一種鑑別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法
2024-04-04 23:57:05
專利名稱：一種鑑別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法
技術領域：
本發明屬於辣椒育種領域，具體涉及一種植物分子標記技術，特別涉及 一種鑑別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，該方法適用於抗疫病分子標記輔 助育種。
背景技術：
辣椒疫病是危害辣椒生產的主要病害之一，在世界上許多國家都有發 生，在我國青海、新疆、甘肅、陝西、'北京、遼寧、上海、浙江、湖南、四 川、雲南等辣椒主產區均有大面積發生、流行的報導。隨著辣椒產業的發展， 辣椒疫病有逐年加重的趨勢，造成了嚴重的經濟損失。該病害的病原菌為
(屍/^o/ /^2oraca/^dLeon)，辣椒的苗期、成株期均可受害，莖、葉和果 實都能發病。傳播速度快，發病田經常絕產，造成嚴重的經濟損失。目前生 產上控制辣椒疫病以化學防治為主，防治效果差，且汙染環境；此外，辣椒 疫黴菌易發生變異，常導致耐(抗)藥菌株的產生。採用土壤消毒雖有較好 地防效，但生產上大面積使用則較為困難。
抗疫病品種的應用是防治或減輕辣椒疫病危害的有效途徑。目前世界上 許多辣椒主產國家均已把選育抗疫病品種作為辣椒育種工作的主要目標之 一。但目前對疫病表現出極高抗性的辣椒資源，它們的共同缺點是果形小、 品質較差、轉育周期長，難以滿足辣椒產業化對品種更新換代加速的要求。 與傳統育種相比，分子標記育種更快、更節省人力、節約時間、提高效率。 分子標記技術在植物育種中主要起輔助性作用。它主要尋找與目標基因緊密 連鎖的分子標記，然後從雜交子代中檢測分子標記是否存在。檢測到了分子 標記的植株，表明含有目的基因，可以進一步優化和篩選。
3利用抗病基因產物具有保守結構域的特性，通過人工合成與已知抗病基
因產物的保守序列類似的簡併引物，以植物總DNA為模板進行PCR擴增，就 可得到該種植物的抗病基因同源序列。許多研究證明， 一些抗病基因同源序 列與抗病基因密切連鎖，甚至就是抗病基因的一部分。此外，抗病基因同源 序列還具有容易獲得、擴增結果穩定和使用費用低廉等優點。因此，分離和 克隆植物的抗病基因同源序列成為當前人們比較認同的標記、定位和克隆植 物抗病基因的策略之一。
利用抗病基因同源序列獲得的基因，往往是一段缺乏5'端與3'端的DNA 序列，獲得全長基因序列可採用未知側翼序列擴增~~DNA Walking步移 法，簡稱步移法。此法所選擇的引物雖與己知DNA序列互補，但兩引物3' 端是反向的。染色體步移技術主要應用於基因克隆、步查獲得新物種中基因 的非保守區域、鑑定T-DNA或轉座子的插入位點、染色體測序工作中的空隙 填補，從而獲得完整的基因組序列等方面。
發明內容
針對現有技術中存在的缺陷或不足，本發明的目的在於，提供一種鑑別 辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，該方法採用與辣椒抗疫病基因緊密連鎖的 抗病基因同源序列分子標記，從而實現在育種過程中快速、有效選擇抗疫病 材料，加速辣椒抗疫病育種進程。
為了實現上述目的，本發明採用如下的技術解決方案 一種鑑別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，其特徵在於，包括以下步驟:
1) 人工設計合成一對核苷酸序列作為引物，該引物是由鹼基組成的特 定序列的寡聚體，其中
正向引物5 ， - AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA -3 ， 反向引物5,-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC國3，
2) 提取辣椒基因組的DNA，以引物對辣椒基因組DNA進行PCR擴增，抗疫病材料和感疫病材料均可擴增出長度為590 bp的片段；
3) PCR擴增產物在37 'C條件下經I酶切16 h後，I酶的酶切 位點為抗疫病品種克隆的基因序列第324bp處；酶切產物經2%瓊脂糖凝 膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察並拍照記錄，抗疫病植株酶 切產物有325 bp和265 bp兩條譜帶，感疫病植株只有590bp —條譜帶。
本發明的鑑別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，步驟簡單快捷、穩定可 靠，鑑別結果與田間抗病性鑑定結果準確一致、重複性好，特別適用於抗疫 病分子標記輔助育種，能夠很好地提高選擇效率，加速育種進程。
圖1為7個辣椒自交系PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNA Marker; 1: A5; 2: All; 3: B17; 4: B23; 5: B2; 6: B32; 7: B19
圖2為7個辣椒自交系PCR擴增產物酶切產物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNAMarker; 1: A5; 2: All; 3: B17; 4: B23; 5: B2; 6: B32; 7: B19
圖3為7個辣椒自交系PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNA Marker; 1: B3; 2: Pll; 3: B4; 4: P30; 5: B12; 6: P97; 7: P45
圖4為7個辣椒自交系PCR擴增產物酶切產物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNAMarker; 1: B3; 2: Pll; 3: B4; 4: P30; 5: B12; 6: P97; 7: P45。
以下結合附圖和實施例對本發明作更詳細的說明。
具體實施例方式
以下相關參考文獻在本發明中被得以應用
辣椒LRR類抗病基因同源序列的克隆與分析，馬維等，西北農林科技 大學學報(自然科學版)，第1期，2008。
A PCR畫based approach for isolating pathogen resistance gene from potato with potential for application in plants. Leister D， Ballvora A， Salamini F， Gebhardt C. Nature Genet, 14， 1996。以PCR鑑定轉基因植株的微量DNA提取方法，鞏振輝等，西北農業 大學學報，第1期，1997。
辣椒疫病三種接種方法的比較，易圖永等，中國蔬菜，第2期，2003。 本發明的鑑別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，首次以辣椒抗、感疫病 材料為試材，根據植物抗性基因保守區域設計引物(馬維等，辣椒LRR類 抗病基因同源序列的克隆與分析[J].西北農林科技大學學報(自然科學版)， 2008， 36 (1): 143~148)，以辣椒基因組DNA為模板擴增，得到抗疫病基 因同源序列片段，再利用DNA Walking步移法(Leister D， Ballvora A， Salamini F， Gebhardt C. A PCR-based approach for isolating pathogen resistance gene from potato with potential for application in plants [J]. Nature Genet ， 1996， 14: 421 429。)獲得了辣椒疫病抗性基因Ca"朋。通過對C""朋基因序列 限制性酶切位點分析，篩選適宜的限制性酶切位點，結合PCR擴增與酶切 產物多態性分析，創建和優化辣椒疫病抗性基因的分子標記體系，開發出與 辣椒抗疫病基因連鎖的分子標記，以期加快辣椒抗疫病分子育種進程。 具體包括如下步驟
1、 一對核苷酸序列作為引物，該引物是由鹼基組成的特定序列的寡聚
體，其中
正向引物5 ，- AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA -3 ， 反向引物5，-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3，
2、 辣椒基因組DNA的提取採用改良SDS方法提取辣椒基因組DNA (鞏振輝等，以PCR鑑定轉基因植株的微量DNA提取方法[J].西北農業大
學學報，1997， 25 (1): 45-47)。
3、 以步驟1所述核苷酸分子為引物，對步驟2辣椒基因組DNA進行 PCR擴增，抗疫病材料和感疫病材料均可擴增出長度為590 bp的片段。PCR 擴增體系如下
6(1) 反應液體積為25^L，所用物品的組成及含量為
10倍PCR buffer 2.5 ^L， 25 mmol丄國1 MgCl2 2.0 pL， 5 U'^iL-1 DNA 聚合酶0.2 jxL， 5 mmol丄-1 dNTPs 1.0 (oL， 20 ^imol'L"正向引物1.0 ^L， 20 pmol'L"下遊引物l.OnL，基因組DNA1.0pL (50ng'iaL")， ddH20 16.3 pL。
(2) PCR擴增反應條件為
PCR擴增反應在PCR儀上進行，反應條件為94 -C預變性5 min; 94 °C 變性1 min， 58 。C退火1 min， 72 "C延伸1 min，進行35個循環；最後72 °C 延伸10 min,隨後於4 'C保存備用。
4、 PCR擴增產物在37 "C條件下經Beg I酶切16 h後，酶切產物經2 % 瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察並拍照記錄。抗疫 病植株酶切產物有325 bp和265 bp兩條譜帶，感疫病植株只有590bp —條 譜帶。
以下是發明人給出的實施例，這些實施例僅是用於理解本發明，本發明 不限於這些實施例。 實施例l:
1、 人工設計合成的核苷酸序列作為引物
正向引物5 ，- AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA -3 ， 反向引物5 ，- CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC -3 ，
2、 辣椒基因組DNA的提取採用改良SDS方法分別提取7個辣椒自 交系A5、 All、 B17、 B23、 B2、 B32及B19基因組DNA (鞏振輝等，以 PCR鑑定轉基因植株的微量DNA提取方法[J].西北農業大學學報，1997， 25 (1): 45-47)。
3、 以步驟1所述核苷酸分子為引物，分別對上述7個辣椒自交系基因 組DNA進行PCR擴增，7個辣椒自交系均可擴增出長度為590 bp的片段(圖 1為7個辣椒自交系PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNAMarker;1: A5; 2: All; 3: B17; 4: B23; 5: B2; 6: B32; 7: B19)。 PCR擴增 體系如下
(1) 反應液體積為25pL，所用物品的組成及含量為
10倍PCR buffer 2.5 fiL, 25 mmol.L.1 MgCl2 2.0 pL， 5 U.nL-1 &《DNA 聚合酶0.2 ^L， 5 mmol.U1 dNTPs 1.0 ^L， 20拜ol.L-1正向引物1.0 j^L， 20 pmoH/下遊引物I.OmL，基因組DNA1.0pL (50ng^L")， ddH20 16.3 pL。
(2) PCR擴增反應條件為
PCR擴增反應在PCR儀上進行，反應條件為94 。C預變性5min; 94 °C 變性1 min， 58 "C退火1 min， 72 。C延伸1 min,進行35個循環；最後72 °C 延伸10 min。隨後於4 'C保存備用。
4、 PCR擴增產物在37 。C條件下經Scg I酶切16 h後，酶切產物經2 % 瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察並拍照記錄(圖2 為7個辣椒自交系PCR擴增產物酶切產物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNA Marker; 1: A5; 2: All; 3: B17; 4: B23; 5: B2; 6: B32; 7: B19)。 結果表明，辣椒自交系A5、 All、 B17、 B23、 B32及B19酶切產物均有325 bp和265 bp兩條譜帶，鑑別為抗疫病材料；而辣椒自交系B2隻有590bp 一條譜帶，鑑別為感疫病材料。
採用灌根接種法(易圖永等，辣椒疫病三種接種方法的比較[J].中國蔬 菜，2003 (2): 16~18)對辣椒自交系對疫病抗病性鑑定結果表明辣椒自 交系A5、 All、 B17、 B23、 B32及B19為抗疫病自交系，辣椒自交系B2 為感疫病自交系。因此，利用本發明創製的鑑別辣椒抗疫病特性的分子標記 與植株真實抗性相一致，適用於抗疫病分子標記輔助育種。 實施例2:
1、人工設計合成的核苷酸序列作為引物
正向引物5 ， - AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA國3 ，
8反向弓I物5,- CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC -3'
2、 辣椒基因組DNA的提取採用改良SDS方法分別提取7個辣椒自 交系B3、 Pll、 B4、 P30、 B12、 P97和P45基因組DNA。
3、 以步驟1所述核苷酸分子為引物，分別對上述7個辣椒自交系基因 組DNA進行PCR擴增，7個辣椒自交系均可擴增出長度為590 bp的片段(圖 3為7個辣椒自交系PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNAMarker;
1: B3; 2: Pll; 3: B4; 4: P30; 5: B12; 6: P97; 7: P45)。 PCR擴增 體系如下
(1) 反應液的體積為25pL，所用物品的組成及含量為
10倍PCR buffer 2.5 pL， 25 mmol丄-1 MgCl2 2,0 ^L， 5 U.pL-1 DNA 聚合酶0.2 |xL， 5 mmol.L" dNTPs 1.0 ^L， 20拜ol.L-1正向引物1.0 ^L， 20 limol'L-1下遊引物1.0 mL，基因組dna 1.0 (50 ng^！/1)， ddH20 16.3 pL。
(2) PCR擴增反應條件為
PCR擴增反應在PCR儀上進行，反應條件為94 。C預變性5 min; 94 °C 變性1 min， 58 'C退火1 min， 72 'C延伸1 min，進行35個循環；最後72 °C 延伸10min。隨後於4'C保存備用。
4、 PCR擴增產物在37。C條件下經萬cgl酶切16h後，酶切產物經2% 瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察並拍照記錄(圖4 為7個辣椒自交系PCR擴增產物酶切產物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNA Marker; 1: B3; 2: Pll; 3: B4; 4: P30; 5: B12; 6: P97; 7: P45丄 結果表明，辣椒自交系Pl 1 、 P30、 P97及P45酶切產物均有325 bp和265 bp 兩條譜帶，鑑別為抗疫病材料；而辣椒自交系B3、 B4和B12隻有590bp 一條譜帶，鑑別為感疫病材料。
採用灌根接種法(易圖永等，辣椒疫病三種接種方法的比較[J].中國蔬 菜，2003 (2): 16~18)對辣椒自交系對疫病抗病性鑑定結果表明辣椒自交系Pll、 P30、 P97及P45為抗疫病自交系，辣椒自交系B3、 B4和B12 為感疫病自交系。因此，利用本發明創製的鑑別辣椒抗疫病特性的分子標記 與植株真實抗性相一致，適用於抗疫病分子標記輔助育種。
權利要求
1、一種鑑別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，其特徵在於，包括以下步驟1)人工設計合成一對核苷酸序列作為引物，該引物是由鹼基組成的特定序列的寡聚體，其中正向引物5』-AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA-3』反向引物5』-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3』2)提取辣椒基因組的DNA，以引物對辣椒基因組DNA進行PCR擴增，抗疫病材料和感疫病材料均可擴增出長度為590bp的片段；3)PCR擴增產物在37℃條件下經Bcg I酶切16h後，Bcg I酶的酶切位點為抗疫病品種克隆的基因序列第324bp處；酶切產物經2％瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察並拍照記錄，抗疫病植株酶切產物有325bp和265bp兩條譜帶，感疫病植株只有590bp一條譜帶。
2、 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)的PCR擴 增反應包括(1) 25 PCR反應體系，包括10倍PCR buffer 2.5 pL， 25 mmol'L-1 MgCl2 2.0 ^L， 5 U.pL-1 7hg DNA聚合酶0.2 ^L， 5 mmol.L" dNTPs 1.0 pL， 20pmol丄"正向引物1.0nL， 20pmol'L"反向引物1.0jiL，基因組DNAl.O j^L， ddH20 16.3 kiL;(2) PCR擴增反應在PCR儀上進行，反應條件為94。C預變性5min; 94 。C變性1 min， 58 'C退火1 min， 72 'C延伸1 min，進行35個循環；最後 72'C延伸10min，隨後於4'C保存備用。
全文摘要
本發明公開了一種鑑別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，包括辣椒基因組DNA的提取、PCR擴增及特異酶切產物多態性分析，其特徵在於根據植物抗病基因序列人工合成一對由一定數量的鹼基組成特定序列的核苷酸分子，以此對核苷酸分子為引物，通過PCR反應得到分子標記，利用此標記中的特異酶切產物的大小能鑑別出辣椒抗疫病材料和感疫病材料。這一方法用於辣椒苗期或成株期抗疫病性篩選，能極大地加速辣椒抗疫病育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK101487048SQ20091002096
公開日2009年7月22日 申請日期2009年1月19日 優先權日2009年1月19日
發明者鞏振輝, 李大偉, 賈慶利, 逯明輝, 陳儒鋼, 煒 黃 申請人:西北農林科技大學