一種檢測人β幹擾素的生物傳感器及其專用多肽的製作方法

2024-04-05 14:01:05 2

專利名稱：一種檢測人β幹擾素的生物傳感器及其專用多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測人j3幹擾素的生物傳感器及其專用多肽。
技術背景人卩幹擾素(hIFN-p)是一種由166個胺基酸組成的分子量為20kD的糖蛋白， 體內主要由病毒和雙股RNA誘導成纖維細胞後分泌產生，也可通過原核或真核細胞 培養表達產生。作為一種生物工程產品，hIFN-p屬於I型幹擾素，具有廣譜的抗病毒、 抗腫瘤及免疫調節作用，臨床上主要用於多發性硬化症、B型肝炎、C型肝炎及多種 腫瘤的治療。目前，檢測人(3幹擾素的方法主要有抗病毒活性檢測法、紫外分光光度 法、等電聚焦法、SDS-PAGE、 HPLC法[劉長暖，張翊，饒春明，林建偉，高凱，張 明芳，王軍志重組人千擾素-p製品的質量標準研究，中國腫瘤生物治療雜誌，2003, 7(3)， 212-215]和酶聯免疫吸附測定法(ELISA) [Staehelin, T.， Stahli, C., Hobbs, D.S., and Pestka, S. "A Rapid Quantitative Assay of High Sensitivity for Human Leukocyte Interferon with Monoclonal Antibodies" in Methods in Enzymology, Vol. 79 (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York, 1981， 589-595.]等。生物傳感器系根據生物化學和電化學原理，將生化反應的信號轉化為光或電信號 並通過對光、電信號的加工、處理而監測或測量生化反應或參與生化反應的物質的種 類或濃度的器件。生物傳感器一般由識別元件和換能器構成。識別元件用於識別和感 知被測目標及其發生的生化反應的信號，是生物傳感器進行選擇性測定的基礎；換能 器則執行信號轉換的功能。目前，發展較為成熟的生物傳感器主要包括表面等離子體 共振(SPR)、石英晶體微天平(QCM)和電化學傳感器等。QCM石英晶體振蕩頻 率的改變和SPR共振角或頻率移動的改變正比於被吸附物質的質量變化。基於QCM 和SPR的生物傳感器具有設備簡單、操作方便、樣品無須標記等特點，既可進行濃度 測定，又可進行動態、實時的相互作用分析，近年來已被廣泛應用於多種生物學體系 的分析與測定。通常的免疫傳感器系基於抗原與抗體分子間的特異性識別作用而構建的，具有良 好的生物專一性和很高的檢測靈敏度。但是，傳感元件是固定在傳感晶片表面的抗原 或抗體分子，而大多數蛋白質如抗原或抗體對環境非常敏感，其固定化過程和隨後的 保存條件很可能引起其生物活性的下降乃至變性失活。此外，大多數蛋白質如抗原或者抗體製備十分困難，且價格昂貴。因此，發展具有較高親和力和較強生物專一性， 但又性能穩定、來源方便的小分子識別元件是免疫傳感器的一個新的研究熱點。發明內容本發明的目的是提供一種檢測人(3幹擾素的生物傳感器及其專用多肽。 本發明的檢測人(3幹擾素的生物傳感器，包括識別元件和換能器，其中，識別元 件為至少含有SEQ Nal胺基酸序列的多肽或其衍生物。在本發明中，多肽中的胺基酸殘基為可以是L一型，也可是D —型，或L一、 D 一型混合型；並且，多肽的氨端基、羧端基或其側鏈基團可以是該基團的原形，或其 醚型、酯型、醯胺型衍生物。優選的，識別元件為序列如SEQ Nq2或SEQ他3胺基酸 序列的多肽。在本發明生物傳感器中，識別元件在換能器上的負載量為2.0xl0" — 5.0x10-12 mol/mm2。在上述生物傳感器中，常用換能器為鍍金的石英晶片。識別元件與石英晶片之間以式I結構的連接子連接OH 0H—S—CH2—CH2—S—CH2—CH-—CH2—0^(CH2iO—CH2—CH—CH2—NH— (式I) 本發明生物傳感器的製備方法，包括如下步驟-1 )基片修飾:通過1,2-乙二硫醇在晶片金電極表面的自組裝使電極表面帶上巰基； 在弱鹼性條件下令巰基與雙環氧1,4-丁二醇二縮水甘油醚反應，得到修飾的晶片；2)連接識別元件SEQNa2或SEQNs3胺基酸序列的多肽溶液加入到修飾的晶片 上，通過氨基與晶片上環氧基團的反應，連接識別元件到晶片上，得到生物傳感器。優選的，步驟l)按如下過程進行將雙面鍍金的石英晶片表面清洗後，浸入乙二硫醇的乙醇溶液中，再浸入l，4-丁 二醇二縮水甘油醚和pH 9.5的Na2C03緩衝液組成的混合溶液中，反應後用水衝洗， 得到修飾的晶片。步驟2)按如下過程進行將SEQ Ns2或SEQ Na3胺基酸序列的多肽溶液滴加於已修飾的晶片電極表面，反 應後將晶片浸入乙醇胺-HCl水溶液中封閉殘餘的環氧基，得到所述生物傳感器。製備過程中，為了控制多肽的負載量，在進行連接前後均測定其共振頻率，根據 Sauerbray方程計算結合物質的量。對於10MHz的石英晶片，l略的質量負載約產生 457Hz的頻率改變。 一般可控制多肽的負載量為2.0 — 5.0xl0—12mol/mm2。該生物傳感器與人p幹擾素有特異性吸附作用，能安裝於石英晶體微天平(QCM)中用於檢測人P幹擾素；或以相同連接方法製備傳感晶片用於表面等離子體共振儀(SPR)檢測人(5幹擾素。本發明所提供的胺基酸序列如SEQ N"的多肽，也屬於本發明的保護範圍。本發明設計、合成出與人卩幹擾素具有特異性相互作用的反義肽，並將其製備為 生物傳感器，進而實現對人(3幹擾素的檢測。本發明生物傳感器對人卩幹擾素均顯示 出明顯的專一性結合，具有良好的選擇性；信號響應與人P幹擾素的進樣量呈線性關 系，重現性好，可用於人(3幹擾素的定量檢測。


圖1為三種修飾晶片的金電極表面結構示意圖；圖2為不同蛋白質在空白晶片上的非特異吸附作用；圖3為不同蛋白質與反義肽修飾晶片的相互作用；圖4為人P幹擾素在三種修飾晶片上的結合與再生傳感曲線；圖5為不同濃度的人P幹擾素在固定化AS-IFN 1晶片上的傳感曲線； 圖6為不同濃度的人P幹擾素在固定化AS-IFN 3晶片上的傳感曲線。
具體實施方式
在生物學上，遺傳密碼具有簡併性，也就是說，在大多數情況下一個胺基酸可能 具有兩個或者更多的密碼子，這就意味著正義肽鏈上的某一個胺基酸殘基有可能與一 組不同的反義胺基酸殘基相配對。因此， 一條給定的正義肽可能對應多條反義肽，並 具有不同的相互作用，我們將這一現象稱之為反義肽的簡併性。基於此，針對人p幹 擾素1-14位多肽片段上的亮氨酸殘基，設計了此多肽的二條簡併反義肽，分別命名為 AS-IFN 1和AS-IFN 3 (表l)。考察了它們與人卩幹擾素1-14位多肽，即正義肽之 間相互作用的強度，與直讀反義肽AS-IFN 1相比，經簡併胺基酸取代的反義肽3與正 義肽的親和作用力有大幅提高。在此基礎上，以人p幹擾素(hlFN-(3)的反義肽為識 別元件，構建了一種生物傳感器，用於測定人p幹擾素。表l人P幹擾素的正、反義肽序列正義肽序列反義肽序列(AS-IFN)HOOC-H-A-V-V-Q-K-S-E-Q-L-S-A-A-I-NH2NH2-M-S-Y-N-L-L-G-F-L-Q-R-S-S-N-COOH(AS-IFN 1—SEQ Na2)HOOC-H-A-V-V-E-K-S-E-E-L-S-A-A-l-NH2 (AS-IFN3-SEQ N23)上述兩種反義肽AS-IFN1和AS-IFN3可以按照多肽固相合成方法進行合成(W.C. Chan, P.D. White, "FMOC Solid phase Peptide Synthesis". Oxford University Press, 2000)。該生物傳感器的製備按如下方法進行通過1，2-乙二硫醇在晶片金電極表面的自組裝使電極表面帶上巰基；在弱鹼性條 件下令巰基與雙環氧1，4-丁二醇二縮水甘油醚反應，金電極表面即為環氧基團所修飾； 小分子識別元件反義肽AS-IFN 1或AS-IFN3即可通過其氨基與環氧基團的反應修飾 到金電極的表面，即得到生物傳感器，其結構如圖l所示，圖中(a) AS-IFN 1固定 化晶片；(b) AS-IFN3固定化晶片；(c)空白晶片。為了控制多肽的負載量，在固定前後均測定其共振頻率，根據Sauerbray方程計 算結合物質的量。對於10MHz的石英晶片，l嗎的質量負載約產生457Hz的頻率改 變。 一般可控制多肽的負載量為2.0xl0—12 —5.0x10—12mol/mm2。用橡膠密封圈將生物傳感器固定在石英晶體微天平一流動注射分析系統(QCM — FIA)或SPR的流通池中，通過進樣閥注入不同濃度的蛋白溶液，記錄振蕩頻率或折射 率隨時間的變化即傳感譜，以進行人P幹擾素的測定。利用專用軟體，可記錄並計算 人(3幹擾素與固定化反義肽的動態相互作用參數。所製備的固定化AS-IFN 1和固定化AS-IFN 3兩種QCM免疫傳感器，在0.12 mg/mL至0.96 mg/mL的範圍內，振蕩頻率下降值均與人P幹擾素的進樣量呈現出良 好的線性關係，重現性好，可用於人(3幹擾素的定量檢測。所製備的固定化AS-IFN 1和固定化AS-IFN 3兩種QCM免疫傳感器，對非相關 蛋白牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)及雞卵白蛋白(CEA)沒有非特 異性吸附，但對人p幹擾素均顯示出明顯的專一性結合，具有良好的選擇性。所製備的固定化AS-IFN 1和固定化AS-IFN 3兩種QCM生物傳感器，它們與人 (3幹擾素的親和作用力表現出明顯的差異，其頻率下降分別為150Hz和300 Hz。利用所製備的固定化AS-IFN 1和固定化AS-IFN 3兩種QCM免疫傳感器，可在 QCM—FIA系統中測定人p幹擾素與固定化反義肽的相互作用。經測定可知，人卩幹 擾素與固定化AS-IFN 3的親和作用力比直讀反義肽AS-IFN 1提高了 15倍。以下以具體的實施例來說明本發明。 實施例1、生物傳感器的製備取10MHzAT切壓電石英晶片，直徑12.0 mm，雙面鍍金電極，電極直徑6.0mm。 以Piranha溶液(濃硫酸:30%11202-3:1， v/v)處理，然後分別用乙醇、三蒸水仔細洗淨、 吹乾備用。清潔晶片浸入5%乙二硫醇的乙醇溶液中，避光靜置2小時後，用乙醇和 三蒸水洗淨，再浸入由1 mL 1,4-丁二醇二縮水甘油醚和4 mL pH 9.5的0.1 mol/L Na2C03緩衝液組成的混合溶液中，4(TC反應4小時後停止反應，用水衝洗，得到修飾 的晶片。將反義肽AS-IFN1溶於pH 10.0的緩衝液中製成2mg/ml的溶液，用微量注 射器滴加於已修飾的晶片電極表面，4"C反應20小時。最後，將晶片浸入1.0 mol/L 乙醇胺.HC1水溶液中30 min，以封閉殘餘的環氧基，即製得以反義肽AS-IFN 1為配 基的人P幹擾素生物傳感器。若以反義肽AS-IFN 3取代AS-IFN 1進行上述步驟，則 可製得以反義肽AS-IFN 3為配基的人(3幹擾素生物傳感器。若採用上述處理步驟但 不加反義肽，則可製備空白晶片。用O形橡膠密封圈將生物傳感器固定在QCM流通池中，以固定了反義肽的一面 接觸溶液另一面置於氣相。流動相為20mmol/L的磷酸鹽緩衝液，pH7.4，流速為30 —90 iiL/min。以六通進樣闊注入100 不同濃度的蛋白溶液，記錄傳感譜。根據 Sauerbray方程計算可知，l(ig質量負載導致了約457Hz的頻率改變。以反義肽AS-IFN1 和AS-IFN 3為配基的人P幹擾素生物傳感器在完成反義肽的偶聯之後，頻率降低分 別為69.6 Hz和44.2 Hz (n=5)，據此計算出金電極表面固定反義肽的量分別為 3.64x10—12mol/mm2 (AS-IFN 1)和2.31xl0"2 mol/mm2 (AS-IFN3)。 一次測定後， 晶片以甘氨酸鹽酸鹽溶液(100mmol/L， pH20)再生，並進行後續測定。實施例2、生物傳感器的特異性實驗用O形橡膠密封圈將空白晶片固定在QCM流通池中，以修飾的一面接觸溶液另 一面置於氣相。流動相為20mmol/L的磷酸鹽緩衝液，pH7.4，流速為30—90 piL/min。 以六通進樣閥分別注入100(iL不同濃度的人(3幹擾素、牛血清白蛋白(BSA)、人血 清白蛋白(HSA)及雞卵白蛋白(CEA)蛋白溶液，記錄傳感譜，如圖2所示(流動 相20mmol/L磷酸鹽緩衝液(pH7.4) ，流速60 ^iL/miri;蛋白濃度1.0mg/mL; 進樣量100 pL)。結果表明，人P幹擾素及其它3種蛋白在空白晶片上均無非特異 性吸附作用。用O形橡膠密封圈將以AS-IFN 1和AS-IFN3為配基的人卩幹擾素生物傳感器固定在QCM流通池中，以固定了反義肽的一面接觸溶液另一面置於氣相。流動相為20 mmol/L的磷酸鹽緩衝液，pH7.4，流速為30—90 ^L/min。以六通進樣閥分別注入100 pL不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)及雞卵白蛋白(CEA) 蛋白溶液，記錄傳感譜，如圖3所示，圖中(a) AS-IFN 1修飾的晶片；(b) AS-IFN 3修飾的晶片。結果表明，它們在以AS-IFN 1和AS-IFN 3為配基的人p幹擾素生物 傳感器上均未表現出明顯的頻率變化。用O形橡膠密封圈將以AS-IFN 1和AS-IFN 3為配基的人|3幹擾素生物傳感器固 定在QCM流通池中，以固定了反義肽的一面接觸溶液另一面置於氣相。流動相為20 mmol/L的磷酸鹽緩衝液，pH7.4，流速為30—90 pL/min。以六通進樣閥分別注入100 ^L不同濃度人p幹擾素溶液，記錄傳感譜，如圖4所示，圖中，(a)空白晶片；(b) AS-IFN 1修飾的晶片；(c) AS-IFN 3修飾的晶片；蛋白溶液0.96mg/mL;進樣量 100 ^L;流速:60pL/min。結果表明，人卩幹擾素並不會引起空白晶片的頻率變化，AS-IFN 1修飾的晶片頻率下降了約150 Hz; AS-IFN3修飾的晶片頻率下降了約300 Hz。以上結果表明，以AS-IFN 1和AS-IFN 3為配基的人p幹擾素生物傳感器與人卩 幹擾素之間有特異性的相互作用，其他蛋白不會干擾該生物傳感器對人P幹擾素的測 定。實施例3、用O形橡膠密封圈將以AS-IFN 1和AS-IFN 3為配基的人P幹擾素生物傳感器固 定在QCM流通池中，以固定了反義肽的一面接觸溶液另一面置於氣相。流動相為20 mmol/L的磷酸鹽緩衝液，pH7.4，流速為30—90 jiL/min。以六通進樣閥分別注入100 不同濃度人P幹擾素溶液，考察了人(3幹擾素在反義肽AS-IFN 1及AS-IFN 3修飾 的晶片上濃度與頻率響應的關係。在0.12 mg/mL至0.96 mg/mL的濃度範圍內，人P 幹擾素的濃度(X)與AS-IFN 1及AS-IFN 3修飾晶片上的頻率響應值(Y)之間表現 出良好的線性關係，Y=228.54X+7.545， r=0.994 (AS-IFN 1); Y=380.52X+19.453， r=0.9897 (AS-IFN 3);可據此標準曲線進行人卩幹擾素的定量分析。實施例4、用O形橡膠密封圈將以AS-IFN 1和AS-IFN 3為配基的人卩幹擾素生物傳感器固 定在QCM流通池中，以固定了反義肽的一面接觸溶液另一面置於氣相。流動相為20mmol/L的磷酸鹽緩衝液，pH7.4，流速為30—90 pL/min。以六通進樣閥分別注入100 pL不同濃度人p幹擾素溶液，考察了不同濃度(0.12、 0.24、 0..48禾口 0.96mg/mL)的 人(3幹擾素在反義肽AS-IFN 1及AS-IFN 3修飾晶片上的結合過程，如圖5及圖6所 示。通過計算可以得出，人(3幹擾素與AS-IFN1的平衡解離常數為(1.89土0.101)x10—4 mol/L;與AS-IFN 3的平衡解離常數為(1.22±0.0479) xl(r5mol/L。<160〉 3 1〈211〉 14<212〉 PRT〈213〉 1misc-feature (6, 10) 〈223〉Xaa= Gin或Glu 1lie Ala Ala Ser Leu Xaa Glu Ser Lys Xaa Val Val Ala His 1 5 10<210〉 2 14〈212〉 PRT <213〉人工序列<220〉 <223〉<400〉 2lie Ala Ala Ser Leu Gin Glu Ser Lys Gin Val Val Ala His 1 5 10 3<211〉 14〈212〉 PRT 人工序列 <223〉〈400〉 3lie Ala Ala Ser Leu Glu Glu Ser Lys Glu Val Val Ala His 1 5 10
權利要求
1. 一種檢測人β幹擾素的生物傳感器，包括識別元件和換能器，其特徵在於所述識別元件為至少含有SEQ №1胺基酸序列的多肽或其衍生物。
2、 根據權利要求1所述的生物傳感器，其特徵在於所述識別元件在換能器上的負載量為2.0xl(T12—5.0xlO'12mol /mm2。
3、 根據權利要求1或2所述的生物傳感器，其特徵在於所述識別元件為SEQ N2 2或SEQ Nq3胺基酸序列的多肽。
4、 根據權利要求1所述的生物傳感器，其特徵在於所述換能器為鍍金的石英曰曰斤o
5、 根據權利要求4所述的生物傳感器，其特徵在於所述識別元件與石英晶片之間以式I結構的連接子連接。OH OH-—S—CH2—CH2—S—CH2-CH—CH2—04CH2^0—CH2—CH—CH2—NH-— (式I)
6、 權利要求5所述生物傳感器的製備方法，包括如下步驟1) 晶片電極修飾通過1,2-乙二硫醇在晶片金電極表面的自組裝使電極表面帶上巰基；在弱鹼性條件下令巰基與雙環氧1，4-丁二醇二縮水甘油醚反應，得到修飾的晶 片；2) 連接識別元件SEQ他2或SEQNQ3胺基酸序列的多肽溶液加入到修飾的晶片 上，通過氨基與金電極上環氧基團的反應，連接識別元件到晶片上，得到所述生物傳 感器。
7、 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於步驟l)按如下過程進行 將雙面鍍金的石英晶片表面清洗後，浸入乙二硫醇的乙醇溶液中，再浸入l,4-丁二醇二縮水甘油醚和pH 9.5的Na2C03緩衝液組成的混合溶液中，反應後用水衝洗， 得到修飾的晶片。
8、 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於步驟2)按如下過程進行將SEQ Ns2或SEQ Na3胺基酸序列的多肽溶液滴加於已修飾的晶片電極表面，反 應後將晶片浸入乙醇胺'HCl水溶液中封閉殘餘的環氧基，得到所述生物傳感器。
9、 序列如SEQ N2l胺基酸序列的多肽。
全文摘要
本發明公開了一種檢測人β幹擾素的生物傳感器及其專用多肽。本發明所提供的多肽，其胺基酸序列如SEQ №1。本發明的檢測人β幹擾素的生物傳感器，包括識別元件和換能器，其中，識別元件為至少含有SEQ№1胺基酸序列的多肽或其衍生物。本發明設計、合成出與人β幹擾素具有特異性相互作用的反義肽，並將其製備為生物傳感器，進而實現對人β幹擾素的檢測。本發明生物傳感器對人β幹擾素均顯示出明顯的專一性結合，具有良好的選擇性；信號響應與人β幹擾素的進樣量呈線性關係，重現性好，可用於人β幹擾素的定量檢測。
文檔編號G01N33/68GK101221185SQ20071006266
公開日2008年7月16日 申請日期2007年1月12日 優先權日2007年1月12日
發明者劉國詮, 章群丹, 佳 羅, 睿 趙 申請人:中國科學院化學研究所