乳腺癌基因1(brca的製作方法
2024-02-03 13:32:15
專利名稱：乳腺癌基因1(brca的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物基因，更準確地說本發明涉及中國人BRCA1基因突變、缺失、插入、顛換的電泳，基因測序檢測技術，BRCA1綜合症，乳腺癌及其癌前疾病，乳腺癌家族人員基於BRCA1基因突變的各項治療領域及保健領域。
背景技術：
關於乳腺癌基因1(BRCA1)乳腺癌是目前全世界範圍內發病率快速增長的癌症。WHO發布的乳腺癌世界地理圖譜中，每10萬人口發病數為澳大利亞(83/10萬)、美國、加拿大(82/10萬)、歐洲(70/10萬)。其次為南美國家(65/10萬)、東歐(49/10萬)、北非、南非、日本、以色列和阿拉伯均為(28/10萬)，而中非、亞洲發病率最低(16-19/10萬)。
乳腺癌在女性癌症中發病率佔第一位，在所有的女性癌症中佔1/4以上，歐美人每7-9位女性一生中要有一位發生乳腺癌。攜帶有乳腺癌BRCA1致病基因的女性，70歲時患乳腺癌的機率高達80％以上；因此乳腺癌的分子病理學在醫學基因中是最受關注的基因之一。不僅已經明確了BRCA1、BRCA2基因，現在還有關於BRCA3和其它乳腺癌相關基因的報導。就其中最受重視的BRCA1基因來說，由它所引發的相關疾病和腫瘤已被WHO命名為「BRCA1綜合症」。美國政府的基因組網站還專門建立了Breast Cancer Information core Database網站。該網站已登記了1300個BRCA1突變位點。美國民間最大商業化基因測序公司(Myriad公司)每年從國家衛生署獲得8千萬美金的資助，完成公益化的乳腺癌基因檢測1萬6千人，獲得了大量的基因突變位點資源和專利，並在本土、歐洲等國家註冊。幾年來巨大的利潤空間，引發了歐美各國政府間的BRCA1基因專利戰。
乳腺癌BRCA1基因定位於人類染色體17q21，共有24個外顯子(22個編碼外顯子、可變區5』UTR外顯子、1a1b)，實際長達81kb的染色體區間。具有少見的高密度Alu重複性DNA(41％)，BRCA1上遊少量的假基因(BRCA1φ)導致1a、1b和2外顯子串連複製長達44.5kb。
在BRCA1基因中，第11個顯子長3.4kb，BRCA1編碼的全部1863個胺基酸中，第11外顯子編碼了61％的胺基酸，所以對外顯子11的研究文獻眾多。
脊柱動物中BRCA胺基酸鏈末端鋅指環結構域和C-端的BRCT域重複保守，而其它的蛋白部分可能與其餘基因產物同源融合。
有關BRCA1基因表達研究進展很多，已知BRCA1有數種剪切轉錄方式；最主要的是在第11外顯子的框移缺失(BRCA1-Δ11)，全長和Δ11外顯子都可以表達，但是第100和97КDa Δ11蛋白異構體缺乏核的定位信號，位於漿內。另一種全長220КDa蛋白主要位於核內亞磷酸化。從G1到S期慢慢到達最高水平。此時BRCA1與BRCA2及Rad51蛋白共同定位在分散的核內各灶點。DNA損傷時BRCA1過磷酸化，BRCA1、BRCA2、Rad51在各灶點彌散、重新定位到含有PCNA的DNA複製結構區域，形成DNA修復蛋白(BASC)。它具有多種細胞功能如DNA修復、轉錄、染色體重組的蛋白泛素化。
1、關於BRCA1基因突變BRCA1突變主要位於第11外顯子，佔全基因突變率2/3，它分為ABCD4個區，生物學上共分框移(插入)，框移(缺失)，錯義、無義、剪切、多態，未分類，同義等9種突變亞型，醫學上將其聚類為三種醫學意義的突變類型，第一類為有害突變(deleterior)，以框移，剪切為主；第二類為可疑致病突變，它們佔了突變率的大多數，表現為錯義突變，無義突變，內含子大鹼基(3bp)變化，還有部分單胺基酸缺失的突變。第三類為大量的未明意義的突變，以同義、多態和非編碼突變、沉默突變為主，以及距外顯子40bp左右的內含子突變。
突變頻度(prevanlence)即BRCA1在家族性乳腺癌，散發性乳腺癌，癌患者各級親屬及非相關人群的頻率分布。以Myriad genetic在www.genome.gov的BIC database公布的資料最具權威性。在乳癌、卵巢癌人群中，猶太人BRCA1/2突變率升高≥30％，美國人≥10％，中國人小樣本≥3％，家族性乳癌患者中猶太人≥80％，美國人≥60-80％，仍然缺乏中國人的相關資料。
醫學外顯意義(penetrace)對BRCA1突變的醫學意義，外顯率和預後等認識以Myriad genetic 2002年早期報告1萬例乳腺癌和相關信息為主，隨後的研究將突變分類如下有害性突變，包括蛋白截短至少距-C端10個胺基酸以上。特殊的錯義和無義插序突變。其中17.2％的突變屬有害性突變。其中60％為框移，25％為無義突變，12.5％在內含子區，2.1％為錯義突變。
可疑致病突變，又稱未定性突變。包括錯義突變，內含子區突變，末端突變，佔19.8％。
非外顯突變也稱未表現突變、多態性突變。不產生蛋白截短，對照組等位基因變化大於1％但無臨床影響；編碼區變異既不改變胺基酸序列也不預示剪切外顯子(沉默)；突變並不損害mRNA轉錄的長度和穩定性；佔60％的突變屬於這一大類。
在人種突變率的差異上，Myriad報告的1萬例乳腺癌中，亞洲人僅112例(1.1％)，91人中有11人存在有害性突變(12％)，加上可疑致病突變(1.15倍)和非外顯突變(3.5倍)，共達56％的突變率，與國內同類數據差距太大。
Myriad報告的BRCA基因總有害性突變是17.2％。其中乳腺癌組織有20％的有害性突變率，病理學上導管內癌突變率低(13％)，浸潤性乳癌突變率高(24％)，男性乳腺癌BRCA有高達28％突變率，卵巢癌高達34％。就乳腺癌人種差異來說，歐洲血統的有害性突變率為16％，猶太血統的為21％，非洲血統的佔19％，拉丁/加勒比血統的為18％，美國土著血統為14％，亞洲血統為12％，可見差異不大。
國內研究概況結合查新檢索內容，用直接測序法報導的數據與Myriad數據較為接近徐光煒等用DHPLC加測序檢測9例乳癌家族BRCA全基因組(36對BRCA1引物)，另32例散發性乳癌33例正常人血液標本的BRCA第18外顯子。家族性乳腺癌致病突變率達11-22％，散發性乳癌和正常人合有33-37％的18外顯子變異或多態，他指出中國發表的論著資料突變率大多＜5％，是因為檢測的位點不全面、不系統。周冬先等對35例乳腺癌和10例健康人血液第11外顯子全長PCR擴增，檢測出共11名突變(31.4％)，25名多態雜合(71.4％)，但未分析其中的致病性突變。
另一方面，劉麗等對含12例家族史的56例乳腺癌和34例卵巢癌用PCR-SSCP和MNA方法檢測第2、11、20外顯子，未發現基因突變。王樹玉等對37例乳腺癌(含4例家族史)用PCR-SSCP法檢測第2、第11外顯子，然後測序，僅發現1例移碼突變(2.7％)。王旭芬等對50例乳腺癌用PCR-SSCP方法檢測第2、11、20外顯子，未檢測出突變。崔靜等同法對79例乳腺癌檢測6個外顯子，只檢出1例單鹼基(2430T＞C)突變。陸雲飛等同法檢測了89例乳腺癌，僅發現4例突變(4.5％)。董秋明對34例乳腺癌同法檢測相同外顯子2例(6％)有突變。柯玉雄檢測86例乳癌第2、11和20外顯子發現一個多態。賴春寧等檢測186例散發性乳腺癌BRCA1第2.11.20外顯子，經PCR-SSCP然後測序檢出13例突變。有害性突變率為僅2.7％，總突變率7％。胡震同法檢測41例僅3例突變(7.3％)。結果他們的共同結論是中國女性乳腺BRCA1與國外相比突變率低、沒有必要進行BRCA1突變檢測。Suter在美國用PCR法檢測1306例上海女工BRCA突變率僅8％。我們對46例乳腺癌或一級親屬(含12例家族性乳癌及親屬)進行BRCA1測序，其中14例進行BRCA1全基因組測序。共發現127個突變位點，15種不同的突變類型，其中5種為有害性位點，每例遺傳性乳腺癌病人含10個以上的位點，有4個新位點是BIC及NCBI未見報導的。總的46人中有19位突變(41％)。
2、國外BRCA1專利申請基因專利是上世紀八九十年代生物科技興起的產物，1978年左右人類生長基因組獲得最早的基因專利權。目前已有4000種以上的人類基因因其不斷發現的新用途而申報了專利，其中63％歸屬於國外私人公司，28％屬於大專院校。享有人類基因專利權最多的是美國Incyte公司，約覆蓋了2000種人類基因；中國聯合基因公司在1999年曾報導說已申報4000種基因專利。去年底《科學》雜誌曾繪製了專利現狀申報詳圖，提示20％人類基因被申報了專利，其中醫學用途明顯的如老年性痴呆和癌症相關基因，一個基因被申報了20多種不同用途的專利。
目前中國在基因保護方面存在流失的問題，中國人哮喘病基因、愛滋病基因已在國外被註冊了專利，某些靶向藥物基因(EGFR)也在國外被註冊了專利，有關BRCA1基因的專利是國際上影響力最大的基因專利申請事件。
(一)現有技術存在的問題和缺點BRCA1檢測技術目前主要包括四個方面1、免疫組化技術主要利用BRCA1抗體，在組織細胞切片上標記腫瘤和靶細胞的BRCA1蛋白表達情況。可作陽性、陰性半定量記錄。缺點①敏感性差②特異性差③屬於蛋白水平的粗略評估④不能觀察基因層面突變類型、方式及編碼位置。故評估基因突變沒有應用價值。
2、PCR技術基於PCR的各種基因擴增和凝膠電泳方法，如單鏈核苷酸變性PCR(PCR-SSCP)，變性高效液相色譜(DHPLC)，二維基因掃描(TDGS)，變性梯度凝膠電泳(DGGI)，異源雙鏈分析(HA)，螢光誤配分析(FAMA)，蛋白截短試驗(PTT)等，是目前檢測BRCA1基因的主流技術，主要特點①應用已知的鹼基序列合成針對性的引物，②檢測的是突變中的單鹼基突變類型，③檢測結果僅反應抽樣、篩查性質的的短鹼基片段，以電泳凝膠的方式記錄結果。
缺點是①識別電泳條帶有主觀因素，擬合優度不佳時易誤判，故重複準確性低②受實驗條件影響大，如模板質量、制膠質量、溫度、電壓對電泳單鹼基點突變的檢測精度不夠，產生假陰性，③如應用於商業化檢測，則受到專利中已公布BRCA1突變位點的限制。
3、基因晶片技術這是國外近年興起的大通量檢測BRCA1突變位點的技術，可檢測人數多、位點多、時間短。但缺點是①僅能用於已知公布的BRCA1位點，以點突變篩查為主，②鹼基長度受限於20-30bp的外顯子區，大片段缺失剪切區和內涵子則漏檢，③實驗重複準確率低，故要求2次重複率達70-80％以上時才能發報告，④同樣當應用於商業化檢測時受智慧財產權保護的限制。也沒有執業醫師和物價政策。
4、基因測序技術可以全基因組逐鹼基檢查BRCA1基因的各種類型基因突變，並顯示出每個鹼基序列的形態結果，屬當今分子生物學領域最尖端科學的檢測技術，可分析各種族已知、未知的鹼基變化狀態。缺點是①需要高質量精度的基因測序儀和執業病理醫師，普及困難②逐鹼基測序，目前技術難以大通量的多位點的測序，所以世界上的文獻幾乎沒有BRCA1基因組全長測序資料。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供新的乳腺癌基因突變位點(BRCA1)以及一種針對被檢測DNA模板，應用ABI的BRCA1全基因組44對引物(RSS000009248-01)進行PCR擴增、純化、電泳分析；全基因組測序反應，純化後經基因測序儀測序分析、數據分析比對、檢測出已報導及未報導的BRCA1外顯子、內含子基因突變位點、方式和類型。
(-)發明原理1、BRCA1基因與乳腺癌發病密切相關，受到美國國家專利局和歐洲專利局的重視，其臨床醫學診療，保健，科研方面已在各癌基因中率先廣泛應用。
2、應用BRCA1全基因組引物，對中國漢族人胚細胞和BRCA1綜合症，乳腺癌家族成員及乳腺癌腫瘤體細胞進行基因測序，檢測BRCA1基因突變，儘可能無遺漏全面的檢測。
3、利用BRCA1全基因組(外顯子、內含子)測序結果進行健康體檢、乳腺癌及癌前疾病，BRCA1綜合症病人的基因檢測和診治。
本發明是採取以下的技術方案來實現的乳腺癌基因突變位點，所述的位點為第一類第11外顯子914T/C(S265S)雜合突變；第1內含子鹼基突變，124C＞T，385A＞G，495InsACA/494InsAAC/493InsCAA，雜合突變124C/T雜合、385A/G雜合；872T/C雜合突變；第24外顯子非編碼區鹼基突變，6410G＞T，7276C＞T；第二類第11外顯子的鹼基突變2201C＞T(S694S)、2430T＞C(L771L)，2731C＞T(P871L)、3232A＞G(E1038G)、3667A＞G(K1183R)，2685位T/C(Y856H)，第13外顯子4427T＞C(S1436S)，第16外顯子4956A＞G(S1613G)；第二類上述位點全部存在雜合性突變方式；以及上述第一、第二類突變位點的任何單一或組合性突變。
乳腺癌基因(BRCA1)突變位點檢測分析方法，包括下列步驟一、發明應用對象和材料1、社會人群的血液、機體組織細胞、蠟塊和福馬林固定組織、培養細胞、各類凍存、固定保存細胞；2、乳腺癌和全部BRCA1綜合症病人及其家族血緣人員的腫瘤細胞和血液；3、BRCA1相關腫瘤病人的腫瘤細胞和血液標本；二、技術方法1、DNA提取和定量新鮮組織商業化DNA提取試劑盒固定和石蠟商業化公司DNA提取試劑盒血液和液體細胞商業化公司DNA提取試劑盒以上均按說明書指示方法操作，以凝膠電泳系統，及核酸定量儀檢測DNA模板質量和濃度，選擇dsDNA為測定目標，260nm吸光率大於0.05以上(DNA含量大於2.0ug/ul)，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之間，320nm波長處吸光率接近為0的樣本作為適用模板。
2.PCR特異性擴增①引物BRCA1測序引物，OMIM(NCBI)113705(序列見磁碟)celera資料庫號RSS000009248-01，檢測BRCA1100kb全長的基因序列(外顯子、內含子、剪切區)，包含了鋅指蛋白內含子區和5』端BRCT及轉錄活性區的末端鹼基。
②PCR擴增條件PCR體系AmpliTaq Gold PCR Master Mix，50％甘油，PrimerMix，模板DNA，Distilled water。
PCR條件置PCR擴增儀中95℃預變性15min，94℃變性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃/1min)，72℃延伸1min，共循環10次，94℃變性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循環30次，最後於72℃延伸10min；PCR產物質量控制PCR反應產物要求條帶單一，濃度30-100ngPCR酶應用HotStarTaq DNA Polymerase、金牌酶及優質的國內外其它酶；③PCR產物純化過柱純化Promega公司PCR純化試劑盒，及其它商業性純化試劑盒。
酒精/EDTA純化產物純化後凝膠顯像電泳評估純化質量，編號、存檔(-80℃)，報告。
④測序反應及純化測序PCR反應條件1ul BigDye(2.5X)+1.5ul BigDye SeqBuffer(5X)+3ul引物+1ulPCR純化產物+3.5ul ddH2O。96℃，10sec→(96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min)×25個循環→60℃，4min→4℃保溫測序純化用酒精/NaAc/EDTA方法和其他商業化純化法。主要步驟見ABI操作說明。
⑤基因測序(含反向測序)96孔板樣品製備，上樣至3100遺傳分析儀進行電泳。Datecollection軟體自動進行數據處理和分析。
6、測序結果分析和報告測序結果形成書面報告，操作人和報告醫師籤字、注期，並附上原始測序電泳圖、序列圖交給臨床或患方；7、檔案處理登記所有檢測對象均填寫登記申請單，註明病史、病理診斷、複查HE切片；全部DNA模板，PCR純化產物均編號-80度超低溫保存備查三、工藝步驟①BRCA1基因測序 四、工藝條件1、環境條件DNA模板提取 PCR擴增和測序反應必須分區或分室操作，嚴防交叉汙染，規範汙染物處理。在國家分子生物學三級實驗室操作或監理，培訓，並發證書。
2、人員條件相關操作人員須經《國家實驗室認可制度》培訓班培訓合格，具有病理執業醫師資格，碩士研究生畢業以上，臨床病理診斷從業三年以上，有分子病理實驗基礎並操作培訓一年以上。
3、硬體條件DNA分光光度定量儀，自動凝膠顯像儀，測序級PCR擴增儀，電泳儀，冷凍離心機，高速離心機，DNA分析儀(基因測序儀)，寬帶網際網路。
4、軟體條件具有熟練的分子生物和分子病理知識技能查閱NCBI和相關文獻庫會使用3100-AvantDate Collection 2.0軟體運行測序儀會分析DNA sequencing analysis 5.1軟體分析原始數據DNA seqScape軟體自動比較基因突變DNA star seqman軟體手工比較基因突變和其他基因分析軟體。
技術結果(一)、對象1.乳腺癌家系在江蘇省中醫院乳腺外科門診、住院部以及隨診的乳腺癌患者中收集漢族的9個乳腺癌家系的12名檢測者(年齡41-60歲)，其中2例患乳腺癌，分別予以編號，籤署知情同意書後取其外周血。乳腺癌家系收集標準家族3例乳腺癌中至少有1例乳腺癌病例是在50歲以前被確診，符合上述基本條件的一個乳腺癌家系的一級親屬或成員。
2.散發性乳腺癌在江蘇省中醫院乳腺外科住院的乳腺癌患者，經知情同意後採集3例患者的新鮮腫瘤組織。
3、乳腺癌前病變在江蘇省中醫院乳腺外科住院的乳腺癌前病變患者，經知情同意後採集10例患者的新的新鮮腫瘤組織，1例右乳分葉狀腫瘤，5例導管內乳頭狀瘤變，2例乳腺囊性增生症，2例乳腺小葉增生。
4，BRCA1綜合症除了乳腺癌外，卵巢癌，子宮內膜癌，宮頸癌，前列腺癌，肝癌等。
3.正常人對照入選條件為知情同意，年齡35歲以上，身體健康，無乳腺癌家族史，無乳腺嚴重疾病史，採集到符合以上標準正常對照者8人的外周血(包括1正常男性對照)。
(二)、方法(見前述)(三)、結果1、乳腺癌家系基因測序結果12名檢測者中11名進行了BRCA1全基因測序，1名檢測第3和11外顯子全序列。其中第11外顯子有5名均檢測到鹼基突變，均為相同的鹼基突變2處同義突變2201C＞T、2430T＞C，和3處誤義突變2731C＞T、3232A＞G、3667A＞G(EMBL/Gene Bank/DDBJ基因記錄號AY304547)，分別造成第871、1038和1183位胺基酸發生替換(蛋白質記錄號AAP70031)。另5名個體為雜合突變，為上述突變基因與正常基因的雜合體2201、2430和2731位為鹼基C/T雜合，3232和3667位A/G雜合。另有G050434號病人發現914T/C(S265S)雜合突變，此位點未見BIC記錄。另有2名患者2685位T/C(Y856H)雜合突變(二者為姐妹，姐為浸潤性導管癌，妹為正常體檢)。第13外顯子和第16外顯子有4名檢測到相同鹼基突變，分別為4427T＞C(S1436S)，4956A＞G(S1613G)，另有5名個體為雜合突變4427T/C雜合，4956A/G雜合。第24外顯子非編碼區有4名檢測到相同鹼基突變，6410G＞T，7276C＞T，另有5名個體為雜合突變6410G/T雜合，7276C/T雜合。第1內含子有4名檢測到相同鹼基突變，124C＞T，385A＞G，495InsACA/494InsAAC/493InsCAA，另4名個體為雜合突變124C/T雜合、385A＞G雜合，495 InsACA。另G050477號發現872T/C雜合突變。詳細突變見列表。
2、散發性乳腺癌患者測序結果3名檢測者中2名進行了BRCA1全基因測序，1名檢測第3外顯子。其中2名第11、13、16、24外顯子和第1內含子出現與上述乳腺癌家系檢測者相同的鹼基突變。
3、乳腺癌前病變患者測序結果10名檢測者中5名檢測了第3外顯子，5名檢測第11外顯子部分序列，第3外顯子未發現鹼基變異，2名檢測到和乳腺癌家系相同的5個雜合性突變。
4、正常人對照8名檢測者中1名進行了全基因測序，7名檢測了第11外顯子部分序列，其中2名檢測到全乳腺癌家系相同的5個雜合性突變。
5、新的位點1、G050434號病人發現第11外顯子914T/C(S265S)雜合突變2、第1內含子有4名檢測到相同鹼基突變，124C＞T，385A＞G，495InsACA/494InsAAC/493InsCAA，另4名個體為雜合突變124C/T雜合、385A＞G雜合，495位InsACA。另G050477號發現872T/C雜合突變。
3、第24外顯子非編碼區有4名檢測到相同鹼基突變，6410CG＞T，7276C＞T總結1、乳腺癌家系12人中12例發現17個位點突變，突變率100％
2、3例散發性乳腺癌中2例發現12個位點突變，突變率66.6％3、10例乳腺癌前病變中2例發現5個位點突變，突變率20％4、8例正常對照人群中2例發現5個點突變，突變率25％。
上述實施例不以任何形式限定本發明，凡採用等同替換或效變換的方式所形成的技術方案，均落在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.乳腺癌基因突變位點，所述的位點為第一類第1內含子鹼基突變，124C＞T，385A＞G，495InsACA/494InsAAC/493InsCAA，雜合突變124C/T雜合、385A/G雜合；872T/C雜合突變；第24外顯子非編碼區鹼基突變，6410G＞T，7276C＞T；第二類第11外顯子的鹼基突變2201C＞T(S694S)、2430T＞C(L771L)，2731C＞T(P871L)、3232A＞G(E1038G)、3667A＞G(K1183R)，914T/C(S265S)雜合突變，2685位T/C雜合(Y856H)，第13外顯子4427T＞C(S1436S)，第16外顯子4956A＞G(S1613G)；第二類上述位點全部存在雜合性突變方式；以及上述第一、第二類突變位點的任何單一或組合性突變。
2.乳腺癌基因1(BRCA1)突變位點檢測分析方法，包括下列步驟(1)應用對象和材料a、社會人群的血液、機體組織細胞、蠟塊和福馬林固定組織、培養細胞、各類凍存、固定保存細胞；b、乳腺癌和全部BRCA1綜合症病人及其家族血緣人員的腫瘤細胞和血液標本及其上述材料；c、BRCA1相關腫瘤病人的腫瘤細胞和血液標本；(2)檢測方法a、DNA提取和定量新鮮組織商業化DNA提取試劑盒固定和石蠟商業化DNA提取試劑盒血液和液體細胞商業化DNA提取試劑盒b.以上均按說明書指示方法操作，以凝膠電泳系統，及核酸定量儀檢測DNA模板質量和濃度。選擇dsDNA為測定目標(3)、PCR特異性擴增a、引物BRCA1測序引物，OMIM(NCBI)113705celera資料庫號RSS000009248-01，檢測BRCA1100kb全長的基因序列(外顯子、內含子、剪切區)，包含了鋅指蛋白內含子區和5』端BRCT及轉錄活性區的末端鹼基；b、PCR擴增條件PCR體系ABI AmpliTaq Gold PCR Master Mix，Primer Mix模板DNA，Distilled water；PCR條件置PCR擴增儀中，預變性15min，94℃變性50sec，63℃-58℃退火1min，72℃延伸1min，共循環10次，94℃變性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循環30次，最後於72℃延伸10min；PCR產物質量控制PCR反應產物要求條帶單一，濃度30-100ngPCR酶應用HotStarTaq DNA Polymerase、金牌酶及優質的國內外其它酶；c、PCR產物純化過柱純化商業化PCR純化試劑盒，及其它商業性純化試劑盒；酒精/EDTA純化產物純化後凝膠顯像電泳評估純化質量，編號、存檔(-80℃)，報告；(4)、測序反應及純化測序PCR反應條件BigDye(2.5X)+BigDye Seq Buffer(5X)+引物+PCR純化產物+ddH2O；96℃，10sec→(96℃10sec→50℃5sec→60℃4min)×25個循環→60℃，4min→4℃保溫測序純化用酒精/NaAc/EDTA方法和其他商業化純化法；(5)，基因測序及反向測序96孔板樣品製備，上樣至3100遺傳分析儀(基因測序儀)進行電泳；Datecollection軟體自動進行數據處理和分析；(6)、測序結果分析和報告測序結果形成書面報告，操作人和報告醫師籤字、注期，並附上原始測序圖交給臨床或患方；(7)、檔案處理登記所有檢測對象均填寫登記申請單，註明病史、病理診斷、全部DNA模板，PCR純化產物均編號，-80度超低溫保存備查(8)工藝步驟，條件a、BRCA1基因測序 b、環境條件DNA模板提取 PCR擴增和測序反應必須分區或分室操作，嚴防交叉汙染，規範汙染物處理，程序由相應SOP系統控制。
全文摘要
本發明涉及中國人BRCA
文檔編號C12Q1/68GK1920054SQ20061008555
公開日2007年2月28日 申請日期2006年6月23日 優先權日2006年6月23日
發明者賴仁勝, 謝玲, 朱長樂, 王劍蓉 申請人:南京中醫藥大學附屬醫院, 賴仁勝, 謝玲, 朱長樂