一種大腸桿菌外膜囊泡的製備、載藥方法與其在抗腫瘤中的應用與流程

2024-04-05 03:21:05

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種大腸桿菌外膜囊泡的製備、載藥方法與其在抗腫瘤中的應用。

背景技術：

細菌外膜囊泡(omv)是一種納米尺寸、雙分子層的球狀蛋白脂質體。其粒徑大約在50-100nm之間。外膜囊泡外表面由磷脂雙分子層包繞，富含水溶性蛋白、mrna和microrna等物質。它主要由革蘭氏陰性菌分泌並外排出細菌外，是細菌新陳代謝過程的重要途徑，同時也是細菌之間進行信號傳導的重要媒介。革蘭氏陰性菌在其生長期間自發釋放外膜囊泡，然而，自發生成的細菌外膜囊泡產量相對較低，往往需要培養大量的細菌才能提取一定質量的外膜囊泡。使用一系列的去汙劑處理或超聲處理方法，能夠通過破壞完整的細菌進而促進細菌產生omv，但此類方法工藝較複雜，往往還需要多步驟提純，除去化學試劑，或需要外加超聲處理。

在應用於藥物載體方面，傳統的藥物載體粒徑和毒性較大，合成相對複雜，容易被巨噬細胞等吞噬，載體無法有效到達腫瘤部位。傳統藥物載體包括陽離子脂質體和陽離子聚合物兩大類，它們表面由於永久正電荷的存在，故可以通過靜電相互作用與藥物結合，但是陽離子脂質體經過靜脈注射後，會與帶負電荷的血清蛋白結合，導致靶向性差並且無法在體內長時間循環，而外膜囊泡作為一種膜結構的藥物載體，憑藉其表面帶負電荷、粒徑小以及生物相容性好等特點，可以通過攜載抗腫瘤藥物，在體內長時間循環，隨後被動靶向到達腫瘤部位，將藥物遞送至腫瘤細胞內。

目前將藥物遞送至omv載體內的方法有37℃孵育法、超聲法和電穿孔法三種。37℃孵育法依靠自身的細胞膜間隙和濃度梯度使藥物由omv外部向omv內部擴散，但omv細胞間隙很小且為脂溶性膜，所以擴散效率很低，導致其載藥量低。超聲法和電穿孔法可以在一定程度上提高omv的載藥量，但需要藉助超聲儀和電穿孔儀，操作不方便，這些限制均阻礙了omv在藥物載體方面的應用。

技術實現要素：

針對以上不足，本發明提供一種大腸桿菌外膜囊泡的製備、載藥方法與其在抗腫瘤中的應用，直接使用了一種細菌外膜囊泡誘導劑，使其能夠刺激大腸桿菌分泌更多omv，大幅提升了大腸桿菌omv的產量。本發明直接使用一種皂苷類小分子物質，十二烷基麥芽糖苷，當它與omv孵育之後，可以在omv表面形成孔狀通道，使小分子藥物通過孔狀通道滲透進入omv內部，隨後採取氯化鈣分子封住孔道，將其完全包裹在omv中。方法簡便可行，提高omv載藥效率，並且後續實驗證明攜載藥物的omv能夠明顯抑制腫瘤生長，在藥物載體領域具有廣闊的應用前景。

本發明解決技術問題所採用的技術方案如下：一種大腸桿菌外膜囊泡的製備方法，所述製備方法具體如下：

(1)收集體外培養的大腸桿菌溶液；

(2)將大腸桿菌溶液在0-25℃下離心棄去沉澱，用濾膜過濾上清液，獲得無細菌上清液；

(3)用超濾管濃縮步驟(2)得到的無細菌上清液，濃縮後的體積為濃縮前的1/50-1/4；

(4)將濃縮後的無細菌上清液在0-25℃下超速離心，棄去上清，沉澱以pbs緩衝液重懸，重複超速離心、棄去上清液、沉澱重懸於pbs緩衝液，最後即得細菌外膜囊泡。

進一步的，所述步驟(1)中大腸桿菌溶液的獲取方法如下：

(1.1)將bl21菌株的凍存液融化，使用接種環挑取細菌溶液，接種於含50μg/ml卡那黴素的固體培養基，37℃培養箱內培養1-48h，再挑取固體培養基上的1個單菌落至含50μg/ml卡那黴素的lb液體培養基，再在37℃下震蕩培養1-24h；

(1.2)隨後將震蕩培養1-24h獲得的細菌溶液以體積比為1：100的比例接種至含50μg/ml卡那黴素的lb液體培養基中，繼續在37℃下震蕩培養，在600nm的波長下，細菌od值達到0.1-0.5時，在lb液體培養基中加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)，使異丙基硫代半乳糖苷在lb液體培養基中的最終濃度為1-500μg/ml，繼續在37℃下震蕩培養1-48h，最終獲得大腸桿菌溶液。

進一步的，所述步驟(2)中的離心轉速為1000g-10000g，離心時間為1-30min。

進一步的，所述濾膜的孔徑為0.2-1μm。

進一步的，所述步驟(4)中的超速離心轉速為100000g-200000g，離心時間為0.5-5h。

本發明的另一目的是提供一種大腸桿菌外膜囊泡的載藥方法，該方法利用十二烷基麥芽糖苷作為制孔劑將抗腫瘤藥物載入大腸桿菌外膜囊泡中，得到攜載抗腫瘤藥物的細菌外膜囊泡。

進一步的，該方法具體過程如下：

(a)將大腸桿菌外膜囊泡分散在pbs緩衝液中，再向其中加入十二烷基麥芽糖苷，大腸桿菌外膜囊泡、十二烷基麥芽糖苷和pbs緩衝液的質量比為0.1-10：0.1-10：1000，在37℃下震搖0.1-10h；

(b)向步驟(a)製得的溶液中加入抗腫瘤藥物，使抗腫瘤藥物的最終濃度為1-10mg/ml，在37℃條件下孵育0.1-10h；

(c)向步驟(b)得到的溶液中加入氯化鈣，使氯化鈣濃度為0.1-1mg/ml，繼續在37℃條件下孵育0.1-10h，超速離心，棄去上清液，沉澱重懸於pbs緩衝液，重複超速離心、棄去上清液、沉澱重懸於pbs緩衝液，即得到攜載抗腫瘤藥物的細菌外膜囊泡。

進一步的，所述抗腫瘤藥物為鹽酸阿黴素、dna、紫杉醇、順鉑、mrna、吉非替尼、吉西他濱、sirna、氮芥、噴司他丁、阿那曲唑和利妥昔單抗中的一種或幾種按任意比混合。

進一步的，所述步驟(c)中的超速離心轉速為100000g-200000g，離心時間為0.5-5h。

本發明還提供一種上述大腸桿菌外膜囊泡的載藥方法獲得的攜載抗腫瘤藥物的細菌外膜囊泡在抗腫瘤中的應用。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

1)本發明首次利用一種簡便可行的方式提高了大腸桿菌omv的產率，操作簡單、成本較低、可行性高。

2)本發明根據omv自身較高的生物相容性等特點，使其能夠攜載抗腫瘤藥物，與其它傳統藥物載體相比，理論上能夠減少毒性，增加藥物載體內循環時間，更好的通過被動靶向的方式達到腫瘤部位。

3)omv不僅能夠攜載小分子抗腫瘤藥物，還能夠攜載基因類藥物，例如sirna等，在抑制腫瘤細胞生長的同時，也可以降低腫瘤細胞的侵襲能力，是一種多功能的藥物載體。

4)與omv現有的載藥方法相比，本發明首次使用十二烷基麥芽糖苷作為促進載藥的試劑，並篩選出合理的孵育濃度，與其它方法相比，本發明操作簡單，不破壞omv的膜結構，是一種高效的載藥方法。

附圖說明

圖1為外膜囊泡的粒徑圖；

圖2為外膜囊泡的掃描電鏡圖；

圖3為放大後外膜囊泡的掃描電鏡圖；

圖4為不同方式製得外膜囊泡的產量圖；

圖5為外膜囊泡三種不同載藥方式的載藥效果圖；

圖6為腫瘤細胞對外膜囊泡的攝取效果圖；

圖7為載藥外膜囊泡對腫瘤細胞對的抑制效果圖；

圖8為載藥外膜囊泡對腫瘤細胞對的侵襲能力的抑制效果圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明做進一步的說明。

實施例1：

大腸桿菌外膜囊泡的製備

(1)大腸桿菌的復甦與體外培養

將bl21菌株的凍存液融化，使用接種環挑取細菌溶液，接種於含50μg/ml卡那黴素的固體培養基，37℃培養箱內培養1h，接種固體培養基上1個單菌落至含50μg/ml卡那黴素的lb液體培養基，37℃震蕩培養1小時。

隨後將細菌溶液以體積比為1：100的比例接種至含50μg/ml卡那黴素的lb液體培養基(已經過高溫滅菌)，繼續37℃震蕩培養，當細菌od值(600nm)達到0.1時，在lb液體培養基中加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)，使異丙基硫代半乳糖苷在lb液體培養基中的最終濃度為1μg/ml，促進大腸桿菌分泌外膜囊泡，繼續在37℃下震蕩培養1h。

(2)大腸桿菌外膜囊泡的分離與提純

收集體外培養的大腸桿菌培養物，在0℃下，1000g離心1min，棄去沉澱，用0.2μm濾膜過濾上清夜，獲得無細菌上清液。使用超濾管超濾濃縮上清液，得到濃縮後的無細菌上清液，濃縮後的體積為濃縮前的1/50。在0℃下，100000g超速離心0.5h，棄去上清，沉澱以pbs緩衝液重懸，再次以100000g超速離心0.5h，棄去上清液，沉澱重懸於pbs緩衝液，即得到細菌外膜囊泡。

大腸桿菌外膜囊泡的載藥

將所製得的大腸桿菌外膜囊泡分散在pbs緩衝液中，向其中加入十二烷基麥芽糖苷，大腸桿菌外膜囊泡、十二烷基麥芽糖苷和pbs緩衝液的質量比為0.1：0.1：1000，在37℃下震搖0.1h。向大腸桿菌外囊泡溶液中加入抗腫瘤藥物，使抗腫瘤藥物的最終濃度為1mg/ml，37℃條件下孵育0.1h。抗腫瘤藥能夠從高濃度梯度向低濃度梯度逐漸擴散，進入大腸桿菌外膜囊泡內。

為了防止藥物洩露，需要向溶液中加入氯化鈣離子，使氯化鈣濃度為0.1mg/ml，繼續37℃條件下孵育0.1h，超速離心，棄去上清液，沉澱重懸於pbs緩衝液。重複超速離心，棄去上清液，沉澱重懸於pbs緩衝液，即得到攜載抗腫瘤藥物的細菌外膜囊泡。

實施例2：

大腸桿菌外膜囊泡的製備

(1)大腸桿菌的復甦與體外培養

將bl21菌株的凍存液融化，使用接種環挑取細菌溶液，接種於含50μg/ml卡那黴素的固體培養基，37℃培養箱內培養48h，接種固體培養基上1個單菌落至含50μg/ml卡那黴素的lb液體培養基，37℃震蕩培養24小時。

隨後將細菌溶液以體積比為1：100的比例接種至含50μg/ml卡那黴素的lb液體培養基(已經過高溫滅菌)，繼續37℃震蕩培養，當細菌od值(600nm)達到0.5時，在lb液體培養基中加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)，使異丙基硫代半乳糖苷在lb液體培養基中的最終濃度為500μg/ml，促進大腸桿菌分泌外膜囊泡，繼續震蕩培養48h。

(2)大腸桿菌外膜囊泡的分離與提純

收集體外培養的大腸桿菌培養物，在25℃下，10000g離心30min，棄去沉澱，1μm濾膜過濾上清夜，獲得無細菌上清液。使用超濾管超濾濃縮上清液，得到濃縮後的無細菌上清液，濃縮後的體積為濃縮前的1/4。在25℃下，200000g超速離心5h，棄去上清，沉澱以pbs緩衝液重懸，再次超速離心，棄去上清液，沉澱重懸於pbs緩衝液，即得到製備的細菌外膜囊泡。

大腸桿菌外膜囊泡的載藥

將所製得的大腸桿菌外膜囊泡分散在pbs緩衝液中，向其中加入十二烷基麥芽糖苷，大腸桿菌外膜囊泡、十二烷基麥芽糖苷和pbs緩衝液的質量比為10：10：1000，在37℃下震搖10h。向大腸桿菌外囊泡溶液中加入抗腫瘤藥物，使抗腫瘤藥物的最終濃度為10mg/ml，37℃條件下孵育10h。抗腫瘤藥能夠從高濃度梯度向低濃度梯度逐漸擴散，進入大腸桿菌外膜囊泡內。

為了防止藥物洩露，需要向溶液中加入氯化鈣離子，使氯化鈣濃度為1mg/ml，繼續37℃條件下孵育10h，超速離心，棄去上清液，沉澱重懸於pbs緩衝液。重複200000g超速離心5h，棄去上清液，沉澱重懸於pbs緩衝液，即得到攜載抗腫瘤藥物的細菌外膜囊泡。

實施例1和實施例2中的用到的抗腫瘤藥物為鹽酸阿黴素、dna、紫杉醇、順鉑、mrna、吉非替尼、吉西他濱、sirna、氮芥、噴司他丁、阿那曲唑和利妥昔單抗中的一種或幾種按任意比混合。

實施例3：

大腸桿菌外膜囊泡的驗證

(1)對大腸桿菌外膜囊泡進行粒徑測量

首先使用pbs緩衝液將實施例1合成好的外膜囊泡調整至100μg/ml，在馬爾文雷射粒徑儀下測量外膜囊泡的尺寸，結果如圖1所示。

(2)對外膜囊泡進行形態觀察

取實施例1外膜囊泡溶液，滴加在專用銅網上，直接在掃描電鏡下觀察外膜囊泡的大小和形態，結果如圖2、圖3所示。

(3)考察大腸桿菌外膜囊泡產率

取實施例1外膜囊泡溶液，加入溶菌酶(1mg/ml)，室溫震搖30min。隨後使用bca蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，即得到實施例1所製得外膜囊泡濃度。

取未經異丙基硫代半乳糖苷(iptg)處理的大腸桿菌所製得外膜囊泡溶液，加入溶菌酶(1mg/ml)，室溫震搖30min。隨後使用bca蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，即得到未經異丙基硫代半乳糖苷(iptg)處理的外膜囊泡濃度。兩種不同的培養方法所製備的外膜囊泡的產率如圖4所示。

(4)考察不同方法大腸桿菌外膜囊泡的載藥效率

取實施例1製得的含有藥物的外膜囊泡溶液，加入溶菌酶(1mg/ml)，室溫震搖30min。隨後使用高效液相色譜法檢測溶液中藥物的濃度，並與總投藥量相比較，得出化學藥物的載藥效率。

取實施例1製得的外膜囊泡溶液，加入藥物(1mg/ml)，與外膜囊泡溶液孵育10min，隨後使用電穿孔儀(eppendorfag,hamburg,germany)，以1000kv電擊5ms，最終在37℃條件下孵育30min，即得載藥的外膜囊泡溶液。取上述外膜溶液，加入溶菌酶(1mg/ml)，室溫震搖30min。隨後使用高效液相色譜法檢測溶液中藥物的濃度，並與總投藥量相比較，得出電穿孔法製備得到的藥物載藥效率。

取實施例1製得的外膜囊泡溶液，加入藥物(1mg/ml)，在37℃條件下孵育24h，即得載藥的外膜囊泡溶液。取上述外膜溶液，加入溶菌酶(1mg/ml)，室溫震搖30min。隨後使用高效液相色譜法檢測溶液中藥物的濃度，並與總投藥量相比較，得出37℃孵育法製備得到的藥物載藥效率。

三種不同的載藥方法製備外膜囊泡的載藥效率如圖5所示。

(5)考察載藥的外膜囊泡溶液的細胞攝取效果

以每孔2×104個細胞的密度將對數生長的b16f10細胞種在細胞培養板中，置於細胞培養箱培養24小時後，除去培養液並用pbs洗兩遍，每孔加入500μl不含血清的dmem高糖培養液。用5wt％蔗糖水溶液稀釋載藥的外膜囊泡溶液，加入上述藥物溶液，使其細胞藥物的孵育為10μg/ml。在37℃，5wt％co2條件下與b16f10細胞孵育12小時後，除去培養液，加入200μl4％多聚甲醛固定30min，pbs洗滌2次，每次10min，每個樣品加200μldapi(1μg/ml)染色液，室溫避光反應10min，pbs洗滌2次，立即在激發波長為550nm的條件下，使用螢光顯微鏡觀察螢光的分布情況。結果如圖6所示。

(6)考察載藥的外膜囊泡溶液的抗腫瘤效果

以每孔1×104個細胞的密度將對數生長的b16f10細胞種在96孔板中，置於細胞培養箱培養24小時後，除去培養液並用pbs洗兩遍，每孔加入100μl不含血清的dmem高糖培養液。用5wt％蔗糖水溶液稀釋載藥的外膜囊泡溶液，加入上述藥物溶液，使其細胞藥物的孵育濃度分別為1μg/ml、5μg/ml以及10μg/ml。在37℃，5wt％co2條件下與b16f10細胞孵育24小時後，每孔加入20μl濃度為5mg/mlmtt溶液，孵育4h後除去培養液，每孔加入150μldmso，振搖使結晶完全溶解後，在酶標儀上於570nm下測定各組od值。結果如圖7所示。

(7)考察載藥的外膜囊泡溶液對細胞侵襲的影響

用transwell培養板(直徑6.5mm，孔徑8μm)考察b16f10的體外侵襲能力。將b16f10細胞，按照每孔5×104個細胞的密度種在24孔板中，置於細胞培養箱培養24小時後，棄去培養液並用pbs洗兩遍，每孔加入500μl不含血清的dmem高糖培養液。用5wt％蔗糖水溶液稀釋載藥的外膜囊泡溶液，調整其藥物濃度至100μg/ml。加入40μl上述溶液，5wt％co2條件下繼續培養24小時。隨後將細胞以每孔3×104的濃度加入transwell板的上層，下層加入600μl含有10wt％血清的培養液，繼續培養48h，取出上層插件，用棉籤輕輕擦去膜上層的細胞，侵襲到下層的細胞用4wt％多聚甲醛固定20min，pbs洗三次，細胞用結晶紫染色。使用螢光顯微鏡觀察細胞的侵襲情況，結果如圖8所示。