一種微生物總基因組dna的提取方法
2024-04-06 00:12:05 2
專利名稱：一種微生物總基因組dna的提取方法
技術領域：
本發明屬於環境科學和生物技術科學領域，具體地涉及一種微生物總基因組DNA 的簡易提取方法，該方法藉助於生物技術手段，獲取樣品中微生物基因組。
背景技術：
環境樣品由於其成分的複雜性在對其進行DNA提取時，想要得到量大，純度又高的DNA是比較困難的。相對於環境水樣中微生物DNA的提取，養殖池塘底泥中微生物DNA提取難度更大。一方面，養殖池塘底泥中微生物種類更為豐富，這就提高了在DNA提取過程中對裂解細胞壁的要求；另一方面，底泥中富含的懸浮物，腐殖質和硫化物等物質，都會影響到所提取到的DNA的純度，進而影響後續的PCR等實驗操作。所以，使環境樣品中微生物細胞壁充分裂解釋放DNA以及獲得純度較高的DNA樣品是養殖池塘底泥微生物總基因組DNA 提取和對底泥微生物多樣性分析的關鍵。本發明解決了養殖池塘底泥微生物總基因組DNA提取中存在的操作時間長，所提取的DNA量少而純度低等問題，提出了一種微生物總基因組DNA的提取方法，具有DNA釋放量大、實驗條件簡易、成本低等有益效果。
發明內容
本發明提出了一種微生物總基因組DNA的提取方法，包括以下步驟
(1)將TENP洗液加入待提取樣品中，再經過8000rpm，4°C，離心得到沉澱；
(2)向所述沉澱加入裂解液和溶菌酶溶液，於37°C進行水浴後，充分渦旋震蕩；
(3)加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，依次於55°C、70°C下進行水浴，於17000g，4°C，離心
得上清；
(4)用等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提液對所述步驟(3)得到的上清進行抽提，經離心得上清，重複用等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提液抽提一次；
(5)用等體積的氯仿/異戊醇抽提液抽提，離心得上清；
(6)向所述步驟(5)得到的上清中加入異丙醇，室溫下靜置，離心得到DNA沉澱；
(7)用乙醇將所述DNA沉澱重懸，離心後棄上清，經乾燥得到沉澱；
(8)用成分為IOmMTris-HCl, ImM EDTA, PH=8. 0的TE溶液將所述步驟(7)得到的沉澱溶解，得到所述微生物總基因組DNA，置於-20°C保存備用。當所述待提取樣品是含有水分的，所述步驟(2)中進行水浴前還加入玻璃珠，並對待提取樣品進行充分渦旋震蕩處理。所述的步驟(1)中TENP洗液pH為8 10，添加量為1. 5^3mL,優選添加量為2mL。所述 TENP 洗液成分為 50 m mol/L Tris, 20 m mol/L EDTA，100 m mol/L NaCl, 0. 59Γ2. 5%w/v聚乙烯基吡咯烷酮。其中，聚乙烯基吡咯烷酮的優選添加量為l%w/v。所述的步驟(2)中，所述裂解液成分為IM Tris-HCl,0. 5M EDTA，0. 5M Na3P04,1. 5M NaCl, 1% CTAB ；所述溶菌酶溶液添加量為200 400 μ L，濃度為10_80mg/mL。
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所述的步驟(3)中，SDS溶液濃度為20% 25%W/v，添加量為100 200 μ L ；蛋白酶K 濃度為15-30mg/mL，添加量為50 100μ L。所述的步驟(4)中酚/氯仿/異戊醇抽提液中酚、氯仿、異戊醇的體積比例為 25:24:1ο所述的步驟(5)中氯仿/異戊醇抽提液中氯仿、異戊醇的體積比例為對:1。所述的步驟(6)中所述異丙醇的加入體積是步驟(5)得到的上清體積的0. 6倍。所述的步驟(7)中所述乙醇為預冷的70%乙醇，添加量為廣1. 5mL。本發明目的之一在於解決養殖池塘底泥微生物總基因組DNA提取過程中操作時間長，試劑價格昂貴以及提取到的DNA量少、純度不夠等問題。該方法可以很好的破裂革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的細胞壁，大量除去樣品中的腐殖質和蛋白質，所得的DNA可以用於PCR-DGGE技術，能較準確地反映出底泥環境中細菌微生物的豐度和種群多樣性。本發明將採集到的樣品先用洗液洗滌，然後經過玻璃珠，裂解液和溶菌酶的作用， 使細菌細胞充分破裂，釋放DNA。將獲得的粗提DNA經過酚/氯仿/異戊醇抽提後得到純化。按照本發明得到的DNA樣品純度較高，可直接用於後續的PCR等實驗操作，且本發明操作簡單，耗時短，一次可處理多個樣品，非常適合在實驗室條件下進行簡單的DNA提取。針對養殖池塘底泥類樣品中微生物總基因組DNA的提取，本發明具體操作步驟如下
(1)把待提取樣品放入離心管中，用洗液除去樣品中的腐殖酸，SOOOrpm,4°C，離心後得到樣品沉澱；
(2)所得的沉澱中加入玻璃珠，裂解液和溶菌酶溶液，37°C水浴Ih後，充分渦旋，使細菌充分裂解釋放DNA ；
(3)離心管中加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，使蛋白變性或降解，55°C水浴20min，7(TC 水浴 IOmin, 17000g, 4°C，離心 IOmin 得上清；
(4)所得的上清轉移至乾淨離心管中，用等體積酚/氯仿/異戊醇抽提液抽提兩次，離心得上清；
(5)上清轉移至乾淨離心管中，用等體積氯仿/異戊醇抽提液抽提一次，離心得上清；
(6)所得的上清中加異丙醇沉澱DNA，室溫下靜置一段時間，離心取沉澱；
(7)所得的DNA沉澱用乙醇重懸，離心後棄上清，乾燥沉澱；
(8)所得的沉澱用TE溶液溶解，得到微生物總基因組DNA，並置於-20°C保存備用。上述步驟中洗液TENP的pH為10左右，可以有效地除去腐殖質。上述步驟⑵中溶菌酶的濃度為50mg/mL，添加量為300 μ L，渦旋時間為5 10min。上述步驟(3)中SDS濃度為25%w/v，添加量為100 μ L ；蛋白酶K的濃度為20mg/ mL，添加量為60 μ L。上述TE 溶液的成分為 10mmol/L Tris-Hcl，lmmol/L EDTA，溶液 pH=8。本發明上述方法也可適用於其他土壤中微生物DNA的提取，若待測樣品是乾燥的土壤，可以省去適用於含有水分的底泥類樣品的玻璃珠，改為先用液氮研磨處理樣品後，再按本發明其他步驟進行操作。本發明方法是利用物理、化學和酶等多種方法對細胞壁進行裂解，從而最大限度地釋放DNA;另外，實驗中所用的所有試劑和儀器都是基礎的生物學實驗用品，容易獲得且價格低廉。使用本發明得到的DNA樣品，可直接用於16 S rDNA片段的擴增，得到的DGGE 圖譜能較準確地反映環境樣品中細菌的豐度和多樣性。
圖1養殖池塘底泥微生物基因組DNA電泳圖譜。圖2養殖池塘底泥微生物基因組DNA 16S rDNA擴增電泳圖譜。圖3養殖池塘底泥微生物基因組DNA PCR-DGGE電泳圖譜。
具體實施例方式結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內容不局限於以下實施例。在不背離發明構思的精神和範圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，並且以所附的權利要求書為保護範圍。實施例上海市金山區漕涇養殖基地對蝦養殖池塘底泥微生物DNA提取 1.底泥樣品的前期處理
1. 1取底泥樣品0. 2g加入已滅菌的2mL TENP洗液(50 m mol/L Tris, 20 m mol/ L EDTA, 100 m mol/L NaCl，l%w/v 聚乙烯基吡咯烷酮，pH=10)，渦旋混勻，65°C水浴!3min， SOOOrpm離心5min，取沉澱。重複1步驟2 3次，直至上清變得較透明。2.底泥樣品中微生物細胞壁裂解
2.1向1. 1步驟獲得的沉澱中加入約6粒直徑為Imm的玻璃珠，ImL的裂解液(IM Tris-HCl, 0. 5M EDTA，0. 5M Na3P04,1. 5M NaCl, 1% CTAB)禾口 300 μ L 50mg/mL 的溶菌酶溶液， 渦旋震蕩5 10min，37°C水浴Ih以上。3.底泥樣品種粗DNA的獲取
3.1向2. 1的離心管中再加入60 μ L 20mg/mL蛋白酶K溶液和100 μ L 25%SDS溶液，55°C水浴20min，7(TC水浴IOmin ； 17000g，4°C，離心lOmin，取上清；加等體積酚/氯仿 /異戊醇(體積比25 24 :1)提取液，混勻，12000g，4°C，離心5min，取上清；用酚/氯仿/異戊醇(體積比25 24 :1)提取液再抽提一次，取上清；加等體積氯仿/異戊醇(體積比M :1) 提取液，混勻，12000g, 4°C，離心5min，取上清。4.底泥樣品微生物基因組DNA的獲取
4. 1在3. 1所得上清中加0. 6倍體積的異丙醇，室溫下靜置30min以上，5400g， 4°C，離心5min，取沉澱；加入預冷的70%的乙醇，5400g, 4°C，離心5min，一次性倒盡上清，沉澱乾燥 15min，用 50μ L IXTE 溶液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ΡΗ=8. 0)溶解沉澱，得到底泥樣品中微生物總基因組DNA樣品，將樣品置於-20°C下冷凍保存。
使用實施例中所用方法提取上海市金山區漕涇養殖基地對蝦池底泥樣品DNA，可以得到清亮的DNA條帶，經紫外分光光度測定，所得樣品0擬60/0擬80的值在1. 6^1. 9之間，表明所提到的DNA蛋白含量較低。本實施例提取得到的養殖池塘底泥微生物基因組DNA 電泳檢測結果如圖1所示。圖1中，第1泳道為λ -Hind πι Marker，第2泳道為養殖池塘進水口處底泥中微生物的總基因組DNA，條帶大小在IOOOObp左右，第3泳道養殖池塘中部底泥中微生物的總基因組DNA，條帶大小在IOOOObp左右，第4泳道養殖池塘出水口處底泥中微生物的總基因組DNA，條帶大小在IOOOObp左右。從條帶亮度來看，本實施例提取得到的養殖池塘中部底泥中微生物的總基因組DNA量較大，且條帶清晰說明提取到的DNA完整性較好。為了驗證所提取到的DNA樣品能否用於分子生物學分析，將實驗得到的DNA樣品用細菌16S rDNA V3區特異性引341F/534R進行擴增，PCR擴增後，取分別取5 μ L和IOyL 進行瓊脂糖電泳和變性梯度凝膠電泳，電泳結果如圖2和圖3所示。圖2為養殖池塘底泥微生物基因組DNA 16S rDNA擴增電泳圖譜；其中，第1泳道為空白對照，第2泳道為養殖池塘進水口處底泥中微生物的總基因組DNA，條帶大小在 200bp左右，第3泳道為養殖池塘中部底泥中微生物的總基因組DNA，條帶大小在200bp左右，第4泳道為養殖池塘出水口處底泥中微生物的總基因組DNA，條帶大小在200bp左右，第 5 泳道 DL-2000Markero圖3為養殖池塘底泥微生物基因組DNA PCR-DGGE電泳圖譜；其中，第1泳道養殖池塘進水口處底泥中微生物的總基因組DNA，第2泳道養殖池塘中部底泥中微生物的總基因組DNA，第3泳道泳道養殖池塘出水口處底泥中微生物的總基因組DNA。從實驗結果可以看出樣品中微生物種類豐富，優勢菌條帶明顯，進一步驗證了本發明方法能夠較好地實現微生物總基因組DNA的提取，所提取的DNA樣品經16 S rDNA片段的擴增能夠準確反映環境樣品中細菌的豐度和多樣性。
權利要求
1.一種微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將TENP洗液加入待提取樣品中，再經過8000rpm，4°C，離心得到沉澱；(2)向所述沉澱加入裂解液和溶菌酶溶液，於37°C進行水浴後，充分渦旋震蕩；(3)加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，依次於55°C、70°C下進行水浴，於17000g，4°C，離心得上清；(4)用等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提液對所述步驟(3)得到的上清進行抽提，經離心得上清，重複用等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提液抽提一次；(5)用等體積的氯仿/異戊醇抽提液抽提，離心得上清；(6)向所述步驟(5)得到的上清中加入異丙醇，室溫下靜置，離心得到DNA沉澱；(7)用乙醇將所述DNA沉澱重懸，離心後棄上清，經乾燥得到沉澱；(8)用TE溶液將所述步驟(7)得到的沉澱溶解，得到所述微生物總基因組DNA，置於-20°C保存備用。
2.如權利要求1所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，當所述待提取樣品是含有水分的，所述步驟(2)中進行水浴前還加入玻璃珠，並對待提取樣品進行渦旋震蕩。
3.如權利要求1所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，所述的步驟(1) 中TENP洗液pH為8 10，添加量為1. 5 3mL，優選添加量為2mL。
4.如權利要求2所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，所述TENP洗液成分為 50 m mol/L Tris, 20 m mol/L EDTA，100 m mol/L NaCl，0. 5% 2. 5%w/v聚乙烯基吡咯烷酮；其中，聚乙烯基吡咯烷酮的優選添加量為l%w/v。
5.如權利要求1所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，所述的步驟(2) 中，所述裂解液成分為 IM Tris-HCl,0. 5M EDTA，0. 5M Na3P04,1. 5M NaCl，1% CTAB ；所述溶菌酶溶液添加量為20(Γ400μ L，濃度為10-80mg/mL。
6.如權利要求1所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，所述的步驟(3) 中，SDS溶液濃度為20% 25%w/v，添加量為100 200 μ L ；蛋白酶K濃度為15_30mg/mL，添加量為 50^100 μ L0
7.如權利要求1所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，所述的步驟(4) 中酚/氯仿/異戊醇抽提液中酚、氯仿、異戊醇的體積比例為25:24:1。
8.如權利要求1所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，所述的步驟(5) 中氯仿/異戊醇抽提液中氯仿、異戊醇的體積比例為1。
9.如權利要求1所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，所述的步驟(6) 中所述異丙醇的加入體積是步驟(5)得到的上清體積的0. 6倍。
10.如權利要求1所述的微生物總基因組DNA的提取方法，其特徵在於，所述的步驟 (7)中所述乙醇為預冷的70%乙醇，添加量為廣1. 5mL。
全文摘要
本發明公開了一種微生物總基因組DNA的提取方法，向待提取樣品中加入裂解液和溶菌酶，使細菌細胞充分破裂並釋放DNA；將獲得的粗提DNA經過酚/氯仿/異戊醇提取液抽提後得到經純化的微生物總基因組DNA。本發明提取方法具有DNA釋放量大、實驗條件簡易、成本低等有益效果。
文檔編號C12N15/10GK102409041SQ20111040592
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者常忠義, 王亭芳, 趙雲龍, 金風傑, 高紅亮 申請人:華東師範大學