枇杷液泡轉化酶及其編碼基因改善菸草糖水平的方法
2024-03-01 08:45:15 1
枇杷液泡轉化酶及其編碼基因改善菸草糖水平的方法
【專利摘要】一種枇杷液泡轉化酶及其鯿碼基因改善菸草糖水平的方法，按如下五個步驟進行：一是分離克隆枇杷液泡轉化酶基因的cDNA片段序列，二是分離克隆枇杷液泡轉化酶基因的cDNA全長序列，三是枇杷液泡轉化酶基因雙元表達載體的構建，四是菸草的遺傳轉化，五是轉基因菸草生長速度和糖分組成水平的試驗與測定.採用本方法獲得的轉基因菸草植株生長快，葉片中蔗糖含量明顯下降，葡萄糖含量基本不變，果糖含量提高4％-20％，實現了利用液泡轉化酶基因調控糖組成及糖水平，改善菸草風味品質的目的，而且利用這種新獲得的枇杷液泡轉化酶基因，拓寬至用於轉接至其它蔬菜、果樹和糧食作物，具有有望改善受體作物品質風味的前景。
【專利說明】枇杷液泡轉化酶及其編碼基因改善菸草糖水平的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物轉基因【技術領域】，具體涉及一種枇杷(Eriobotrya japonicaLindl.)液泡轉化酶及其編碼基因改善菸草(Nicotiana tabacum)糖水平的方法。
【背景技術】
[0002]蔗糖是高等植物光合產物的主要貯運形式之一，轉化酶(EC3.2.1.26)不可逆地催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，與蔗糖代謝密切相關。高等植物轉化酶根據其亞細胞定位、溶解性、最適pH值以及等電點(pi)等可以分為三種:液泡轉化酶(VIN)、細胞壁轉化酶(CffIN)和細胞質轉化酶(Cl N).其中，VIN和CWIN的最適pH為3.5~5.5，因此又稱為酸性轉化酶，而CIN的最適pH為7.0~7.8，因此又稱為中性/鹼性轉化酶.已有研究表明，細胞壁轉化醇在植物花、種子等器官發育方面起重要作用(Jinet al.Plant Cell, 2009, 21:2072-2089)，而液泡轉化酶參與植物的滲透調節、細胞膨大，對番茄、馬鈴薯、甘蔗等的糖積累水平起重要調控作用(Klann et a 1.Plant Physiol, 1996,112:1321-1330 ；Brummellet al.J.Exp.Bot.2011,62:3519-3534).例如，反義液泡轉化酶基因轉化的番茄果實中蔗糖含量約為對照的5倍，而葡萄糖和果糖則只有50%，這表明糖分組成直接受液泡轉化酶水平的調控.糖是水果風味的重要組成物質，其中果糖對風味構成起更為關鍵的作用，因此，如能通過液泡轉化酶基因實現對糖組成及糖水平的調控，可為水果風味的改善提供技術依據；糖類與菸草的品質關係密切，是影響菸草吸味的最重要化學組分之一，對煙氣的酸鹼平衡和焦油含量有直接影響，無疑，利用液泡轉化酶實現菸草糖分的調控，對改善菸草品質是有益的、可行的，但至今未見相關的資料報導和新植株問世.
【發明內容】
[0003]本發明要解決 的技術問題是提供一種枇杷液泡轉化酶及其編碼基因改善菸草糖水平的方法.[0004]解決上述技術問題採用如下技術方案:
[0005]本枇杷液泡轉化酶及其編碼基因改善菸草糖水平的方法按如下步驟進行:
[0006](I)分離克隆枇杷液泡轉化酶基因的cDNA片段序列:提取枇杷葉片總RNA，反轉錄合成cDNA,通過與GenBank已知的植物液泡轉化酶序列進行比對設計簡併引物,利用反轉錄PCR獲得擴增產物，擴增產物經瓊脂糖凝膠回收，回收產物克隆到PMD18-T載體中並測序，利用分子生物學工具分析測序結果，與其他植物液泡轉化酶基因比對，確定為枇杷液泡轉化酶基因的保守區片段；
[0007](2)分離克隆枇杷液泡轉化酶基因的cDNA全長序列:根據上述枇杷液泡轉化酶基因cDNA片段序列設計引物，通過cDNA末端快速擴增技術獲得基因的全長cDNA序列，與其他植物液泡轉化酶基因比對，通過分析基因編碼區及液泡轉化酶特有的功能域確定分離到枇杷液泡轉化酶全長cDNA序列，並命名為EJVIN，EJVIN基因編碼區核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示，編碼胺基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示；[0008](3)枇杷液泡轉化酶基因雙元表達載體的構建:根據上述基因EJVIN的完整編碼區設計引物，進行PCR擴增，利用無縫克隆技術將擴增產物與經過酶切的植物表達載體pCAMBIA-1302進行連接，將EJVIN正向插入pCAMBIA_1302，獲得植物過量表達重組雙元表達載體，命名為 pCAMBIA-1302-EJVIN ；
[0009](4)菸草的遺傳轉化:將上述表達載體pCAMBIA-1302-EJVIN利用農桿菌介導法轉化菸草，獲得具有特異抗生素抗性的轉基因植株，提取轉基因植株葉片DNA，利用特異引物進行PCR擴增鑑定，確定成功獲得轉基因植株，單株收種子，對其後代進行現察鑑定；
[0010](5)轉基因菸草生長速度和糖分組成水平的試驗與測定:將轉基因菸草種子進行播種，轉基因菸草與未轉基因菸草進行生長速度的對比試驗，生長速度明顯加快；定期採集葉片進行糖含量的高效液相色譜分析，轉基因菸草葉片的蔗糖水平顯著降低，而果糖水平顯著提高，說明EJVIN基因既加快菸草生長速度，又能提高葉片的果糖水平，菸草品質明顯改善.[0011]本發明的有益效果是，從批杷中分離克隆到液泡轉化酶基因EJVIN全長cDNA序列，將該基因的編碼區以正向方式插入到植物雙元表達載體並轉入菸草中，與未轉基因植株相比，轉基因植株生長加快，葉片中蔗糖含量明顯下降，而果糖含量提高4% -20%，因此，本發明實現了利用液泡轉化酶基因調控糖組成及糖水平，對改善菸草的風味品質具有
重要意義.【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為本申請所用植物雙元表達載體pCAMBIA-1302-EJVIN構建示意圖.[0013]圖2為轉基因菸草不同時期的生長形態圖.[0014]圖3為轉基因菸草葉片的PCR檢測電泳圖.[0015]圖4為轉基因菸草與對照菸草葉片酶活性對比圖.[0016]圖5為轉基因菸草與對照菸草葉片糖含量對比圖
[0017]圖6為菸草葉片糖含量測定的HPLC峰形圖.【具體實施方式】
[0018]本發明下面結合實施例並參照附圖作進一步詳述.下述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法.所用的試劑，如無特殊說明，均為購自生化試劑公司的常規試劑.所述的對照菸草或野生型菸草均系未轉基因菸草.[0019](I)分離克隆枇杷液泡轉化酶基因的cDNA片段序列
[0020]採用改良CTAB法提取批杷葉片總RNA，具體步驟如下:提前預熱RNA提取液500 μ 1(2% CTAB,2% PVP, IOOmM Tris,25mM EDTA, 2M NacI, ρΗ8.0)於 65°C水浴鍋中；將0.2g枇杷葉片加入液氮中研磨成粉末，迅速將粉末轉入預熱好的提取液中，然後快速加入40 μ I的巰基乙醇和少量亞精胺渦旋混勻；在651:水浴鍋中培養15min ;加入等體積氨仿/異戍醇(24: I),潤旋混勻，10000rpm,4°C,20min ;取上清,加入等體積的氯仿異戍醇，渦旋混勻，10000印111，41:，201^11;取上清，加入1 / 4體積的lOMLicl，倒轉混勻，放於4°C冰箱過夜(8-16 小時);10000rpm，4°C，35min，棄上清，加入 500μ I 的 SSTE(1.45g NaCl,
0.125g SDS,50y 10.5M EDTA (pH8.0),0.25ml IM Tri s (pH8.0)，定容至 25ml)和 2 倍體積的100%的乙醇，-70°c放置30min，取出，12000rpm，4°C，20min ;棄上清，加入lml75%的乙醇，12000rpm，4°C，IOmin ;棄上清，常溫乾燥；加入30 μ I DEPC水溶解，進行電泳及紫外分光光度計檢測；
[0021]利用反轉錄酶將總RNA反轉錄合成第一鏈cDNA，具體步驟如下:在DEPC處理過的
1.5mL離心管中加入約I μ g總RNA和I μ 10.5 μ g / μ I的Oligo (dT) 18primet,小心混勻，70°C保溫5min，立即置於冰上；按次序分別加入下列試劑:5μ 15XM-MLV RT Buffer,2y IdNTP mix (2.5mM), I μ I RNase 抑制劑(30U / μ L), I μ I M-MLV Reverse Transcriptase,然後加DEPC水到25 μ I ;小心混勻，室溫離心5秒，將所有溶液收集到管底，37°C保溫I小時；90°C 5min，冰上冷卻，_20°C保存備用；
[0022]通過與GenBank已知的植物液泡轉化酶序列進行比對設計簡併引物，具體步驟如下:在NCBI查找並下載植物液泡轉化酶序列，將所下載序列保存為fasta格式，利用Clustalx進行序列比對，根據序列相似性判斷植物液泡轉化酶的保守區，根據保守區序列設計簡併引物，引物序列如下:上遊引物:5』-ATGGTA(T / C)CA(T / C)CT(G / A)TT (C / T) TA (C / T) CA (G / A) TACAA-3』;下遊引物 5』-TCCCCACAT (G / T / A) CC (A / C)GTACCCGG(G / A)AC_3』.以上述cDNA為模板，通過此對引物擴增到約500bp的片段，回收片段並測序，獲得枇杷液泡轉化酶基因保守區片段；
[0023](2)分離克隆枇杷液泡轉化酶基因的cDNA全長序列
[0024]根據上述測序信息設計引物用於cDNA末端快速擴增(RACE)，用於 5』 RACE 擴增的引 物為:5』 -GCCCATCATGGAGCTCATAGTT-3』 (SEQ ID No:3)和5』 -GCGGACCCGGTCCACACCCCG-3』 (SEQ ID No:4)；用於 3』 RACE 擴增的引物為:5』 -ATCAAGTACGAGGGTAACCC-3』 (SEQ ID No:5)和 5』 -CAAATGGCGCATTACCATTGGA-3』 (SEQID No:6);參考 5』-Full RACE Kit 和 3』-Full RACE Kit (TaKaRa)進行 RACE 擴增，通過RACE技術獲得基因未知區域的序列，進行序列拼接獲得基因的全長序列，將該基因命名為EJVIN，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，胺基酸序列如SEQ ID No:2所示；按照拼接序列的兩端設計引物，擴增得到該基因的完整序列，並克隆到PMD18-T載體，獲得PMD18-T-EJVIN.[0025](3)枇杷液泡轉化酶基因雙元表達載體的構建
[0026]根據⑵中獲得的枇杷液泡轉化酶基因EJVIN編碼區設計引物，上遊引物為E TVIN-F, 5』 -CGGGGGACTCTTGACATGGACTCCAACAACACTTCCTACACTCCC-3』 (SEQ ID No:7);下遊引物為 EJVIN-R，5』 -ACTAGTCAGATCTACCATGGAAACCTGGTCTAATGGGAATGGATGAATGAA-3』 (SEQID No:8).(下劃線區域的序列為附加序列，用於和表達載體的無縫克隆).以步驟⑵的質粒載體(pMD18-T-EJVIN)DNA為模板，擴增編碼區序列，PCR體系如下:
[0027]10 XAccuPrime pfx React ionmix5μ I
[0028]10 X enhancer5 μ I
[0029]EJVIN-F(IOyM)Iy I
[0030]EJVIN-R(IOyM)Iy I
[0031]pMD18-T_EJVIN 質粒(20ng / μ L) I μ I
[0032]AccuPrime pfx polymerase (2.5U / μ L) 0.5 μ I
[0033]PCR water36.5 μ I[0034]擴增條件為:940C 3minlcycle ；94 °C 30sec，58 °C 30sec，68 °C 2minl0sec,28cycles ；68 °C IOminlcycle ；4°C foreverlcycle.PCR 反應結束後按照 TaKaRa AgaroseGet DNA ExtractionKit 回收目的片段.[0035]用NcoI單醇切pCAMBIA-1302載體，酶切體系如下:
[0036]pCAMBIA-1302 載體質粒(200ng / μ 1)5 μ I
[0037]NcoIl μ I
[0038]10 X FiS Ι?)? |CS t* Green Buffer5 μ I
[0039]ddH2039 μ I
[0040]37度酶切2小時後電泳切膠回收；
[0041]將目的片段和載體進行無縫克隆和重組(CS麗IfP Seamless Cloning andAssembly Kit, Invitrogen),反應體系如下:
[0042]5 X Reaction buffer4 μ I
[0043]DNA 片段(lOOng/ μ 1)2 μ I
[0044]pCAMBIA-1302vector(NcoI)(50ng / μ 1)2 μ I
[0045]ddH2010 μ I
[0046]IOXEnzyme Mix2 μ I
[0047]25°C連接30min後置於冰上,取8 μ I反應液轉化感受態細胞DH5 α.測序驗證重組克隆插入片段的序列信息，含有目的基因序列的正確質粒命名為pCAMBIA-1302-EJVIN(雙元表達載體結構見圖1).[0048](4)菸草的遺傳轉化
[0049]將上述構建的植物雙元表達載體pCAMBIA-1302-EJVIN轉化至農桿菌菌株LBA4404，28°C培養，挑取攜帶植物表達載體pCAMBIA-1302-EJVIN質粒的農桿菌單菌落，接種在3-5ml含50mg / Lrif和50mg / L Kan的YEB液體培養基中，28°C，180rpm振蕩培養過夜，直至對數生長OD6tltl為0.6-0.8 ;活化過夜的農桿菌按1: 100-1: 50的比例接種在相同的20-50ml YEB液體培養基中，繼續培養至對數生長期；取菸草無菌葉片，切成4_6mm的葉盤到無菌瓶中，加入農桿菌菌液，感染lOmin，期間輕微振蕩，取出外植體用無菌濾紙吸去附著的菌液；將浸染過的外植體接種在分化培養基上，暗培養2d-4d ;將共培養的外植體轉移到分化培養基上，25°C，光照培養.每隔3-4周繼代一次，待轉化後的外植體長出大量叢生芽即轉入生根培養基，培養篩選的抗性芽長1-1.5cm時，從基部將芽切下，並轉入含有適宜抗生素的生根培養基上誘導生根，獲得具有潮黴素抗性的轉基因植株；待植株長到一定高度時移出組培瓶，在含有蛭石、珍珠巖等的基質中繼續培養；選擇抗性植株，單株收種子，對其後代進行觀察鑑定(轉基因菸草不同時期的生長形態圖見圖2).[0050]對獲得的抗性植株進行進一步的鑑定，主要步驟如下:取0.2g幼嫩葉片，加入研缽中，加入 2%CTAB 提取液(2 % CTAB, 1.4MNaCl，IOOmMTri s-HCl，IOOmMEDTA, pH8.0,2% β-巰基乙醇)700 μ I研磨，研磨好後轉入1.5ml離心管中，65°C保溫20min ;冷卻後加入等體積氯仿:異戊醇(24: I)混勻，lOOOOrpmlOmin，取上清液至一新離心菅，加入100μ 15M NaCl和Iml乙醇，沉澱DNA，離心去上清，70%乙醇洗沉澱，乾燥後溶解於100 μ ITE中.以35S CaMV序列設計引物，上遊引物為5』 -GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3』，下遊引物為5』 -CCCCGTGTTCTCTCCAAAT-3』，以上述提取到的DNA為模板，進行PCR擴增，檢測到有條帶(500bp)的即為陽性植株，即轉基因植株(轉基因菸草的PCR檢測電泳圖見圖3).轉基因植株單株收種子，播種.[0051](5)轉基因菸草生長速度和糖分組成水平的試驗與測定
[0052]將轉基因菸草種子進行播種，轉基因菸草與未轉基因菸草進行生長速度的對比試驗，定期測定植株高度，與未轉基因植株相比，轉基因植株的生長速度明顯加快；定期採集葉片進行酶活性測定和糖含量的高效液相色譜分析，具體步驟如下:
[0053]酶活性測定:取上述(4)獲得的轉基因植株葉片Ig剪碎，用預冷的蒸餾水在冰浴中研磨成勻眾，定客至100ml,在冰箱中浸提3小時，4000rpml5min,吸取上清液2ml,加入0.05mol / I磷酸緩衝液5ml，10%蔗糖溶液1ml，37°C水浴中保溫30min，取出後立即按3，5二硝基水楊酸法測定還原糖的含量，以煮沸酶液IOmin鈍化酶的試管作對照，通過還原糖的變化計算可溶性酸性轉化酶的活性(轉基因菸草與對照菸草葉片酶活性對比圖見圖4).[0054]糖的提取及測定:提取液為乙醇:氯仿:水(E: C: ff)=12: 5: 3.加入5倍體積(w / V)的提取液,研磨植物葉片材料3~5min,5000g離心5min.取上清液,重複3次.合併提取液，轉入分液漏鬥，加入水和氯仿使E: C: W=IO: 6: 5，分層，去掉氯仿相.用0.1mol/LNaOH調pH值至7.0,40°C減壓真空蒸乾,超純水定容,Waters Sep_Pak_C18固相萃小柱預分離，過濾滅菌.糖含量測定用Waters高效液相色譜儀(HPLC)進行.色譜條件為:柱溫為90°C，流動相為超純水，流速0.5ml / min.蔗糖、葡萄糖和果糖通過出峰時間及峰面積與標樣比較來定性和定量.轉基因菸草葉片的蔗糖水平顯著降低，而果糖水平顯著提高，說明EJVIN基因既加快菸草生長速度，又能提高葉片的果糖水平，菸草品質明顯改善.(轉基因菸草與對照菸草葉片糖含量對比圖見圖5，樣品HPLC峰形圖見圖6)
[0055]下面，將與本申請有關的試驗情況介紹如下:
[0056]為了明確本EJVIN基因是否對其編碼蛋白質活性起作用，在進行糖含量分析前，對菸草的酸性轉化酶活性進行了分析測定，結果顯示，轉基因菸草葉片中酸性轉化酶活性均顯著高於對照未轉基因菸草(轉基因菸草與對照菸草葉片酶活性對比圖見圖4).[0057]尚需說明的是圖1表示本申請所用植物雙元表達載體pCAMBIA-1302-EJVIN構建示意圖，其中所標記的(I)表示潮黴素抗性標記基因，(2)表示35S CaMV啟動子，(3)表示NocI酶切插入位點，(4)表示EJVIN，(5)表示綠色螢光蛋白，(6)表示NOS終止子.EJVIN位於35S CaMV下遊，GFP綠色螢光蛋白上遊.[0058]圖2為轉基因菸草不同時期的生長形態圖，其中所標記的(I)為侵染後的愈傷誘導後菸草生長形態圖，(2)為生根誘導後菸草生長形態圖，(3)為轉基因菸草移栽入土壤後的菸草生長形態圖.[0059]圖3為轉基因菸草葉片的PCR檢測電泳圖，從左側起第一泳道為DL2000MARKER、轉基因植株vinl-7、1-11、1-12、野生型植株、轉基因植株1-13、1-16、1-20、陰性對照(不含模板、只加擴增引物)、陽性對照(含有EJVIN的質粒DNA).圖3顯示出，陽性對照和轉基因植株均可擴增出500bp條帶，而陰性對照和未轉基因植株均未擴增出這一條帶.說明EJVIN基因在轉基因植株vinl-7、l-ll、l-12、l-13、l-16、l-20中成功表達，而在未轉基因植株不表達.[0060]圖4為轉基因菸草與對照菸草葉片酶活性對比圖，縱坐標表示轉化酶活性(單位μ mo I / min / g.FW),橫坐標從左側起分別表示野生型菸草、轉基因菸草vinl_7、1_11、l-12、l-13、l-16、l-20.圖4顯示出轉基因菸草葉片中酸性轉化酶活性均高於野生型菸草，說明EJVIN基因的表達可以提高其編碼蛋白質的酶活性.[0061]圖5為轉基因菸草與對照菸草葉片糖含量對比圖，縱坐標表示糖含量(單位mg /g.Fff),葡表示葡萄糖,果表示果糖,鹿表示鹿糖,橫坐標從左側起分別表示野生型菸草、轉基因菸草vinl-7、l-ll、l-12、l-13、l-16、l-20.每一橫坐標對應3種糖含量，從左向右分別為:葡萄糖、果糖、蔗糖.圖5顯示出轉基因菸草葉片中的蔗糖含量均低於野生型菸草，果糖含量均高於野生型菸草，說明EJVIN基因可以提高菸草葉片的果糖水平.[0062]圖6為菸草葉片糖含量測定的HPLC峰形圖，從左側起分別為蔗糖、葡萄糖、果糖.說明HP LC檢測菸草葉片的蔗糖、葡萄糖、果糖水平方法可行。
【權利要求】
1.一種枇杷液泡轉化酶及其編碼基因改善菸草糖水平的方法，其特徵是按如下步驟進行: (1)分離克隆枇杷液泡轉化酶基因的CDNA片段序列:提取枇杷葉片總RNA，反轉錄合成cDNA,通過與GenBank已知的植物液泡轉化酶序列進行比對設計簡併引物,利用反轉錄PCR獲得擴增產物，擴增產物經瓊脂糖凝膠回收，回收產物克隆到PMD18-T載體中並測序，利用分子生物學工具分析測序結果，與其他植物液泡轉化酶基因比對，確定為枇杷液泡轉化酶基因的保守區片段； (2)分離克隆枇杷液泡轉化酶基因的cDNA全長序列:根據上述枇杷液泡轉化酶基因cDNA片段序列設計引物，通過cDNA末端快速擴增技術獲得基因的全長cDNA序列，與其他植物液泡轉化酶基因比對，通過分析基因編碼區及液泡轉化酶特有的功能域確定分離到枇杷液泡轉化酶全長cDNA序列，並命名為EJVIN，EJVIN基因編碼區核苷酸序列如序列表中SEQID No:I所不，編碼囊基酸序氣如序列表中SEQ ID No:2所不； (3)枇杷液泡轉化酶基因雙元表達載體的構建:根據上述基因EJVIN的完整編碼區設計引物，進行PCR擴增，利用無縫克隆技術將擴增產物與經過酶切的植物表達載體pCAMBIA-1302進行連接，將EJVIN正向插入pCAMBIA-1302，獲得植物過量表達重組雙元表述載體，命名為 pCAMBIA-1302-EJVIN ； (4)菸草的遺傳轉化:將上述表達載體pCAMBIA-1302-EJVIN利用農桿菌介導法轉化菸草，獲得具有特異抗生素抗性的轉基因植株，提取轉基因植株葉片DNA，利用特異引物進行PCR擴增鑑定，確定成功獲得轉基因植株，單株收種子，對其後代進行觀察鑑定； (5)轉基因菸草生長速度和糖分組成水平的試驗與測定:將轉基因菸草種子進行播種，轉基因菸草與未轉基因菸草進行生長速度的對比試驗，生長速度明顯加快；定期採集葉片進行糖含量的高效液相色譜分析，轉基因菸草葉片的蔗糖水平顯著降低，而果糖水平顯著提高，說明EJVIN基因既加快菸草生長速度，又能提高葉片的果糖水平，菸草品質明顯改盡口 ο
【文檔編號】C12N15/56GK103789346SQ201410050727
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月14日 優先權日:2014年2月14日
【發明者】秦巧平, 張嵐嵐, 賴齊賢 申請人:浙江農林大學