桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子及其重組表達載體和應用的製作方法
2024-03-02 13:56:15 1
桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子及其重組表達載體和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子及其重組表達載體和應用，桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，長度為1812bp，包括二氫黃酮醇還原酶基因起始密碼子ATG開始的12bp編碼序列和上遊的1800bp序列，該啟動子能夠介導外源蛋白在根部特異表達，為植物基因工程的研究和應用提供了具有重要價值的啟動子。
【專利說明】桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子及其重組表達載體和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於基因工程領域，具體涉及桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子，還涉及含有 桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子的重組表達載體和應用。
【背景技術】
[0002] 桑樹是一種多年生木本植物，長期以來，桑樹作為家蠶的主要食物來源，對蠶絲 產業的發展起到至關重要的作用。桑樹含有豐富的類黃酮化合物，二氫黃酮醇還原酶 (dihydroflavonol4_reductase，DFR)基因是植物類黃酮生物合成途徑中的一個關鍵基因， 該基因的編碼產物能夠催化二氫黃酮醇的還原反應而生成無色花青素，屬於還原型輔酶II 依賴性的還原酶家族。目前該基因已在多種植物中被克隆，序列分析表明其在功能區域的 序列高度保守，並且該基因結構保守，一般由6個外顯子和5個內含子組成。桑樹DFR基因 (MnDFR)的⑶S序列長度為1008bp，編碼336個胺基酸殘基，由6個外顯子組成。序列分析 表明MnDFR的N端具有預測的NADP結合結構域，其決定底物特異性的關鍵胺基酸殘基為天 冬氨酸，表明MnDFR屬於天冬氨酸類型DFR，該類型DFR不能有效的催化二氫山萘酚還原生 成天竺葵素類花青素。MnDFR的表達模式及調控活性由MnDFR啟動子序列決定，而現有技術 中尚未見關於MnDFR啟動子的報導。
【發明內容】
[0003] 有鑑於此，本發明的目的之一在於提供桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子，本發明的 目的之二在於提供含有桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子的重組表達載體；本發明的目的之三 在於提供桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子的應用。
[0004] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0005] 1、桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子，核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。
[0006] 2、含有所述桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子的重組表達載體。
[0007] 優選的，所述重組表達載體由SEQ ID N0. 3所示序列替換pCAMBIA1303載體上35S 啟動子而得。
[0008] 3、所述桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子在植物根部特異表達外源蛋白中的應用。
[0009] 優選的，所述植物為擬南芥。
[0010] 優選的，所述外源蛋白可以為生物活性物質或抗性蛋白，更優選的，所述外源蛋白 為β-葡萄糖苷酸酶。
[0011] 本發明的有益效果在於：本發明首次提供了桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子，該啟 動子可特異性地在轉基因植物的根部實現外源基因的高效表達；本發明還提供了含有桑樹 二氫黃酮醇還原酶啟動子的重組表達載體，該重組表達載體能夠用於製備轉基因植物，獲 得在根部特異二氫黃酮醇還原酶啟動子下遊基因的轉基因植株，為特異在植物根部表達外 源蛋白提供了有利的工具。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0013] 圖1為桑樹MnDFR啟動子的PCR結果（M表示DL2000Plus DNA Marker，泳道1為 桑樹MnDFR啟動子的PCR擴增，箭頭所示為擴增得到的目的條帶）。
[0014] 圖2為植物表達載體pCAMBIA1303-MnDFR的重組質粒與酶切驗證（M表示 DL2000Plus DNA Marker，泳道 1 表示 pCAMBIA1303 載體，泳道 2、3 表示 pCAMBIA1303-MnDFR 重組質粒，泳道4、5表示pCAMBIA1303-MnDFR的雙酶切驗證）。
[0015] 圖3為擬南芥的⑶S染色結果（WT表示野生型擬南芥，Dfrp-3、Dfrp-ll和Dfrp-12 表示不同的轉基因陽性植株）。
【具體實施方式】
[0016] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未註明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0017] 實施例1、桑樹MnDFR基因啟動子的獲得
[0018] 設計擴增MnDFR啟動子的引物，上遊引物為5' -cgtctgaacccggtcctaa-3'（SEQ ID NO. 1)，下遊引物為：5' -cttcgatcccatattgctgc-3'（SEQ ID N0.2)。然後以川桑基因組 DNA為模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示序列為引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為： 10 X Ex-taq buffer2. 5 μ L，25mM MgCl22 μ L，2. 5mM dNTP2 μ L，川桑基因組 DNA30ng，10 μ Μ 上、下遊引物各1 μ L，5U/ μ 1 Ex-taq聚合酶0. 2 μ L，滅菌水補足至25 μ L ;PCR擴增條件為 94°C預變性4分鐘；94°C變性40秒，55°C退火40秒，72°C延伸2分鐘，進行30個循環；最 後72°C延伸10分鐘，4°C保存。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，待溴酚藍跑至2/3時 停止電泳，溴化乙錠（EB)染色後用清水衝洗，置於紫外燈觀察，結果如圖1所示。然後切下 含有目的條帶的膠塊，並使用Takara公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit對 產物進行回收，回收產物與PMD19-T simple載體連接，得pMD19-T simple-MnDFR載體。將 PMD19-T simple-MnDFR載體送測序公司測序。測序結果表明，MnDFR啟動子序列如SEQ ID NO. 3所示，長度為1812bp，包括MnDFR基因起始密碼子ATG開始的12bp編碼序列和上遊的 1800bp 序列。
[0019] 實施例2植物表達載體pCAMBIA1303-MnDFR的構建
[0020] 根據實施例1獲得的桑樹MnDFR基因啟動子序列和pCAMBIA1303載體序列，選擇 合適的酶切位點，設計構建植物表達載體的引物，具體為：上遊引物：5' -cgggatcccgtctg aacccggtcctaa-3'（SEQ ID Ν0· 4)，下劃線表示 BamHI 酶切位點，下遊引物：5' -gactagtctt cgatcccatattgctgc-3'（SEQ ID Ν0· 5)，下劃線表示Spel酶切位點。然後以實施例1所得 PMD19-T simple-MnDFR載體為模板，SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示序列為引物進行PCR擴 增，PCR 擴增體系為：10 X Ex-taq buffer2. 5 μ L，25mM MgCl22 μ L，2. 5mM dNTP2 μ L，pMD19-T simple-MnDFR質粒 50pg，10 μ M上、下遊引物各 1 μ L，5U/ μ L Ex-taq聚合酶 0· 2 μ L，滅菌水 補足至25 μ L ;PCR擴增條件為94°C預變性4分鐘，94°C變性40秒，55°C退火40秒，72°C延 伸2分鐘，共30個循環，最後72 °C延伸10分鐘，4°C保存。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠 電泳，待溴酚藍跑至2/3時停止電泳，溴化乙錠（EB)染色後用清水衝洗，置於紫外燈下切下 含有目的條帶的膠塊，使用Takara公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit對產 物進行回收。
[0021] 將回收的PCR產物經BamHI和Spel雙酶切，回收酶切產物（MnDFR啟動子）， 同時用BamHI和Spel雙酶切pCAMBIA1303載體，將該載體中的35S啟動子切掉，回收 PCAMBIA1303載體片段，然後將酶切後的MnDFR啟動子與pCAMBIA1303載體片段進行連 接，構建得到pCAMBIA1303-MnDFR重組載體。為了驗證pCAMBIA1303-MnDFR重組載體，將 pCAMBIA1303-MnDFR重組載體用BamHI和Spel雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳，待溴酚藍跑至 2/3時停止電泳，溴化乙錠（EB)染色後用清水衝洗，置於紫外燈下切下含有目的條帶的膠 塊，同時以未經酶切的PCAMBIA1303載體和pCAMBIA1303-MnDFR重組載體為對照，結果如圖 2所示。結果顯示，pCAMBIA1303-MnDFR重組載體經BamHI和Spel酶切後能夠獲得預期的 片段，表明pCAMBIA1303-MnDFR重組載體構建成功。獲得的pCAMBIA1303-MnDFR重組載體 是以MnDFR啟動子替換pCAMBIA1303載體上的35S啟動子，替換後β -葡萄糖苷酸酶基因 (⑶S)基因由MnDFR啟動子啟動表達。
[0022] 實施例3、桑樹MnDFR基因啟動子在擬南芥中表達外源蛋白
[0023] 將植物表達載體pCAMBIA1303-MnDFR轉化到農桿菌菌株LBA4404感受態細胞中， 在YEB培養基中培養至0D 6(?為0. 6-0. 8,離心收集菌體，用擬南芥轉化滲透液（1/2MS培 養基 2. 17g，蔗糖 50g，MESO. 5g，定容至 1L，Κ0Η 調 pH 值至 5. 7 後，加入 lmg/mL6-BA10 μ L 和SilwetZOOuL)重懸後製成轉化菌液。通過農桿菌介導的浸花法，將植物表達載體 pCAMBIA1303-MnDFR轉化至擬南芥基因組中，然後培養並收穫擬南芥種子。
[0024] 篩選轉基因植株，具體方法如下：將收穫的擬南芥種子放置於4°C春化兩天後，置 於30°C烘箱烘乾一天，然後將種子放在消毒液（立白消毒液500yL，Tw een-205yL，滅菌 水定容至10mL)中，震蕩消毒10分鐘，用滅菌水清洗種子5次，之後用0. 05%的瓊脂懸浮 種子，用槍頭將懸浮的擬南芥種子點在篩選培養基（1/2MS培養基2. 17g，蔗糖30g，定容至 1L，Κ0Η調pH值至5. 8,加入6. 5g瓊脂，高壓滅菌後，加入卡那黴素至終濃度50ng/mL，混勻 後倒平板）中，將平板用封口膜封緊後置於23°C培養。
[0025] 對篩選得到的轉基因陽性植株的種子繼續進行篩選，獲得T3代植株，並對其進行 β_葡萄糖苷酸酶（GUS)染色觀察，結果如圖3所示。結果顯示，在不同的轉基因系中，GUS 基因特異性的在根部表達，表明MnDFR啟動子能夠調控下遊基因在根部特異表達。
[0026] 最後說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通 過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在 形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的範圍。
[0001] _序歹丨j表_ 西南大學 桑樹二氫黃酮醇還原酶β動子及其重組表達載體和應用 <160 5 <210 1 19 DNA 人工序列 MwZXPi?啟動子上遊引物 1 cgicigaacc cgglcclaa 19 2 20 DNA 人丄序列 仰啟動了上遊引物 2 cttcgalccc atatlgcigc 20 3 1812 DNA 人工序列 MnDM啟動子 3
[0002] cgtctgaacc cggtcctaag taaggcaggt ataggagcaa gttttttttg tttggtgggg 60 gggaagcata cccaacttga tttcgcccaa taatcatcct tattctcaat tttttagacg 120 aaataaagaa aaataaatgt taagaatttt caatcggggg ^agaaaaatc aatgttaaga 180 attttcaatc gtggggaagc atacccaact ttatttcgcc caataatcat ccttattctc 240 aattttttag attgcaatac gaattctaga ttgaacacga aataaagaaa aatcaatgtt 300 aagaattttc aatctcaacg actttactgt attctacatt gagattgagt caatgttaag 360 agtatttcaa tatcaacgac tttactgagt gttagaagct tccttcgaat ttttaaatat 420 gaatcaccat gcttacacct cttctatttt ctagaaatgt cccatcattg ctgttgctat 480 tttctaataa ataccatttg ctataattta tatttttttt tctccagtaa agtacaaaac 540 ctactattat tacaactaaa atttaaaccg taaaaaattc ttggttgtta ttttcccctc 600 cttttggggc cctaaaagtc atttcggcac aatacaatgc aaatcatttg tttgttatac 660 aagtattcaa aatatttacg agacgtttag tttatagatt taaaattatg atttataatt 720 ttaattttta aaatttaaat tttttgtaag aaaaaaatac tgtaaaaaat taaaaattat 780 gattcaaaat tattgacgaa ctctttaaac aaatatccca ttagtgtaga ccttatttca 840 cttttacaat ttcttttcat tttgtcataa tttagaggag aacaagcatc gtgttcaa.aa 900 aatattcaag tataatcttt aaaaaaatca aatataatcg tggactctaa attggtaaat. 960 tttaagatga aaaaatggta ttcatctcca tgggataaat ctccatcact caaaaaaaaa 1020 aaatgtaatt ggctctcatc tattcattta gtggatcaat tttatgtgag tagcgaaatt 1080 ttaatctcat tgtgatgaat agaggtgttc tttaaaataa tgacatccaa aatgcaacaa 1140 tcacatccta ataatactag ctaacggtac gtttggtagt gattcttaga gtctaaaatc 1200 aattctctag tcagttgaaa tttgtatttg gtaaaaacca tagaaagtga ttcttaaaga 1260 aattttggag aattaacagt caaaattaga agtagtccaa tgacaacttt agcttttaga 1320 atacgcggta attaccttga agtgtaatta ataaaacttt catgataccc ataatatttc 1380 tggaatcaat acttatatag ttacagttta ctaaacactc agactgtttt ttgtaacagt 1140 tattttttta gcacagctaa tagtaatttt tttaaaaatt tacagcacta tcaaactagc 1500 tttaagtaga ctttttgaga acttaaaatt aaagaggaag atgaaaaaaa aaagggaaaa 1560 aaacttttaa aaaaaaaaaa aaaagcctca ggacctagga gcagccaaca atttcaactc 1620 ccacgttact agaaggtaaa gacttttata tgcgcgctag cccacgcgcg ttagggagat 1680 agttatagac catataatat atacagtttc tagcatggct aattgaggca atcatacaag 1740 tgctgtagag tttccaacga tcagtaacca aattttgtct ttcaaaagat tagcagcaat 1800 atgggatcga ag 1812 4 27 DNA 人[序列 構建植物表達載體上遊引物 4 cgggalcccg Ictgaacccg gtcctaa 27
[0003] 5 27 DNA 人工序列 構建植物表達載體下遊引物 5 gaclagLcLt cgalcccala UgcLgc 27
【權利要求】
1. 桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子，其特徵在於：核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2. 含有權利要求1所述桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子的重組表達載體。
3. 根據權利要求2所述的重組表達載體，其特徵在於：所述重組表達載體由SEQ ID NO. 3所示序列替換pCAMBIA1303載體上35S啟動子而得。
4. 權利要求1所述桑樹二氫黃酮醇還原酶啟動子在植物根部特異表達外源蛋白中的 應用。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於：所述植物為擬南芥。
6. 根據權利要求4或5所述的應用，其特徵在於：所述外源蛋白為β-葡萄糖苷酸酶。
【文檔編號】C12N9/24GK104059920SQ201410330860
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】何寧佳, 亓希武, 向仲懷 申請人:西南大學