一種發酵偶聯氣提的生產和分離純化丁醇的方法
2024-02-29 14:51:15
專利名稱：一種發酵偶聯氣提的生產和分離純化丁醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵偶聯氣提的生產和分離純化丁醇的方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
由於石油資源的短缺及其價格的不斷高漲，通過微生物發酵法獲得液體生物質能源不斷被人們所關注。和乙醇相比，丁醇具有能量密度高、飽和蒸汽壓低、和與現有的汽車發動機和石油管道運輸匹配性好等優點，被認為是更有前景的生物質能源(非專利文獻I)。但是，用生物法生產丁醇時，由於丁醇對細胞生長有強抑制作用，發酵液中終點的丁醇濃度通常不超過I. 5%(w/v)，導致其分離成本極高，很難實現工業化生產。近30年來，利用代謝 工程或誘變篩選的方法，通過對菌種的改造提高其丁醇耐受性及提高丁醇產量方面取得了一定的進展，但是發酵終點的丁醇濃度很難突破2%(w/v)。由於丁醇的沸點高於水且在發酵液中的濃度通常小於2%(w/v)，利用傳統的精餾分離技術對其分離所消耗的能量大於丁醇自身的能量(36kJ/g)，因此經濟上是不可行的(非專利文獻2)。在線發酵偶聯分離技術如液-液萃取、氣提、吸附和滲透汽化等，可以通過在發酵過程中不斷移除並回收對細胞產生抑制的產物丁醇，就可提高發酵效率，是提高生物法生產丁醇的一個經濟可行的有效途徑。其中，氣提法和其他在線分離回收技術相比，具有操作簡單、對細胞無毒害、節省能量消耗、設備投資和維護低等優點(非專利文獻3)。然而傳統的氣提分離技術均使用一步法分離純化，而且有些需要額外通入氮氣等氣體，增加了投入成本，即使使用自產氣進行氣提，由於未優化氣提操作條件和選取合適的發酵分離策略，也存在效率低和能耗大等缺點。例如，目前關於丁醇氣提的文獻中，氣提得到的丁醇濃度都低於其在水中溶解的濃度7. 7%(w/w)，在氣提冷凝液中仍然有大量的水存在，不但致使氣提過程中大部分能量消耗在冷凝液中的水上，並且導致後續分離成本很高(非專利文獻4-5)。到目前為止，未見使用兩步氣提法對丁醇進行分離純化的報導。現有技術非專利文獻I :Qureshi N, Saha BC, Hector RE, Hughes SR, Cotta MA. Butanolproduction from wheat straw by simultaneous saccharification and fermentationusing Clostridium beijerinckii: Part I — batch fermentation. BiomassBioenergj 32:168-175，2008.非專利文獻2:Zheng YNjLi LZj Xian M，Ma YJ，Yang JMj Xu X，He DZ. Problemswith the microbial production of butanol.Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology，36:1127-1138，2009.非專利文獻3 :Qureshi Nj Maddox IS, Friedl A. Application of continuoussubstrate feeding to the ABE fermentation:relief of product inhibitionusing extraction，perstract ion, stripping, and pervaporat ion.Biotechno IProg, 8:382-90, 1992.
非專利文獻4 :Ezeji TC, Qureshi N，Blaschek HP. Production ofacetone,butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAlOland in siturecovery by gas stripping. World J Microbiol Biotechnol.19:595-603,2003.非專利文獻5 ；Ennis B，Marshall CTj Maddox IS, Paterson AHJ. Continuousproduct recovery by in-situ gas stripping/condensation duringsolvent production from whey permeate using Clostridium acetobutyiicum.BiotechnolLett. 8:725-30，1986.
發明內容
本發明的目的在於提供一種有效提高丁醇分離效率從而得到高濃度丁醇產物的方法。能夠實現上述目的的本發明是一種發酵偶聯氣提的生產和分離純化丁醇的方法， 其特徵在於，該方法包括(I)培養丁醇生產菌的步驟；(2)發酵丁醇生產菌得到丁醇的步驟；和(3)利用兩步氣提法從發酵液中在線分離純化丁醇的步驟。在本發明的方法中，丁醇生產菌優選為丙酮丁醇梭菌、拜式梭菌或者酪丁酸梭菌。優選在步驟(2)中使用的發酵系統包括細胞固定化裝置，其中使用的吸附材料優選選自木塊、陶瓷、海綿、毛巾、樹脂、活性碳和沸石中的至少ー種。 在步驟(3)的第一步氣提中優選所用的氣體為發酵過程中丁醇生產菌產生的自產氣體，氣提原料液為丁醇生產菌的發酵液，氣體通過發酵系統中的分散器變成毫米或微米尺度的氣泡進入發酵系統中進行氣提；間歇式通入氣體吋，當發酵液中的丁醇濃度大於5g/L時通入氣體，當發酵液中的丁醇濃度低於5g/L時停止通入氣體；間歇式通入氣體時，對發酵終點的丁醇濃度可達到16g/L以上的生產菌，當發酵液中的丁醇濃度大於8g/L時通入氣體，當發酵液中的丁醇濃度低於8g/L時停止通入氣體；連續式通入氣體吋，當發酵液中的丁醇濃度大於5g/L時通入氣體，直到發酵結束；連續式通入氣體時，對發酵終點的丁醇濃度可達到16g/L以上的生產菌，當發酵液中的丁醇濃度大於8g/L時通入氣體，直到發酵結束。在步驟(3)的第二步氣提中優選所用的氣體為管路中的不凝性氣體，氣提原料液為第一步氣提得到的冷凝液的下層水相。另外，在步驟(3)中還優選第一步氣提和第二步氣提的氣體流速為每升氣提原料液中通入l_20L/min，氣體流動方向為向上或者向下，在氣提分離裝置中使用的冷凝管為直型或者蛇形冷凝管，冷凝溫度為_15°C -15° C。通過本發明的方法，在不增加設備投資和節省能耗的前提下，有效提高了丁醇的生產和分離效率，為目前以生物法生產丁醇為導向的液體生物燃料的生產提供了新的技術支持。
圖I為本發明中用於生產和分離純化丁醇的裝置結構示意圖。
圖2為發酵系統中的氣體分散器示意圖。圖3為發酵液的氣相色譜圖。圖4為第一步氣提得到的冷凝液的氣相色譜圖。圖5為第二步氣提得到的冷凝液的氣相色譜圖。圖6為最終產物的氣相色譜圖。
具體實施例方式本發明是一種發酵偶聯氣提的生產 和分離純化丁醇的方法，其特徵在於，該方法包括( I)培養丁醇生產菌的步驟；(2)發酵丁醇生產菌得到丁醇的步驟；和(3)利用兩步氣提法從發酵液中在線分離純化丁醇的步驟。下面，結合附圖I對發明進行詳細說明。首先，如圖I所不，在種子培養罐I中，使用CGM (Clostridium Growth Medium)
種子培養基來培養丁醇生產菌。對所述丁醇生產菌沒有特別限制，可列舉丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜式梭菌(Clostridium bei jerinckii )和酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)等生產丁醇的工程菌,優選丙酮丁醇梭菌。所述種子培養基在使用之前，優選先通入氮氣或其他惰性氣體3-5分鐘進行除氧處理後，再在121°C滅菌30分鐘，冷卻到室溫後，接入丁醇生產菌。優選將丁醇生產菌培養到生長最活躍的對數生長期。為了將丁醇生產菌培養到對數生長期，培養時間優選為12-18h，更優選為15h ;培養溫度優選為35-39°C，更優選為37。。。然後，將上述步驟中得到的含有丁醇生產菌的種子液從種子培養罐I經泵10接入到攪拌式生物反應器2中的發酵培養基後，通過啟動泵11，使發酵液在攪拌式生物反應器2和細胞固定化裝置3中循環(細胞會被細胞固定化裝置3中的吸附材料吸附，實現細胞固定化。)，開始發酵。發酵培養基是為丁醇生產菌提供營養(碳源)的物質，可以葡萄糖作為發酵培養基中的碳源，也可以澱粉、糖蜜、木薯或者纖維素水解液(例如秸杆水解液)等為發酵培養基中的碳源。所述發酵培養基在接入丁醇生產菌種子之前，優選在121°C滅菌30分鐘後，通入氮氣或其他惰性氣體l_2h進行除氧處理，冷卻到室溫後，接入丁醇生產菌。丁醇生產菌的接入量可依據發酵培養基的量適當調整，一般為培養基的5-10%(體積百分比)。發酵溫度優選為35-39° C，更優選為37° C。發酵過程中的pH優選控制在5. O以上，當pH低於5. O吋，向培養基中加入氫氧化鈉水溶液或氨水，當pH大於5. O吋，不需要調整。
另外，細胞固定化裝置3中使用的吸附材料可以是木塊、陶瓷、海綿、毛巾、樹脂、活性碳和沸石等可用來吸附細胞的材料。細胞固定化裝置具有如下作用第一、細胞被吸附材料吸附後，細胞在發酵系統中的密度增加，從而提高發酵液中的丁醇濃度和生產強度；第二、大部分細胞被吸附材料所吸附，小部分細胞懸浮在發酵液中，因此發酵液中的細胞密度降低，進而發酵液粘度降低，有利於對發酵液中丁醇的氣提，從而提高氣提效率和回收後冷凝液中的丁醇濃度；第三、非細胞固定化發酵需要每次發酵結束後，重新接入種子(菌體)，而細胞固定化後，發酵前不需要接種。本發明中，利用丁醇的揮發性和氣提過 程中氣體對丁醇的吸附原理，通過兩步氣提法從發酵液中在線分離純化丁醇，即一邊進行丁醇發酵，一邊利用兩步氣提法從發酵液中分離純化丁醇(發酵偶聯氣提)。對於氣提分離裝置，當攪拌式生物反應器2中的丁醇達到一定濃度後，啟動泵12開始第一步氣提，同時啟動低溫冷卻恆溫槽8為一次氣提冷凝管4提供低溫冷凝液，通過泵13將得到的丁醇冷凝液泵入一次氣提冷凝液儲罐5中。第一步氣提所用的氣提原料液為丁醇生產菌的發酵液，進入發酵系統中用於提取丁醇的氣體優選為發酵過程中丁醇生產菌產生的任何自產氣體，通常是二氧化碳和氫氣，並不需要提供外來氣體，這樣就可節省投入成本。其中，氣體優選通過發酵系統中的分散器(如圖2所示，通常放在攪拌式生物反應器2的底部)變成毫米或微米尺度的氣泡進入發酵系統中，其中分散器小孔的孔徑依氣提需要變化。第一步氣提中氣體的通入方式可為間歇式或者連續式。通入氣體的時機或策略，可依據生產菌對丁醇的耐受能力而定，根據發酵液中的丁醇濃度的變化而變化。間歇式通入氣體時，優選當發酵液中的丁醇濃度大於5g/L時通入氣體，當丁醇濃度小於5g/L時停止通入氣體。對於發酵性能好，產丁醇濃度高的生產菌，如果發酵終點的丁醇濃度(即未進行提取步驟的丁醇終濃度)可以達到16g/L以上，則優選發酵液中丁醇濃度大於8g/L時通入氣體，當丁醇濃度小於8g/L時停止通入氣體。同樣，連續式通入氣體時，優選當發酵液中的丁醇濃度大於5g/L時通入氣體，對於產丁醇濃度高的生產菌，優選發酵液中丁醇濃度大於8g/L時通入氣體，直到發酵結束。這樣，通過優化第一步氣提時發酵液中的丁醇濃度，第一步氣提後的冷凝液中的丁醇濃度可提高到15%左右，比傳統氣提方法的氣提效率提高了一倍並且能耗降低了 50%以上。第一步氣提的分離條件優選如下氣體流速為l_20L/min,氣體流動方向為向上或者向下；在氣提分離裝置中使用的冷凝管為直型或者蛇形冷凝管，冷凝溫度為-15。C-15°C。丁醇冷凝液在一次氣提冷凝液儲罐5中靜置分層，上層為富集丁醇的有機相，丁醇濃度在80%左右，下層為水相，濃度在8%左右。將上層通過泵15直接泵入二次氣提冷凝液儲罐7中回收，然後啟動泵14對一次氣提冷凝液儲罐5的下層冷凝液進行第二步氣提，同時啟動低溫冷卻恆溫槽9為二次氣提冷凝管6提供低溫冷凝液，通過泵16將得到的二次氣提冷凝液泵入二次氣提冷凝液儲罐7中。優選將第一步氣提得到的冷凝液的下層水相加熱到25° C_80° C之間進行二次氣提，通常選取37° C。使用的氣體優選為管路中的任何不凝性氣體如氮氣、二氧化碳和空氣，並不需要提供外來氣體，這樣就可節省投入成本。另外，第二步氣提中優選的分離條件與第一步氣提相同。對第一步氣提得到的冷凝液的下層水相進行第二步氣提，可以將丁醇濃度由8%提高到35%左右，而且只需要第一步氣提10%的能耗。如上所述，本發明的方法實現了丁醇發酵過程中毒性抑制產物的不斷移除和丁醇產物的有效回收與濃縮的雙重目的，提高了丁醇的生產效率，降低了丁醇的回收成本，提高了發酵法生產丁醇的經濟收益，適合於推廣應用。實施例下面結合實施例對本發明作具體說明。但本發明不受下述實施例的限制，在符合本發明前後宗旨的範圍內，可對本發明作適當變更。另外，下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學公司購買。
丁醇生產菌丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum,參見美國專利No. 5192673)，購買於美國 ATCC 菌種庫(ATCC number :55025_Ε604)。CGM種子培養基每升培養基中含葡萄糖30g、酵母粉2g、胰蛋白腖4g、磷酸二氫鉀
O.5g、磷酸氫二鉀O. 5g、乙酸銨2. 2g和礦物質混合物。其中，礦物質混合物的組成為每升培養基中含7水合硫酸鎂O. lg、7水合硫酸亞鐵O. 015g、2水合氯化鈣O. 015g、l水合硫酸錳O. Olg、氯化鈷O. 02g和硫酸鋅O. 002g。發酵培養基每升培養基中含葡萄糖80g、酵母粉lg、磷酸二氫鉀O. 5g、磷酸氫二鉀O. 5g、乙酸銨2. 2g、礦物質混合物和維生素。其中，礦物質混合物的組成為每升培養基中含7水合硫酸鎂O. 2g、7水合硫酸亞鐵O. Olg、I水合硫酸錳O. Olg和氯化鈉O. Olg ;維生素的組成為每升培養基中含對氨基苯甲酸O. OOlg、維生素B10. OOlg和生物素0. 00001g。丁醇生產菌的培養和發酵種子培養基在使用之前，通氮氣除氧3-5分鐘，然後在121° C滅菌30分鐘，冷卻到室溫後，接入生產菌。將丁醇生產菌在種子培養罐I中於37°C的條件下培養15h後，準備接入到發酵培養基中。發酵培養基在使用之前，在121° C滅菌30分鐘，然後通入氮氣除氧lh，冷卻到室溫後，通過泵10將含有丁醇生產菌的種子液(發酵培養基體積的5%-10%)泵入攪拌式生物反應器2中在37° C的條件下開始發酵，同時開啟泵11使含丁醇生產菌的發酵培養基在細胞固定化裝置3 (使用毛巾為吸附材料)和攪拌式生物反應器2中循環，實現細胞固定化。發酵培養基初始不調節pH值，當發酵液pH低於5. O後，自動流加氫氧化鈉水溶液或氨水，將pH調整到5. O以上。丁醇的分析使用常規氣相色譜法，葡萄糖的濃度測定使用常規液相色譜法或DNS法。比較例I傳統法進行氣提(一步氣提)按上述方法進行丁醇生產菌的培養和發酵。當丁醇生產菌接入攪拌式生物反應器2後，啟動用於氣提的氣提分離裝置，直到發酵結束。對氣提得到的冷凝產物進行收集、靜置，冷凝液無分層。傳統法進行氣提，採用發酵與氣提同時進行，並且無細胞固定化裝置 』另夕卜，傳統法也未進行第二步氣提。除此之外，第一步氣提的方法等均與實施例I相同。結果如表I所示。結果表明傳統法的氣提效率和丁醇回收濃度非常低。實施例I連續式通入氣體進行氣提(兩步氣提)
按上述方法進行丁醇生產菌的培養和發酵。當攪拌式生物反應器2中丁醇的濃度達到8g/L後，啟動泵12開始第一步氣提，直到發酵結束，同時啟動低溫冷卻恆溫槽8為ー次氣提冷凝管4提供低溫冷凝液。丁醇生產菌在發酵過程中產生的自產氣體通過分散器變成毫米至微米尺度的氣泡進入攪拌式生物反應器2中，作為氣提氣體。通過泵13將丁醇冷凝液泵入一次氣提冷凝液儲罐5中。丁醇冷凝液在一次氣提冷凝液儲罐5中靜置分層，將上層通過泵15直接泵入二次氣提冷凝液儲罐7中。然後將下層水相加熱到37°C，啟動泵14進行二次氣提，同時啟動低溫冷卻恆溫槽9為二次氣提冷凝管6提供低溫冷凝液。氣提氣體為管路中的不凝性氣體。通過泵16將二次氣提冷凝液泵入二次氣提冷凝液儲罐7中。在兩步氣提過程中均無外來氣體供應。另外，第一步氣提裝置和第二步氣提裝置的參數均設置為氣體流經冷凝管的方向為從下至上，蛇形冷凝管垂直放置，冷凝管控制溫度為0-2°C，氣體流速為I. 5L/min。第一步氣提的冷凝產物、第二步氣提的冷凝產物及最終產物中的丁醇濃度(％，w/V)如表I所示。對發酵液、第一步氣提得到的冷凝液、第二步氣提得到的冷凝液以及最終產物進行氣相色譜分析，結果如圖3-6所示。實施例2間歇式通入氣體進行氣提(兩步氣提)按上述方法進行丁醇生產菌的培養和發酵。當丁醇在發酵液中的濃度達到8g/L後，啟動用於第一步氣提的氣提分離裝置，當丁醇在發酵液中的濃度低於8g/L吋，關閉該氣提分離裝置。當發酵培養基中的葡萄糖濃度降到5g/L後，向發酵培養基中補加600g/L的濃縮葡萄糖，將葡萄糖濃度調節到80g/L，繼續發酵，共進行6個批式，加5次濃縮糖。除此之外，兩步氣提的方法與實施例I相同，氣提裝置與參數設置也與實施例I相同。結果如表I所示。表I
權利要求
1.一種發酵偶聯氣提的生產和分離純化丁醇的方法，其特徵在於，該方法包括 (1)培養丁醇生產菌的步驟； (2)發酵丁醇生產菌得到丁醇的步驟；和 (3)利用兩步氣提法從發酵液中在線分離純化丁醇的步驟。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述丁醇生產菌為丙酮丁醇梭菌、拜式梭菌或者酪丁酸梭菌。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，在步驟(2)中使用的發酵系統包括細胞固定化裝置，其中使用的吸附材料選自木塊、陶瓷、海綿、毛巾、樹脂、活性碳和沸石中的至少一種。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，在步驟(3)中，第一步氣提所用的氣體為發酵過程中丁醇生產菌產生的自產氣體,氣提原料液為丁醇生產菌的發酵液,氣體通過發酵系統中的分散器變成毫米或微米尺度的氣泡進入發酵系統中進行氣提。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，間歇式通入氣體時，當發酵液中的丁醇濃度大於5g/L時通入氣體，當發酵液中的丁醇濃度低於5g/L時停止通入氣體。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，對發酵終點的丁醇濃度可達到16g/L以上的生產菌，當發酵液中的丁醇濃度大於8g/L時通入氣體，當發酵液中的丁醇濃度低於8g/L時停止通入氣體。
7.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，連續式通入氣體時，當發酵液中的丁醇濃度大於5g/L時通入氣體，直到發酵結束。
8.根據權利要求7述的方法，其特徵在於，對發酵終點的丁醇濃度可達到16g/L以上的生產菌，當發酵液中的丁醇濃度大於8g/L時通入氣體，直到發酵結束。
9.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，在步驟(3)中，第二步氣提所用的氣體為管路中的不凝性氣體，氣提原料液為第一步氣提得到的冷凝液的下層水相。
10.根據權利要求4-9中任意一項所述的方法，其特徵在於，第一步氣提和第二步氣提的氣體流速為每升氣提原料液中通入l_20L/min，氣體流動方向為向上或者向下，在氣提分離裝置中使用的冷凝管為直型或者蛇形冷凝管，冷凝溫度為_15°C -15°C。
全文摘要
本發明公開了一種發酵偶聯氣提的生產和分離純化丁醇的方法，其特徵在於，該方法包括(1)培養丁醇生產菌的步驟；(2)發酵丁醇生產菌得到丁醇的步驟；和(3)利用兩步氣提法從發酵液中在線分離純化丁醇的步驟。通過本發明的方法，在不增加設備投資和節省能耗的前提下，有效提高了丁醇的生產和分離效率，為目前以生物法生產丁醇為導向的液體生物燃料的生產提供了有力的技術支持。
文檔編號C12P7/16GK102676589SQ20121014254
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者楊尚天, 白鳳武, 薛闖 申請人:大連理工大學