細鱗魚Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、製備、應用的製作方法

2024-04-04 14:48:05 2

專利名稱：細鱗魚Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、製備、應用的製作方法
技術領域：
本發明提供一種來源於細鱗魚(Brachymystax Ienok)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽CATH_BRALE及其基因，製備方法和在醫療、生物製藥及水產養殖病害防治中的應用，屬於生物醫學技術領域。
背景技術：
Cathelicidin是一類由N端信號肽 區域、中間保守cathelin結構域和C端高度特異的成熟肽區域構成的具有多功能的抗菌肽家族，在幾乎所有種類的動物體內(哺乳類、鳥類、兩棲類和魚類)都有發現。與防禦素(defensin) —樣,Cathelicidin是包括人類在內的大多數脊椎動物所特有的宿主防禦肽，構成了脊椎動物自然免疫反應的關鍵組分，是連接自然免疫和特異性免疫的橋梁。Cathelicidin具有廣譜的抗菌活性，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強的殺菌活性，而且對許多臨床耐藥細菌同樣具有作用。除此之外，Cathelicidin還具有許多其他生物學活性，如對多種免疫細胞(中性粒細胞、單核細胞、肥大細胞和T細胞)具有趨化作用、誘導肥大細胞脫粒和組織胺釋放、調節巨噬細胞轉錄、促進傷口癒合、誘導血管發生、誘導變異細胞系細胞凋亡和淋巴細胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或異常表達都將導致人類嚴重疾病的發生。最新研究發現，系統性紅斑狼瘡和牛皮癬的發病與人體內Cathelicidin LL-37的過度表達有關。由於具有如此眾多的活性，Cathelicidin —直是國際上研究的熱點。針對Cathelicidin的藥用開發則蘊含著巨大的臨床治療藥物製備價值。由於近年來抗生素的濫用，導致致病性微生物耐藥性的問題日益嚴重，在臨床上已經出現了大量能夠完全耐受青黴素等傳統抗生素的微生物。最近，一種攜帶編寫NDM-I酶基因的「超級病菌」的出現，罪魁禍首正是抗生素的濫用和誤用。這種酶可分解β_內醯胺環結構，因此可使目前為止臨床最常用的抗生素，包括青黴素與頭孢菌素，以及新發展的頭黴素類、硫黴素類、單環內醯胺類等其他非典型內醯胺類抗生素失效。而Cathelicidin家族抗微生物肽的殺菌機制是通過破壞細菌細胞膜的完整性介導的通過靜電相互作用吸引並結合到帶負電的細菌細胞膜表面，進一步在細菌細胞膜上形成跨膜的孔洞，導致細菌細胞內容物的外洩,從而導致細菌細胞的死亡。除此之外,越來越多的文獻報導表明抗菌肽還具有其他的殺菌機制，如抑制細菌細胞壁合成、改變細菌細胞質膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細胞內酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質的合成等。正是由於作用方式的不同，Cathelicidin介導的殺菌作用遠遠快於傳統抗生素，並且不會產生耐藥性。體外抗微生物測試中，大多數Cathelicidin成熟肽可以在微摩爾和亞微摩爾的濃度下快速殺死廣泛的微生物。Cathelicidin成熟肽表現抗微生物肽的典型特徵大多數Cathelicidin成熟肽分子量小於5000，中性pH條件下帶淨正電荷，緣於它們含有多個鹼性氣基酸殘基；富含疏水喊基，整體具有兩未性的拓撲結構。目前Cathelicidin抗菌肽藥物研究熱點主要集中在消炎、抗感染和抗真菌等方面，應用方式可以是局部的也可以是系統的，劑型可以是口服也可以外用。尤其由於陽離子抗菌肽的表達與皮炎、侵入性燒傷膿血症、腫瘤病毒引起的肉贅等之間的病理聯繫，這些抗菌肽對這些疾病的局部治療有較好的開發前景。例如中科院昆明所優選出蛇cathelicidin抗菌肽對500多株臨床耐藥菌株顯示了較強的抗菌活性，同時具有極低的哺乳動物細胞毒性以及溶血活性，優於美國正進行III期臨床的同類候選藥物pexiganan;來源於豬protegrin的IB-367用於治療腫瘤患者口腔潰瘍，已進入臨床III期試驗。LL-37作為治療囊腫性纖維化支氣管炎的局部殺菌劑、及人抗菌肽CAP-18及其衍生物用於治療上呼吸道感染、呼吸道感染、鼻竇炎、中耳炎等疾病的藥物均已經成為生物製藥領域內的研究熱點。不僅限於醫藥領域，在農業、畜牧業和日化用品領域，cathelicidin也存在巨大的應用潛能。我國是漁業大國，水產品總產量位居世界首位。但是，近幾年，隨著高密度、集約化養殖模式的發展，水環境的汙染程度加重，各種細菌性和病毒性疾病頻發，防治疾病大量使用抗生素破壞水環境的微生態平衡，導致某些病原體對藥物產生了耐藥性，危害人體健康等。相繼發生的水產養殖或水產品加工過程中過量使用漁用藥物或加入禁用藥物導致的 「孔雀石綠事件」、「多寶魚事件」、「氯黴素事件」等，給水產業蒙上一層濃厚的陰影，對消費者的人身安全造成威脅，也因此食品安全問題更加受到人們的關注。近年來，我國已有研究利用抗菌肽替代傳統抗生素針對抗水產養殖過程中常見病原菌，如嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi)、遲純愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)及溫和氣單胞菌(Aobria)均有較好的抑菌效果。通過飼料攝入抗菌肽，對南美白對奸親蟲下產卵、孵化率及蝦苗飼養，和對成蝦的飼養效果明顯優於金黴素。抗菌肽製品在對蝦的飼料或水體中能對水中的微生物加以控制，使致病微生物如弧菌等均能殺滅，通過飼料攝入蝦體內能提聞免疫力和促進生長等功效。由於世界範圍內對Cathelicidin的研究歷史並不長，我國在此類活性多肽家族的研究還鮮有報導。細鱗魚(Brachymystax lenok)屬鮭科,細磷魚屬，生長在高寒冷水區域，是重要的冷水性經濟魚類。由於肉質鮮美，過量捕撈，已列入我國國家二級保護動物名單。本次發明的細鱗魚抗微生物肽CATH_BRALE，將其全序列胺基酸結構經NCBI蛋白質資料庫進行搜尋比對，未發現有任何相同多肽。發明人將本發明的細磷魚CATH_BRALE編碼基因經NCBI基因資料庫進行搜尋比對，未發現有任何相同基因。

發明內容
本發明提供一種在亞微摩爾劑量下即具有很強的抗微生物活性的來源於細鱗魚的一種抗微生物肽，CATH_BRALE及其基因、化學合成方法和應用。本發明的目的是基於上述理論研究和現有技術基礎，提供一種具有強烈的抗菌活性，尤其針對水產養殖中幾種常見病原菌的細磷魚CATH_BRALE及其應用，著重水產養殖領域。為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案CATH_BRALE是細鱗魚Cathelicidin基因編碼的一種直鏈多肽，含有53個胺基酸殘基，理論等電點(Pl)為12. 43，理論分子量為5200. 6，含有15個鹼性胺基酸殘基(11個精氨酸和4個賴氨酸)，含有兩個酸性胺基酸殘基(天冬氨酸)，靜電荷為+13，說明它是一種較強的鹼性多肽。CATH_BRALE不含半胱氨酸，因此沒有分子內和分子間二硫鍵，結構簡單。cath_brale全序列為精氨酸-精氨酸-絲氨酸-賴氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-賴氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-精氨酸-天冬醯胺-丙氨酸細鱗魚抗菌肽CATH_BRALE基因的克隆包括細鱗魚脾臟總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物，利用PCR方法篩選細鱗魚抗菌肽CATH_BRALE基因。5』端引物分別為Pl(5，-ACATGAAGATGAAGGCTCTGGCG-3』)和 P2 (5，-CCCAGACTGAGACCAGGTACGAAG-3』)，PCR 另一擴增引物為 CL0NTECH 公司 CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit 中的3』 PCR Primer引物，其序列為5』 - CGGGGTACGATGAGACACCAT - 3』。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定。基因測序結果表明編碼細鱗魚抗菌肽CATH_BRALE前體cathelicidin的基因由909個核苷酸組成，自5』端至3』端序列為 I ATGAAGATGA AGGCTCTGGC GAGATCTCTT CTCTTGCTCG CTGTGACTGG51 CCTGCTGGTC AGAGGTCATT CCCAGACTGA GACCAGGTAC GAAGACATCA101 TCACAGCTGC TTCAACTCAG CTGCTTCCTG TGGAAGAGCA GGCTTTCCGT151 CCGCTTCTGA ACCAGCTGGA AGTCGAGACT TTGAATACAG AGGATGTGGA201 CCAGTCTGAG GTATCTGTAA AGTTGAGCTT TCCCCTGCAG GAGACTCTCT251 GCAGAAAGGC ACAAGGCCAA CCATGCCCTC TGAAGAAAAA TGGGAAACGA301 ATGATGTGCA GCATGGAGGT CAGACATCCG ATTCTGGATA CTGGCAACAC351 CCTCAACACT GACTGGTCTG ACATTTCTTG TGAATACATG GAGGCAGAAG401 ATGCTATGCC AGTACTGAGC ACTCAGAAGA TTCGGACAAG AAGAAGCAAG451 GCCAGGGGAG GCTCTAGGGG CTCTAAGATG GGTAGAAAAG ATTCCAAGGG501 GGGTAGCAGA GGTCGTCCTG GGAGTGGCTC TCGTCCTGGG GGTGGCTCCT551 CCATTGCTGG AGCTAGCAGA GGAGACCGTG GTGGAACTCG CAATGCATAG601 AACAGCACAA CACACCCTCT GGATAACTGC AAAATATCTC ACCAATCAAA651 GGAACTTCAA AAGCACTCAA AGTTGAGTTT AACGGATGAA CATGCAACCT701 TAAGCTTCTG GTAACTCTTT TGTCTACATT CTGAATTGGT TTGTATTTTG751 TAGCTATCGT TGTTTGTAAT AATGTACCTA TTCTTACATG CCAATCCTTG801 AATTTTAACT ACGGAAAATT GTTTCCAGTT CATGTTTACT GCACTAATAA851 ACTGCTAAAT AAGTTTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAATGGT GTCTCATCGT901 ACCCCGAAT編碼細鱗魚cathelicidin成熟肽CATH_BRALE為第367 — 445位核苷酸，其胺基酸序列為Arg1 Arg2 Ser3 Lys4 Ala5 Arg6 Gly7 Gly8 Ser9 Argici Gly11 Ser12 Lys13 Met14 Gly15
a 16 τ 17 a 18c1 19 τ 20 -\ 21 -\ 2223 a 24 -\ 25 a 26 27 -\ 28 c1 29 -\ 30 c1 31
Arg Lys Asp Ser Lys Crly Crly Ser Arg Crly Arg rro Crly Ser Crly SerArg32 Pro33 Gly34 Gly35 Gly36 Ser37 Ser38 He39 Ala40 Gly41 Ala42Ser43 Arg44 Gly45 Asp46Arg47 Gly48 Gly49 Thr50 Arg51 Asn52 Ala53
細鱗魚抗菌肽CATH_BRALE基因作為基因工程製備細鱗魚抗菌肽CATH_BRALE的應用。CATH_BRALE的化學製備方法根據編碼細鱗魚cathelicidin抗微生物肽基因推斷的成熟肽CATH_BRALE胺基酸序列，用自動多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列。通過HPLC反相柱層析脫鹽純化，並確定其純度大於95%。用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)測定其分子量，等電聚焦電泳測定等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。合成的CATH_BRALE抗菌肽可以溶於滅菌超純水，用於藥理活性檢測。本發明的有益效果在於基因克隆得到編碼細鱗魚cathelicidin抗微生物肽的基因，通過化學合成方法得到成熟肽CATH_BRALE。該抗微生物肽富含鹼性胺基酸，對水產養殖常見病原菌A. salmonicida, A. hydrophila殺菌作用很強,結構簡單,不含有二硫鍵及環狀結構,方便化學合成及基因工程製備。抗菌實驗顯示其對多種臨床耐藥菌也有較好的殺滅作用。此外還具有無溶血性，無細胞毒性等特點。
具體實施例方式下面結合技術方案詳細敘述本發明的具體實施例，但本發明的內容並不局限於此。實施例I抗微生物肽CATH_BRALE前體基因的克隆及基因測序，包括米用RNeasy AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Qiagen,union city, CA, USA)提取細鱗魚脾臟總RNA，mRNA分離純化採用美國PR0MEGA公司的PolyATtract mRNA Isolation Systems 試劑盒。利用 In-Fusion SMARTer DirectionalcDNA Library Construction Kit建庫試劑盒構建細鱗魚骨髓cDNA文庫。PowerScriptReverse Transcriptase反轉錄合成cDNA第一鏈,引物為正向SMARTer V Oligonucleot 引物5，- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX - 3』反向 In-Fusion SMARTer CDS III引物5，- CGGGGTACGATGAGACACCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3』 (N = A, C，G, or T; V = A, G, or C) ·利用Advantage DNA Polymerase 合成第二鏈，引物為正向 5』 - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT-3』，反向引物同為 In-Fusion SMARTer CDS III。.設計兩條特異性正向引物(Pl、P2)和一條反向非特異性通用引物(⑶S III)，以細鱗魚脾臟cDNA為模板，採用半巢式PCR的方法擴增cathelicidin的cDNA。正向Pl :5，-ACATGAAGATGAAGGCTCTGGCG-3，；正向P2 :5，-CCCAGACTGAGACCAGGTACGAAG-3，；反向非特異性通用引物為In-Fusion SMARTer CDS III，其序列為5 『一CGGGGTACGATGAGACACCAT-3，。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定，pMD19-T Vecter測序通用引物正向M13F :5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，；反向M13R :5』-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3』 ；
具體步驟如下第一步、細鱗魚脾臟總RNA提取(以下實驗所用器具和試劑均經過處理，無RNase)A.從新鮮宰殺的細鱗魚各種新鮮組織上分別剪下Ig左右的小塊，分別放入液氮預冷的細胞凍存管中，然後迅速放入液氮中保存；B.將保存在液氮中的組織材料取出，放入預冷的研缽內，迅速充分研磨，期間不斷向研缽內加入少許液氮；將大約30 mg的組織粉末轉移至預冷的I. 5 ml離心管中，向其中分別加入400 μ I Buffer R-I(裂解液，RNA Miniprep Kit提供)，用21-25號針頭的注射器反覆抽吸8-10次，轉入I. 5ml離心管中，加入150 μ I Buffer R-Π，渦旋振蕩15_30s，4 C，12000 rpm 離心 5 min ；C.將離心後的上清轉移至新的I. 5 ml離心管中，加入250ul異丙醇，迅速吸打混
勻；將混合液分別轉移至離心吸附柱，室溫，6000 rpm離心Imin ;棄廢液,然後加入500 μ IBuffer W1A,4 C，12000 rpm 離心 Imin ;棄廢液，加入 700 μ I BufferW2A，4 C，12000rpm 離心 Imin ;棄廢液,加入 700 μ I Buffer W2A, 4 C，12000 rpm 離心 I min;棄廢液，空管12000 rpm離心I min ;將離心吸附柱轉移至新的I. 5 ml離心管中，然後直接向吸附膜上滴加70-100 μ I Buffer TE，室溫放置lmin，12000 rpm離心I min洗脫得到總RNA ;第二步、cDNA文庫的構建第一鏈的合成(mRNA反轉錄):A.在新的O. 2ml PCR管(無DNase和RNase)中配製下列混合液模板RNAI μ g3，In-Fusion SMARTer CDS Primer (50 μ Μ) I μ I去離子水2·5μ1混合均勻，短暫離心；PCR儀中72 C保溫5 min後，然後42 C2 min ;短暫離心
後，在上述管中配製如下反轉錄反應液
上述混合液4.5μ1
5Χ First-Strand Buffer2.0μ1
DTT(IOOmM)0.25μ1
dNTP Mix (ΙΟπιΜ )Ι.ΟμΙ
SMARTer V Oligonucleotide (12 μ.Μ.)1.0μ14μ1
RNase Inhibitor (40 /μ1)0,25μ1
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 (J)*I .ΟμΙ混合均勻後，短暫離心；在PCR儀中完成以下程序42 C，90min;68 C，IOmin ;4 C，保存。cDNA 保存於-80 C。第二鏈的合成第一鏈 cDNA2μ1
去離子水80μ1
1OxAdvantage 2 PCR buffer10μ1 50xdNTP Mix2μ1
5』 PCR primer2μ1
In-Fusion SMARTerCDSlllprimer2μ1
50X Advantage 2 Polymerase Mix2μ!
第三步、採用半巢式PCR進行細鱗魚cathelicidin的基因克隆篩選引物使用前先12000 rpm離心5min，然後根據標明的摩爾數加入相應體積的ddH20溶解至20 μ M的濃度。以合成的骨髓cDNA為模板，以Pl和In-Fusion SMARTer⑶S為引物，進行第一次PCR擴增。在O. 2ml PCR管中加入下列試劑(總體積20 μ I):
ddH208μ1 cDNA 模板 Ιμ
正向引物 Ρ1(20μΜ)0.5μ1
反向引物 In-Fusion SMARTer CDS (20μΜ)0.5μ1
2X Pfu PCR MasterMixI ΟμΙ混勻後，短暫離心。PCR條件為94 C變性5min ;25個循環94 C變性30s，60 C退火30s，72 C延伸lmin;72 C延伸IOmin ;4 C保存。反應結束後，取5 μ I產物於1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。取上步PCR產物I μ I加入99 μ I ddH20稀釋100倍作為模板，以P2和CDS III為引物，進行第二次PCR擴增。在O. 2 ml PCR管中先後加入下列試劑(總體積20 μ I)
ddH207μ1
一次PCR產物稀釋液模板Iμ
正向引物Ρ2(20μΜ)Ιμ
反向引物 CDS 111(20 μΜ)Iμ
2xPfu PCR Masti rMixI ΟμΙPCR 條件為94 C 變性 5min ;25 個循環94 C 變性 30s，58 C 退火 30s，72 C延伸lmin ；72 C延伸IOmin ；4 C保存。反應結束後，取5 μ 1，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。擴增完成後用膠回收試劑盒(天根生物)進行目的片段回收。將回收的目的DNA片段與測序載體PMD19-T Vecter連接，轉化進CaCl2-MgCl 2法製備好的DH5a感受態細胞。取100 μ I轉化菌液均勻塗布在含有100 μ lg/ml氨苄青黴素(Amp)的LB瓊脂培養基平板上；表面晾乾後，放在37 C恆溫培養箱中倒置培養12-16 h。挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落,搖菌提取質粒,使用Applied Biosystems DNAsequencer, model ABI PRISM 377 進行核苷酸測序。第四步、細鱗魚cathelicidin的基因序列測定和結果基因測序結果表明編碼CATH_BRALE前體cathelicidin的基因由909個核苷酸組成，自5』端至3』端序列為I ATGAAGATGA AGGCTCTGGC GAGATCTCTT CTCTTGCTCG CTGTGACTGG51 CCTGCTGGTC AGAGGTCATT CCCAGACTGA GACCAGGTAC GAAGACATCA
101 TCACAGCTGC TTCAACTCAG CTGCTTCCTG TGGAAGAGCA GGCTTTCCGT151 CCGCTTCTGA ACCAGCTGGA AGTCGAGACT TTGAATACAG AGGATGTGGA201 CCAGTCTGAG GTATCTGTAA AGTTGAGCTT TCCCCTGCAG GAGACTCTCT251 GCAGAAAGGC ACAAGGCCAA CCATGCCCTC TGAAGAAAAA TGGGAAACGA301 ATGATGTGCA GCATGGAGGT CAGACATCCG ATTCTGGATA CTGGCAACAC351 CCTCAACACT GACTGGTCTG ACATTTCTTG TGAATACATG GAGGCAGAAG401 ATGCTATGCC AGTACTGAGC ACTCAGAAGA TTCGGACAAG AAGAAGCAAG451 GCCAGGGGAG GCTCTAGGGG CTCTAAGATG GGTAGAAAAG ATTCCAAGGG501 GGGTAGCAGA GGTCGTCCTG GGAGTGGCTC TCGTCCTGGG GGTGGCTCCT551 CCATTGCTGG AGCTAGCAGA GGAGACCGTG GTGGAACTCG CAATGCATAG601 AACAGCACAA CACACCCTCT GGATAACTGC AAAATATCTC ACCAATCAAA651 GGAACTTCAA AAGCACTCAA AGTTGAGTTT AACGGATGAA CATGCAACCT701 TAAGCTTCTG GTAACTCTTT TGTCTACATT CTGAATTGGT TTGTATTTTG751 TAGCTATCGT TGTTTGTAAT AATGTACCTA TTCTTACATG CCAATCCTTG801 AATTTTAACT ACGGAAAATT GTTTCCAGTT CATGTTTACT GCACTAATAA851 ACTGCTAAAT AAGTTTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAATGGT GTCTCATCGT901 ACCCCGAAT細鱗魚cathelicidin編碼區的cDNA核苷酸的序列表為序列長度為909個鹼基，序列類型核酸，鏈數單鏈，拓撲學直鏈狀，序列種類cDNA，來源細鱗魚骨髓。編碼細鱗魚cathelicidin成熟肽CATH_BRALE為第367 — 445位核苷酸，其胺基酸序列為Arg1 Arg2 Ser3 Lys4 Ala5 Arg6 Gly7 Gly8 Ser9 Argici Gly11 Ser12 Lys13 Met14 Gly15
a 16 τ 17 a 18c1 19 τ 20 -\ 21 -\ 2223 a 24 -\ 25 a 26 27 -\ 28 c1 29 -\ 30 c1 31
Arg Lys Asp Ser Lys Crly Crly Ser Arg Crly Arg rro Crly Ser Crly SerArg32 Pro33 Gly34 Gly35 Gly36 Ser37 Ser38 He39 Ala40 Gly41 Ala42Ser43 Arg44 Gly45 Asp46Arg47 Gly48 Gly49 Thr50 Arg51 Asn52 Ala53CATH_BRALE的化學製備方法I、根據編碼細鱗魚cathelicidin基因推斷的成熟肽CATH_BRALE胺基酸序列，用自動多肽合成儀(Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽純化,並確定其純度大於95%。
II、分子量測定採用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。合成的CATH_BRALE抗菌肽可以溶於滅菌超純水，用於藥理活性檢測。細磷魚抗微生物肽CATH_BRALE的藥理實驗I. CATH_BRALE 抗菌活性檢測將化學合成的CATH_BRALE以2mg/ml的濃度溶解在無菌超純水中；用接種環挑取新活化的微生物，然後均勻塗布在新的LB瓊脂板上；將直徑O. 5 cm的圓形無菌濾紙片放在上述瓊脂板上，然後向紙片上滴加10 μ I CATH_BRALE樣品溶液；放入37 ° C恆溫培養箱中培養12-24 h ;觀察抑菌圈形成與否，將對CATH_BRALE敏感的菌株記錄下來。2. CATH_BRALE對敏感菌株最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)的測定。該實驗以人cathelicidin LL-37，無菌液體LB作陰性對照；最小抑菌濃度的定義為肉眼可以觀察到的完全抑制微生物生長的最低多肽濃度，或者是光吸收值不高於陰 性對照5%的最低濃度。挑取新活化的微生物，接種至無菌液體LB培養基，37 °C恆溫振蕩器中200 rpm培養10-16h至對數生長期；用紫外分光光度計測菌液600 nm光波處的吸光值，吸光值為I時，濃度大約為IO9 cfu/ml，將菌液用無菌液體LB培養基稀釋至IO6 cfu/ml，冰上待用；在96微孔板上配製濃度梯度為 200 μ g/ml> 100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml> 12. 5 μ g/ml、6.25 μ g/ml、3. 13 μ g/ml>I. 56 μ g/ml、0. 78 μ g/ml、0. 39 μ g/ml、0. 20 μ g/ml 的經O. 22 μ m孔徑膜過濾的CATH_BRALE樣品溶液，每孔50 μ I ;每孔加入50 μ I上述稀釋菌液；在恆溫振蕩器中37 °C，100 rpm振蕩培養10-16h ;使用酶標儀測600 nm吸光值或肉眼觀察；上述實驗重複3次，取平均值。另取一塊96孔板，同樣操作，僅是每孔多加IOOmMNaCl，仍然重複3次，取平均值。由表I可見，cath_brale對測試的微生物具有廣譜的抗菌活性，特別是對兩種水產養殖常見病原菌株Aeromonas salmonicida,(殺鮭氣單胞菌)Aeromonas hydrophila(嗜水氣單胞菌)。CATH_BRALE不僅對革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)具有抗菌活性，還對部分真菌也有抗菌活性，而LL-37對革蘭氏陰性菌(G-)基本無活性。與人LL-37相t匕，CATH_BRALE對革蘭氏陰性菌(G-)抗菌活性更強CATH_BRALE對P. aeruginosa(銅綠假單胞菌)最為敏感，最小抑菌濃度僅為I. 17 μ M0 CATH_BRALE對兩種水產養殖常見病原菌株A. salmonicida和A. hydrophila都具有非常強的抗菌活性，最小抑菌濃度僅為9. 38 μ M,而LL37在2mg/ml的高濃度下仍未顯示抑菌活性。此外，CATH_BRALE還具有一定的抗真菌活性，對白色念珠菌ATCC2002的最小抑菌濃度也僅為2. 34μΜ。表I CATH_BRALE的最小抑菌濃度(MIC)
權利要求
1.ー種細磷魚Cathelicidin家族廣譜抗微生物肽CATH_BRALE，是細鱗魚Cathelicidin基因編碼的一種直鏈多肽，富含鹼性胺基酸，其全序列為精氨酸_精氨酸-絲氨酸-賴氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-賴氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-精氨酸-天冬醯胺-丙氨酸。
2.權利要求I所述抗微生物肽CATH_BRALE的基因，其特徵在於編碼細鱗魚抗微生物肽CATH_BRALE前體cathelicidin的基因由909個核苷酸組成，自5』端至3』端序列為I ATGAAGATGA AGGCTCTGGC GAGATCTCTT CTCTTGCTCG CTGTGACTGG51 CCTGCTGGTC AGAGGTCATT CCCAGACTGA GACCAGGTAC GAAGACATCA101 TCACAGCTGC TTCAACTCAG CTGCTTCCTG TGGAAGAGCA GGCTTTCCGT151 CCGCTTCTGA ACCAGCTGGA AGTCGAGACT TTGAATACAG AGGATGTGGA201 CCAGTCTGAG GTATCTGTAA AGTTGAGCTT TCCCCTGCAG GAGACTCTCT251 GCAGAAAGGC ACAAGGCCAA CCATGCCCTC TGAAGAAAAA TGGGAAACGA301 ATGATGTGCA GCATGGAGGT CAGACATCCG ATTCTGGATA CTGGCAACAC351 CCTCAACACT GACTGGTCTG ACATTTCTTG TGAATACATG GAGGCAGAAG401 ATGCTATGCC AGTACTGAGC ACTCAGAAGA TTCGGACAAG AAGAAGCAAG451 GCCAGGGGAG GCTCTAGGGG CTCTAAGATG GGTAGAAAAG ATTCCAAGGG501 GGGTAGCAGA GGTCGTCCTG GGAGTGGCTC TCGTCCTGGG GGTGGCTCCT551 CCATTGCTGG AGCTAGCAGA GGAGACCGTG GTGGAACTCG CAATGCATAG601 AACAGCACAA CACACCCTCT GGATAACTGC AAAATATCTC ACCAATCAAA651 GGAACTTCAA AAGCACTCAA AGTTGAGTTT AACGGATGAA CATGCAACCT701 TAAGCTTCTG GTAACTCTTT TGTCTACATT CTGAATTGGT TTGTATTTTG751 TAGCTATCGT TGTTTGTAAT AATGTACCTA TTCTTACATG CCAATCCTTG801 AATTTTAACT ACGGAAAATT GTTTCCAGTT CATGTTTACT GCACTAATAA851 ACTGCTAAAT AAGTTTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAATGGT GTCTCATCGT901 ACCCCGAAT 編碼細鱗魚cathelicidin成熟肽CATH_BRALE為第439 — 597位核苷酸，其胺基酸序列為Arg1 Arg2 Ser3 Lys4 Ala5Arg6 Gly7 Gly8 Ser9 Arg10 Gly11 Ser12 Lys13 Met14 Gly15 Arg16T 17 a 18<-^ 19 T 20 /-Ai 21 /-Ai 2223 a 24 /-a t 25 a 26 t) 27 r^-\ 2829 /-a i 3031 a 32Lys Asp Ser Lys Gly Gly Ser Arg Gly Arg Pro Gly Ser Gly Ser ArgPro33 Gly34 Gly35 Gly36 Ser37 Ser38 He39 Ala40 Gly41 Ala42Ser43 Arg44 Gly45 Asp46 Arg47Gly48 Gly49 Thr50 Arg51 Asn52 Ala53
3.權利要求I所述抗微生物肽CATH_BRALE的製備方法，其特徵在於根據編碼細鱗魚cathelicidin抗微生物肽基因推斷的成熟肽CATH_BRALE胺基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列；通過HPLC反相柱層析脫鹽純化，並確定其純度大於95% ;用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜測定其分子量；等電聚焦電泳測定等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。
4.權利要求2所述細磷魚抗微生物肽CATH_BRALE基因在醫療、生物製藥及水產養殖病害防治中的應用，其特徵在幹，合成的CATH_BRALE抗菌肽具有很強的殺菌作用，尤其對於水產養埴常見的病原菌A. salmonicida、A. hydrophila及真菌。溶於滅菌超純水,用於藥理活性檢測。
全文摘要
一種細鱗魚Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、製備、應用，屬於生物醫學技術領域。CATH_BRALE的基因由909個核苷酸組成，其中編碼成熟肽部分的為第439－597位核苷酸。成熟肽CATH_BRALE富含鹼性胺基酸，對水產養殖常見病原菌殺菌作用很強。結構簡單，不含有二硫鍵及環狀結構，方便化學合成及基因工程製備。其對多種臨床耐藥菌，尤其是真菌也有較好的殺滅作用。
文檔編號C12N15/12GK102816223SQ20121018694
公開日2012年12月12日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者於海寧, 王義鵬, 厲政, 張嵩巖 申請人:大連理工大學