一種分離微生物宏基因組dna與總rna的方法
2024-04-06 01:00:05 1
一種分離微生物宏基因組dna與總rna的方法
【專利摘要】本發明涉及DNA和RNA分離【技術領域】，公開了一種分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，S1：總核酸的獲取：準備細胞裂解液，利用有機溶劑將細胞裂解液中的蛋白質與脂類去除；S2：總RNA的分離：向步驟S1中的總核酸中加入氯化鋰溶液，在低溫靜置後採用離心的方法分離出總RNA，將上清液中的宏基因組DNA轉移放置；S3：宏基因組DNA的沉澱：取出步驟S2中所轉移放置的上清液，利用預冷的異丙醇或乙醇將上清液中的宏基因組DNA沉澱，並在低溫靜置後採用離心的方法分離出宏基因組DNA；S4：宏基因組DNA與總RNA的純化，採用乙醇洗滌純化步驟S2和步驟S3中獲得的總RNA和宏基因組DNA，採用離心的方法獲得純化後的總RNA和宏基因組DNA。本發明具有分離效果好、回收率高、成本低、操作簡單的優點。
【專利說明】—種分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及DNA和RNA分離【技術領域】，更具體的說，特別涉及一種分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法。
【背景技術】
[0002]目前，關於核酸同時提取的方法報導的已有很多，有針對無細胞壁的動物組織細胞(Deborah A.Triant, Andrew Whitehead.Simultaneous Extraction of High-QualityRNA and DNA from Small Tissue Samples[J].Journal of Heredity,2009,100 (2):246-250)，有堅韌細胞壁的植物組織(劉勝洪，劉文，劉明峰，等.一種高效提取獼猴桃DNA 和 RNA 的方法[J],生物技術通報，2011，9:171-175)，醫學材料(M.Bauer, D.Patzelt.A method for simultaneous RNA and DNA isolation from dried blood and semenstains [J].Forensic Science International [J].2003,136 (1-3):76-78.)或其他環境樣品(Carla M.Zammita, Lesley A.Mutcha, v, et al.The recovery of nucleic acid from biomining and acid mine drainage microorganisms[J].Hydrometallurgy, 2011,108(1-2):87-92)。但這些報導中應用的核酸分離法多為試劑盒分離或採用核酸酶處理。
[0003]採用試劑盒分離的成本較高，且在處理量較大超過吸附柱的承載量時回收率會降低，造成損失嚴重；採用酶處理時，雖然可以有效除去DNA中的RNA或RNA中的DNA，但是浪費比較嚴重，特別針對一些提取所得核酸總量較少的難取樣或取樣量有限的樣品，可能會導致分析所需核酸量不足而需要擴增，而擴增常常就會導致分析結果的偏差或失真。但是，目前基於分子生物學分析的技術已經深入各個領域，如分析環境樣品中的生物多樣性和代謝多樣性，生態系統中的群落動態變化與對環境因子的響應(X i e，J., Z.He, X.Liu, etal.GeoChip-based analysis of the functional gene diversityand metabolic potential of microbial communities in acid mine drainage[J].Appl Environ Microbiol.2011.3(77):991-999)，疾病診斷、監測和治療，法醫鑑定，生物酶的開發與生產等，相關的實驗手段如:實時定量PCR技術(Han，J.S.，and C.G.Kim.Microbiological monitoring of acid mine drainage treatment systems andaquatic surroundings using real-time PCR[J].Water Sci Technol.2009.11 (59):2083-2091)、基因晶片技術(Guo, X., H.Yin, J.Cong, et al.RubisCO gene clustersfound in a metagenome microarray from acid mine drainage[J].Appl EnvironMicrobiol.2013.6(79):2019-2026)和宏基因組測序技術(Auld, R.R.，M.Myre,N.C.Mykytczuk, et al.Characterization of the microbial acid mine drainagemicrobial community using culturing and direct sequencing techniques[J].JMicrobiol Methods.2013.2(93):108-115)等。然而這些分析均需以高質量的DNA或RNA為材料，故在核酸的提取與分離過程中既要保證完整性又要保證全面性。因此，有必要提供一種分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法,為分子生物學分析提供有利的技術支持,為宏基因組學或宏轉錄組學的分析奠定技術基礎。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種成本低、回收率高、操作簡單的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法。
[0005]為了解決以上提出的問題，本發明採用的技術方案為:
[0006]一種分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，包括以下步驟:
[0007]步驟S1:總核酸的獲取，準備細胞裂解液，並利用有機溶劑將細胞裂解液中的蛋白質與脂類去除；
[0008]步驟S2:總RNA的分離，向步驟SI中的總核酸中加入氯化鋰溶液，並在低溫靜置後採用離心的方法分離出總RNA，同時將上清液中的宏基因組DNA轉移放置；
[0009]步驟S3:宏基因組DNA的沉澱，取出步驟S2中所轉移放置的上清液，利用預冷的異丙醇或乙醇將上清液中的宏基因組DNA沉澱，並在低溫靜置後採用離心的方法分離出宏基因組DNA ；
[0010]步驟S4:宏基因組DNA與總RNA的純化，分別採用乙醇洗滌純化步驟S2和步驟S3中獲得的總RNA和宏基因組DNA，並分別採用離心的方法獲得純化後的總RNA和宏基因組DNA。
[0011]根據本發明的一優選實施例:所述步驟SI中的有機溶劑為氯仿和異戊醇的混合液，並且氯仿和異戊醇的體積比為24: 1，所述有機溶劑的加入量與細胞裂解液的體積相
坐寸ο
[0012]根據本發明的一優選實施例:所述步驟SI中的總核酸體積若小於100 μ L，則核酸樣品濃度在300-400ng/ μ L。
[0013]根據本發明的一優選實施例:所述步驟S2中的氯化鋰溶液為飽和溶液，並且氯化鋰溶液的加入體積為總核酸溶液體積的0.25倍，而氯化鋰溶液需經121°C，0.1MPa的高溫高壓滅菌30min。
[0014]根據本發明的一優選實施例:所述步驟S2中的低溫靜置條件具體為，首先在-20°C的溫度下靜置20min，然後在4°C的溫度下靜置6_8h。
[0015]根據本發明的一優選實施例:所述步驟S2和S3中的離心條件具體為，在溫度為40C (也可以為常溫)，離心力為12000Xg下離心20min。
[0016]根據本發明的一優選實施例:所述步驟S3中，所述異丙醇或乙醇的加入量為上清液體積的0.6倍，其低溫靜置條件具體為在-20°C的溫度下靜置30min，也可以為_70°C或-80℃。
[0017]根據本發明的一優選實施例:所述步驟S4中的洗滌用乙醇為70 %稀釋液，其中的無水乙醇與水體積比為7: 3。
[0018]根據本發明的一優選實施例:所述步驟S4中的離心條件為在離心力為1000OXg的條件下室溫離心15min。
[0019]根據本發明的一優選實施例:所述細胞裂解液為菌種樣品或環境樣品的細胞裂解液。
[0020]與現有技術相比，本發明的方法相對於現有技術中的試劑盒分離以及酶處理法的優點在於:1、能夠實現純菌樣品或環境樣品的同提核酸中大片段(大於23kb)的基因組DNA與總RNA的有效分離；2、該方法具有分離效果好、回收率高、成本低、操作簡單，無容量限制的優點；3、該方法回收的DNA和RNA質量較好，純度較高，可以滿足下遊的聚合酶鏈式反應(PCR)和逆轉錄PCR反應。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為本發明的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法的流程圖。
[0022]圖2為本發明中純茵樣品的同時提取核酸分離結果示意圖。
[0023]圖3為本發明中環境樣品的同時提取核酸分離結果示意圖。
[0024]圖4為本發明中分離純化後核酸的吸收曲線圖。
[0025]圖5為本發明中分離所得DNA的PCR擴增示意圖。
[0026]圖6為本發明中分離所得RNA的逆轉錄PCR示意圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0028]實施例一:
[0029]本實施例中，採用的細胞裂解液為菌種樣品，所採用的菌種均來自中南大學資源生物學院生物冶金教育部重點實驗室菌種庫中保藏的純菌，這些細菌均分離自酸性礦坑水(pHl-3左右)，能夠在較低的pH下生長，具有氧化亞鐵和硫的能力，一般用於微生物溼法冶金生產中；其中，Acidithiobacillus.ferrooxidans (A.f)為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌,最適生長溫度25-30°C，最適pHl.5-2，以氧化亞鐵離子獲取能源；Acidithilbacillus caldus (A.c)為嗜酸喜溫硫桿菌，最適生長溫度40-45°C,最適pH2-2.5,以還原型硫化物,單質硫為能源物質；At.albertlensis (A.t)為嗜酸中溫硫桿菌,最適生長溫度30°C,最適pHl.8,利用單質硫和還原型硫化物生長；Leptospirillum.ferriphilium(L.f)為嗜鐵鉤端螺旋菌,最適生長溫度40°C,最適pHl.6,僅利用亞鐵為能源物質；Ferroplasma.thermophilum(F.t)嗜熱鐵質古菌，最適生長溫度為45°C,最適pH為1.0,該菌為化能有機營養型或化能混營養型，可以利用酵母浸出物。實驗具體操作步驟如下(結合圖1):
[0030]1.60 μ L混合核酸中加入15 μ L飽和氯化鋰溶液，於-20°C靜置30min後於4°C靜置6-8小時；
[0031]2.室溫下，在離心力為12000Xg的條件下離心20min沉澱總RNA，上清液轉移入新的1.5mL無酶EP管；
[0032]3.在上清液中加入45tL異丙醇，於_20°C靜置30min後，在室溫下，在離心力為12000 Xg的條件下離心20min沉澱宏基因組DNA ；
[0033]4.為了提高所得RNA的純度，用DNase I進一步純化總RNA，加入量為0.2U / μ g，37°C 水浴 30min ；
[0034]5.用ImL濃度為70%預冷乙醇洗滌宏基因組DNA與總RNA並於室溫下，在離心力為1000OXg的條件下離心15min後回收宏基因組DNA和總RNA ；
[0035]6.室溫下晾乾乙醇,用TE緩衝液或ddH20重溶。
[0036]在上述過程中，所有的移液器等需經RNase噴霧清除劑處理後，高溫高壓蒸汽滅菌。
[0037]下表1與表2為分別利用本方法與現有的QIAGENA11 Prep DNA / RNA MiniKit (Germany)試劑盒分離所得宏基因組DNA和總RNA的質量,從這兩個表可以看出，在初始量核酸一致的情況下，本方法所回收到的宏基因組DNA與總RNA均高於利用商業化試劑盒所回收到的量，其中，本發明對宏基因組DNA的回收量比試劑盒提高50-300%，本發明對總RNA的回收量比試劑盒提高10-50%，而且，本方法所回收到的核酸質量也優於試劑盒所分離得到的核酸質量。
[0038]表1利用本發明分離不同菌DNA與RNA結果
[0039]
【權利要求】
1.一種分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟S1:總核酸的獲取，準備細胞裂解液，並利用有機溶劑將細胞裂解液中的蛋白質與脂類去除； 步驟S2:總RNA的分離，向步驟SI中的總核酸中加入氯化鋰溶液，並在低溫靜置後採用離心的方法分離出總RNA，同時將上清液中的宏基因組DNA轉移放置； 步驟S3:宏基因組DNA的沉澱，取出步驟S2中所轉移放置的上清液，利用預冷的異丙醇或乙醇將上清液中的宏基因組DNA沉澱，並在低溫靜置後採用離心的方法分離出宏基因組 DNA ； 步驟S4:宏基因組DNA與總RNA的純化，分別採用乙醇洗滌純化步驟S2和步驟S3中獲得的總RNA和宏基因組DNA，並分別採用離心的方法獲得純化後的總RNA和宏基因組DNA。
2.根據權利要求1所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述步驟SI中的有機溶劑為氯仿和異戊醇的混合液，並且氯仿和異戊醇的體積比為24: 1，所述有機溶劑的加入量與細胞裂解液的體積相等。
3.根據權利要求1所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述步驟SI中的總核酸體積若小於100 μ L，則核酸樣品濃度在300-400ng/ μ L。
4.根據權利要求1所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述步驟S2中的氯化鋰溶液為飽和溶液，並且氯化鋰溶液的加入體積為總核酸溶液體積的0.25 倍。
5.根據權利要求1所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述步驟S2中的低溫靜置條件具體為，首先在_20°C的溫度下靜置20min，然後在4°C的溫度下靜置6-8h。
6.根據權利要求1所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述步驟S2和S3中的離心條件具體為，在溫度為4°C，離心力為12000Xg下離心20min。
7.根據權利要求1所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述步驟S3中，所述異丙醇或乙醇的加入量為上清液體積的0.6倍，其低溫靜置條件具體為在_20°C的溫度下靜置30min。
8.根據權利要求1所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述步驟S4中的洗滌用乙醇為70%稀釋液，其中的無水乙醇與水體積比為7: 3。
9.根據權利要求1所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述步驟S4中的離心條件為在離心力為1000OXg的條件下室溫離心15min。
10.根據權利要求1~9任一項所述的分離微生物宏基因組DNA與總RNA的方法，其特徵在於:所述細胞裂解液為菌種樣品或環境樣品的細胞裂解液。
【文檔編號】C12N15/10GK103642799SQ201310732555
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】劉新星, 謝建平, 雲慧, 邱冠周 申請人:中南大學