一種防治辣椒疫病的短芽孢桿菌及生物製劑的製備方法與應用的製作方法
2024-04-05 03:17:05 3
專利名稱：一種防治辣椒疫病的短芽孢桿菌及生物製劑的製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物農藥防治技術，特別涉及一種防治辣椒疫病的短芽孢桿菌及生物製劑的製備方法與應用。
背景技術：
辣椒疫病是由辣椒疫黴菌(Phytophthora capsici)引起的一種世界性土傳病害， 發病較輕的田塊病株率為15 30%，造成產量損失為20 25%，嚴重的田塊損失在50% 以上，甚至絕收。近年來隨著保護地辣椒種植面積的增加，辣椒疫病的發生有逐年加重的趨勢。目前生產中尚無理想的抗病品種，病害的防治主要依賴於化學藥劑，長期單一使用甲霜靈等同類藥劑，使辣椒疫黴的藥劑抗藥性顯著提高，且化學農藥對生態環境和人類健康造成危害，生防菌及其次生代謝產物對環境友好，有利於農業的可持續發展成為防治植物病害的重要手段。從辣椒疫黴生存的土壤環境中分離和篩選生防菌株是辣椒疫病生物防治技術產品開發的主要途徑。短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)的一些菌株，如短短芽孢桿菌 (Brevibacillusbrevs)具有廣譜抗菌活性，其分泌的抗菌物質包括短桿菌肽S、脂肽類、磷脂類、多烯類和胺基酸類等多種化合物，它們具有抑制真菌、細菌、病毒和菌原體等作用，是植物病害生防功能的重要組成部分，其抑菌機理包括拮抗、競爭、溶菌、誘導系統抗性等。目前關於短短芽孢桿菌生物防治的研究主要處於分離篩選及離體抑菌活性測定階段，尚無用於辣椒生產的生防菌製劑。
發明內容
本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種防治辣椒疫病的細菌。本發明的另一目的在於提供包含上述防治辣椒疫病的細菌的發酵液乾燥物的生物製劑及其製備方法與應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種防治辣椒疫病的細菌，名稱為短芽孢桿菌Brevibacillus sp. 26-13，於2011年1月8日保藏於中國典型培養物保藏中心 (CCTCC，湖北武漢大學內)，保藏編號為CCTCC M 2011009 ；所述的短芽孢桿菌26-13的形態及生理生化特性杆狀，(0. 7 0. 9) μ mX (3 5) μπι，革蘭氏陽性，以周生鞭毛運動，在膨大孢囊內含橢圓形芽孢，菌落平、光滑、黃灰色、 無可溶性色素，可使澱粉水解，氧化酶和硝酸鹽還原為陰性，可利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖和蔗糖。所述的短芽孢桿菌26-13的16S rDNA序列在GeneBank與Brevibacillus sp. DYJL-F比對，同源率100%，系統發育樹與Brevibacillus sp. DYJL-F聚為一枝，但其形態有一定的差異；
所述的短芽孢桿菌26-13根據其形態、生理生化特徵及16S rDNA序列分析，故命名為 Brevibacillus sp. 26-13 ；一種防治辣椒疫病的生物製劑，含有上述短芽孢桿菌沈-13的發酵液乾燥物；該發酵液乾燥物包括短芽孢桿菌26-13的菌體和代謝物；
所述防治辣椒疫病的生物製劑還含有載體和保護劑；
所述的載體為滑石粉、高嶺土、粘土、膨潤土、硅藻土或陶土中的至少一種；
所述的保護劑為可溶性澱粉、糊精、蔗糖或穀氨酸中的至少一種；
所述的防治辣椒疫病的生物製劑，更優選為包含以下按質量百分比計的成分
短芽孢桿菌沈-13的發酵液乾燥物 3. 0 6. 0%
可溶性澱粉0.5 1.0%
糊精1 2%
蔗糖1 2%
穀氨酸鈉0.2 0.5%;
所述的短芽孢桿菌26-13的發酵液乾燥物的製備方法包括以下步驟 (1)菌種活化在滅菌的NA培養基中接入短芽孢桿菌26-13進行搖瓶培養；搖瓶培養條件如下30 32°C，轉速為160 200轉/min、培養時間為12 18小時；得到活化的菌種；NA培養基的組成為每升含有牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白腖5g、葡萄糖10g，水定容至 IOOOmL, pH 為 7. 2 7. 4 ；(2)菌體的大量繁殖連續放大發酵，首先將步驟(1)得到的活化的菌種按接種量為發酵培養基體積的8 10%接種入100L發酵罐，發酵16 20h後，將100L發酵罐的短芽孢桿菌沈-13發酵液轉至1000L發酵罐中，補充發酵培養基，繼續發酵培養M 30h ；整個發酵過程的發酵條件為發酵培養基為LA培養基，裝液量為發酵罐體積的70%，泡敵量為0. 05 0. 1 %，初始pH為7. 0 7. 2，發酵溫度30 32°C ；LA培養基的組成為每升含有玉米澱粉3g、大豆蛋白粉15g、玉米漿25g、MnSO4 0. 0308mg、K2HPO4 3g、KH2PO4 1. 5g、MgSO4 0. 5g、FeSO4 0. lg、CaCO3Ig,水定容至 lOOOmL， pH7. 0 ；(3)短芽孢桿菌沈-13的發酵液乾燥物的製備將步驟( 得到的發酵液進行噴霧乾燥，得到發酵液乾燥物。步驟(3)中所述的噴霧乾燥的優選條件為溫度為60 70 、ν$= 14 16m3/ min 禾口 V噴嘴=43 ；所述防治辣椒疫病的生物製劑的製備方法，包括以下步驟將短芽孢桿菌 Bacullices sp. 26-13發酵液乾燥物與載體和保護劑混和得到；更優選混合後乾燥至水分相對溼度小於10%、粉碎，得到防治辣椒疫病的生物製劑。所述防治辣椒疫病的生物製劑的使用方法可以是拌種或淋施，也可以是噴霧；所述防治辣椒疫病的生物製劑的使用時期是辣椒苗期和/或成株期。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果(1)本發明所述的防治辣椒疫病的生物製劑對環境友好，無農藥殘留問題，成本較低，生產工藝先進等特點；
(2)本發明所製成的防治辣椒疫病的生物製劑稀釋400X防治辣椒疫病的防治效果達到85%以上。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1(1)細菌的分離採用平皿稀釋法分離分離採自廣東廣州市天河區五山的菜地土壤的細菌，將土壤樣品用無菌水稀釋成川入川人川人川入川…梯度濃度。NA固體培養基(牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白腖5g、葡萄糖10g，瓊脂18g，水定容至1000mL，pH為7. 2 7. 4)滅菌後倒入9cm 平皿中(每皿約15mL)。用移液管每濃度移取0. Iml放入每皿中，用塗布棒均勻塗布，每濃度重複10皿，30-32°C下培養M-30h後，選取每皿生長10-30個細菌菌落的平皿進行挑取， 無菌操作抑制NA試管斜面，30-32 °C培養M_30h後保存備用。(2)防治辣椒疫病的細菌的篩選將步驟(1)分離得到的細菌進行篩選，採用對峙培養法。將滅菌好的V8固體培養基(V8固體培養基組分為美國進口 V8蔬菜汁lOOmL，CaCO3 0. 2g，瓊脂18g，水定容至 IOOOmL)倒入9cm的平皿中(每皿約15mL)，冷卻後，將生長的好的辣椒疫黴菌(辣椒抗疫病鑑定方法初探，天津農業科學，2010，16 (5) =100-103)的瓊脂塊(6mm)放在平皿，2648°C 培養24h後，將分離得到的細菌用移植環挑取後點在距病菌瓊脂塊3cm處，2648°C培養培養7 後，觀察辣椒疫黴病菌的生長情況。如細菌對病菌有抑制作用，則有明顯的抑菌帶； 如細菌對病菌無抑制作用，則無抑菌帶。篩選得到一株對辣椒疫病菌具有明顯的抑制作用，抑菌帶寬度為1. 72cm，稱為細菌 26-13o(3)形態及生理生化特徵採用NA培養基平皿，將所述細菌26-13通過稀釋平皿法和劃線法進行純化，與 32 35°C條件下培養1 Mh，並進行革蘭氏染色及菌體形態和菌落特徵觀察；參照張紀忠(1990)的方法進行需氧試驗、碳源利用試驗、吲哚試驗。
得到的觀察檢測結果為杆狀，0.7 0.9 μ mX3 5 μ m，革蘭氏陽性，以周生鞭毛運動，在膨大孢囊內含橢圓形芽孢，菌落平、光滑、黃灰色、無可溶性色素，可使澱粉水解，氧化酶和硝酸鹽還原為陰性，可利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖和蔗糖。(2) 16S rDNA 序列分析採用細菌通用16S rRNA 擴增引物序列 27F (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)、 1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)擴增16S rRNA基因片段，擴增產物由英濰捷基(上海)貿易有限公司測序後，將所測的16SrDNA(如下所示，1391bp)序列與GenBank資料庫中所有已測定的原核生物16S rDNA序列進行比較，得出細菌沈-13系統發育地位。1 AGTCGAGCGA GGGTCTTCGG ACCCTAGCGG CGGACGGGTG AGTAACACGT AGGCAACCTG61 CCTCTCAGAC TGGGATAACA TAGGGAAACT TATGCTAATA CCGGATAGGT TTTTGGATCG121 CATGATCCGA AAAGAAAAGA TGGCTTCGGC TATCACTGGG AGATGGGCCT GCGGCGCATT181 AGCTAGTTGG TGGGGTAACG GCCTACCAAG GCGACGATGC GTAGCCGACC TGAGAGGGTG
241ACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT
301TTTCCACAATGGACGAMGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGA
361TTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGMTAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACG
421GTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG
481CMGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTG
541TTAAAGCCCGGAGCTCMCTCCGGTTCGCATCGGMACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGA
601GGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGG
661CGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG
721GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGTTTCM
781TACCCTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAG
841TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGA
901AGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGACCGCTCTGGAGACAGAGCT
961TCCCTTCGGGGCAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG
1021TTGGGTTAAGTCCCGCMCGAGCGCMCCCTTATCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGC
1081ACTCTAGAGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCAT
1141GCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGGGATGCTACCTC
1201GCGAGAGGACGCCAATCTCTTAAAACCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCC
1261TACATGMGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG
1321GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGT
1381AACCGCAAGGA
所述細菌 26-13 的 16S rDNA 序列在 GeneBank 與 Brevibacillus sp. DYJL-F 比
對，同源率100%，系統發育樹與Brevibacillus sp. DYJL-F聚為一枝，但其形態有一定的
差異；所述短芽孢桿菌沈-13根據其形態、生理生化特徵及16S rDNA序列分析，故命名為短芽孢桿菌 Brevibacillus sp. 26-13。實施例2短芽孢桿菌沈-13生物製劑製備(1)菌種的活化配製NA培養基(每升的組成為牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白腖 5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH為7. 2 7. 4)後，每個規格為500mL的三角瓶中裝NA 培養基lOOmL，121滅菌15min。在滅菌的NA培養基中接入短芽孢桿菌沈_13進行搖瓶培養；搖瓶培養條件如下30 32°C，轉速為160 200轉/min、培養時間為15小時；得到活化的菌種；(2)菌體的大量繁殖，為連續放大發酵過程。首先應用100L的發酵罐進行發酵，發酵液為LA培養基(每升的組成為玉米澱粉 3g、大豆蛋白粉 15g、玉米漿 25g、MnSO4 0. 0308mg、K2HPO4 3g、KH2PO4 1. 5g、MgSO4 0. 5g、 FeSO4 0. IgXaCO3 lg，水定容至1000mL，pH7. 0)，裝液量為70L，將步驟(1)得到的活化的菌液9L接種至100L發酵罐，泡敵量(體積百分比)為0. 08 %，初始pH為7. 2，發酵溫度30 32°C、發酵培養18小時；然後將100L發酵罐的短芽孢桿菌26-13發酵液轉至1000L發酵罐中，發酵溫度30 32 °C、發酵培養^h ；
(3)防治辣椒疫病的生物製劑的製備利用噴霧乾燥儀將步驟(2)得到的發酵液進行噴霧乾燥(溫度為60 70°C、Vs ^= 14 16m7min和Veffi=中速)，得到發酵液乾燥物，將發酵液乾燥物、載體和保護劑進行混和，具體組成為發酵液乾燥物5% wt、可溶性澱粉0. 8% wt、糊精1. 5% wt、蔗糖1. 5% wt、穀氨酸鈉0. 4% wt、滑石粉20% wt和粘土 70. 8% Wt0然後乾燥至水分相對溼度小於 10 %、粉碎，得到防治辣椒疫病的生物製劑。實施例3短芽孢桿菌沈-13生物製劑防治辣椒疫病試驗(1)生物製劑實施例3獲得的生物製劑，菌體含量約為5X IO11CFU/克。(2)辣椒疫黴病菌遊動孢子懸浮液將辣椒疫黴病菌接種至V8培養液(V8蔬菜汁 IOOmLjCaCO3 0. 2g，水定容至IOOOmL)中，沈 培養5 7天，過濾菌絲得到孢子懸浮液，用血球計數板計數並稀釋至濃度800cfu/mL。(3)溫室試驗在溫室08 30°C )培養辣椒苗，直至辣椒苗長至3片葉。試驗前 1天對供試辣椒苗進行充分灌水，保持基質溼潤。用實施例2獲得的短芽孢桿菌沈-13生物製劑400X、800X、1200X噴霧和淋根處理，以50%烯醯嗎啉可溼性粉劑2000倍液為對照藥劑，清水噴霧為空白對照(CK)，晾乾，用辣椒疫病菌遊動孢子懸浮液(濃度為SOOcfu/ mL)進行接種，接種時用針在幼苗莖接近基質表面處刺小孔，將IOmL的遊動孢子懸浮液注入，接種後保溼12h，每處理為30棵苗，每處理重複三次，28-30°C培養7天後調查葉發病情況，記錄病株數、死株數或明顯枯萎的植株數，計算發病率和防治效果(表1)。表1短芽孢桿菌沈-13生物製劑防治辣椒疫病試驗結果
權利要求
1.一種防治辣椒疫病的細菌，其特徵在於名稱為短芽孢桿菌 (BrevikiCilluSSp.U6-13，於2011年1月8日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC M 2011009。
2.一種防治辣椒疫病的生物製劑，含有權利要求1所述的短芽孢桿菌沈-13的發酵液乾燥物。
3.根據權利要求2所述的防治辣椒疫病的生物製劑，其特徵在於還含有載體和保護劑；所述的載體為滑石粉、高嶺土、粘土、膨潤土、硅藻土或陶土中的至少一種；所述的保護劑為可溶性澱粉、糊精、蔗糖或穀氨酸中的至少一種。
4.根據權利要求2所述的防治辣椒疫病的生物製劑，其特徵在於包含以下按質量百分比計的成分短芽孢桿菌沈-13的發酵液乾燥物 3. 0 6. 0%可溶性澱粉0.5 1.0%糊精1 2%蔗糖1 2%穀氨酸鈉0.2 0.5%。
5.根據權利要求4所述的防治辣椒疫病的生物製劑，其特徵在於所述的短芽孢桿菌 26-13的發酵液乾燥物的製備方法包括以下步驟(1)菌種活化在滅菌的NA培養基中接入短芽孢桿菌26-13進行搖瓶培養；搖瓶培養條件如下30 32°C，轉速為160 200轉/min、培養時間為12 18小時；得到活化的菌種；NA培養基的組成為每升含有牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白腖5g、葡萄糖10g，水定容至 IOOOmL, pH 為 7. 2 7. 4 ；(2)菌體的大量繁殖連續放大發酵，首先將步驟(1)得到的活化的菌種按接種量為發酵培養基體積的8 10%接種入100L發酵罐，發酵16 20h後，將100L發酵罐的短芽孢桿菌沈-13發酵液轉至1000L發酵罐中，補充發酵培養基，繼續發酵培養M 30h ；整個發酵過程的發酵條件為發酵培養基為LA培養基，裝液量為發酵罐體積的70%，泡敵量為 0. 05 0. 1 %，初始pH為7. 0 7. 2，發酵溫度30 32°C ；LA培養基的組成為每升含有玉米澱粉3g、大豆蛋白粉15g、玉米漿25g、MnSO4 0. 0308mg、K2HPO4 3g、KH2PO4 1. 5g、MgSO4 0. 5g、FeSO4 0. lg、CaCO3Ig,水定容至 lOOOmL， pH7. 0 ；(3)短芽孢桿菌沈-13的發酵液乾燥物的製備將步驟( 得到的發酵液進行噴霧乾燥，得到發酵液乾燥物。
6.根據權利要求4所述的防治辣椒疫病的生物製劑，其特徵在於步驟(3)中所述的噴霧乾燥的條件為溫度為60 701^5^= 14 16m7mir^nV_=中速。
7.權利要求2 6任一項所述防治辣椒疫病的生物製劑的製備方法，其特徵在於包括以下步驟將短芽孢桿菌沈-13的發酵液乾燥物與載體和保護劑混和得到。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於將短芽孢桿菌沈-13的發酵液乾燥物與載體和保護劑混合後，乾燥至水分相對溼度小於10 %、粉碎，得到防治辣椒疫病的生物製劑。
9.權利要求2 6任一項所述防治辣椒疫病的生物製劑的應用，其特徵在於所述防治辣椒疫病的生物製劑的使用方法為拌種、淋施或噴霧。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於所述防治辣椒疫病的生物製劑的使用時期是辣椒苗期和/或成株期。
全文摘要
本發明公開了一種防治辣椒疫病的短芽孢桿菌及生物製劑的製備方法與應用。該防治辣椒疫病的短芽孢桿菌為短芽孢桿菌26-13，於2011年1月8日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2011009。將該短芽孢桿菌26-13進行發酵，得到的發酵液乾燥，再將發酵液乾燥物與載體、保護劑混合，得到防治辣椒疫病的生物製劑。該生物製劑具有對環境友好，無農藥殘留問題，成本較低，生產工藝先進等優點，而且將其稀釋400×防治辣椒疫病的防治效果達到85％以上。
文檔編號C12R1/01GK102154178SQ201110030249
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月28日 優先權日2011年1月28日
發明者李培謙, 林壁潤, 沈會芳, 潘群英, 蒲小明 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所