一種高細胞生長密度微藻突變體的篩選方法與流程

2024-03-01 07:54:15

本發明涉及生物
技術領域：
：，特別是涉及一種高細胞生長密度微藻突變體的篩選方法。
背景技術：
：：微藻因其具有生長速率快、生長周期短、油脂含量高等特點，被認為是最具潛力的油脂生物能源。萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardti)作為研究微藻的單細胞模式生物，已成為潛在的適合大規模生產的能源微藻。但是，萊茵衣藻與其他商業微藻相比生物量較小，較低的生長密度和生物量限制了其作為大規模能源生產的可能。插入突變是一種常用的突變株篩選方法，已廣泛應用於萊茵衣藻特殊表型突變株的篩選。插入的序列一般都含有標記基因，例如aphⅷ(sizova,i.,fuhrmann,m.andhegemann,p.(2001)astreptomycesrimosusaphviiigenecodingforanewtypephosphotransferaseprovidesstableantibi-oticresistancetochlamydomonasreinhardtii.genetics,277,221-229.)，ble(lumbreras,v.,stevens,d.r.andpurton,s.(1998)efficientforeigngeneexpressioninchlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.theplantjournal,14,441-447.)等，便於對突變株進行篩選。已有研究表明：為提高生物量，降低色素，去除觸角等的插入突變株在高光下可達到目的，但在低光照下卻不可行。這主要是因為在高光條件下，去觸角的細胞會浮在表面獲得更多的光照，比野生型可接收到更多的光源。但在低光下無觸角的生物量與野生型相比類似，因為此時光照強度在表面和底下相差不大(polle,j.e.w.,kanakagiri,s.d.andmelis,a.(2003)tla1,adnainsertionaltransformantofthegreenalgachlamydomonasreinhardtiiwithatruncatedlight-harvestingchlorophyllantennasize.planta,217,49-59.)。儘管高光下可提高衣藻生物量，但強光能耗大，不利於大規模投入使用。因此，如何篩選在普通光照強度下仍具有較高生物量的微藻品系變得更加重要。技術實現要素：本發明針對現有技術中缺乏合適的方法來篩選在普通光照強度下仍具有較高生物量的微藻品系的問題，提供了一種高細胞生長密度微藻突變體的篩選方法。一種高細胞生長密度微藻突變體的篩選方法，包括以下步驟：(1)將抗性基因轉化微藻，通過固體平板抗性篩選獲得轉入抗性基因序列的突變微藻的單藻落，收集各個單藻落獲得微藻突變體文庫；(2)從微藻突變體文庫中的每個單藻落取樣混合後在液體培養基中培養，並連續傳代；(3)每傳代若干次用抗性基因序列特異性的rflp分析方法檢測，當檢測結果顯示只剩一種微藻突變體時結束篩選，獲得一株高細胞生長密度微藻突變體；當檢測結果顯示還剩2～5種微藻突變體時，使用固體培養基進行單藻落分離獲得高細胞生長密度微藻突變體。從隨機插入突變法獲得的突變株中篩選細胞密度較高的突變子不能通過固體平板篩選獲得。因為塗布在平板上的細胞並非同步生長，且區域性營養耗竭也會導致藻落大小與生長密度缺乏相關性。因此，本發明選擇在液體培養基中連續傳代突變子混合藻液，由於密度高的突變子在連續傳代培養過程中會逐漸佔據優勢，富集之後高細胞密度突變株可在有效的傳代培養後從藻液中分離出來。為實時監測整個過程，本發明採用rflp分析方法對富集效果進行追蹤測試。rflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性內切酶片段長度多態性)是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點上鹼基的插入、缺失、重排或點突變所引起的。通過使用限制性內切酶酶切dna，然後用凝膠電泳分開dna片段，再把dna片段轉移到濾膜上，利用放射性標記的探針雜交顯示特定的dna片段(southern雜交)，最後進行結果分析。在本發明中，抗性標記基因插入位置不同，使用特定的限制性內切酶(一般是抗性標記基因序列中不包含的)處理後，所得的片段中，包含抗性標記基因的酶切片段長度會有差異，再使用針對該抗性標記基因序列的探針進行southern雜交檢測。優選的，所述微藻為萊茵衣藻。本發明篩選方法也同樣適用於其他可進行遺傳轉化的微藻，比如小球藻(chlorellasp.)，鹽藻(dunaliellasalina)，團藻(volvoxcarteri)，三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum)等。優選的，所述抗性基因為aada基因、ble基因、aphⅷ基因或als基因。進一步優選的，所述抗性基因為ble基因。本發明篩選方法使用的抗性基因一方面是用於對突變株進行抗性篩選，另一方面是用於rflp分析方法檢測，所以，只要滿足這兩點的基因序列或片段均適用於本發明篩選方法。優選的，所述抗性基因轉化微藻使用電轉化法。當然，使用其他適用於微藻的轉化方法也可以。比如基因槍法，又稱為微粒子轟擊法，可適用於各種類型的微藻進行遺傳轉化；針對細胞壁缺陷型的微藻可使用玻璃珠轉化法。優選的，傳代時接種密度為od750為0.1～0.2。進一步優選的，傳代次數不少於30次。傳代次數與rflp檢測結果相結合，如果在傳代較少的時候，rflp檢測結果顯示突變株種類已經很少時，即可使用固體培養基來分離；而如果傳代次數大於30次時，rflp檢測結果顯示突變株種類仍然較多時，需要繼續進行傳代來篩選富集。優選的，步驟(3)中，每傳代5～15次用抗性基因序列特異性的rflp分析方法檢測。每傳代一次，可能rflp檢測結果變化較小，所以可以在連續傳代幾次之後，進行一次檢測。優選的，rflp分析時，先用限制性酶進行酶切，再採用southern法檢測，檢測時用dig標記的針對抗性基因的探針雜交。本發明篩選方法採用抗性基因隨機插入突變，然後將獲得的各突變體混合進行液體培養連續傳代，傳代過程中生長快的突變株逐漸佔據優勢得到富集，連續傳代過程中使用rflp分析方法監測篩選效果，最終在普通光照條件下即可篩選獲得生長密度比野生型高的微藻突變體。本發明篩選方法無需高光條件，無需特殊的檢測設備，能夠快速、簡便、高效地完成篩選過程。附圖說明圖1為實施例2中傳代培養突變株的生長曲線圖。圖2為連續傳代培養流程示意圖。圖3為rflp分析結果圖，其中a、b、c分別代表3個重複，泳道m為dnamarker(下同)，泳道c為作為對照的野生型萊茵衣藻cc503(下同)，泳道0、10、20、30分別代表傳代次數。圖4為實施例4中傳代篩選結束後分別對a、b、c三組實驗篩選到的突變株進行驗證的rflp分析結果圖，其中泳道i1～i6分別代表單個分離株(下同)。圖5為實施例4中雙酶切基因組dna後的rflp分析結果圖。圖6為實施例5中篩選所得3株突變株的生長曲線檢測結果圖。圖7為實施例5中篩選所得3株突變株的生長速率比較圖，其中wt表示野生型萊茵衣藻cc503(下同)。圖8為實施例5中篩選所得3株突變株在hs培養基和2倍hs培養基中最大生物量結果比較圖。圖9為實施例5中篩選所得3株突變株的葉綠素含量結果圖。具體實施方式萊茵衣藻原始藻株：萊茵衣藻cc503，購自衣藻資源中心(chlamydomonasresourcecenter)(網址：www.chlamy.org)。質粒psp124s：購自衣藻資源中心，該質粒包含ble基因序列。萊茵衣藻od值檢測均在750nm波長下檢測。hs培養基：配方參見文獻sueoka,n.(1960)proc.natl.acad.sci.usa46,83-91，具體成分如下：母液1(鹽溶液)：nh4cl100.0gmgso4·7h2o4.0gcacl2·2h2o2.0g加h2o至1l母液2(磷酸緩衝液)：k2hpo4288.0gkh2po4144.0g加h2o至1l母液3(微量元素)：hs培養基使用時：5ml母液1，5ml母液2，1ml母液3，加水至1l。tap培養基：配方參見文獻gorman,d.s.,andr.p.levine(1965)proc.natl.acad.sci.usa54,1665-1669，具體成分如下：母液1(tap鹽)：nh4cl15.0gmgso4·7h2o4.0gcacl2·2h2o2.0g加h2o至1l母液2(磷酸緩衝液)：k2hpo428.8gkh2po414.4g加h2o至100ml母液3(微量元素)：tap培養基使用時：2.42gtris，25ml母液1，0.375ml母液2，1ml母液31ml乙酸(glacialaceticacid)，加h2o至1l。實施例1上遊引物ble_1f：5』-tggaagcttaaatgccagaaggagcgcagcc-3』；下遊引物ble_1160r：5』-ccgagctcagcttcaaatacgcccagcccg-3』，使用上述引物擴增質粒psp124s，獲得ble基因序列，核苷酸序列如seqidno.1所示，長度為1.1kb。使用電轉化法將上述ble基因片段轉化到萊茵衣藻cc503細胞內，轉化株在具有2.5μg/ml博來黴素(zeocin)的tap平板上進行篩選，平板上長出的萊茵衣藻藻落即為轉化了ble基因片段的突變株，將所有獲得的藻落一一保存到96孔板中，構建萊茵衣藻突變體文庫。本實施例經上述方法獲得了1000多個萊茵衣藻突變株。電轉化步驟：(1)取對數生長早期的藻液2500rpm離心5分鐘收集藻細胞，經電轉液(geneartmaxefficiencytransformationreagent)清洗離心3次後，重懸至終濃度為2×108～3×108個/ml。(2)每250μl細胞懸液加入2～4μg線性化dna，2～8℃下孵育5分鐘。(3)電轉化之前將含dna的250μl細胞懸液加入到預冷的比色皿中。(4)電轉化參數為：電壓500v，電容為50μf，電阻為800ω。通常，電脈衝持續時間為30ms。(5)電轉化後，細胞復甦15分鐘。將細胞轉移至含有10mltap-40mm蔗糖溶液50ml離心管內室溫放置；然後將藻液轉移至培養箱中，溫度設為26℃，光照強度為50μem-2s-1孵育14～16h。(6)2500rpm離心5分鐘收集藻細胞，棄上清，將藻液重懸於200μltap培養基中。(7)在含有2.5μg/ml博來黴素(zeocin)的tap培養基平板上進行篩選突變體，多板篩選匯集總共獲得了1000多個萊茵衣藻突變株。這些突變株培養於96孔板的液體培養基(液體培養基體積200μl)中保存備用。實施例2將實施例1中獲得的1000多個突變株從96孔板各取10μl藻液，混合後離心，用新鮮配製的含2.5μg/mlzeocin的hs培養液懸浮，接種於含100ml(含2.5μg/mlzeocin)的hs培養液的搖瓶中培養，培養光照條件為連續的50μmolm-2s-1。在這種情況下，初始培養的突變株(約0.15od)在1、2、3、4天可分別達到約0.4od、約0.95od、約1.35od、約1.45od(圖1)。細胞在第三天開始進入平臺期，選取這一點用作接種的起點進行連續傳代培養(圖2)。待初始混合藻液生長至od750＝1.0時，突變株以約為0.15od的初始濃度接種至3個搖瓶中繼續培養，分為a，b，c三個實驗組。連續的傳代在平臺早期(3天，約1.4od)進行，取新鮮培養基(含2.5μg/mlzeocin)重新接種(0天，約0.15od)，繼續進行對數期和平臺期的傳代。該連續傳代次數為30代。實施例3rflp檢測為實時監測整個過程，本發明採用rflp對富集效果進行追蹤測試。由於rflp圖譜中每個插入突變株至少有一條獨特大小的dna片段，在含1000多個插入突變株的初始培養中可以見到複雜的rflp圖譜。隨著傳代的繼續，rflp圖譜的複雜性下降，表明在連續傳代培養中hcd突變株(high-cell-density的簡寫，代表篩選到的高細胞密度突變株)的逐漸富集。大概30個傳代循環後，rflp中只留下幾條帶，含有這些片段的突變株被認為是hcd的候選突變株。為檢測傳代過程中藻株變化情況，對突變株進行了ble序列特異性的rflp分析。具體操作如下：收集初培養細胞，傳代第10代，20代，30代的細胞樣品，採用ctab緩衝液裂解，苯酚∶氯仿法提取基因組dna。用限制性內切酶ncoi酶切dna，檢測rflp圖譜情況。檢測探針從模板質粒psp124s中利用pcrdig探針合成試劑盒(roche，pcrdigprobesynthesiskit，貨號：11636090910)合成，合成引物如下：ble_e2_f：5'-tggccaagctgaccagcgccgttcc-3'；ble_e3_r：5'-cctccgaccactcggcgtacagc-3'，最後所得探針序列如seqidno.2所示，探針偶聯了鹼性磷酸酶的抗地高辛抗體。southern雜交按照dig標記膜雜交方式進行。具體步驟如下，分離電泳後的基因組dna，將dna片段轉移至尼龍膜上，採用上述合成的dig標記的探針與其雜交並檢測。檢測反應中α-dig-ap按1∶15000稀釋，為優化檢測步驟，洗脫液成分為0.1m馬來酸，3mnacl，0.3％tween20，ph8.0。在實施例2中的3個重複的傳代實驗中，發現在實驗a，b，c中分別有1，3和3個優勢片段(圖3)。一個在實驗a中存在的優勢片段stn_a1在實驗組b和c中均存在。在實驗b中存在的片段stn_b3在c中也存在(stn_c2)。因此，進行連續傳代後，富集獲得至少4個可能的hcd突變株。實施例4將實施例2傳代30次後獲得的突變株進行固體平板單藻落篩選，每板挑取5-6個單藻落再次進行rflp驗證分析。結果表明，實驗a中的5個突變株都顯示有一條片段同stn_a1片段相似。實驗b中，分離的2，4，6同stn_b1片段相似，分離的3和5片段同stn_b3相似，分離的1同stn_b2片段相似。實驗c中，所有分離的片段都同stn_c1相似，未發現包含同stn_c2和stn_c3片段大小的分離株(圖4)。為驗證在分離株中觀察到的片段確實同30次傳代後富集的一致，每個分離株的基因組經ncoi和kpni的雙酶切後進行了rflp分析。雙酶切後的片段大小同30次傳代後富集藻株的一致(圖5)。結果表明，分離株是所有插入突變株中的優勢種。因此，把包含stn_b1(分離株stn_a1_i1-i5；stn_b1_i2、i4和i6；stn_c1_i1和i3-i6)，stn_b2(分離株stn_b2_i1)和stn_b3(分離株stn_b3_i3和i5)片段的突變株分別命名為hcd1，hcd2和hcd3突變株。因此，本發明採用連續傳代的方式富集獲得了具有以上3株高細胞生長密度突變株，連續傳代法能夠分離快速生長或密集生長的突變株。實施例5為分析hcd突變株的生長速率和最大細胞密度，突變株在連續光照強度為50μmolm-2s-1的hs培養基中生長，測定其生長曲線(圖6)、生長速率及生物量。結果顯示，hcd1和hcd2的生長速率均高於野生型(p-value<0.001)(圖7)。hs培養基中生長的hcd1、hcd2和hcd3最大細胞密度(最大細胞乾重，cdw)比野生型高22％-40％；當培養基在2倍hs培養基生長時，hcd突變株的最大細胞密度比野生型高50％-100％(圖8)。同時，葉綠素含量(圖9)和細胞形態顯示，hcd突變株與野生型相比未見顯著差異。綜上，hcd突變株已經具備了優於野生型萊茵衣藻的生長密度和生物量。當前第1頁12當前第1頁12