L－蘇氨酸生產方法
2024-03-01 06:28:15
專利名稱：L－蘇氨酸生產方法
技術領域：
本發明涉及與微生物有關的L-蘇氨酸的生產。更具體地，本發明涉及使用微生物高產率地生產L-蘇氨酸的方法，其中通過重組技術將微生物的基因組DNA的蘇氨酸脫水酶(tdc)基因部分失活，從而顯著增加了L-蘇氨酸的產量。
提高特定基因的表達水平的常用方法是使用在微生物中有高拷貝數的質粒從而增加在微生物中的基因數目(Sambrook等，分子克隆，第二版，1989，1.3-1.5)。將靶基因整合到質粒中，並且用重組的質粒轉化宿主微生物，使宿主微生物中的基因的數目根據質粒拷貝數增多而增多。美國專利No.5,538,873報導了這種方法在增加蘇氨酸產量方面的部分成功。然而，多數使用這類重組質粒的技術過量表達宿主微生物不需要的特定基因，並且造成質粒的不穩定的問題，使得質粒可能在重組菌株培養過程中丟失。
針對這一問題，據建議使用向培養基中添加抗生素或使用表達調節質粒的方法(Sambrook等，分子克隆，第二版，1989，1.5-1.6 1.9-1.11)。在使用表達調節質粒生產特定產品的方法中，在生長期中，細胞培養是在非-表達條件下進行的以降低對宿主菌微生物的不利並在微生物完全生長後，誘導瞬時表達。但是，多數這種表達調節質粒可能只適用於最終產物是蛋白質的情形。
生產初級代謝產物與微生物的生長密切相關，因此除非在生長期表達靶基因，否則難以增加初級代謝產物的產量。初級代謝產物蘇氨酸的生產即是如此。
為了補償這種缺點，將一種特定的蘇氨酸生物合成基因摻入到染色體DNA來產生蘇氨酸(美國專利5,939,307)。然而，這種方法將染色體基因替換為一種可誘導的啟動子-取代的基因，很難期望它可以顯著增加蘇氨酸操縱子基因的表達。
因此，本發明人通過失活染色體中的蘇氨酸脫水酶(tdc)基因，其涉及一種蘇氨酸降解途徑，以便抑制蘇氨酸的降解而保留宿主微生物的其它的固有的普通功能並且因此增加了蘇氨酸的產量，從而完成了本發明。
現在多數用於增加蘇氨酸產量的基因工程技術集中在從草醯乙酸(oxaloacetate)開始的生物合成途徑。但是，本發明還涉及蘇氨酸降解途徑中的蘇氨酸脫水酶(tdc)基因活性以有效和顯著的增加L-蘇氨酸產量。
為了達到本發明目的，提供了一種摻入了失活的tdc(蘇氨酸脫水酶)基因的重組質粒。
在為達此目的的本發明的一個實施方案中，可以通過切割tdc操縱子的tdc B和tdc C中的一個位點並向切割位點插入有抗生素標記的盒來失活生產蘇氨酸的微生物的tdc操縱子。優選地，蘇氨酸生產微生物是大腸桿菌菌株。
在本發明的另一實施方案中，大腸桿菌菌株可以是抗蘇氨酸類似物、賴氨酸類似物、異亮氨酸類似物和甲硫氨酸類似物的。在本發明的又一個實施方案中，將附加的一個或多個拷貝的各個磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因和蘇氨酸操縱子整合到大腸桿菌菌株的染色體DNA。優選地，該大腸桿菌名字是pGmTN-PPC12，保藏號是KCCM-10236。
本發明還提供了用上述重組質粒轉化的大腸桿菌菌株。來自重組質粒的含有抗生素標記的tdc B和tdc C基因片段可以插入到大腸桿菌菌株的基因組。優選地，包含抗生素標記的tdc B和tdc C基因片段是圖2的Δtdc∷loxpKan。最優選地，該大腸桿菌名字是TRN212，保藏號是KCCM-10353。
現在更詳細地描述本發明。
已知一些L-蘇氨酸代謝途徑(Neihardt FC等(eds)Escherichia coli andSalmonellaCellular and Molecular Biology，2ndedn.ASM Press.，WashingtonD.C.，pp 369-370)，包括三種主要途徑第一個途徑涉及蘇氨酸脫水酶，其催化蘇氨酸分解為α-氨基-β-酮丁酸，然後它又轉化為乙醯-輔酶A和甘氨酸，或進一步分解形成氨基丙酮並轉化為丙酮酸；第二個途徑涉及蘇氨酸脫水酶，其產生α-酮丁酸，然後代謝生成丙醯-輔酶A並最終代謝為琥珀醯-輔酶A，TCA循環的中間體；並且第三種途徑涉及蘇氨酸醛縮酶。
本發明的特徵是抑制了L-蘇氨酸代謝途徑中的蘇氨酸脫水酶的活性導致L-蘇氨酸的最大積累。
在本發明的L-蘇氨酸生產方法中，使用來自大腸桿菌TF4076(KFCC10718，韓國專利申請號90-22965)的pGmTN-PPC12(KCCM-10236，本申請人申請的韓國專利申請號01-6976)作為L-蘇氨酸生產菌株。pGmTN-PPC12菌株(KCCM-10236)是通過聚合酶鏈式反應(PCR)將來自產生L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株，TF4076(KFCC 10718)的染色體的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因以及將克隆自同一染色體的蘇氨酸操縱子插入到宿主大腸桿菌菌株TF4076的染色體而得到的，因此在染色體DNA上有兩倍於TF4076菌株的ppc基因和蘇氨酸操縱子。pGmTN-PPC12菌株可以增加涉及將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉化為蘇氨酸生物合成前體，草醯乙酸的ppc基因，以及編碼涉及從草醯乙酸的蘇氨酸的合成途徑的酶，包括thrA(天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶)，thrB(高絲氨酸激酶)，和thrC(蘇氨酸合酶)的基因的表達，從而增加L-蘇氨酸的產量。PGmTN-PPC12菌株於2001年1月5日保藏在韓國微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganism)(KCCM)，並且保藏號是KCCM10236。
本發明中，失活了參加pGmTN-PPC12(KCCM-10236)的蘇氨酸代謝途徑的蘇氨酸脫水酶(tdc)基因，從而增加了L-蘇氨酸的產率。
已知蘇氨酸脫水酶是一種在低水平氧和高水平蘇氨酸濃度條件下表達的操縱子。tdc操縱子的表達還受到發酵後半期低-葡萄糖含量的誘導。因此，需要失活蘇氨酸脫水酶來發現高產率蘇氨酸生產菌株。
發明詳述在下文中，本發明的L-蘇氨酸生產方法將會被更加詳細地描述。
1.構建重組質粒從蘇氨酸生產菌株分離染色體DNA。使用該染色體DNA作為模板，獲得包含tdc操縱子的tdc B和tdc C的重組質粒pT7Blue/tdc。不限制使用任何克隆載體，但優選的是pT7Blue克隆載體。
通過將包含lox p位點的卡那黴素抗性基因片段整合到重組質粒pT7Blue/tdc，獲得含有缺陷的tdc基因的重組質粒pT7Δtdc∷loxpKan。
2.整合重組質粒和篩選使用重組質粒pT7Δtdc∷loxpKan轉化大腸桿菌。分離質粒DNA並用限制性酶消化，通過電泳從消化物中分離DNA片段(Δtdc∷loxpKan)。此過程圖示於圖2。
用產生的DNA片段Δtdc∷loxpKan轉化蘇氨酸生產菌株。這一轉化是通過同源重組進行，其使得用重組DNA片段pT7Δtdc∷loxpKan取代了大腸桿菌菌株的固有的tdc基因區域。
將產生的轉化子接種到含卡那黴素的固體培養基收集菌落。最後，獲得含有失活的tdc基因的靶重組體菌株。
對於重組菌株，雖然該菌株可以增殖，但該tdc基因保持缺陷，具有比宿主菌株高20％的出色的L-蘇氨酸產率。
可以使用已知的方法，例如，鹼溶液(Sambrook筆分子克隆，第一卷，1.25-1.28)從轉化菌株中回收重組質粒。具體地，加入溶液1(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA)消弱轉化子的細胞膜，並且加入溶液2(0.2N NaOH，1％SDS)破壞細胞膜並變性細胞的蛋白和染色體成分，並且加入溶液3(5M醋酸鉀，乙酸)聚集除了重組質粒之外的成分。通過離心分離重組質粒級分，並且通過加入乙醇只沉澱重組質粒並且回收。
本發明將參照下面的實施例進行描述。下面的實施例是為了舉例說明的目的而不是為了限制本發明的範圍。
實施例1構建重組質粒並使用重組質粒敲除tdc基因使用QIAGEN Genomic-tip體系分離蘇氨酸生產菌株pGmTN-PPC(KCCM-10236)的基因組DNA。以基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增大約3.1kb的含有tdc B和tdc C的tdc操縱子基因片段(5295pb)。使用的引物是5』-agg agg gga tcc ggt atg tct tct gag gcg-3』和5』-agg agg gaa ttc atc ggc aac agg cac ag-3』。PCR是如下進行的，30循環的擴增，每循環包括94℃變性30秒，56℃退火30秒，以及72℃延伸3分鐘30秒。
在0.7％的瓊脂糖凝膠上將PCR產物電泳，洗脫所需大小的帶。將洗脫帶與pT7Blue克隆載體(Novagen Co，)在16℃下平端連接過夜以便獲得重組質粒pT7Blue/tdc(參看
圖1)。使用產生的重組質粒pT7Blue/tdc轉化大腸桿菌DH5α，在含有50mg/L的氨苄青黴素的固體培養基上鋪平板，在37℃過夜培養。
從培養物上用牙籤挑取菌落，接種到3毫升液體培養基，並在200rpm培養過夜。使用QIAGEN微量製備試劑盒從培養物中分離質粒DNA，並鑑定質粒DNA的大小。用限制性酶，Sma I和Pst I消化質粒DNA，並在0.7％的瓊脂糖上電泳鑑定其方向是否為tdc R-A-B-C。用限制性酶Bgl II和Hpa I消化鑑定的質粒DNA，pT7Blue/tdc(各大約1.1kb)，將消化物上樣到0.7％瓊脂糖凝膠，以便洗脫大約4.9kb的帶。將洗脫的帶與Klenow酶反應產生平端。將含有lox P位點的大約1.7kb的卡那黴素抗性基因片段，其將質粒pUG6(Ulrich等，A new efficient gene disruptioncassette for repeated use in budding yeast，Nucleic Acids Research，1996，24，pp.2519-2524)與限制性酶Hinc II和EcoR V反應而獲得，通過平端連接與分離的pT7Blue/tdc片段連接，從而產生重組質粒pT7Δtdc∷loxpKa。
實施例2篩選整合了重組質粒的菌株用重組質粒pT7Δtdc∷loxpKan轉化大腸桿菌DH5α，鋪板到含有50mg/L氨苄青黴素和15mg/L卡那黴素的固體培養基，37℃培養過夜。從培養物上用牙籤挑取菌落，接種到含有氨苄青黴素和卡那黴素的3毫升液體培養基，並200rpm培養過夜。使用QIAGEN微量製備試劑盒從培養物中分離質粒DNA，並鑑定質粒DNA的大小。用限制性酶消化質粒DNA並加樣到0.7％的瓊脂糖上鑑定其方向。用限制性酶PVU II消化鑑定的質粒DNA，並在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳，以便洗脫大約3840kb的DNA片段(Δtdc∷loxpKan)。通過電穿孔法用DNA片段Δtdc∷loxpKan轉化蘇氨酸產生菌株pGmTN-PPC12，並且鋪板到含卡那黴素的固體培養基來篩選菌落，得到有失活的tdc基因的重組菌株。
實施例3獲得的重組菌株的搖瓶培養比較蘇氨酸產量在Erlenmeyer搖瓶(flask)中使用蘇氨酸滴定度培養基篩查實施例2中含卡那黴素的固體培養基中培養的30個單菌落的重組菌株的L-蘇氨酸產量比較。各種情況下使用的蘇氨酸滴定度培養基的組分示於表1。
表1.蘇氨酸滴定度培養基的組分
將單菌落在培養箱中的LB固體培養基上在32℃下培養過夜。將一滿環各培養物接種到25毫升滴定度培養基並在32℃，250rpm下培養48小時。檢測的結果示於表2。與產生23g/L蘇氨酸的宿主菌株pGmTN-PPC12相比，重組菌株的30個菌落中的28個菌落顯示卓越的生產率，其中包括產生26g/L或更多的蘇氨酸的8個菌落。觀察到記錄有最高蘇氨酸生產率27g/L，比宿主菌株產率高17.4％的重組菌株，並且命名為「TRN212」。突變菌株TRN212在2002年2月19日保藏在韓國微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganism)(KCCM)並給予保藏號KCCM-10353。
表2.重組菌株的搖瓶滴度實驗結果
實施例4使用Southern印跡檢測證實tdc基因的敲除進行了Southern印跡來確認實施例3中獲得的重組菌株的tdc基因的特異性的敲除(knock-out)。將宿主菌株pGmTN-PPC12和重組菌株TRN212(KCCM-10353)在30毫升液體培養基中在200rpm下培養過夜，使用QIAGEN基因組試劑盒20分離基因組DNA。用限制性酶EcoR I消化分離的基因組DNA並在0.7％的瓊脂糖凝膠中電泳根據大小分離DNA片段。通過電泳膠的毛細管轉移(分子克隆，第一卷，6.31-6.38)過夜將按照大小分離的DNA片段附著到尼龍膜(YOUNG Sci.Biodyne BMembrane)，隨後經脫水和UV照射(120mJ/cm2，SpectroLinkerTM)將該DNA片段固定在尼龍膜上(分子克隆，第一卷，6.45)。將粘附到尼龍膜上的DNA片段在預雜交緩衝液I(Roche # 1093657)中在55℃下預雜交2小時，然後，加入預先製備的變性DNA探針在雜交烘箱(BAMBINO230300)中雜交。
變性的探針是如下製備的。用限制性酶，Hinc II和EcoR V消化使用QIAGEN試劑盒分離的質粒pUG6，獲得含有lox p位點的大約1.7kb的卡那黴素抗性基因片段。將該基因片段在100℃沸水中加熱5分鐘並在冰上冷卻5分鐘，產生單鏈DNA。使用DIG標記和檢測試劑盒(Roche#1093657)將單鏈DNA在37℃下反應過夜，產生DIG-UDP-整合的DNA探針。
雜交後，使用洗滌溶液I和II(Roche # 1093657)除去非特異性結合到膜的DNA片段。然後，用預雜交緩衝液2(Roche # 1093657)在室溫下處理膜30分鐘來遮蔽並與特異性結合到DIG-UTP的抗-DIG抗體在室溫下反應30分鐘。用洗滌溶液III(Roche # 1093657)除去非特異性結合到膜的抗-DIG抗體，然後，使用標記和檢測試劑盒(Roche #1093657)將膜進行顏色反應，直到出現條帶。結果示於圖3。沒有卡那黴素基因的宿主菌株pGmTN-PPC12(泳道1)不顯示條帶。與此對比，本發明的新重組菌株TRN212(KCCM-10353)被期望具有的大約7kb的條帶在泳道2中觀察到。用限制性酶EcoR I消化產生的大約5.3kb的tdc基因片段和大約1.7kb的卡那黴素-抗性基因共大約7.0kb。泳道1和4表示分子量標記。
實施例5使用發酵罐的L-蘇氨酸產率比較比較了宿主菌株pGmTN-PPC12和重組菌株TRN212(KCCM-10353)的L-蘇氨酸產率，該重組菌株有失活的tdc基因，其已經在實施例2中被篩選出來，並在實施例4中進行了試驗證實了該基因的敲除。表3給出了使用的初始培養基組分。還含有每升10g葡萄糖和0.1g L-甲硫氨酸的LB培養基用於種子培養為，以3-5％體積的目的初始培養物確定接種到發酵罐中的初始體積。每次將葡萄糖加至終濃度5％重量，共超過6次，同時加入1％重量的磷酸二氫鉀。此處，每次加入的葡萄糖是通過葡萄糖的缺損確定的。培養物的初體積是1.5L，終體積是3.0L。發酵中加入的葡萄糖的總濃度是250g/L。在發酵過程中，培養基在700-1000rpm下攪拌，溫度控制在32℃，pH用25-28％的氨水調節在7.0。氣流速率調節在0.5vvm。結果示於表4。如表4所示，宿主菌株TRN212產生93.5g/L的L-蘇氨酸，相對於葡萄糖的消耗的產率是37.4％。與此相比，重組菌株TRN212產生112g/L的L-蘇氨酸，產率是45.2％，比宿主菌株TRN212高21％。此外，觀察到重組菌株與宿主菌株有類似的發酵模式，在發酵中糖消耗不降低，而這種在發酵中糖消耗降低的情況在重組菌株中由於生長抑制是經常出現的。
表3.5-L發酵罐中初始培養基組分
表4.重組菌株的蘇氨酸發酵生產的結果
使用本發明的新的重組菌株生產L-蘇氨酸，與宿主菌株相比，數量和產率都增加超過20％，而在發酵過程中的糖的消耗不降低，而這種在發酵中糖消耗降低的情況在重組菌株中由於生長抑制是經常出現的。
權利要求
1.具有失活的tdc(蘇氨酸脫水酶)基因的重組質粒。
2.權利要求1中的重組質粒，其中蘇氨酸生產微生物的tdc操縱子是通過切割tdc操縱子的tdcB和tdcC中的一個位點並向該切割位點插入具有抗生素標記的盒而失活的。
3.權利要求2中的重組質粒，其中的蘇氨酸生產微生物是大腸桿菌。
4.權利要求3中的重組質粒，其中的大腸桿菌是對蘇氨酸類似物，賴氨酸類似物，異亮氨酸類似物，以及甲硫氨酸類似物抗性的。
5.權利要求3中的重組質粒，其中將另外一個或多個拷貝的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因和蘇氨酸操縱子整合到大腸桿菌的染色體DNA中。
6.權利要求5中的重組質粒，其中的大腸桿菌名稱是pGmTN-PPC12，其保藏號是KCCM-10236。
7.權利要求2中的重組質粒，其中的重組質粒是通過失活圖1的pT7Blue/tdc的tdc基因而構建的。
8.權利要求7中的重組質粒，表達為圖2的pT7Δtdc∷loxpKan。
9.用權利要求1到8中的任一項的重組質粒轉化的大腸桿菌菌株。
10.權利要求9中的大腸桿菌菌株，衍生自保藏號是KCCM-10236的pGmTN-PPC12。
11.權利要求9中的大腸桿菌菌株，其中來自重組質粒的包含抗生素標記的tdc B和tdc C基因片段被整合到了大腸桿菌菌株的基因組中。
12.權利要求11中的大腸桿菌菌株，其中包含抗生素標記的tdc B和tdc C基因片段是圖2的Δtdc∷loxpKan。
13.權利要求12中的大腸桿菌菌株，其具有名稱TRN212，其保藏號是KCCM-10353。
14.一種使用權利要求9中的大腸桿菌菌株生產L-蘇氨酸的方法。
15.權利要求14中的方法，其中來自重組質粒的包含抗生素標記的tdc B和tdc C基因片段被整合到了大腸桿菌菌株的基因組中。
16.權利要求15中的方法，其中包含抗生素標記的tdc B和tdc C基因片段是圖2的Δtdc∷loxpKan。
17.權利要求14中的方法，其中的大腸桿菌菌株名字是TRN212，其保藏號是KCCM-10353。
全文摘要
提供了一種使用一種微生物生產L－蘇氨酸的方法。在該方法中，通過重組技術將微生物基因組DNA中存在的蘇氨酸脫水酶(tdc)基因部分失活。對於一種有增強的含蘇氨酸操縱子的酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的活性的微生物，參與四種蘇氨酸代謝途徑中的一個的tdc基因專一性地被失活，從而顯著提高L－蘇氨酸產量。
文檔編號C12N1/21GK1446914SQ02122600
公開日2003年10月8日 申請日期2002年6月14日 優先權日2002年3月21日
發明者樸宰鏞, 李炳春, 金大哲, 李珍鎬, 趙載容, 樸英薰 申請人:第一製糖株式會社