一種具有高生物功能性的肝素化界面材料製備方法
2024-04-06 07:27:05 1
專利名稱：一種具有高生物功能性的肝素化界面材料製備方法
技術領域：
本發明涉及生物工程功能材料，尤其是具有生物功能性的肝素化界面材料製備技術領域。
背景技術：
肝素是硫酸乙醯肝素的高度硫酸化的形式，是一種具有抗凝血性的生物分子，存在於細胞外基質中、它也是多種蛋白酶和生長因子的特異性識別體。因此，界面肝素化材料具有的抗凝活性和特異識別性，在生物晶片技術以及生物材料領域得到了廣泛的研究和應用。目前製備肝素化界面材料的方法主要有物理吸附和共價固定。肝素分子物理吸附於材料表面的結合方式不穩定，體內情況下很短時間釋放完。肝素在材料表面的共價固定是製備肝素化界面材料的最常用方法，儘管共價固定的肝素化界面材料對於肝素分子的保留具有較持久性，然而共價固定使肝素分子的生物活性被大大削弱，其潛在的蛋白特異性識別能力的大大降低，限制了其進一步拓展的應用價值。
發明內容
鑑於現有技術的以上不足，本發明的目的是提供一種可製備出具有高度肝素生物活性保持力的界面材料的方法，在保證其具有高度生物活性保持力的同時，使之具有製備操作簡單方便，無需昂貴的專用設備，製備成本低的優點。本發明的目的是通過如下手段來實現的。一種具有高生物功能性的肝素化界面材料製備方法，採用如下步驟在生物材料表面獲得肝素化界面材料A、採用脈衝等離子體聚合方法在經濺射清洗的基底材料表面上沉積一層烯丙胺等離子體聚合薄膜；B、將A處理後的沉積有等離子體聚合薄膜的生物材料浸泡於pH值為2-7的PBS 溶液中I-M小時，使其表面氨基質子化；C、將肝素鈉加入B步驟所述的PBS緩衝溶液中，濃度為l-10mg/ml，室溫25°C下反應I-M小時，反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，得目標材料。採用本發明方法製備的肝素化界面材料不僅具有優異的抗凝和抗平滑肌細胞粘附和增殖能力，並且對其特異性識別的酶(如蛋白酶ATIII)、細胞外基質蛋白(如而)、生長因子(如VEGF)、趨化因子(如SDF-I α )表現出優異的特異識別能力。結合特異性識別的蛋白酶(ATIII)、細胞外基質蛋白蛋白(纖連蛋白)、生長因子(FGF-1、FGF-2、VEGF)、趨化因子(SDF-Ia)等的肝素功能化界面材料在抗凝、血管生成、免疫學、促進傷口癒合、組織再生醫學等領域具有廣泛的應用前景。
圖1是本發明獲得的316L不鏽鋼和肝素化界面材料H印-PPAam的APTT結果圖。
圖2為316L不鏽鋼和肝素化界面材料Ifep-PPAam結合ATIII和VEGF的定量結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的實施作進一步的描述，實施例所用試劑均為分析純。 為敘述方便，本申請中的「基底材料」是對採用本發明方法進行表面改性生物的材料和器件的統稱。實施例1製備鈷基合金為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將基底材料放入薄膜沉積反應室中，當反應室真空抽至為0. 01時， 通入流量為Isccm的氬氣，在射頻功率為50W，負偏壓為50的條件下進行5分鐘的濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜製備濺射清洗後，重新使反應室的真空度為0. OlPa，通入流量為0. 5sccm的氬氣作為放電氣體，並通入作為反應氣體的烯丙胺，使工作壓力為lPa， 在射頻功率5W、負偏壓為50V、脈衝佔空比為5%的條件下進行為時60分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在基底材料表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的材料浸泡於pH值為2的PBS溶液中1小時，使其表面氨基質子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩衝溶液中，濃度為lmg/ml，室溫25°C下反應1小時，反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，即得。實施例2製備鐵基材料為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將基底材料放入薄膜沉積反應室中，當反應室真空抽至為2 時，通入流量IOsccm的氬氣，在射頻功率為200W，負偏壓為150V的條件下進行30分鐘的濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜製備濺射清洗後，重新使反應室的真空度為2Pa，通入流量為^ccm的氬氣作為放電氣體，並通入作為反應氣體的烯丙胺，使工作壓力lOPa，在射頻功率50W、負偏壓為150V、脈衝佔空比為100%的條件下進行為時5分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在基底材料表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的基底材料浸泡於pH值為7的PBS溶液中M小時，使其表面氨基質子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩衝溶液中，濃度為10mg/ml，室溫25°C下反24小時，反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，即得。
實施例3製備NiTi合金為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將基底材料放入薄膜沉積反應室中，當反應室真空抽至為0. 2Pa時， 通入流量為kccm的氬氣，在射頻功率為100W，負偏壓為100V的條件下進行15分鐘的濺射
清洗；A2等離子體聚合薄膜製備濺射清洗後，重新使反應室的真空度為0. 2Pa，通入流量為^ccm的氬氣作為放電氣體，並通入作為反應氣體的烯丙胺使工作壓力為5Pa，在射頻功率30W、負偏壓為100V、脈衝佔空比為30%的條件下進行為時30分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在材料表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的材料浸泡於pH值為4的PBS溶液中12小時， 使其表面氨基質子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩衝溶液中，濃度為5mg/ml，室溫25°C下反應12小時， 反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，即得。實施例4製備鈦合金為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將材料放入薄膜沉積反應室中，當反應室真空抽至為1 時，通入流量為Ssccm的氬氣，在射頻功率為150W，負偏壓為75V的條件下進行25分鐘的濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜製備濺射清洗後，重新使反應室的真空度為lPa，通入流量為如ccm的氬氣作為放電氣體，並通入作為反應氣體的烯丙胺，使工作壓力為8Pa，在射頻功率40W、負偏壓為120V、脈衝佔空比為50%的條件下進行為時45分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在血管支架表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的材料浸泡於pH值為5. 5的PBS溶液中小時，使其表面氨基質子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩衝溶液中，濃度為8mg/ml，室溫25°C下反應20小時， 反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，即得。D、ATIII 固定將C步表面肝素化的材料浸泡在含抗凝血酶原(ATIII)的PBS溶液中，室溫25°C 下反應M小時，反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，即得。其Hep-PPAam的 APTT結果如圖1。實施例5製備316L不鏽鋼為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將基底材料放入薄膜沉積反應室中，當反應室真空抽至為0. OlPa時，通入流量為IOsccm的氬氣，在射頻功率為200W，負偏壓為150V的條件下進行30分鐘的
濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜製備濺射清洗後，重新使反應室的真空度為0. OlPa，通入流量為^ccm的氬氣作為放電氣體，並通入作為反應氣體的烯丙胺，使工作壓力為10Pa，在射頻功率50W、負偏壓為150V、脈衝佔空比為5%的條件下進行為時60分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在材料表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的材料浸泡於pH值為2的PBS溶液中M小時， 使其表面氨基質子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩衝溶液中，濃度為10mg/ml，室溫25°C下反應M小時， 反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，即得。D、VEGF 的固定將C步表面肝素化的材料浸泡在含內皮細胞生長因子(VEGF)的PBS溶液中，室溫 25°C下反應M小時，反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，即得目標產物。其 Hep-PPAam結合ATIII和VEGF的定量結果如圖2所示。圖1為用本發明的方法製備的肝素化界面材料的部分凝血活酶時間結果表明肝素化界面材料表面顯著地提高了內源性抗凝血性能，說明本專利製備的肝素化界面材料具有優異的抗凝血性。圖2為用本發明的方法製備的肝素化界面材料對AT-III和VEGF特異性結合的定量測試結果，表明該化界面材料能顯著提升對AT-III和VEGF的結合量，說明本專利製備的肝素化界面材料具有優異的優異肝素-蛋白結合功能。圖1和圖2的良好結果對本發明其它實施例亦不失一般性。本發明製備方法在生物材料及其器械表面構建具有高度生物活性保持力的肝素單分子層。採用等離子體聚合技術在生物材料及其器械表面沉積上一層結合牢固且富含胺基官能團的等離子體聚合薄膜。經過在酸性PBS中浸泡後，表面氨基被質子化並帶上豐富的正電荷，與肝素分子自身負電基團(羧酸根和磺酸根)發生強靜電作用後，有效的把肝素結合上其表面。與現有技術相比，本發明的有益效果是一、聚合塗層與生物材料及其器械表面採用等離子沉積方法，結合牢固，塗層含有豐富的氨基官能團。二、依靠肝素的羧酸根和磺酸根和等離子體聚合薄膜表面質子化的氨基的強靜電吸附作用在其表面固定的肝素具有很強的結合力。三、由於肝素固定不採用任何偶聯劑，使得肝素功能性得到有效的保持，表現出優異肝素-蛋白結合功能。通過進一步在該肝素功能化界面材料表面結合特異性識別的蛋白、生物分子和生長因子，能實現其在抗凝、血管生成、免疫學、促進傷口癒合、組織再生醫學等領域的應用。同時此種肝素功能化界面材料的製備，僅需以浸泡自組裝的的方式在等離子體聚合薄膜表面構建肝素單分子層，其製備過程，操作簡單方便，也無需昂貴的專用設備，製備成本低。 採用本發明的基本方法，在實際實施時還可有廣泛的實際變例，例如本申請中的 「基底材料」可包括生物醫用金屬基材料(Fe、鎂基材料、316L SS、Ti、Ti合金Ni-Ti合金及 Co-Cr合金等)、無機材料(Ti_0、TiN等)、不可降解聚合物(如PET、PTFE、PDMS等)及可降解聚合物材料(如PLA、PLGA和PCL等)。
權利要求
1.一種具有高生物功能性的肝素化界面材料製備方法，採用如下步驟在生物材料表面獲得肝素化界面材料A、採用脈衝等離子體聚合方法在經濺射清洗的基底材料表面上沉積一層烯丙胺等離子體聚合薄膜；B、將A處理後的沉積有等離子體聚合薄膜的生物材料浸泡於pH值為2-7的PBS溶液中I-M小時，使其表面氨基質子化；C、將肝素鈉加入B步驟所述的PBS緩衝溶液中，濃度為l-10mg/ml，室溫25°C下反應 1-24小時，反應完畢後，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，乾燥，得目標材料。
2.根據權利要求1所述的一種具有高生物功能性的肝素化界面材料製備方法，其特徵在於，所述A步用脈衝等離子體聚合法在生物醫用材料及其器件表面上沉積等離子體聚合薄膜的具體作法為Al濺射清洗將生物醫用材料及其器件表面放入薄膜沉積反應室中，當反應室真空抽至為0. 01-2Pa時，通入流量為I-IOsccm的氬氣，在射頻功率為50-200W，負偏壓為50-150V 的條件下進行5-30分鐘的濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜製備濺射清洗後，重新使反應室的真空度為0. 01-2Pa,通入流量為0. 5-^ccm的氬氣作為放電氣體，並通入作為反應氣體的烯丙胺，使工作壓力為 Ι-lOPa，在射頻功率5-50W、負偏壓為50-150V、脈衝佔空比為5-100 %的條件下進行為時 5-60分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，得到所述烯丙胺等離子體聚合薄膜。
3.根據權利要求1所述的一種具有高生物功能性的肝素化界面材料製備方法，其特徵在於，所述基底材料可為生物醫用金屬基材料。
4.根據權利要求3所述的一種具有高生物功能性的肝素化界面材料製備方法，其特徵在於，所述生物醫用金屬基材料為316L不鏽鋼、鈦及其合金、NiTi合金、鈷基合金、鐵基材料和鎂基材料。
全文摘要
本發明公開了一種具有高生物功能性的肝素化界面材料製備方法。首先採用脈衝等離子體聚合方法在經濺射清洗的基底材料表面上沉積一層烯丙胺等離子體聚合薄膜，然後將處理後的沉積有等離子體聚合薄膜的生物材料浸泡於pH值為2-7的PBS溶液中1-24小時，使其表面氨基質子化；再將肝素鈉加入的PBS緩衝溶液中，濃度為1-10mg/ml，室溫25℃下反應1-24小時，經蒸餾水充分漂洗，乾燥，得目標材料。本發明方法僅需以浸泡自組裝的的方式在等離子體聚合薄膜表面構建肝素單分子層，其製備過程操作簡單方便，無需昂貴的專用設備，製備成本低。
文檔編號C23C14/12GK102268639SQ20111019570
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月13日 優先權日2011年7月13日
發明者冷永祥, 楊志祿, 王進, 趙元聰, 黃楠 申請人:成都交大麥迪克科技有限公司, 西南交通大學