到淨化水質的作用； 3)將這些來自水環境中的放線菌DL2-F-5製劑成生物漁藥，來抑制養殖水體中的病原微生物，或內服控制水產動物體內的病害菌，可以替代化學藥物進行疾病防治，且不破環生態環境； 4)放線菌DL2-F-5還能分解水體中的有機物及殘餘餌料，消除致病微生物因子的滋生，改善養殖水體環境。
圖1是本發明的放線菌DL2-F-5的基內菌絲在400倍的顯微鏡圖。
圖2是本發明的放線菌DL2-F-5的氣生菌絲在400倍的顯微鏡圖。
圖3是依據16SrDNA序列構建的放線菌DL2-F-5株的系統進化樹圖。
圖4是慶大黴素標準曲線圖。
圖5DL2-F-5菌株16SrRNA基因片段序列長度是1289bp核苷酸序。
具體實施例方式 以下結合發明人給出的附圖和具體試驗例及具體實施例來進一步說明本發明放線菌DL2-F-5的有益效果和製備方法。
實施例1.放線菌DL2-F-5的分離篩選 1)、海泥來源採自大連海域海底泥層。
2)、菌株的分離篩選 將採集的海泥通過採樣箱空運實驗室中。每份樣品取3g，分別加入27mL滅菌的去離子水，用磁力攪拌器攪拌20min，即成10-1濃度的懸液，然後用滅菌去離子水依次稀釋至10-2，10-3，10-4，分別取各稀釋度上清液0.1mL，塗抹到高氏1號培養基平板上(培養基中含0.0075％的重鉻酸鉀，以抑制細菌和真菌的生長)，放入28℃的培養箱中培養7d，挑取不同形態的菌落到高氏1號斜面上進行培養，將分離的菌落在平板上反覆劃線純化，直至得到純培養，命名為DL2-F-5菌株。4℃保存備用。
所述的高氏1號培養基的組分及配比為可溶性澱粉20g，KNO3 1g，K2HPO40.5g，NaCl 15g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，瓊脂粉15g，水1000mL，pH7.2～7.4，121℃滅菌30min。
實施例2.放線菌DL2-F-5的鑑定 1)、形態學的特徵 放線菌DL2-F-5菌株在高氏1號上，採用插片法，培養3d，7d，15d，30d後，在光學顯微鏡下觀察，可見基內菌絲髮達，呈分枝狀，無橫隔無斷裂見(圖1)；氣生菌絲較少，呈螺旋或曲線狀，孢子橢圓形見(圖2)。
2)、培養學的特徵 放線菌DL2-F-5株在9種培養基上，28℃培養，分別於3d，7d，15d，30d觀察其生長情況，氣絲、基絲的顏色及產色素情況，其培養特徵見表1。
表1海洋放線菌DL2-F-5菌株的培養特徵 所述的上述培養基的組分及配比分別為 蔗糖察氏瓊脂蔗糖30g，NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，FeSO4 0.01g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，112℃滅菌30min。
葡萄糖酵母膏瓊脂葡萄糖10g，酵母膏10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，112℃滅菌30min。
酪氨酸瓊脂酵母膏1g，L-酪氨酸1g，NaCl 8.5g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30min。
甘油天門冬素瓊脂L-天門冬素1g，微量鹽溶液1mL，甘油10g，K2HPO410g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，112℃滅菌30min。
(微量鹽溶液FeSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O0.1g，蒸餾水100mL)。
普通營養瓊脂蛋白腖10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30min。
燕麥粉瓊脂燕麥粉20g，微量鹽溶液1mL(同上)，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30min。
無機鹽澱粉瓊脂可溶性澱粉10g，NaNO3 1g，MgCO3 1g，K2HPO4 0.3g，NaCl 0.5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30min。
伊莫松瓊脂牛肉膏4g，蛋白陳4g，酵母膏10g，葡萄糖10g，氯化鈉2.5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.0，112℃30min高壓滅菌。
3)、生理生化特徵 參照《微生物分類學》(張繼忠.復旦大學出版社，1990)，對放線菌DL2-F-5菌株分別進行明膠液化、牛奶凝固和腖化、澱粉水解、纖維素生長、硝酸鹽還原、黑色素產生、H2S產生、唯一碳源利用等各項試驗，放線菌DL2-F-5菌株的生理生化特徵見表2。
表2放線菌菌株生理生化特徵 注「+」表示陽性反應，「-」表示陰性反應。
4)、放線菌DL2-F-5菌株的分子生物學鑑定。
(1)放線菌DL2-F-5菌株16SrRNA的基因片段序列測定 將放線菌DL2-F-5純培養物接種於普通肉湯，28℃搖床培養48h，離心收集菌體，採用離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒提取放線菌總DNA。擴增放線菌DL2-F-5菌株16SrRNA的基因採用通用引物，正向引物為5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′(對應於E.coli 16S rDNA 5′43-63f)，反向引物為3′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-5′(對應於E.coli16S rDNA 3′1405-1387r)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系(50μL)10×PCR Buffer 5μL，25mmol/LMgCl24μL，2mmol/L dNTPs4μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，0.6mmol/L的引物各1μL，模板DNA2μL，ddH2O 32.5μL。PCR反應條件在94℃預變性5min，進入循環擴增階段94℃變性1min→56℃復性1min→72℃延伸2min，循環35次，最後72℃延伸5min。結束反應後，PCR產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，並用H.Q.&.Q.Gel凝膠回收試劑盒II回收，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。DL2-F-5菌株16SrRNA基因片段的1289bp核苷酸序列如圖5所示。
(2)放線菌DL2-F-5序列分析和系統進化樹的構建 將測定的16S rDNA序列，與GenBank資料庫中的所有已測定的原核生物16SrDNA進行比對，其同弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)的相似率達到99.6％，利用Blast搜索軟體從GenBank資料庫中調出相關放線菌株的16SrDNA序列(相關放線菌菌株的登陸號如表3所示)，通過Clustal X 1.83軟體進行多序列比對，並採用Neighbour-joining法進行系統進化樹的構建見(圖3)所示，分析表明DL2-F-5菌株與弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)之間的進化距離相隔較近。再結合放線菌菌株的形態特徵、培養特徵和生理生化特性，認為DL2-F-5株放線菌屬於弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)。
表3相關放線菌株登陸號 該放線菌DL2-F-5的經形態學的特徵、培養學的特徵、生理生化特徵測定和16S rDNA序列同源性分析，鑑定為弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)。該菌能產生抗菌活性物質可以殺滅水產動物病原菌，同時能夠利用水體中的氮源、碳源，可降解水體中的有機質起到淨化水質作用。
試驗例1放線菌DL2-F-5發酵液抑菌效果試驗 1)指示病原菌 柱狀黃桿菌(魚害粘球菌)(Flavobacterium columnare，編號G4)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum，編號E-3-11)、點狀產氣單胞菌點狀亞種(Aeromonaspunctata sub.punctata，編號XP91-4-1)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，編號ST78-3-3)均由中國科學院水生生物研究所魚病室細菌組提供；溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈維弧菌(Vibrio harvey)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonida)為西北農林科技大學水產科學實驗室提供。
2)放線菌DL2-F-5原始發酵液中抗生素相對生物效價的測定 按照前述方法用發酵罐發酵50L放線菌DL2-F-5原始發酵液，採用挖孔法分別測定慶大黴素對大腸桿菌的抑制作用(用抑菌圈表示)，設置10個濃度，分別為78μg/ml，156μg/ml，313μg/ml，625μg/ml，1250μg/ml，2500μg/ml，5000μg/ml，10000μg/ml，20000μg/ml，40000μg/ml，以慶大黴素濃度對數值為縱坐標，以抑菌圈直徑的大小為橫坐標，製成線性關係圖，函數關係為Y＝0.209+0.173X，結果見(圖4)，通過計算，對放線菌DL2-F-5原始發酵液測定抗生素的相對生物效價為4667μg/mL。
3)放線菌DL2-F-5原始發酵液體外殺菌試驗 以引起魚類腸炎病的腸型點狀氣單胞菌(Aeromonas punctataf.instestinalis)為例，來說明放線菌DL2-F-5原始發酵液的體外殺菌效果 取8支試管，每支試管加入1mL無菌肉湯，在第1支試管中加入1mL放線菌DL2-F-5發酵液，混勻後，取出1mL加入第2支試管中，混勻，在從第2支試管中取出1mL加入第3支試管中，依此，一直加到第7支試管，第7支試管混勻後，棄去1mL，濃度依次為原發酵液的2-1，2-2，2-3，2-4，2-5，2-6，2-7；第8支試管為空白肉湯。向這8支試管中各加入1mL濃度為105cfu/mL的腸型點狀氣單胞菌菌液。另取8支試管作為對照組，稀釋方法同上，但不加入腸型點狀氣單胞菌，而是各加入1mL的空白普通肉湯培養基。兩組試管均放入28℃培養箱中培養，24h後觀察結果。
24h後，與對照組相比，試驗組前5個試管與對照組渾濁度基本一致，第6管開始，渾濁度比對照組明顯增加。故認為放線菌DL2-F-5稀釋至2-5時，與腸型點狀氣單胞菌共同培養24h後，能抑制腸型點狀氣單胞菌。對於試驗組的第1到第5支試管，在培養24h，48h，72h後分別取100μL塗布於R-S培養基上，28℃條件下培養24h後，觀察有無黃色菌落產生，腸型點狀氣單胞菌在R-S培養基呈黃色菌落，是鑑定特徵，結果見表4。
表4放線菌DL2-F-5發酵液對腸型點狀氣單胞菌的殺滅效果 注「+」表示有黃色菌落產生，「-」表示沒有黃色菌落產生 由表4可見，培養48h後，前3支試管中均不含腸型點狀氣單胞菌，故認為，當放線菌DL2-F-5發酵液稀釋至2-3以上時，與腸型點狀氣單胞菌共同培養48h後，可將其全部殺滅。
放線菌DL2-F-5發酵液除對腸型點狀氣單胞菌有較強殺滅效果外，對嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、哈維弧菌(Vibrio harvevi)、殺鮭氣單胞菌史氏亞種(Aeromonas salmonicida)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)等多種水產病原菌均有殺滅作用。採用挖孔法測定其殺菌作用，結果表5。
表5放線菌DL2-F-5殺菌譜測定結果(抑菌圈直徑mm) 所述的普通肉湯培養基和R-S培養基的組分及配比為 普通肉湯培養基牛肉膏4g，蛋白腖10g，NaCl 5g，KH2PO4 0.5g，蒸餾水1L，pH為7.4～7.6，121℃高壓滅菌20min。
R-S培養基L-賴氨酸鹽酸鹽5g，L-鳥氨酸鹽酸鹽6.5g，麥芽糖3.5g，Na2S2O3 6.8g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.3g，溴麝香草酚蘭0.03g，去氧膽酸鈉1g，新生黴素0.005g，酵母浸膏3g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1L，pH為7.0，121℃高壓滅菌20min。
4)放線菌DL2-F-5原始發酵液的體內殺菌效果試驗 以鯽魚腸炎病的防治為例，說明放線菌DL2-F-5原始發酵液的體內殺滅效果。
①放線菌DL2-F-5原始發酵液對鯽魚腸炎病的預防試驗 將體質健康、規格基本一致的鯽魚隨機分成2組，每組3尾。預防組先投餵添加放線菌DL2-F-5發酵液的飼料(含菌量4×103cfu/g飼料)，連續投餵2d，第3天開始投餵添加腸型點狀氣單胞菌的飼料(含菌量109cfu/g飼料)，連續投餵5d；對照組先投餵基礎飼料，連續投餵2d，第3天開始投餵添加腸型點狀氣單胞菌的飼料(含菌量109cfu/g飼料)，連續投餵5d。每組每天的投餵量為魚體重的2％。飼餵7d後，觀察各組鯽魚的發病情況，並觀察放線菌DL2-F-5發酵液對鯽魚腸道氣單胞菌(Aeromonas)數量的影響。
具體操作如下無菌條件下每尾鯽魚取腸道內容物0.5g左右，放入預先稱重的滅菌玻璃小採樣瓶內，準確稱量腸道內容物的重量，按1∶10的比例加入無菌水，充分混勻，並用無菌水稀釋至一定濃度後，塗抹到R-S選擇培養基上(氣單胞菌在此培養基上呈黃色)，在28℃條件下培養24h，選擇黃色菌落進行計數，並計算出每克腸道內容物中所含的氣單胞菌數。記錄每尾鯽魚腸道內容物中的氣單胞菌數，並按生物統計處理數據，比較組間差異。
預防試驗結果飼餵7d後，對照組鯽魚出現活動遲鈍、吞餌吐餌甚至不攝食現象，攝食和搶食能力明顯下降，個別個體肛門出現紅腫；解剖觀察，可見腸壁充血，腸道內有黃色粘液，但沒有食物或僅有少量食物；而預防組鯽魚均無明顯發病症狀。兩組鯽魚腸道內氣單胞菌數量比較結果見表6。
表6預防組與對照組鯽魚腸道內容物中氣單胞菌數量比較 從表6可以看出預防組與對照組相比差異顯著(p＜0.05)，鯽魚腸道內氣單胞菌數量明顯降低。因此將殺菌放線菌應用到水產養殖上，能夠在一定程度預防爆發性疾病的發生。
②放線菌DL2-F-5原始發酵液對鯽魚腸炎病的治療試驗 將體質健康、規格基本一致的鯽魚隨機分成2組，每組3尾。治療組先投餵添加腸型點狀氣單胞菌的飼料(含菌量109cfu/g飼料)，連續投餵2d，第3天開始投餵添加放線菌發酵液的飼料(含菌量4×105cfu/g飼料)，連續投餵5d；對照組先投餵添加腸型點狀氣單胞菌的飼料(含菌量109cfu/g飼料)，連續投餵2d，第3天開始投餵未添加原始發酵液的飼料，連續投餵5d。每組每天的投餵量為魚體重的2％。飼餵7d後，按預防試驗的方法記錄結果。
治療試驗結果飼餵7d後觀察，對照組鯽魚出現反應遲鈍，攝食和搶食能力明顯下降，肛門出現紅腫，解剖觀察，可見腸壁充血，腸道內有黃色粘液，無食物；而治療組鯽魚發病症狀明顯減輕或基本無發病症狀。兩組鯽魚腸道內氣單胞菌數量比較結果見表7。
表7治療組與對照組鯽魚腸道內容物中氣單胞菌數量比較 從表7可以看出治療組鯽魚腸道內氣單胞菌數量與對照組相比明顯降低(p＜0.05)。因此將殺菌放線菌應用到水產養殖上，能夠代替一部分的化學藥物治療養殖動物的各種疾病，以減少對環境的破壞，而又能達到理想的治療效果。
③放線菌DL2-F-5原始發酵液對鯽魚腸道總菌數的影響 將體質健康、規格基本一致的鯽魚隨機分成2組，每組3尾，一組投餵添加放線菌DL2-F-5原始發酵液的飼料(每克飼料含弗氏鏈黴菌3.7×105cfu)，另一組投餵不含原始發酵液的飼料作為對照。每天的投餵量為魚體重的2％-3％。
將連續投餵15d後的兩組鯽魚在無菌條件下，用燃燒的75％的酒精棉球擦拭體表進行消毒，用灼燒後冷卻的剪刀從肛門處剪開，然後向上朝前剪成弧形，掀開游離腹壁展現腸道，無菌採取腸道內容物0.5g左右放入預先稱重的無菌採樣玻璃瓶瓶內，再準確稱出腸內容物重量，按1∶10加入無菌蒸餾水稀釋，在旋渦混合器充分混勻10min，從採樣瓶內取0.5mL混合液加入盛有4.5mL的試管內，混勻，此為10-1，逐步稀釋至10-8。用微量加樣槍從第4到第8個梯度各取100μL塗普通營養瓊脂平板上，進行平板細菌計數。每個梯度設3個平行。
塗菌的普通營養瓊脂平板在28℃培養箱中培養24h後，選擇菌落數在30～300個之間的計數，求出每組樣品菌落數的平均值，計算出每克腸道內容物中所含的總菌數；每克腸道內容物中總菌數＝菌落數×10×稀釋倍數×100cfu。鯽魚腸道中總菌數測定結果見表8 表8放線菌DL2-F-5發酵液對鯽魚腸道總菌數的影響(log 10/g腸道內容物) 結果表明與投餵未添加原始發酵液的飼料的對照組相比，連續投餵15d添加放線菌DL2-F-5飼料的試驗組鯽魚腸道總菌數有所降低，但試驗組與對照組的差異不顯著。因而，放線菌DL2-F-5不會擾亂鯽魚腸道內微生物正常菌群。
試驗例2放線菌DL2-F-5的毒性試驗及安全性評價 (1)金魚急性毒性試驗挑選健康、無病無外傷的金魚50尾，隨機分成2組，每組25尾，第一組投餵添加放線菌DL2-F-5的飼料(100g基礎飼料原料中加入60mL發酵液)；第二組為對照組，投餵基礎飼料，投餌量均為魚體重的2％。連續投餵5d後，兩組金魚全部改投基礎飼料，連續投餵7d，試驗組和對照組金魚，均未出現死亡，解剖試驗組沒有病理現象。(2)小鼠急性毒性試驗取昆明種小鼠20隻，雌雄各半，隨機分成2組，分別飼養禁食12h後，給各小鼠灌胃，第一組灌胃放線菌DL2-F-5發酵液0.2mL/20g，第二組灌胃生理鹽水0.2mL/20g，觀察7d，試驗組和對照組小鼠均未出現死亡，解剖試驗組沒有病理現象。
說明放線菌DL2-F-5對水產動物和哺乳動物均無較大毒性，可安全使用。
實施例3放線菌DL2-F-5水產生物製劑使用方法與用量 (1)放線菌DL2-F-5水產生物製劑技術指標 將獲得的放線菌DL2-F-5發酵液通過低溫(20℃)氣流濃縮4倍製成水產放線菌生物製劑，製劑有固體與液體劑型，固體製劑用麩皮或腐殖酸作為吸附載體，並測定相對生物效價≥10mg/g，活菌數量≥109cfu/g；液體製劑為濃縮後即成，相對生物效價≥10mg/mL，活菌數量≥109cfu/mL。達到制定的標準要求再裝入不同體積的包裝袋或瓶中。
(2)放線菌DL2-F-5水產生物製劑使用方法與劑量 該製劑可以添加到水產養殖動物的飼料中使用。預防用量將放線菌DL2-F-5水產生物製劑0.5～0.8％的比例添加於飼料中投喂，每20d使用1～2次；治療用量添加量為1％，連續使用一周。
池塘潑灑外用，每畝(水深1m)每次2000mL，連續使用3次，可以達到較佳防病和水質改良的效果。
實施例4製備放線菌DL2-F-5菌株發酵液的方法 用接種環從保藏的斜面培養基(高氏1號培養基)中刮取放線菌DL2-F-5的孢子，在無菌條件下接入生產用斜面培養基(高氏1號培養基)上，28℃條件下培養5～7d，待長出孢子後，用接種環刮取孢子，在無菌條件下接入250mL裝有50mL已滅菌的種子液培養基的三角瓶中，於28℃條件下搖床振蕩培養2d，搖速為150r/min，將獲得的一級種子液按10％的接種量接入到二級種子培養基中，28℃搖床振蕩培養2d，搖速為150r/min，獲得二級種子液，將獲得的二級種子液按10％的接種量接入到裝有已滅菌發酵培養基的發酵罐中，於28℃條件下，進行通氣培養，保持罐壓0.1Mpa，發酵培養7d，即可獲得活性菌株發酵液。
各種培養基配方如下 (1)種子液培養基配方葡萄糖10g，牛肉膏10g， NaCl 15g，MgSO4·7H2O 0.5g， K2HPO4 0.5g，CaCO3 0.5g， 水1000mL，121℃滅菌30min。
(2)發酵培養基配方蔗糖10g，可溶性澱粉5g， 牛肉膏4g，NaCl 15g， MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 0.5g， CaCO3 0.5g，2％的黃豆粉浸汁原液1000mL， pH7.0～7.5，121℃滅菌30min。
2％的黃豆粉浸汁原液的製作方法稱取20g黃豆粉，先用少量水調成漿糊狀，然後加入一定量的水，小火煮沸30min，加水定容至1000mL，如有較多沉澱，可用紗布過濾。
實施例5含有放線菌DL2-F-5水產生物製劑 (1)放線菌DL2-F-5水產生物製劑發酵液的製備用接種環從保藏斜面培養基中刮取放線菌DL2-F-5孢子，在無菌條件下接入生產斜面培養基中，28℃條件下培養5～7d，待長出孢子後，用接種環刮取孢子，在無菌條件下接入250mL裝有50mL已滅菌的種子液培養基的三角瓶中，於28℃條件下搖床振蕩培養2d，搖速為150r/min，將獲得的一級種子液按10％的接種量接入到2500mL裝有500mL已滅菌的二級種子培養基的三角瓶中，28℃搖床振蕩培養2d，搖速為150r/min，獲得二級種子液，將獲得的二級種子液按10％的接種量接入到裝有50L已滅菌發酵培養基的發酵罐中，於28℃條件下，轉速為200r/min，風量為50L/h，進行通氣培養，保持罐壓0.1Mpa，發酵培養7d，即可獲得放線菌DL2-F-5發酵液。
(2)將獲得的50L放線菌DL2-F-5發酵液通過低溫氣流濃縮4倍後，獲得12.5L濃縮液，測定相對生物效價和活菌數量，配製液體裝瓶或使用吸附劑(麩皮或腐殖酸)製成固體。
西北農林科技大學 四川華強漁牧藥業有限公司
一種新的微生物及其基因片段序列和應用
1
1
1289
DNA
弗氏鏈黴菌種(Streptomyces fradiae)
1
gtgcagacgc gtcggtgaga gatagtggcg acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc 60
tgcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatacgacca cttcaggcat 120
ctgatggtgg tggaaagctc cggcggtgca ggatgagccc gcggcctatc agctagttgg 180
tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca 240
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 300
gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 360
ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg 420
tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 480
agctcgtagg cggcctgtca cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca 540
ttcgatacgg gcaggctaga gttcggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa 600
atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc gatactgacg 660
ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 720
acgttgggaa ctaggtgtgg gcgacattcc acgtcgtccg tgccgcagct aacgcattaa 780
gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 840
cacaagcggc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg 900
acatacaccg gaaacaccca gagatgggtg cccccttgtg gtcggtgtac aggtggtgca 960
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1020
tgtcccgtgt tgccagcagg cccttgtggt gctggggact cacgggagac cgccggggtc 1080
aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac 1140
acgtgctaca atggccggta caaagagctg cgataccgca aggtggagcg aatctcaaaa 1200
agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg agtcgctagt 1260
aatcgcagat caggaaggtg cgagcgcag 1289
權利要求
1.一种放線菌DL2-F-5菌株，分類命名是弗氏鏈黴菌(Streptomycesfradiae)，它於2006年12月12日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 206135。
2.如權利要求1所述的放線菌DL2-F-5菌株，其特徵在於，所述的放線菌DL2-F-5菌株16SrRNA基因片段的1289bp核苷酸序列如圖5所示。
3.含有如權利要求1所述的放線菌DL2-F-5菌株的水質改良劑和藥物組合物。
4.含有如權利要求1所述的放線菌DL2-F-5菌株作為添加劑的動物飼料。
全文摘要
本發明涉及一種新的放線菌DL2-F-5菌株，分類命名是弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)，保藏號為CCTCC M 206135。該放線菌DL2-F-5菌株是從海洋或淡水水體微生物有益菌群中分離的，能產生抗菌物質或增強免疫活性成分，可以防治水產動物疾病的發生，並且對藻類無殺滅作用，避免了使用消毒劑或殺生劑對淨化水環境有益藻類的破壞，同時在水體中這些抗菌放線菌大量地增殖，抑制了水體中病原菌的繁殖以及分解了水體中的有機質，起到淨化水質的作用。另外，放線菌還能分解水體中的有機汙染物及殘餘餌料，消除致病微生物因子的滋生，改善養殖水體環境。在生產藥物和作為食品、飼料添加劑中有廣泛用途。
文檔編號C02F3/34GK101100653SQ20061010526
公開日2008年1月9日 申請日期2006年12月25日 優先權日2006年12月25日
發明者王高學, 顧忠旗, 葉道林, 原居林, 楊 穆, 黃海洪, 付維法, 梁朝軍, 婧 崔, 姚嘉贇 申請人:西北農林科技大學, 四川華強漁牧藥業有限公司