一種全酶法製備磷酸寡糖的方法

2024-02-29 11:35:15 2

專利名稱：：一種全酶法製備磷酸寡糖的方法
技術領域：
：本發明涉及一種低聚糖的製備方法，確切地說是利用馬鈴薯澱粉為原料，採用全酶法製備一種新型的功能性低聚糖-磷酸寡糖的方法。二
背景技術：
：寡糖(oligosacchride)也叫低聚糖，是指由210個單糖通過糖苷鍵連接而形成的直鏈或支鏈的低度聚合物。根據寡糖生物學功能又可將其分為功能性寡糖和普通寡糖兩大類，而功能性寡糖是指具有特殊的生理學功能，特別是不被人和動物腸道吸收並促進雙歧桿菌的增殖，有益於腸健康的一類寡糖，即雙歧因子。磷酸寡糖(Phosphorylatedoligosaccharides)的概念最早是由日本學者Kamasaka，H.等於1995年提出的，他們在生產澱粉糖的廢液中，發現了這種新物質，通過結構進行分析以後發現，這是由麥芽低聚糖中的葡萄糖殘基與磷酸根共價連接得到的一類低聚糖，由於其結合有磷酸根，因此，其整個基團帶有負電荷，Kamasaka，H等人將其命名為Phosphorylatedoligosaccharides(P0s)，艮卩磷酸寡糖。在以後的進一步研究中發現，磷酸寡糖具有對人體有益的生理功能，它可以在弱鹼性條件下能與鈣離子結合成可溶性複合物，抑制不溶性鈣鹽的形成，從而提高小腸中有效鈣離子的濃度，促進人體對鈣質的吸收，且不被口腔微生物發酵利用，同時，還具有加強牙齒釉質再礦化的作用，達到防止齒質損害的效果。磷酸寡糖主要成分的結構如圖l所示。在製備磷酸寡糖的技術上，日本學者採用殼聚糖修飾的層析柱進行分離，(《Biosci.Biotech.Biochem.，61(2)，238-244，1997》。從文獻報導來看，該層析柱的交換容量有限，且其洗脫收集液用70%乙醇進行醇沉來脫鹽，脫鹽效率低，僅適用於實驗室的微量製備，無法實現中試放大和工業化生產。經檢索，只發現一例生產磷酸糖類的的美國專利(專利號USPatent6268182)，但該專利技術生產得到的磷酸糖類是對葡聚糖、瓊脂等多糖先進行磷酸化，再進行水解而得，但是，磷酸化處理屬於化學法範疇，可能帶能安全性問題，並且，磷酸化後還需進行水解步驟，過程繁瑣，能耗較大，所以，經濟利益不大，不利於大型工業化生產。我國學者谷利偉在所發文章中曾經提到過磷酸寡糖(《食品與機械，1999，12:27-28》)，但並未引起我國食品研究學者的過多關注。近十年間，國內關於磷酸寡糖的研究和報導很少，僅有關於磷酸寡糖前體及檢測方法的簡單報導，並未對磷酸寡糖的生產做細緻研究。三
發明內容本發明旨在提供一種有益於人體健康的磷酸寡糖，所要解決的技術問題是以馬鈴薯澱粉為原料用生物酶法工業化製備磷酸寡糖。本發明的技術方案是以馬鈴薯澱粉為原料的全酶促反應，包括調漿、液化、糖化以及分離、純化、濃縮、乾燥各單元過程，與現有技術的區別是所述的液化是在比重812。B6、pH值5.06.0的漿料中加入氯化鈣和耐高溫a-澱粉酶用蒸氣噴射液化器於10012(TC下進行液化，控制出口溫度9597t:，並在此溫度下保溫2535min，液化結束後滅酶、壓濾分離得到澱粉液化料，以幹澱粉計，氯化鈣的加入量為0.60.7kg/噸澱粉，耐高溫a-澱粉酶的加入量為16800002520000u/噸澱粉；所述的糖化是在澱粉液化料中加入真菌酶和普魯蘭酶於溫度5565°C、pH值5.05.5條件下糖化24h，糖化結束後滅酶、活性炭脫色並壓濾分離得到澱粉糖化液，以幹澱粉計，真菌酶加入量為24000003600000u/噸澱粉，普魯蘭酶加入量為1600024000u/噸澱粉；所述的純化是澱粉糖化液首先用001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂吸附除去金屬離子和帶正電荷的雜質，然後用陰離子交換樹脂分離磷酸寡糖。收集洗脫液即是主要含磷酸寡糖的糖液，經濃縮、乾燥得到磷酸寡糖產品。所述的陰離子交換樹脂選自7170強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、201X7強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、D201大孔強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂或者D315大孔弱鹼性丙烯酸系陰離子交換樹脂等。優選7170強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂，樹脂活化後，再經pH4.5的乙酸鈉_乙酸緩衝溶液平衡24h，使溶出液pH4.5，採用pH4.05.0的乙酸鈉-乙酸緩衝溶液定容配製的0.20.4mol/L氯化鈉溶液為洗脫劑，以0.3BV/h洗脫流速進行洗脫，收集洗脫流出液即是主要含磷酸寡糖的糖液，經濃縮、乾燥得到磷酸寡糖產品。為進一步純化可用凝膠層析柱對主要含磷酸寡糖的糖液進行脫鹽處理，最後濃縮乾燥。本產品紅外光譜圖與紅外光譜圖庫比較分析表明，產品為結合有磷酸的磷酸寡糖，進一步採用高效陰離子交換色譜法(HPAEC-PAD)進行分析，結果表明磷酸寡糖的含量>85%，聚合度27。由於本方法採用新型國產7170強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂進行磷酸寡糖的分離，該樹脂交換容量大，可以運用於大型離子交換系統，因此可以進行POs的大量製備，且對糖液採用凝膠層析脫鹽，該法脫鹽效果明顯，處理效率高，總之，該法可以適用於磷酸寡糖(POs)的大型工業化生產。同時，由於該法直接對馬鈴薯原澱粉進行液化、糖化等操作來製備POs，無需經過磷酸化處理，不會對產品帶來潛在的安全性問題，且步驟較簡單，能耗少，經濟利益較大。四圖1是磷酸寡糖主要成分X衍射圖。圖2是製備樣品HPAEC-PAD譜圖。圖中(a)為麥芽低聚糖標準品譜圖，(b)為樣品譜圖。圖3是樣品薄層析(TLC)譜圖圖4磷酸寡糖樣品紅外光譜圖。圖中(a)為馬鈴薯澱粉磷酸酯譜圖，(b)為樣品譜圖。圖5是本方法工藝路線圖。五具體實施方式1、具體操作步驟1)調漿。首先向配料罐裡注入水，而後在不斷攪拌下，徐徐投入1噸原料澱粉，用玻美計進行在線檢測，直到漿料濃度為1(TBe，然後加入0.65kgCaCl2做為酶活促進劑，用HC1和Na2C03將漿料調至ra值為5.4。2)液化。用泵將物料泵入噴射液化器後，向其中加入新型耐高溫a-澱粉酶，用量為2100000u/噸澱粉，在噴射器中，粉漿和蒸汽直接充分相遇，噴射溫度ll(TC，並維持48min，控制出料溫度為9597°C，噴射液化後的料液進入層流罐，在95。C條件下保溫30min，典試反應顯碘本色時，通蒸汽滅酶。液化料DE值為15%17%。3)—次板框壓濾。壓濾時，開始壓力應不低於0.6Mpa，待濾餅形成阻力增大時再增加壓力，但以不超過2Mpa為宜，料液應保持一定得溫度，以增加其流動性，但不應高於IO(TC，pH值為5.25.4時，過濾速度最快。4)糖化。將料液冷卻至6(TC，向糖化罐中加入真菌酶和普魯蘭酶，用量分別為3000000u/噸澱粉和20000u/噸澱粉，調節PH值為5.2，反應24h，然後通入高壓蒸汽IO(TC條件下滅酶23h。糖化液DE值為34%37%。主要成分為麥芽低聚糖。澱粉轉化率^98%。5)脫色、二次壓濾。糖化後糖液隨著管道進入脫色罐，罐中含有活性碳，保持罐溫為8(TC左右，糖液通入後，在不斷攪拌的情況下，活性碳吸附糖液所含的色素以及部分無機鹽，隨後活性碳隨同糖液一併進入板框壓濾機，經過壓濾除去活性碳。6)離子交換處理。經脫色、壓濾後的糖化液進入離子交換處理系統，首先，進入陽離子交換柱，樹脂使用001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，用來除去一些金屬離子及帶正電雜質。其次，經陽離子柱交換後的糖化液進入陰離子交換柱進行磷酸寡糖和中性糖的分離步驟，樹脂使用7170強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂(活化後，經pH4.5的乙酸鈉_乙酸緩衝溶液平衡24h，使流出液pH值為4.5)，當糖化液經過陰離子交換柱時，磷酸寡糖被吸附，而中性糖不被吸附，隨著管道進入三效蒸發濃縮系統進行濃縮，作為麥芽低聚糖進行銷售。而後對被吸附的磷酸寡糖進行洗脫，洗脫條件為採用經PH4.5的乙酸鈉-乙酸緩衝溶液定容配製的0.3mol/L氯化鈉溶液為洗脫劑，洗脫流速為0.3BV/h。用苯酚-硫酸法(吸取lml糖液+lml去離子水+lml6%的苯酚+5ml濃硫酸，靜置20分鐘，在490nm下檢測吸光度)進行糖含量檢測，直到洗脫液裡不再含糖，將先前所有洗脫液進行收集，內含磷酸寡糖粗品，最後，對收集液進行凝膠層析脫鹽處理。7)濃縮。將收集的磷酸寡糖粗樣液，使用旋轉蒸發器或者進入三效蒸發濃縮系統進行濃縮處理，為防止焦糖化發生，一般要求溫度不超過7(TC為宜。8)乾燥。使用噴霧乾燥法對濃縮液進行乾燥，即為最終磷酸寡糖成品。其中，噴霧乾燥的工藝條件為進料濃度35%45%;進料溫度6085°C;進風溫度135160°C;排風溫度7590°C;水分含量6%以下。3、產品的定性分析(1)HPAEC-PAD檢測糖組分採用HPAEC-PAD方法測定所製備的樣品糖分組成，以麥芽低聚糖標準品為對照，進行分析檢測。1)離子色譜條件色譜柱CarboPacPA1002_mm分析柱和保護柱；柱溫3(TC;檢測器脈衝安培檢測器PAD;流動相A:100%水；B:100mmol/L氫氧化鈉，200mmol/L乙酸鈉；進樣體積25iiL。梯度洗脫條件見表l。表1麥芽低聚糖漿梯度洗脫條件tableseeoriginaldocumentpage62)繪製標準品譜圖稱取葡萄糖和麥芽27糖標品(分別用G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7表示)約10mg，用100L的超純水溶解，混和均勻，用0.45m的水系濾膜過濾後進樣。得到標品譜圖，如圖2(a)所示。3)樣品組分檢測取製備的樣品將其稀釋至0.005%，用0.45m的水系濾膜過濾後進樣檢測。得到樣品譜圖，如圖2(b)所示(2)薄層層析(TLC)分析展開劑乙酸乙酯甲醇水氨水=io:is:2:3;顯色劑苯胺-二苯胺_磷酸。取矽膠板在100ll(TC活化3060min。取葡萄糖和麥芽低聚糖(DP27)標準品，分離得到的磷酸寡糖樣品，配成1%(W/V)的濃度，用微量吸管點樣於薄層板上，吹乾。再將薄層板放在盛有展開劑的層析缸中展開。當溶劑前沿到達距薄層板末端lcm時，停止展開。取出薄層板，用吹風機吹乾，噴顯色劑於薄層板，再在電熱板上加熱10min使其充分顯色。如圖3所示，1、2樣點均為磷酸寡糖樣品，可以看出譜帶顯色良好，展開稍有拖尾，其各個顯色點對應於標樣均顯滯後，是由於其結合磷酸根從而使分子量增大的緣故，由此我們可以推斷出磷酸寡糖含有結合有磷酸根的G2G7這幾種糖組分。(3)磷酸寡糖的紅外光譜分析將經乾燥後的樣品，通過溴化鉀壓片法進行紅外光譜分析。見圖4。對兩者進行對照分析，發現在1080和928cm—1左右，均有磷脂鍵特徵峰出現。根據紅外光譜圖庫對圖2兩組譜圖進行分析表明1080cm—1處有P-O-C基團的伸縮振動吸收峰，928cm—1處有5價磷的P_0伸展振動。此外，在3000-2800cm—1區域內的吸收峰是糖類的特徵峰，2930cm—1是次甲基(_CH2_)中C-H伸縮振動的吸收峰，1420cm—1處事羰基的C=O伸縮振動引起的吸收峰，768cm—1處是D-葡萄吡喃糖環C_0_C振動吸收峰，由此可以判定該產品即為結合有磷酸基團的磷酸寡糖。權利要求一種全酶法製備磷酸寡糖的方法，以馬鈴薯澱粉為原料，包括調漿、液化、糖化、以及分離、純化、濃縮、乾燥各單元過程，其特徵在於所述的液化是在比重8～12OBé、pH值5.0～6.0的澱粉漿料中加入氯化鈣和耐高溫α-澱粉酶用蒸氣噴射液化器於100～120℃下進行液化，噴射器出口溫度95～97℃並在此溫度下保溫25～30min；以幹澱粉計，氯化鈣的加入量為0.6～0.7kg/噸澱粉，耐高溫α-澱粉酶的加入量為1680000～2520000u/噸澱粉；所述的糖化在澱粉液化料中加入真菌酶和普魯蘭酶於溫度55～65℃、pH值5.0～5.5條件下糖化2～4h，以幹澱粉計，真菌酶加入量為2400000～3600000u/噸澱粉，普魯蘭酶加入量為16000～24000u/噸澱粉；所述的純化是澱粉糖化液首先用001×7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂吸附除去金屬離子和帶正電荷的雜質，然後使用陰離子交換樹脂收集洗脫液即是含磷酸寡糖的糖液。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的陰離子交換樹脂選自7170強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、201X7強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、D201大孔強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂或者D315大孔弱鹼性丙烯酸系陰離子交換樹脂。3.根據權利要求1或2所述的的方法，其特徵在於所述的陰離子交換樹脂為7170強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂，樹脂活化後，再經pH4.5的乙酸鈉-乙酸緩衝溶液平衡24h，使流出液pH值為4.5，採用經pH4.05.0的乙酸鈉-乙酸緩衝溶液定容配製的0.20.4mol/L氯化鈉溶液為洗脫劑，以0.3BV/h洗脫流速進行洗脫，收集洗脫液即是含磷酸寡糖的糖液。全文摘要本發明公開了一種利用馬鈴薯澱粉為原料，採用全酶法製備功能性低聚糖-磷酸寡糖的方法。採用新型耐高溫α-澱粉酶結合低壓蒸汽噴射液化技術對馬鈴薯澱粉進行液化，並加入CaCl2做為酶活促進劑，待液化完全，液化液經板框壓濾後採用真菌酶進行糖化，並加入普魯蘭酶協同作用，使澱粉轉化率≥98％，製備出低DE值的麥芽低聚糖漿。使用001×7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂處理糖漿，用於除去一些帶正電荷的雜質及色素物質，而後採用7170強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂進行處理，分離除去中性糖，得到帶負電荷的磷酸寡糖。最終，對分離所得糖液進行濃縮乾燥，即為目的產品。文檔編號C12P19/00GK101792785SQ200910185880公開日2010年8月4日申請日期2009年12月10日優先權日2009年12月10日發明者劉霞,杜先鋒,楊文軍申請人:安徽農業大學