口腔內疾病的預防、改善或治療劑的製作方法

2023-12-12 00:18:02 1

專利名稱：口腔內疾病的預防、改善或治療劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種齲齒或牙周炎等口腔內疾病的預防、改善或治療劑。
背景技術：
口腔內微生物群由400 500種微生物構成。因此，口腔內存在齲齒菌、牙周病菌及念珠菌等各種病原微生物，引發齲齒病、牙周疾病、舌炎、鵝口瘡、口腔念珠菌病等各種疾病。此外，據報導，最近有研究發現，念珠菌也與牙周病有關。因此，迄今，已有多項關於添加有抗菌物質的口腔用組合物的技術方案提出。但是，即使向口腔內投入抗菌劑，抗菌劑會在短時間內被唾液、食物衝走，其效果只能說是一過性的。此外，近年來，鑑於乳酸菌在大腸內抑制各種疾病的原因菌，人們研究將該方法應用到牙科疾病中。例如，有報告指出，唾液乳酸桿菌(專利文獻1、專利文獻幻、羅伊氏乳酸桿菌(專利文獻3、專利文獻4)、副乾酪乳桿菌(專利文獻幻、德氏乳酸桿菌(專利文獻6)、 發酵乳酸桿菌(非專利文獻1)等乳酸菌對齲齒、牙周病的預防有效。然而，即使是對齲齒菌、牙周病菌顯示出抗菌力的乳酸菌，也存在抗菌譜窄，發酵能力不充分、從而不能得到良好的發酵物，得不到風味良好、嗜好性優異的發酵物的問題。專利文獻專利文獻1 :W02002/016554專利文獻2 :W02003/082027專利文獻3 特開2003-299480號公報專利文獻4 特開2008-502360號公報專利文獻5 特開2008-37859號公報專利文獻6 特開2008-237198號公報非專利文獻專利文獻1 三村純代、二川浩樹、牧平清超、檜山AYA，高本祐子，日本齒科技工學會志，第四卷特別號，298 (2008)

發明內容
本發明涉及提供一種對口腔內疾病的原因菌的抗菌譜廣，能製造風味良好、嗜好性優異的發酵物的新型乳酸菌株，以及用其製成的食品、口腔內疾病的預防、改善或治療劑。本發明者對口腔內微生物進行了深入的研究，結果發現，存在於唾液中的屬於鼠李糖乳桿菌、乾酪乳桿菌及副乾酪乳桿菌的特定乳酸菌株對齲齒菌、牙周病菌及念珠菌均有優異的抗菌力，且用其可以製造出嗜好性優異的發酵物。SP，本發明涉及以下1) 8)。1. 口腔內疾病的預防、改善或治療劑，其以選自鼠李糖乳桿菌(LactcAacillusrhamnosus)K03 菌株(NITE BP-771)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YU3 菌株(NITE BP-772)及副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) YU4 菌株(NITE BP-775)中的 1 種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物為有效成分。2.食品，其含有選自鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)K03菌株(NITE BP-771)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YU3 菌株(NITE BP-772)及副乾酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei)YU4菌株(NITE BP-775)中的1種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物。3.上述2的食品，其為發酵乳或發酵飲料。4.齲齒菌、牙周病菌和念珠菌的增殖抑制劑，其以選自鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)K03菌株(NITE BP—771)、幹酷乳桿菌(Lactobacillus casei) YU3 菌株(NITE BP-772)及副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)YU4 菌株(NITE BP-775)中的1種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物為有效成分。5. 4所述的齲齒菌、牙周病菌和念珠菌的增殖抑制劑，其中，所述齲齒菌、牙周病菌和念珠菌至少為變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、遠緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus)、告艮口卜單 Ifi lif (Porphyromonas gingivalis)及 S fe 3 lif (Candida albicans)。6.保藏在獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心的保藏號為 NITE BP-771 的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)K03菌株、保藏號為NITE BP-772 的乾酪乳桿菌(LactcAacillus casei) YU3菌株及保藏號為NITE BP-775的副乾酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei) YU4 菌株。7.乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物，其用作口腔內疾病的預防、改善或治療劑，所述乳酸菌選自鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)K03菌株(NITE BP-771)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YU3 菌株(NITE BP-772)及副乾酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌株(NITE BP-775)中的 1 種以上。8. 口腔內疾病的預防、改善或治療方法，其包括給予或攝取選自鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)K03菌株(NITE BP-771)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei) YU3 菌株(NITE BP-772)及副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)YU4 菌株(NITE BP-775)中的1種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物。根據本發明，可提供一種能發揮預防、改善或治療齲齒病、牙周疾病、舌炎、鵝口瘡、口腔念珠菌等各種口腔內疾病效果的嗜好性高的食品、藥品、口腔內組合物等。


圖Ia是顯示對Mi^ptococcus mutans的生長抑制效果的圖表。圖Ib是顯示對Mi^ptococcus mutans的生長抑制效果的圖表。圖2是顯示對Mi^ptococcus sobrinus的生長抑制效果的圖表。圖3a是顯示對Porphyromonas gingivalis的生長抑制效果的圖表。圖3b是顯示對Porphyromonas gingivalis的生長抑制效果的圖表。圖如是顯示對Candida albicans的生長抑制效果的圖表。圖4b是顯示對Candida albicans的生長抑制效果的圖表。
圖5是顯示對Candida albicans的生物膜形成抑制效果的圖表。圖6是顯示對味道的評價結果(視覺模擬評分(VAS)法)的圖表。圖7是顯示酸奶的抗菌作用的圖表。(A) S. mutans ingbritt菌株、⑶ S. sobirinus B13 菌株圖8a是顯示人口腔內的齲齒菌及牙周病菌的菌數減少效果的圖表。(A)齲齒菌， (B) :P. intermedia (Pi)圖8b是顯示人口腔內的齲齒菌及牙周病菌的菌數減少效果的圖表。(C): T. forsythensis(Tf), (D) :F.nucleatum(Fuso)
具體實施例方式用於本發明的發酵乳的乳酸菌為屬於鼠李糖乳桿菌、乾酪乳桿菌及副乾酪乳桿菌的乳酸菌株，具體指保藏在獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(地址〒四2-0818日本國千葉縣木更津市KAZUSA鐮足2-5-8)的保藏日為2009年6月10 日、保藏號為NITE BP-771的鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)K03菌株、保藏日為2009年6月10日、保藏號為NITE BP-772的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YU3菌株及保藏日為2009年6月M日、保藏號為NITE BP-775的副乾酪乳桿菌(LactcAaciIlus paracasei) YU4 菌株。K03菌株是由本發明者從人唾液中初次分離得到的，由於其16S rRNA的鹼基序列和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株IDCC 3201的鹼基序列在1485/1485間顯示出100%的同源性，革蘭氏染色後在顯微鏡下呈現革蘭氏陽性桿菌形態，因此將其鑑定為鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)。K03菌株的主要菌學性質如下所示。1)革蘭氏陽性乳酸桿菌，2)同型乳酸發酵，3)過氧化氫酶陰性，4)不形成芽孢，5) 在好氧條件下也可培養，6)產生菌體外多糖類。YU3菌株是由本發明者從人唾液中初次分離得到的，由於其16S rRNA的鹼基序列和乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)ATCC 334的鹼基序列在1485/1485間顯示出100% 的同源性，革蘭氏染色後在顯微鏡下呈現革蘭氏陽性桿菌的形態，因此將其鑑定為乾酪乳桿菌(LactcAacillus casei)。YU3菌株的主要菌學性質如下所示。1)革蘭氏陽性乳酸球菌，幻同型乳酸發酵，幻過氧化氫酶陰性，4)不形成芽孢，5) 在好氧條件下也可培養，6)產生菌體外多糖類。YU4菌株是由本發明者從人唾液中初次分離得到的，由於其16S rRNA的鹼基序列和副乾酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei)菌株DJl 16S核糖體RNA基因的部分序列顯示1477/1477(100% )的同源性，革蘭氏染色後在顯微鏡下呈現革蘭氏陽性桿菌的形態，因此將其鑑定為副乾酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei) 0 YU4菌株的主要菌學性質如下所示。1)革蘭氏陽性乳酸球菌，幻同型乳酸發酵，幻過氧化氫酶陰性，4)不形成芽孢，5) 在好氧條件下也可培養，6)產生菌體外多糖類。在本發明中，不僅可以直接使用將上述乳酸菌的菌體按乳酸菌培養的常法進行培養、從所得培養物中通過離心分離等集菌手段進行分離而得到的產物，也可使用該培養發酵液(培養上清液)、其濃縮液或將菌體用酶、物理方法處理後的細胞質、細胞壁部分。此夕卜，不僅可以是活菌體，也可以是死菌體。培養本發明的乳酸菌的培養基可以是果汁培養基、蔬菜汁培養基、牛奶培養基、脫脂奶粉培養基或含有奶成分的培養基、不含奶成分的半合成培養基等培養基。此類培養基可列舉如將脫脂乳還原後加熱滅菌而得到的還原脫脂乳培養基、添加有酵母浸膏的脫脂奶粉培養基、MRS培養基、GAM培養基等。培養方法只要是靜置培養、將pH保持一定的中和培養、批次培養和連續培養等， 具有使菌體良好生長的條件，則無特殊限制。本發明的乳酸菌的菌體或菌體培養物的提取物是指菌體或菌體培養物通過溶劑提取而得到的各種溶劑提取液、其稀釋液、其濃縮液或其乾燥粉末。作為用於得到本發明的提取物的提取溶劑，極性溶劑、非極性溶劑均可使用，也可將其混合使用。可列舉如，水；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等醇類；丙二醇、丁二醇等多元醇類； 丙酮、甲基乙基酮等酮類；醋酸甲酯、醋酸乙酯等酯類；四氫呋喃、乙醚等鏈狀及環狀醚類； 聚乙二醇等聚醚類；己烷、環己烷、石油醚等烴類；苯、甲苯等芳香烴類；吡啶類等。其中，優選醋酸乙酯等酯類、乙醇等醇類。提取條件視所用溶劑而異，但優選為，例如，對於培養液1質量份，用1 10質量份的溶劑在0 50°C，優選25 37°C的溫度下提取0. 5小時 3小時。上述提取物既可直接使用，也可將該提取物稀釋、濃縮或冷凍乾燥後，根據需要調製成粉末或糊狀使用。此外，還可用液液分配等技術適當精製後使用。在本發明的口腔內疾病的預防、改善或治療劑中，「 口腔內疾病」是指由齲齒菌、牙周病菌及念珠菌所引發的口腔內疾病，可列舉如齲齒病；牙齦炎、牙周炎等牙周病、舌炎、鵝口瘡、嘴角炎等口腔念珠菌病。此外，作為齲齒菌，可列舉出變形鏈球菌(Sti^ptococcus mutans)、遠緣鏈球菌(Str印tococcus sobrinus)，作為牙周病菌，可列舉出牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonas gingivalis)、中 |1]普氏菌(Prevotella intermedia) > S ^J W ili JiE Φ (Treponema denticola)、福賽斯坦納菌(Tannerella forsythensis)、伴放線放線桿菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)等， 作為念珠菌，可列舉出白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、 ^ ! ^ (Candida tropicalis)等。如後述實施例中所示，本發明的乳酸菌對屬於齲齒菌的變形鏈球菌 (Streptococcus mutans)及遠緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus),屬於牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)及屬於念珠菌的白色念珠菌(Candida albicans)均有增殖抑制效果。此外，還有抑制作為口腔內的齦下牙垢形成菌而為人所知的Fusobacterium. nucleatum等Fusobacterium屬細菌增殖的作用。並且,用該乳酸菌調製成的發酵乳風味及口感好，此外，與現有的發酵乳中的其他乳酸菌，如Lactobacillus, bulgaricus等共存時不會損害其風味，或可使風味進一步改善。因此，該乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物可作為口腔內疾病的預防、 改善或治療劑或齲齒菌、牙周病菌及念珠菌的增殖抑制劑。這種口腔內疾病的預防、改善或治療劑或齲齒菌、牙周病菌及念珠菌的增殖抑制劑，其自身即可作為食品、藥品、口腔用組合物使用，用於由該口腔內的病原微生物所引起的齲齒病、牙周病、口腔念珠菌病等口腔內疾病的預防、改善或治療，或用於齲齒菌、牙周病菌及念珠菌的增殖抑制，或者可作為調配食品、藥品、口腔用組合物用的原材料使用。此外，也可將食品製成以齲齒、牙周病、其他口腔疾內感染症的預防、改善等為概念、根據需要標示該內容的健康食品、保健品或特定保健用食品等功能性食品。作為藥品使用時的形式優選為口服給藥形式，其劑型可列舉如液劑；丸劑、顆粒齊U、細粒劑、粉劑、片劑等固體製劑；或者封入有該液劑或固體製劑的膠囊劑、口腔用噴霧、 含片等各種形式。為了調製上述各種劑型的藥劑和保健品，在不影響本發明菌體和培養物的作用的範圍內，可將其他藥學上允許的賦形劑、粘合劑、增量劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、分散劑、緩衝劑、防腐劑、矯味劑、香料、包衣劑、載體、稀釋劑等適當組合使用。作為此類口服製劑使用時，該製劑中本發明的乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物的含量佔整個組成的1質量％ 50質量％，優選佔10質量％ 20質量％。作為食品使用時的形式的例子，除果汁或蔬菜汁飲料、碳酸飲料、茶類飲料、含乳飲料、發酵乳、發酵果汁、發酵蔬菜汁、酒精飲料、清涼飲料等飲料，啫喱狀食品、各種點心類、烘焙糖果、蛋糕類、巧克力、果醬、麵包、□香糖、糖、湯類、醬菜、鹹烹海味等各類食品外， 還有與上述口服給藥製劑相同形式(丸劑、膠囊、糖漿等)的保健品等。本發明的乳酸菌的培養物可直接作為酸奶、奶酪、味噌、醬油、醬菜等發酵食品，也可將此類發酵乳、奶酪用作原材料，做成預防、改善齲齒、牙周病用的麵包、點心、蛋糕等。採用本發明的乳酸菌進行的發酵，優選預先準備好發酵劑，將其接種到發酵用原料物質中使其發酵的方法。這裡，作為發酵劑的代表性例子有預先向經常規殺菌處理過的發酵用原料物質(如添加有酵母浸膏的10%脫脂奶粉等)中接種乳酸菌後培養得到的產物。發酵用原料物質中還可根據需要加入發酵促進物質，如葡萄糖、澱粉、蔗糖、乳糖、糊精、 山梨糖醇、果糖等碳源，酵母浸膏、蛋白腖等氮源，維生素類、礦物質類等。乳酸菌的接種量一般以從ImL含有發酵用原料物質的液體中含有菌體約IXlO6 個細胞以上、優選IX IO7個細胞左右的含量中選擇為宜。培養條件一般從發酵溫度20-42°C 左右，優選25-37°C左右，發酵時間5-72小時左右中選擇。這樣得到的乳酸發酵物具有卡片狀形態(酸奶樣形態)，該產品可直接作為固體食品。該卡片狀形態的乳酸發酵物可通過將其進一步均質處理而得到所希望的飲料形式。將本發明的口腔內疾病的預防、改善或治療劑等作為口腔用組合物使用時的具體形式可列舉如口腔清洗劑、漱口水、牙膏、牙粉、液體牙膏、口腔用軟膏劑、凝膠劑、丸劑、顆粒劑、細粒齊 、粘性果凍、含片、片齊 、膠囊、糖果、口香糖等，優選例子為牙膏、口腔清洗劑、 粘性果凍、含片。對上述藥品、食品中的本發明的乳酸菌的含量無特殊限制，根據一日給藥量做適當調節即可。例如，劑型為液體時，優選使乳酸菌菌體濃度為IX IO6個細胞/ml IXlO8 個細胞/ml，固體時則優為IX IO7個細胞/g IX IOltl個細胞/g。將本發明的乳酸菌以活菌形式給藥時，優選按成人每人IXlO8 5X101(lcfU/日進行給藥。以下給出實施例及試驗例對本發明進行更詳細的說明。 實施例
製造例1乳酸菌菌體的調製將MRS培養基(Difco公司)於121 °C滅菌20分鐘後，接種鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus) K03 菌株(保藏號 NITE BP-77I，2009 年 6 月 10 日在獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(住址〒四2-0818日本國千葉縣木更津市KAZUSA鐮足2-5-8)保藏)，於37°C空氣中培養48小時，用蒸餾水、超純水、緩衝液等清洗後可得到菌體。同樣地，將MRS培養基(Difco公司)於121 °C滅菌20分鐘後，接種乾酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)YU3菌株(保藏號NITE BP-772，2009年6月10日在獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(住址〒四2-0818日本國千葉縣木更津市 KAZUSA鐮足2-5-8)保藏)，於37 °C空氣中培養48小時，用蒸餾水、超純水、緩衝液等清洗後可得到菌體。此外，將MRS培養基(Difco公司)於121°C滅菌20分鐘後，接種副乾酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei) YU4 菌株(保藏號 NITE BP-775，2009 年 6 月 24 日在獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(住址〒四2-0818日本國千葉縣木更津市KAZUSA鐮足2-5-8)保藏)，於37°C空氣中培養48小時，用蒸餾水、超純水、緩衝液等清洗後可得到菌體。另外，用作比較的發酵乳桿菌(LactcAacillus Fermentum)使用上述非專利文獻 1中記載的從人口腔內採集的Lactobacillus Fermentum SU3菌株，按與上述相同的方法進
行培養，供試驗。試驗例1對齲齒菌、牙周病菌及念珠菌的抗菌作用試驗方法將保存在-80°C的各菌株於常溫下解凍，通過離心沉澱(3000rpmX 5min)回收後， 用滅菌蒸餾水(MQ水)清洗2次，調節至0D600為0. 3 (約1. 0 X 109cfu/ml)。取各混懸液 500 μ 1接種到15ml的MRS肉湯或腦心浸液肉湯(以下稱BHI肉湯；Difco公司產品)中後，於37°C靜置培養48小時。然後，以3000rpm離心沉澱5分鐘(室溫)後，回收上清液， 用於抗菌測定。作為齒禹齒菌(mutans streptococci)，使用 Streptococcus mutans Ingbritt、 Streptococcus sobrinus B13。在這些菌的預培養中，使用添加有5%酵母浸膏(Difco) 的胰酶大豆肉湯(以下稱TSBY;Difco公司產品)於37°C培養M小時。然後，使用用MQ 水清洗 2 次後調整至 0D600 為 0. 3 Gti^ptococcus mutans Ingbritt, 1. OX 108cfu/ml ； Streptococcus sobrinus B13,1. OX 108cfu/ml)的菌液。作為牙周病菌，使用Porphyromonas gingivalis 381株，在添加有1 %氯化血紅素及0.2%維生素K的GAM培養基中於37 °C在裝有AneroPack(MCG)的厭氧罐(BBL， Cookeysville, USA) (10% CO2)中預培養7天。然後，使用用磷酸緩衝液(pH 7. 4 ；PBS)清洗2次後調整至0D600為0. 3 (約0. 5X107cfu/ml)的菌液。此外，作為念珠菌，使用Candida albicans MYA274，在沙氏葡萄糖肉湯(Difco)於 37°C預培養M小時。然後，使用用MQ水清洗2次後調整至0D600為0. 3 (Candida albicans MYA274 ;1.0X107 個細胞/ml)的菌液。
在M孔板上接種培養基1ml、各上清液1ml、用0D600調整至0. 3的乳酸菌的菌混懸液50μ 1，於37°C培養M小時後測定濁度，其中，對於齲齒菌，使用TSBY，對於牙周病菌， 使用添加有1 %氯化血紅素及0. 2 %維生素K的GAM培養基或BHI培養基，對於念珠菌，使用沙氏肉湯。在TSBY或沙氏肉湯中添加與乳酸菌預培養中使用的培養基相同的培養基1ml， 即MRS肉湯或BHI肉湯，接種0D600調至0. 3的菌混懸液50 μ 1，將其作為對照。此外，各上清及對照分別製備4份同樣的試料，算出其平均值士SD。結果示於圖Ia及lb、圖2、圖3a及313、圖乜及413。YU3 菌株、YU4 菌株及 K03 菌株對 Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus>Porphyromonas gingivalis>Candida albicans 均顯不出較高的增殖抑制效果。此外,其抗菌力也優於公知的Lactobacillus Fermentum SU3株。試驗例2生物膜抑制作用M Nikawa 等 1996 ^ ' (Nikawa, H. ， Nishimura, H. Yamamoto, T. ， Hamada, T. & S已mar已nayake，L. P. :The role of saliva and serum in Candida albicans biofilm formation on denture acrylic surfaces. Microbial Ecol Health & Dis 9,35—48, 1996.)進行Candida albicans生物膜測定。用假牙床用樹脂(BioResin ；京都松風公司產品)按廠家指示的混合液體比用通常方法聚合成50X50X0. 2mm的樹脂試料。用樹脂刀將其切成10X10X0. 2mm，用於生物膜測定。在M孔板底面放置樹脂板，添加人血清(Type，Sigma co. human male AB plasma)500y 1於37°C培養1小時。隨後去除人血清。將0D600調至0. 3的Candida albicans MYA274菌株的混懸液50 μ 1接種在試料表面，於37°C靜置2小時，促進固定。隨後添加MRS培養上清Iml和沙氏肉湯1ml，於37°C培養72小時。輕輕地取出樹脂，不破壞形成在試料表面的生物膜，用400ml的MQ水清洗5秒鐘，去除剩餘的菌。樹脂試料上形成的生物膜量通過提取ATP後用光度計(AB2200Luminescencer PSN ；東京ATTO公司產品)對 ATP定量來檢測。用等量MRS肉湯代替乳酸菌培養上清，作為對照。此外，各上清及對照分別製備4份同樣的試料，算出其平均值士SD。結果示於圖5。YU3菌株、YU4菌株及K03菌株強烈抑制了 Candida albicans的生物膜形成。實施例1發酵乳的製造(1)用MRS培養基於37°C下培養鼠李糖桿菌(Lactobacillus rhamnosus)K03菌株 (NITE BP-771)18小時，作為預培養液。用MQ水清洗2次後，經離心分離回收菌。向加有 「達能酸奶」(Danone Japan株式會社；使用雙歧桿菌)的市售牛奶中添加清洗後的前述K03 菌株和乳糖，使牛奶100ml中的乳糖含量為0. 1 10%，於37°C培養M小時，得到發酵乳。此外，據認為，少量添加「達能酸奶」(使用雙歧桿菌)進行通常的培養時，由於雙歧桿菌為專性厭氧菌，只有酸奶中使用的發酵劑增殖。試驗例3發酵乳的評價(1)以127名受試者為對象，按視覺模擬評分(VAS)法進行味道調查。食用完酸奶後， 在10釐米長的比例尺線上進行記錄，比例尺左端表示非常可口，右端表示非常難吃，中間表示一般，通過測定距左端的距離後取平均進行定量化。結果示於圖6。
此外，在同時進行的記載自由意見的統計中，寫「可口」、「味道醇厚」的人合計佔到 72%，由此得以確認，本發明的發酵乳均具有良好味道。實施例2發酵乳的製作O)將含乳原材料均勻混合，加熱、滅菌。冷卻後，以S. thermophilus作為發酵劑，用 L. bulgaricus和L. rhamnosus K03菌株於37 40°C進行發酵，得到酸奶(L8020)。此外， 以S. thermophilus作為發酵劑，僅用L. bulgaricus製得空白對照酸奶。試驗例4發酵乳的評價O)用實施例2中調製的L8020酸奶進行對齲齒菌的抗菌試驗。作為齲齒菌，使用前述S. mutans ingbritt株和S. sobirinus B13株。各菌株用 TSBY進行預培養後，用滅菌蒸餾水清洗3次，調至IX 108CfU/ml。向M孔板中分注1. 5mL 的TSBY後，向各孔中接種100 μ L菌液。在裝有各酸奶的培養用筒狀膜容器(intercell)放入M孔板中，比較培養M小時後的菌量。將M小時後的菌量作為ATP進行測定。各樣品製備相同的4份，求出其平均值士SD。結果示於圖7。圖7(A)、⑶中，圖表的縱軸表示ATP量(pmol/孔)，經確認，對於hgbritt菌株和對於B-13株，在空白對照中均呈略為增加的趨勢，而在添加有K03的L8020酸奶的狀態下，也顯示出有意義的抑制效果。試驗例5發酵乳的評價(3)用實施例2中調製的L8020酸奶進行了人體試驗。將40名19 25歲的受試者按隨機數字表分成兩組。第1組和第2組於每天午餐時分別食用空白對照酸奶和L8020酸奶，連續食用兩周。口腔內齲齒菌及牙周病菌的含菌數的計算方法是，用BML的試劑盒採集唾液後， 對於齲齒菌，使用培養法，對於牙周病菌，就P. intermedia (Pi), T. forsythensis (Tf)、 F. nuCleatum(FuS0)4個菌種用PCR-侵染法或侵染法進行定量。唾液採集在試吃開始3天前通過咀嚼口香糖法在刺激5分鐘後將唾液採集在冰上，算出上述各菌的口腔內含菌數，作為上述試驗的前值。試吃2周後，同樣通過咀嚼口香糖法刺激後將約5mL的唾液採集在冰上，算出上述各菌的口腔內含菌數，評價上述試驗的效果，將結果示於圖8。從圖8㈧可知，以齲齒菌的口腔內含菌數的前值作為100時，空白對照酸奶使其降至60%左右。另一方面，使用L8020酸奶，則有意義地減少至15%左右。根據該結果可知，攝取L8020酸奶2周，可有意義地且有效地減少齲齒菌的口腔內含菌數。從圖⑶可知，以Pi菌的口腔內含菌數的前值作為100時，空白對照酸奶使其增至180%左右。另一方面，使用L8020酸奶，則有意義地減少至50%左右。根據該結果可知， 攝取L8020酸奶2周，可有意義地且有效地減少Pi菌的口腔內含菌數。從圖(C)可知，以Tf菌的口腔內含菌數的前值作為100時，空白對照酸奶使其增至105%左右。另一方面，使用L8020酸奶，則有意義地減少至60%左右。根據該結果可知， 攝取L8020酸奶2周，可有意義地且有效地減少Tf菌的口腔內含菌數。從圖8(D)可知，以Fuso菌的口腔內含菌數的前值作為100時，空白對照酸奶使其增至160%左右。另一方面，使用L8020酸奶，則有意義地減少至60%左右。根據該結果可知，攝取L8020酸奶2周，可有意義地且有效地減少Tf菌的口腔內含菌數。此外，Pg菌因含菌者少而未發現有意義的變化。上述結果表明，L8020酸奶使齲齒菌、牙周病菌中的Pi菌、Tf菌、作為齦下牙垢形成菌而為人所知的FuscAacterium屬細菌有意義地減少，與普通的酸奶相比，對與齲齒及牙周病相關的細菌具有非常高的效果。
權利要求
1.口腔內疾病的預防、改善或治療劑，其以選自保藏號為NITE BP-771的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) K03菌株、保藏號為NITE BP-772的乾酪乳桿菌 (Lactobacillus casei) YU3菌株及保藏號為NITE BP-775 的副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracaSei)YU4菌株中的1種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物為有效成分。
2.食品，其含有選自保藏號為NITEBP-771的鼠李糖乳桿菌(LactcAaciIlus rhamnosus)K03 菌株、保藏號為 NITE BP-772 的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YU3 菌株及保藏號為NITE BP-775的副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) YU4菌株中的1 種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物。
3.根據權利要求2所述的食品，其特徵在於，為發酵乳或發酵飲料。
4.齲齒菌、牙周病菌和念珠菌的增殖抑制劑，其以選自保藏號為NITEBP-771的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)K03菌株、保藏號為NITE BP-772的乾酪乳桿菌 (Lactobacillus casei) YU3菌株及保藏號為NITE BP-775 的副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)YU4菌株中的1種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物為有效成分。
5.根據權利要求4所述的齲齒菌、牙周病菌和念珠菌的增殖抑制劑，其特徵在於，所述齲齒菌、牙周病菌和念珠菌至少為變形鏈球菌(Str印tococcus mutans)、遠緣鏈球菌 (Streptococcus sobrinus)、牙告艮口卜H|木單胞菌(Porphyromonas gingivalis)及白色念珠菌 (Candida albicans)。
6.保藏在獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心的保藏號為OTTE BP-771 的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)K03 菌株、保藏號為 NITE BP-772 的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei) YU3菌株及保藏號為NITE BP-775的副乾酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei) YU4 菌株。
7.乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物，其用作口腔內疾病的預防、改善或治療劑，所述乳酸菌選自保藏號為NITE BP-771的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) K03菌株、保藏號為NITE BP-772的乾酪乳桿菌(LactcAacillus casei) YU3菌株及保藏號為NITE BP-775的副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) YU4菌株中的1種以上。
8.口腔內疾病的預防、改善或治療方法，其包括給予或攝取選自保藏號為OTTEBP-771 的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)K03菌株、保藏號為NITE BP-772的乾酪乳桿菌(LactcAacillus casei)YU3菌株及保藏號為NITE BP-775的副乾酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei)YU4菌株中的1種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物。
全文摘要
本發明提供一種對口腔內疾病原因菌的抗菌譜廣、能製造風味良好、嗜好性優異的發酵物的新型乳酸菌株，以及用其製成的口腔內疾病的預防、改善或治療劑。它是一種以選自鼠李糖乳桿菌KO3菌株、乾酪乳桿菌YU3菌株及副乾酪乳桿菌YU4菌株中的1種以上乳酸菌的菌體或菌體培養物或它們的提取物為有效成分的口腔內疾病預防或治療劑。
文檔編號A61K35/74GK102470151SQ20108003187
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月16日 優先權日2009年7月16日
發明者二川浩樹 申請人:國立大學法人廣島大學