一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法
2024-04-05 00:17:05
專利名稱：一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法
技術領域：
本發明屬於作物育種和作物分子標記育種技術的領域，特別涉及一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法。
背景技術：
辣椒疫病(Phytophthora capsici L)是世界範圍內辣椒生產最嚴重的病害之一。辣椒疫病具有空氣傳染性和土壤傳染性兩種性質，但以土壤傳播為主，加之發病的突發性強，流行速度極快，因而藥劑防治和栽培防治措施效果不佳。培育抗疫病的辣椒品種是解決這一問題最經濟有效的途徑。國內外已用人工接種鑑定技術篩選出一些抗疫病的辣椒資源，但這些抗性資源的農藝性狀及品質性狀較差，不能直接作為育種材料來使用，需要將其優良抗性轉育到商業品種上。傳統的抗性轉育方法主要是雜交，這樣在導入抗病基因的同時不可避免地引入不良農藝性狀及品質性狀，育種實踐中急需建立一種更為有效的育種選擇方法。標記輔助選擇技術的建立與發展為解決這一問題提供了有效途徑。
國內外眾多的研究表明，辣椒抗疫病的遺傳呈現出「遺傳多樣性」的特點，即一些材料的抗性受單基因控制，一些為寡基因控制，另一些則受多基因控制。辣椒遺傳育種者依據所掌握的抗性資源的遺傳特性，選擇合適的育種技術來開展研究工作。
目前，法國INRA蔬菜育種研究所Lefebvre和Palloix(1996)以來自種內F1雜種Perennial(具水平抗病性、印度辣椒)X Yolo Wonder(感病、美國甜椒)的雙單倍體種為材料，研究表明，分布在幾個連鎖群或處於非連鎖狀態的13個QTL影響辣椒抗疫病性能；這些QTL的效應不同，有主效、中等效應、微效QTL(數量性狀位點)之分。朝鮮Kang等(1997)以近等基因係為材料，應用AFLP技術，發現有5個DNA(脫氧核糖核酸)片段僅出現在抗疫病材料的圖譜中。由此可知，Lefebvre和Palloix僅對具水平抗性的材料開展了研究，且研究結果尚不能應用於標記輔助選擇中；Kang等僅初步獲得了辣椒抗疫病基因的候選AFLP標記。
國外這方面的研究尚處於起始階段，且目前已有的這些研究尚不夠深入、系統。
發明內容
為了克服上述現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法，從而實現辣椒抗疫病育種中快速、有效地選擇出抗疫病材料的目的。上述分子標記輔助選擇方法還可在辣椒抗疫病育種中應用。
本發明在傳統的辣椒抗疫病育種分離世代(F2至F5世代或BC1至BC5世代)的選擇中，利用與辣椒抗疫病基因緊密連鎖的SCAR(SequencedCharacterized Amplified Regions，序列特徵化的擴增區域)標記的兩個引物對植株的DNA進行PCR(多聚酶鏈式反應)檢測，該兩個引物的序列為引物15′aaa gct gcg gat tta gac ct 3′；引物25′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′。PCR反應條件中復性溫度為56～58℃。採用瓊脂糖凝膠電泳技術分析PCR產物。從抗疫病的材料中均可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶，而從感病的材料則擴增不出這條520個鹼基對大小的DNA條帶。
本發明的目的通過下述技術方案實現一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法，包括如下步驟(1)將辣椒抗疫病育種分離世代材料的植株播種於25～30℃、相對溼度50～70％的溫室，正常管理，待幼苗長出5～6片真葉時，每個植株分別取1～2片幼葉，按照SDS方法提取基因組DNA。
(2)以上述DNA為模板，利用SCAR標記的兩條引物進行PCR擴增。所述SCAR標記的兩條引物分別為引物1和引物2，所述引物15′aaa gct gcggat tta gac ct 3′；引物25 ′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′。
(3)在56～58℃的退火溫度下，進行PCR擴增，將擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離，溴化乙錠(加溴化乙錠至終濃度500ng/mL)染色，在紫外燈下觀測PCR結果。
(4)如果可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶，說明該材料抗疫病；如果擴增不出這條520個鹼基對大小的DNA條帶，說明該材料對疫病表現感病。
為了更好地實現本發明，所述步驟(2)中PCR反應總體積為25微升，含有10m mol/L Tris-HCl(pH8.3)，50m mol/L KCl，1.5m mol/L MgCl2，0.01％gelitin，20ng基因組DNA，每個引物0.2～0.5u mol/L，0.5 U Taq DNAPolymerase(Taq DNA聚合酶)。
所述步驟(3)中PCR擴增反應參數為94℃變性1min，58℃復性1min，72℃延伸2min，35個循環；最後一個循環72℃延長10min。
所述分離世代為F2至F5世代或BC1至BC5世代。
本發明以來自印度尼西亞的抗疫病辣椒材料PBC 534為母本(P1)，以來自我國北方地區的對疫病表現感病的保加利亞尖椒為父本(P2)，將P1、P2及P1×P2、F2代材料播種於溫室，在5～6葉期接種，接種濃度為10000遊動孢子/ml，每株1.5ml。採用BSA(bulked segregant analysis，混合分組分析法)分析原理，採用RAPD技術(DNA隨機擴增多態性標記技術)，獲得了與辣椒抗疫病基因緊密連鎖的標記OPC11500，將該標記克隆，序列結果表明，該標記為522bp。根據該序列，設計了SCAR(Sequenced Characterized AmplifiedRegions，序列特徵化的擴增區域)標記的兩條引物序列分別為引物15′aaagct gcg gat tta gac ct 3′；引物25 ′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′，從而將該RAPD標記轉化為更為穩定的SCAR標記。
與現有辣椒抗疫病育種技術即人工苗期抗病性鑑定技術相比，本發明具有如下優點和有益效果(1)本發明可在試驗室對辣椒抗疫病基因進行直接檢測，不受環境條件的影響。
(2)利用本發明可對辣椒抗疫病育種分離世代中的單個植株在任何時期進行辣椒抗疫病性能檢測，且不影響其正常生長，而傳統方法難以達到。
(3)利用本發明進行辣椒抗疫病性能檢測，檢測迅速，可在1～2天內獲得檢測結果，而傳統方法需要40～50天。
(4)利用本發明進行辣椒抗疫病性能檢測，費用低，僅為10～20元/份材料，而傳統方法需要100～150元/份材料。
圖1為利用SCAR標記對12個BC1代株系的檢測圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1以優質、豐產、感疫病的來源於內蒙古的赤峰牛角椒為母本，以來自亞洲蔬菜發展研究中心的抗疫病材料PBC830為父本，獲得雜交組合F1，用優質、豐產、感疫病的材料赤峰牛角椒為輪迴親本進行回交，獲得回交世代BC1。在對辣椒抗疫病育種分離世代BC1進行選擇時(1)將該材料播種於25～30℃、相對溼度50～70％的溫室，待幼苗長出5～6片真葉時，每個植株分別取1～2片幼葉，按照王得元等(1998)(江西農業大學學報，1998，20(2)180-183)改進的SDS方法提取基因組DNA。
(2)以上述基因組DNA為模板，利用SCAR標記的兩條引物(引物15′aaa gct gcg gat tta gac ct 3′；引物25′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′)進行PCR擴增。
PCR反應總體積為25微升，含有10m mol/L Tris-HCl(pH8.3)，50m mol/LKC1，1.5m mol/L MgCl2，0.01％gelitin，20ng基因組DNA，每個引物0.2～0.5umol/L，0.5 U Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)。
(3)在58℃的退火溫度下，進行PCR擴增，反應參數為94℃變性1min，58℃復性1min，72℃延伸2min，35個循環；最後一個循環72℃延長10min。PCR擴增反應在PE公司生產的9700型PCR儀上進行。
(4)將上述擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離，溴化乙錠(加溴化乙錠至終濃度500ng/mL)染色。在紫外燈下觀測PCR結果。
(5)利用該SCAR標記對12 BC1代植株進行了PCR檢測，結果發現，抗疫病的材料中均可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶，而感病的材料按照王得元等(廣東農業科學，2001，(2)37-39)的方法進行苗期人工接種辣椒疫黴菌抗性鑑定後植株死亡，擴增不出這條520個鹼基對大小的DNA條帶；PCR檢測中，如圖1為利用SCAR標記對12個BC1代株系的檢測圖。其中M100bp DNA ladder(自上到下各條帶分子量分別為900、700、600、500、400、300bp)；湧道1～12代表12個單株，左邊湧道1～12為復性溫度58℃，右邊湧道1～11為復性溫度56℃。
(6)將抗病的單株種植到田間，正常管理，按單株採收種子。
(7)將種子播種於溫室中，按照上述(1)至(4)步驟進行操作，選擇可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶的植株和不能擴增出這條520個鹼基對大小的DNA條帶的植株，進行種植，正常管理，按單株採收種子。
(8)將可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶的單株的種子和不能擴增出這條520個鹼基對大小的DNA條帶的單株的種子播種於溫室，按照王得元等(廣東農業科學，2001，(2)37-39)的方法進行苗期人工接種辣椒疫黴菌抗性鑑定。結果發現，可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶的株系的發病率為5％，表現為抗病；而不能擴增出這條520個鹼基對大小的DNA條帶的株系的發病率為90％，表現為感病。
將抗病的辣椒株系種植到田間，以進行品質、豐產等其他重要性狀的選擇。這樣減少了人力、物力和土地。
實施例2以優質、豐產、感疫病的來源於我國北方地區的保加利亞尖椒為母本，以來自印度尼西亞的抗疫病辣椒材料PBC 534為父本，獲得雜交組合F1，F1自交獲得世代F2。在對辣椒抗疫病育種分離世代F2進行選擇時(1)將該材料播種於25～30℃、相對溼度50～70％的溫室，待幼苗長出5～6片真葉時，每個植株分別取1～2片幼葉，按照王得元等(1998)(江西農業大學學報，1998，20(2)180-183)改進的SDS方法提取基因組DNA。
(2)以上述基因組DNA為模板，利用SCAR標記的兩條引物(引物15′aaa gct gcg gat tta gac ct 3′；引物25′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′)進行PCR擴增。
PCR反應總體積為25微升，含有10m mol/L Tris-HCl(pH8.3)，50m mol/LKC1，1.5m mol/L MgCl2，0.01％gelitin，20ng基因組DNA，每個引物0.2～0.5u mol/L，0.5 U Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)。
(3)在58℃的退火溫度下，進行PCR擴增，反應參數為94℃變性1min，58℃復性1min，72℃延伸2min，35個循環；最後一個循環72℃延長10min。PCR擴增反應在PE公司生產的9700型PCR儀上進行。
(4)將上述擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離，溴化乙錠(加溴化乙錠至終濃度500ng/mL)染色。在紫外燈下觀測PCR結果。
(5)利用該SCAR標記對F2代植株進行了PCR檢測，結果發現，抗疫病的材料中均可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶，而感病的材料按照王得元等(廣東農業科學，2001，(2)37-39)的方法進行苗期人工接種辣椒疫黴菌抗性鑑定後植株死亡，擴增不出這條520個鹼基對大小的DNA條帶。
(6)將抗病的單株種植到田間，正常管理，按單株採收種子，獲得F3世代。
(7)將種子播種於溫室中，按照上述(1)至(4)步驟進行操作，選擇可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶的植株和不能擴增出這條520個鹼基對大小的DNA條帶的植株，進行種植，正常管理，按單株採收種子。
(8)將可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶的單株的種子和不能擴增出這條520個鹼基對大小的DNA條帶的單株的種子播種於溫室，按照王得元等(廣東農業科學，2001，(2)37-39)的方法進行苗期人工接種辣椒疫黴菌抗性鑑定。結果發現，可擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶的株系的發病率為8％，表現為抗病；而不能擴增出這條520個鹼基對大小的DNA條帶的株系的發病率為85％，表現為感病。
將抗病的辣椒株系種植到田間，以進行品質、豐產等其他重要性狀的選擇。這樣減少了人力、物力和土地。
利用本發明進行辣椒抗疫病標記輔助選擇，從DNA提取到檢測結果出來需要1～2天，花費較低。
SEQUENCE LISTING110廣東省農業科學院蔬菜研究所120一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法130261602170PatentIn version 3.2210121120212DNA213Artificial sequence220
223利用SCAR標記的引物14001aaagctgcgg atttagacct 20210221119212DNA213Artificial sequence220
223利用SCAR標記的引物24002aaagctgcgg ttgaatcgg 19
權利要求
1.一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法，其特徵在於包括如下步驟(1)將辣椒抗疫病育種分離世代材料的植株播種於25～30℃、相對溼度50～70％的溫室，待幼苗長出5～6片真葉時，每個植株分別取1～2片幼葉，按照SDS方法提取基因組DNA；(2)以上述DNA為模板，利用SCAR標記的兩條引物進行PCR擴增，所述SCAR標記的兩條引物分別為引物1和引物2，引物15′aaa gct gcg gat tta gac ct 3′；引物25′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′；(3)在56～58℃的退火溫度下，進行PCR擴增，將擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀測PCR結果；(4)如果擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶，說明該材料抗疫病；如果擴增不出這條520個鹼基對大小的DNA條帶，說明該材料對疫病表現感病。
2.根據權利要求1所述的一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法，其特徵在於所述步驟(2)中PCR反應總體積為25微升，含有10mmol/LTris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.01％ gelitin，20ng基因組DNA，每個引物0.2～0.5umol/L，0.5U Taq DNA聚合酶。
3.根據權利要求1所述的一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法，其特徵在於所述步驟(3)中PCR擴增反應參數為94℃變性1min，58℃復性1min，72℃延伸2min，35個循環；最後一個循環72℃延長10min。
4.根據權利要求1所述的一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法，其特徵在於所述分離世代為F2至F5世代或BC1至BC5世代。
全文摘要
本發明公開了一種辣椒抗疫病育種的分子標記輔助選擇方法。該方法是將辣椒抗疫病育種分離世代材料的植株播種於溫室，待幼苗長出5～6片真葉時，每個植株分別取1～2片幼葉，提取DNA。以DNA為模板，利用SCAR標記的兩條引物進行PCR擴增。在56～58℃的退火溫度下，進行PCR擴增，擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離，溴化乙錠染色，觀測PCR結果。如果擴增出一條520個鹼基對大小的DNA條帶，說明該材料抗疫病；如果擴增不出這條520個鹼基對大小的DNA條帶，說明該材料對疫病表現感病。本發明可對辣椒抗疫病育種分離世代中的單個植株在任何時期進行辣椒抗疫病性能檢測且不影響其正常生長；檢測迅速，費用低。
文檔編號C12P19/00GK1970790SQ200610123860
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月29日 優先權日2006年11月29日
發明者王得元, 安康, 李穎, 王恆明 申請人:廣東省農業科學院蔬菜研究所