經代謝的經調節的生長培養基和使用方法

2024-02-04 19:24:15

經代謝的經調節的生長培養基和使用方法
【專利摘要】本發明描述了包含經代謝的經調節的生長培養基和/或經代謝的細胞提取物的組合物和使用方法。經代謝的經調節的生長培養基和經代謝的細胞提取物組合物可以與可接受的載體一起配製在可注射製劑或局部製劑中，例如，作為霜劑、洗劑或凝膠，且可以用於藥妝或藥物應用。經代謝的經調節的生長培養基和經代謝的細胞提取物還可以被進一步處理以濃縮或減少包含在經代謝的經調節的生長培養基或經代謝的細胞提取物內的一種或多種要素或組分。生長培養基可以通過任何真核細胞來調節。經代謝的經調節的生長培養基和經代謝的細胞提取物可以用於防止或治療病狀，例如皮膚病狀。
【專利說明】經代謝的經調節的生長培養基和使用方法
[0001]本申請是申請日為2011年11月11日，申請號為201180064131.0，發明名稱為「經代謝的經調節的生長培養基和使用方法」的發明專利申請的分案申請。
[0002]交叉引用
[0003]本申請要求2010年11月12日提交的美國臨時申請第61/413，166號的權益，通過引用以其整體併入本文。
發明領域
[0004]本公開內容涉及包含經代謝的經調節的生長培養基和/或經代謝的細胞提取物的組合物，和用於通過向受試者施用組合物防止或治療病狀例如皮膚病狀的方法。
[0005]發明背景
[0006]培養基組合物通常包含必需胺基酸、鹽、維生素、礦物質、微量金屬、糖、脂質和核苷。細胞培養基努力供應滿足使細胞在控制的、人造的和體外的環境中生長所需要的營養需求必需的組分。營養素製劑、pH和同滲容摩根據參數例如細胞類型、細胞密度和採用的培養系統而改變。許多細胞培養基製劑在文獻中被證明，且許多培養基是商購的。一旦培養基用細胞溫育，其就被本領域技術人員稱為「廢的」或「經調節的培養基」。經調節的培養基包含培養基的許多原始組分，以及各種細胞代謝物和分泌的蛋白，分泌的蛋白包括，例如生長因子、炎性媒介物和其他胞外蛋白。
[0007]發明概述
[0008]在一個實施方案中，本公開內容提供包含經代謝的經調節的生長培養基和可接受的載體的組合物。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基是由酵母細胞代謝的經調節的生長培養基。在一些實施方案中，經調節的生長培養基通過在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基來製備。在其他實施方案中，組合物是局部的或可注射的組合物。在一些實施方案中，組合物用於治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。在一個實施方案中，組合物使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預防或減少環境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量；促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在一個實施方案中，組合物減淡細紋和皺紋的外觀；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善皮膚紋理、膚色和彈性；減少粗糙度和光損傷；加強皮膚本身再生的能力；防止或減少環境損傷；使皮膚光滑和緊緻；使老年斑變亮和減淡；減少細紋和粗紋以及皺紋；改善細的和粗的眼周皺紋的外觀；改善鼻唇溝的外觀；改善口周皺紋；改善面部細紋和粗紋；改善膚色、發光度和均勻度；改善皮膚緊緻度；減少觸覺粗糙度；改善皮膚紋理、總的光損傷、總的色素沉著過多；整體改善；減淡黑斑和/或斑紋的外觀；改善皮膚亮度外觀和年輕外觀；改善皮膚的總病狀；改善光老化皮膚的外觀；改善內在和外在老化的皮膚的外觀；改善皮膚細胞更新；改善皮膚屏障；改善皮膚保持水分的能力；減淡褐色和紅色斑點、發紅的外觀；增加皮膚表皮厚度；加強真皮表皮連接；減少孔尺寸和孔的出現；改善光滑度，或其組合。
[0009]在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種症狀或病狀改善至少2倍。一種或多種症狀或病狀的改善倍數包括但不限於，3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之間的任何數量。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致改善約1%至約100%、約10%至約90%、約20%至約80%、約30%至約70%、約40%至約60%、或約50%。在其他實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種症狀或病狀改善約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 100%、約 125%、約 150% 或一種或多種症狀或病狀改善更多。
[0010]在其他實施方案中，本公開內容還提供包含經代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物。在一些實施方案中，經代謝的細胞提取物是由酵母細胞代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，細胞提取物源自動物細胞、皮膚細胞或成纖維細胞。在其他實施方案中，組合物是局部的或可注射的組合物。在一些實施方案中，組合物用於治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。
[0011]在一個實施方案中，本公開內容提供通過包括以下的工藝製備的經代謝的經調節的生長培養基:(a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基和從經培養的細胞除去經調節的生長培養基；(b)培養酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露於經調節的生長培養基；(d)培養酵母細胞以使經調節的生長培養基的至少一部分代謝；和(e)收集經代謝的經調節的生長培養基。
[0012]在另一個實施方案中，本公開內容提供用於製備經代謝的經調節的生長培養基的工藝，該工藝包括:(a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基和從經培養的細胞除去經調節的生長培養基；(b)培養酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露於經調節的生長培養基；(d)培養酵母細胞以使經調節的生長培養基的至少一部分代謝；和(e)收集經代謝的經調節的生長培養基。
[0013]在另一個實施方案中，本公開內容提供包含經代謝的經調節的生長培養基和可接受的載體的組合物。在另一個實施方案中，公開內容提供包含經代謝的經調節的生長培養基和可接受的載體的組合物，其中局部組合物用於治療或防止皮膚病狀。在一些實施方案中，組合物用於治療或防止皮膚病狀。在一些實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。
[0014]在另一個實施方案中，本公開內容提供包含經代謝的經調節的生長培養基和可接受的載體的組合物，其中局部組合物用於治療或防止皮膚病狀，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在，且經代謝的經調節的生長培養基通過在足以滿足使酵母細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養酵母細胞以形成經調節的生長培養基來製備。
[0015]在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在一些實施方案中，組合物用於治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。
[0016]在一個實施方案中，本公開內容提供用於治療脫髮的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於刺激毛髮生長的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或治療受試者中的先天性缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或治療受試者中的外觀缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在一個實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預防或減少環境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量；促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或治療受試者中的後天缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。所述方法可以使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；改善膚色、紋理和/或緊緻度；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量；促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀；減淡細紋和皺紋的外觀；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善皮膚紋理、膚色和彈性；減少粗糙度和光損傷；加強皮膚本身再生的能力；防止或減少環境損傷；使皮膚光滑和緊緻；使老年斑變亮和減淡；減少細紋和粗紋以及皺紋；改善細的和粗的眼周皺紋的外觀；改善鼻唇溝的外觀；改善口周皺紋；改善面部細紋和粗紋；改善膚色、發光度和均勻度；改善皮膚緊緻度；減少觸覺粗糙度；改善皮膚紋理、總的光損傷、總的色素沉著過多；整體改善；減淡黑斑和/或斑紋的外觀；改善皮膚亮度外觀和年輕外觀；改善皮膚的總病狀；改善光老化皮膚的外觀；改善內在和外在老化的皮膚的外觀；改善皮膚細胞更新；改善皮膚屏障；改善皮膚保持水分的能力；減淡褐色和紅色斑點、發紅的外觀；增加皮膚表皮厚度；加強真皮表皮連接；減少孔尺寸和孔的出現；改善光滑度，或其組合。
[0017]在另一個實施方案中，本公開內容提供用於減淡細紋和皺紋的外觀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於減少老年斑和色素沉著異常的出現的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於改善皮膚紋理、膚色和彈性的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於減少粗糙度和光損傷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於加強皮膚本身再生的能力的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或減少環境損傷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於使皮膚平滑和緊緻的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於使老年斑變亮和減淡的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的經調節的生長培養基。
[0018]在另一個實施方案中，本公開內容提供通過包括以下的工藝製備的經代謝的細胞提取物:(a)提供細胞提取物；(b)培養酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露於細胞提取物；(d)培養酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和(e)收集經代謝的經調節的細胞提取物。
[0019]在另一個實施方案中，本公開內容提供用於製備經代謝的細胞提取物的工藝，該工藝包括:(a)提供細胞提取物；(b)培養酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露於細胞提取物；(d)培養酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和(e)收集經代謝的細胞提取物。
[0020]在另一個實施方案中，本公開內容提供包含經代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物。在另一個實施方案中，本公開內容提供包含經代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物，其中局部組合物用於治療或防止皮膚病狀。在一些實施方案中，組合物用於治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。
[0021]在另一個實施方案中，本公開內容提供包含經代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物，其中局部組合物用於治療或防止皮膚病狀，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在，且經代謝的細胞提取物是由酵母細胞代謝的細胞提取物。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。在一個實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預防或減少環境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量；促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。
[0022]在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於治療脫髮的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於刺激毛髮生長的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或治療受試者中的先天性缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或治療受試者中的外觀缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在一個實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預防或減少環境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量?』促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或治療受試者中的後天缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。所述方法可以使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；改善膚色、紋理和/或緊緻度；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量；促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，減淡細紋和皺紋的外觀；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善皮膚紋理、膚色和彈性；減少粗糙度和光損傷；加強皮膚本身再生的能力；防止或減少環境損傷；使皮膚光滑和緊緻；使老年斑變亮和減淡；減少細紋和粗紋以及皺紋；改善細的和粗的眼周皺紋的外觀；改善鼻唇溝的外觀；改善口周皺紋；改善面部細紋和粗紋；改善膚色、發光度和均勻度；改善皮膚緊緻度；減少觸覺粗糙度；改善皮膚紋理、總的光損傷、總的色素沉著過多；整體改善；減淡黑斑和/或斑紋的外觀；改善皮膚亮度外觀和年輕外觀；改善皮膚的總病狀；改善光老化皮膚的外觀；改善內在和外在老化的皮膚的外觀；改善皮膚細胞更新；改善皮膚屏障；改善皮膚保持水分的能力；減淡褐色和紅色斑點、發紅的外觀；增加皮膚表皮厚度；加強真皮表皮連接；減少孔尺寸和孔的出現；改善光滑度，或其組合。
[0023]在另一個實施方案中，本公開內容提供用於減淡細紋和皺紋的外觀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於減少老年斑和色素沉著異常的出現的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於改善皮膚紋理、膚色和彈性的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於減少粗糙度和光損傷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於加強皮膚本身再生的能力的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於防止或減少環境損傷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於使皮膚平滑和緊緻的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內容提供用於使老年斑變亮和減淡的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經代謝的細胞提取物。
[0024]在一個實施方案中，還提供包含經代謝的經調節的生長培養基和可接受的載體的組合物，其中經代謝的經調節的生長培養基是由酵母細胞代謝的經調節的生長培養基。在一個實施方案中，經調節的生長培養基通過在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基來製備。在另一個實施方案中，組合物是可注射組合物或局部組合物。在又一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在另一個實施方案中，經代謝的調節生長培養基被封裝在密封劑內。在一個實施方案中，密封劑是脂質體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。在一些實施方案中，組合物用於治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，組合物用於治療或防止細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降?』老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。在其他實施方案中，組合物用於治療或防止外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在一些實施方案中，外觀缺陷是眉間皺眉線、深鼻唇溝摺痕、嘴邊地理皺紋(circum-oral geographical wrinkle)、雙頰凹陷或乳房發育不全。在其他實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預防或減少環境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量；促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在一些實施方案中，後天缺陷是創傷後、手術後或感染後發生的醫療病狀。在其他實施方案中，後天缺陷是醫療程序後缺陷。在其他實施方案中，後天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎縮、角化性病變、去核眼睛中眼球內陷、面部痤瘡凹坑、線狀硬皮病皮下萎縮、鞍鼻畸形、龍貝格病或單側聲帶麻痺。
[0025]還提供了包含經代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物，其中經代謝的細胞提取物是由酵母細胞代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，細胞提取物源自動物細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自皮膚細胞。在另一個實施方案中，細胞提取物源自成纖維細胞。在一些實施方案中，組合物是可注射組合物或局部組合物。在一些實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在其他實施方案中，經代謝的調節生長培養基被封裝在密封劑內。在一個實施方案中，密封劑是脂質體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。在一些實施方案中，組合物用於治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。
[0026]在其他實施方案中，組合物用於治療或防止外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。在一些實施方案中，外觀缺陷是眉間皺眉線、深鼻唇溝摺痕、嘴邊地理皺紋、雙頰凹陷或乳房發育不全。在一些實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預防或減少環境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量；促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在一些實施方案中，後天缺陷是創傷後、手術後或感染後發生的醫療病狀。在其他實施方案中，後天缺陷是醫療程序後缺陷。在其他實施方案中，後天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎縮、角化性病變、去核眼睛中眼球內陷、面部痤瘡凹坑、線狀硬皮病皮下萎縮、鞍鼻畸形、龍貝格病或單側聲帶麻痺。在其他實施方案中，組合物用於治療或防止細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。
[0027]本文還提供通過包括以下的工藝製備的經代謝的經調節的生長培養基:
[0028](a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基和從經培養的細胞除去經調節的生長培養基；
[0029](b)培養酵母細胞；
[0030](C)將酵母細胞暴露於經調節的生長培養基；
[0031](d)培養酵母細胞以使經調節的生長培養基的至少一部分代謝；和
[0032](e)收集經代謝的經調節的生長培養基。在一些實施方案中，在以上工藝中使用的酵母是畢赤酵母(Pichia genus)。在其他實施方案中,酵母是巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。在其他實施方案中，步驟(a)中的細胞是皮膚細胞。在其他實施方案中，步驟(a)中的細胞是成纖維細胞。在其他實施方案中，步驟(a)中的細胞是動物細胞。在其他實施方案中，製備經代謝的經調節的生長培養基的工藝還包括(e)處理經代謝的經調節的生長培養基，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基包括(a)或(b)的培養步驟中的連續流系統或生物反應器系統。在其他實施方案中，細胞被懸浮或漂浮在生長培養基中。
[0033]本文提供了用於製備以上經代謝的經調節的生長培養基的工藝，該工藝包括:
[0034](a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基和從經培養的細胞除去經調節的生長培養基；
[0035](b)培養酵母細胞；
[0036](C)將酵母細胞暴露於經調節的生長培養基；
[0037](d)培養酵母細胞以使經調節的生長培養基的至少一部分代謝；和
[0038](e)收集經代謝的經調節的生長培養基。在一個實施方案中，提供了包含經代謝的經調節的生長培養基和可接受的載體的組合物。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在。在其他實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約10%至約20%的量存在。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.01%、0.5%、
1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一個非限制性實例中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在其他實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調節劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養製品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在一些實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在其他實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基被封裝在密封劑內。在一些實施方案中，密封劑是脂質體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。
[0039]本文還提供了通過包括以下的工藝製備的經代謝的細胞提取物:
[0040](a)提供細胞提取物；
[0041](b)培養酵母細胞；
[0042](c)將酵母細胞暴露於細胞提取物；
[0043](d)培養酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和
[0044](e)收集經代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在其他實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在其他實施方案中，細胞提取物源自皮膚細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自成纖維細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自動物細胞。在其他實施方案中，工藝還包括(e)處理經代謝的細胞提取物，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一個實施方案中，培養包括連續流系統或生物反應器系統。
[0045]在其他實施方案中，用於製備以上經代謝的細胞提取物的工藝包括:
[0046](a)提供細胞提取物；
[0047](b)培養酵母細胞；
[0048](C)將酵母細胞暴露於細胞提取物；
[0049](d)培養酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和
[0050](e)收集經代謝的細胞提取物。
[0051]本文還提供了包含以下的組合物:可接受的載體和通過包括以下的工藝製備的經代謝的經調節的生長培養基:
[0052](a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基和從經培養的細胞除去經調節的生長培養基；
[0053](b)培養酵母細胞；
[0054](C)將酵母細胞暴露於經調節的生長培養基；
[0055](d)培養酵母細胞以使經調節的生長培養基的至少一部分代謝；和
[0056](e)收集經代謝的經調節的生長培養基。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在其他實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在一些實施方案中，步驟(a)中的細胞是皮膚細胞。在其他實施方案中，步驟(a)中的細胞是成纖維細胞。在又一個實施方案中，步驟(a)中的細胞是動物細胞。在一些實施方案中，工藝還包括(e)處理經代謝的經調節的生長培養基，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一些實施方案中，步驟(a)或(b)的培養包括連續流系統或生物反應器系統。在其他實施方案中，細胞被懸浮或漂浮在生長培養基中。在其他實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在。在其他實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在。在其他實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一個非限制性實例中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在其他實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調節劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養製品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在其他實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在其他實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基被封裝在密封劑內。在一個實施方案中，密封劑是脂質體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。
[0057]本文還提供了包含以下的組合物:可接受的載體和通過包括以下的工藝製備的經代謝的細胞提取物:
[0058](a)提供細胞提取物；
[0059](b)培養酵母細胞；
[0060](c)將酵母細胞暴露於細胞提取物；
[0061](d)培養酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和
[0062](e)收集經代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在其他實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在其他實施方案中，細胞提取物源自皮膚細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自成纖維細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自動物細胞。在一個實施方案中，工藝還包括(e)處理經代謝的細胞提取物，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在另一個實施方案中，培養包括連續流系統或生物反應器系統。在其他實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在。在又一個實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在。在其他實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在。在一些實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約10%至約20%的量存在。在一些實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 的量存在。在一個非限制性實例中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在一個實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調節劑、潤膚劑、臘、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養製品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在其他實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在又一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在一個實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基被封裝在密封劑內。在另一個實施方案中，密封劑是脂質體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。
[0063]本文還提供了用於防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的包含以下的組合物:可接受的載體和通過包括以下的工藝製備的經代謝的經調節的生長培養基:
[0064](a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基和從經培養的細胞除去經調節的生長培養基；
[0065](b)培養酵母細胞；
[0066](C)將酵母細胞暴露於經調節的生長培養基；
[0067](d)培養酵母細胞以使經調節的生長培養基的至少一部分代謝；和
[0068](e)收集經代謝的經調節的生長培養基。在一個實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷。在另一個實施方案中，病狀是脫髮。在另一個實施方案中，病狀是先天性缺陷或後天缺陷。在一個實施方案中，後天缺陷是創傷後、手術後或感染後發生的醫療病狀。在另一個實施方案中，後天缺陷是醫療程序後缺陷。在又一個實施方案中，後天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎縮、角化性病變、去核眼睛中眼球內陷、面部痤瘡凹坑、線狀硬皮病皮下萎縮、鞍鼻畸形、龍貝格病或單側聲帶麻痺。在一個實施方案中，外觀缺陷是眉間皺眉線、深鼻唇溝摺痕、嘴邊地理皺紋、雙頰凹陷或乳房發育不全。在某些實施方案中，病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種症狀或病狀改善至少2倍。一種或多種症狀或病狀的改善倍數包括但不限於3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之間的任何數量。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致改善約1%至約100%、約10%至約90%、約20%至約80%、約30%至約70%、約40%至約60%、或約50%。在其他實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種症狀或病狀改善約5%、約10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約100%、約125%、約150%或一種或多種症狀或病狀改善更多。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在一些實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在一個實施方案中，步驟(a)中的細胞是皮膚細胞。在另一個實施方案中，步驟(a)中的細胞是成纖維細胞。在一些實施方案中，步驟(a)中的細胞是動物細胞。在其他實施方案中，工藝還包括(e)處理經代謝的經調節的生長培養基，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一個實施方案中，步驟(a)或(b)的培養包括連續流系統或生物反應器系統。在另一個實施方案中，細胞被懸浮或漂浮在生長培養基中。在其他實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在組合物中。在另一個實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在組合物中。在一個實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在組合物中。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約10%至約20%的量存在。在一些實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一個非限制性實例中，經代謝的經調節的生長培養基以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在一些實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調節劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養製品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、甾族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在一個實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在另一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在一個實施方案中，經代謝的經調節的生長培養基被封裝在密封劑內。在一些實施方案中，密封劑是脂質體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。在一些實施方案中，至少一種胞外基質蛋白通過將組合物施用至受試者而上調。在一些實施方案中，胞外基質蛋白被上調約5%至約100%。在一個實施方案中，胞外基質蛋白被上調約10%至約50%。在另一個實施方案中，胞外基質蛋白被上調約60%至約100%。在又一個實施方案中，胞外基質蛋白被上調約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95% 或約 100%。在一個實施方案中，胞外基質蛋白是膠原蛋白或賴氨醯基羥化酶蛋白。在一些實施方案中，胞外基質蛋白被C0L4A1基因或PLODl基因編碼。在其他實施方案中，至少一種修復蛋白通過將組合物施用至受試者而上調。在一個實施方案中，修復蛋白被上調約10%至約70%。在另一個實施方案中，修復蛋白被上調約25%至約50%。在一些實施方案中，修復蛋白被上調約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%。在一個實施方案中，修復蛋白是纖連蛋白。在又一個實施方案中，修復蛋白被FNl基因編碼。在一些實施方案中，至少一種細胞連接蛋白通過將組合物施用至受試者而上調。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調約5%至約200%。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調約10%至約80%。在一些實施方案中，細胞連接蛋白被上調約30%至約50%。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 110%、約 120%、約 130%、約140%、約150%、約160%、約170%、約180%、約190%或約200%。在其他實施方案中，細胞連接蛋白是內披蛋白。在一些實施方案中，細胞連接蛋白被IVL基因編碼。在一個實施方案中，至少一種抗氧化蛋白通過將組合物施用至受試者而上調。在又一個實施方案中，抗氧化蛋白被上調約5%至約300%。在一些實施方案中，抗氧化蛋白被上調約10%至約50%。在其他實施方案中，抗氧化蛋白被上調約200%至約250%。在一些實施方案中，抗氧化蛋白被上調約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 125%、約 150%、約 175%、約200%、約250%或約300%。在一個實施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在另一個實施方案中，抗氧化蛋白被S0D2基因編碼。
[0069]本文還提供了用於防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的包含以下的組合物:可接受的載體和通過包括以下的工藝製備的經代謝的細胞提取物:[0070](a)提供細胞提取物；
[0071](b)培養酵母細胞；
[0072](c)將酵母細胞暴露於細胞提取物；
[0073](d)培養酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和
[0074](e)收集經代謝的細胞提取物。
[0075]在一個實施方案中，病狀是外觀缺陷。在另一個實施方案中，病狀是脫髮。在另一個實施方案中，病狀是先天性缺陷或後天缺陷。在一個實施方案中，後天缺陷是創傷後、手術後或感染後發生的醫療病狀。在另一個實施方案中，後天缺陷是醫療程序後缺陷。在又一個實施方案中，後天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎縮、角化性病變、去核眼睛中眼球內陷、面部痤瘡凹坑、線狀硬皮病皮下萎縮、鞍鼻畸形、龍貝格病或單側聲帶麻痺。在一個實施方案中，外觀缺陷是眉間皺眉線、深鼻唇溝摺痕、嘴邊地理皺紋、雙頰凹陷或乳房發育不全。在某些實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天醫療缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種症狀或病狀改善至少2倍。一種或多種症狀或病狀的改善倍數包括但不限於，3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之間的任何數量。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致改善約1%至約100%、約10%至約90%、約20%至約80%、約30%至約70%、約40%至約60%、或約50%。在其他實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種症狀或病狀改善約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 100%、約 125%、約150%或一種或多種症狀或病狀改善更多。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在一些實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在一個實施方案中，步驟(a)中的細胞源自皮膚細胞。在另一個實施方案中，步驟(a)中的細胞源自成纖維細胞。在一些實施方案中，步驟(a)中的細胞源自動物細胞。在其他實施方案中，工藝還包括(e)處理經代謝的細胞提取物，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一個實施方案中，步驟(a)或(b)的培養包括連續流系統或生物反應器系統。在另一個實施方案中，細胞被懸浮或漂浮在生長培養基中。在其他實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在組合物中。在另一個實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在組合物中。在一個實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在組合物中。在一些實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約10%至約20%的量存在。在一些實施方案中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一個非限制性實例中，經代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在一些實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調節劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養製品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在一個實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在另一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在一個實施方案中，經代謝的細胞提取物被封裝在密封劑內。在一些實施方案中，密封劑是脂質體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。在一些實施方案中，至少一種胞外基質蛋白通過將組合物施用至受試者而上調。在一些實施方案中，胞外基質蛋白被上調約5%至約100%。在一個實施方案中，胞外基質蛋白被上調約10%至約50%。在另一個實施方案中，胞外基質蛋白被上調約60%至約100%。在又一個實施方案中，胞外基質蛋白被上調約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%。在一個實施方案中，胞外基質蛋白是膠原蛋白或賴氨醯基羥化酶蛋白。在一些實施方案中，胞外基質蛋白被C0L4A1基因或PLODl基因編碼。在其他實施方案中，至少一種修復蛋白通過將組合物施用至受試者而上調。在一個實施方案中，修復蛋白被上調約10%至約70%。在另一個實施方案中，修復蛋白被上調約25%至約50%。在一些實施方案中，修復蛋白被上調約5%、約10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%。在一個實施方案中，修復蛋白是纖連蛋白。在又一個實施方案中，修復蛋白被FNl基因編碼。在一些實施方案中，至少一種細胞連接蛋白通過將組合物施用至受試者而上調。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調約5%至約200%。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調約10%至約80%。在一些實施方案中，細胞連接蛋白被上調約30%至約50%。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調約5%、約10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 110%、約 120%、約 130%、約 140%、約 150%、約160%、約170%、約180%、約190%或約200%。在其他實施方案中，細胞連接蛋白是內披蛋白。在一些實施方案中，細胞連接蛋白被IVL基因編碼。在一個實施方案中，至少一種抗氧化蛋白通過將組合物施用至受試者而上調。在又一個實施方案中，抗氧化蛋白被上調約5%至約300%。在一些實施方案中，抗氧化蛋白被上調約10%至約50%。在其他實施方案中，抗氧化蛋白被上調約200%至約250%。在一些實施方案中，抗氧化蛋白被上調約5%、約10%、約15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 125%、約 150%、約 175%、約 200%、約 250% 或約300%ο在一個實施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在另一個實施方案中，抗氧化蛋白被S0D2基因編碼。
[0076]附圖簡述
[0077]圖1是表示由三維組織產品Transcyte?和Dermagraft?隨時間沉積的氨基葡聚糖和膠原的沉積的動力學的圖表。氨基葡聚糖的沉積體積取決於生長時間，而膠原的沉積不取決於生長時間。
[0078]圖2是表示胞外基質(從Transcyte?除去)和以1:2、1:5、1:10和1:100的稀釋度加入到人成纖維細胞和角質形成細胞的單層培養物的效果的圖表。所闡明的最顯著的效果是以基質的1:10稀釋度。[0079]圖3是表示暴露於經調節的培養基(先前已經支持細胞在Transcyte?中生長的細胞培養基)的人成纖維細胞和角質形成細胞的相對增殖的圖表。在少至三天顯示細胞響應的增加。
[0080]圖4是表明細皺紋和粗皺紋的研究員評估的圖表。在所有訪問中觀察到細皺紋和粗皺紋的平均分數的顯著下降(全部P〈0.0001)。在每一個數據組，在左邊示出細皺紋評估，且在右邊示出粗皺紋評估。
[0081]圖5是表明膚色、緊緻度和發光度的研究員評估的圖表。在所有訪問中皮膚緊緻度、膚色和發光度的平均分數顯著改善(全部P <0.02)。在每一個數據組，在左邊示出第4星期結果，在中間示出第8星期結果，且在右邊示出第12星期結果。
[0082]圖6是表明觸覺粗糙度的研究員評估的圖表。在所有訪問中皮膚緊緻度、膚色和發光度的平均分數顯著改善(全部P〈0.0001)。分別在左手列示出第4星期的從基線的百分數變化，在中間列示出第8星期的從基線的百分數變化和在右手列示出第12星期的從基線的百分數變化。
[0083]圖7是提供來自實施例18中所描述的12星期臨床使用(組合的/組合產品)研究的受試者自我評估問卷的第12星期的結果的圖表。
[0084]發明詳述
[0085]本公開內容涉及包含使用任何真核細胞類型或三維組織構建體培養的經代謝的經調節的生長培養基和/或經代謝的細胞提取物的新的組合物、以及使用組合物的方法。以單層或以三維培養細胞。細胞優選地是人且包括基質細胞、實質細胞、間充質幹細胞、肝儲備細胞、神經幹細胞、胰腺幹細胞和/或胚胎幹細胞。由細胞和組織培養物調節的培養基將包含各種天然分泌的蛋白，例如生物學活性生長因子。還公開了包含源自經調節的細胞培養基的產品的新的組合物和這些組合物的用途。
[0086]「預調節的」細胞培養基可以是充分地解決正被培養的細胞的營養需求的任何細胞培養基。細胞培養基的實例包括(但不限於)達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)、Ham』 sF12、RPMI1640、Iscove』 S、McCoy’s和本領域技術人員容易明白的其他培養基製劑，包括見於以下中的那些:Methods For Preparation of Media, Supplements and SubstrateFor Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss, New York (1984)和Cell & TissueCulture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, Englandl996,
們兩者通過引用以其整體併入本文。培養基可以被補充有支持所需的細胞或組織培養物所需的任何組分。另外，如果需要的話，可以加入血清例如牛血清，其是白蛋白、球蛋白、生長促進劑和生長抑制劑的複合溶液。血清應是不含病原體的且針對支原體細菌、真菌和病毒汙染而被仔細地篩過。此外，血清應通常從美國獲得而不是從本地牲畜攜帶可遞送的劑的國家獲得。激素加入到培養基中可能是期望的或可能不是期望的。培養基還可以是不含血清的，即，細胞在沒有血清補充物的情況下生長。
[0087]「經調節的生長培養基」可以是如本文所公開調節的任何生長培養基，且可以被製備，例如如在美國專利第6，372，494號；第7，118，746號；第7，160，726號中所公開的，它們全部通過引用以其整體併入本文。
[0088]其他成分例如維生素、生長和附著因子、蛋白等，可以由本領域技術人員根據他的或她的特定需要來選擇。在一些實施方案中，可以使用適合於實現所需的經調節的培養基的任何細胞類型。基因工程細胞可以用於培養培養基。這樣的細胞可以被修飾，例如，以表達一種或多種所需的蛋白，使得一種或多種被表達的蛋白在培養基中的濃度被優化用於特定的所需應用。根據本公開內容，用於調節培養基的細胞和組織培養物可以被設計為表達目標基因產物，該目標基因產物可以給予各種各樣的功能，包括(但不限於)類似於生理反應的表達蛋白的改善的性質、可用於具體應用的特定蛋白的增加的表達，例如創傷癒合或抑制某些蛋白例如蛋白酶、乳酸等。
[0089]細胞可以被設計成表達目標基因產物，目標基因產物是生物學活性的，提供所選擇的生物學功能，作為選擇的生理情況的報告基因，增加基因產物的缺乏的或有缺陷的表達，或提供抗病毒、抗菌、抗微生物或抗癌活性。根據本公開內容，目標基因產物可以是肽或蛋白，例如酶、激素、細胞因子、抗原、或抗體、調節蛋白例如轉錄因子或DNA結合蛋白、結構蛋白例如細胞表面蛋白，或目標基因產物可以是核酸例如核糖體或反義分子。目標基因產物包括(但不限於)增強細胞生長的基因產物。例如，遺傳修飾可以上調內源性蛋白，通過表達異種離子通道或改變內源性離子通道功能而引入新的蛋白或調節離子濃度。實例包括(但不限於)基因組織，其表達被全身遞送的基因產物(例如，分泌的基因產物例如蛋白，包括生長因子、激素類、因子VII1、因子IX、神經遞質和腦啡肽)。
[0090]在一些實施方案中，使細胞根據技術人員已知的任何方法以二維單層生長。參見，例如，細胞培養技術，諸如在以下中描述的那些=Sambrook J等人(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第三版)；Goeddel 編輯(1990)Methods inEnzymologyl85, Current Protocols In Molecular Biology ;F.M.Ausubel 等人編輯，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons, Inc.(1994，增訂直到 1999) ；Animal Cell Culture:A PracticalApproach (Freshney 編輯 1986)。
[0091]在一些實施方案中，細胞在三維基質支撐物上生長並以多層生長，形成細胞基質。該基質系統比先前所描述的單層組織培養系統在更大的程度上接近體內存在的生理狀態。三維培養物例如 Dermagraft? (Advanced Tissue Sciences, Inc.，LaJolla, CA) 「Dermagra勝」和 TransCyte?(Smith & Nephew, PLC, UnitedKingdom) 「Transcyte?」，產生許多生長因子和以生理比率和濃度分泌到培養基中的其他蛋白。Dermagraft?主要由在可生物降解的羥乙酸乳酸聚酯(polyglactin)上培養的異源新生成纖維細胞組成。TransCyte?是包括結合至過渡覆蓋物的三維基質組織的臨時活的皮膚替換物，如美國專利5，460，939中所描述的。另外，調節細胞培養基的三維組織培養物可以包含許多組織類型中見到的間充質幹細胞、肝儲備細胞、神經幹細胞、胰腺幹細胞、和/或胚胎幹細胞和/或實質細胞和/或實質幹細胞，組織類型包括(但不限於)骨髓、皮膚、肝、胰腺、腎、腎上腺和神經組織，以及胃腸道和泌尿生殖道組織、和循環系統。參見美國專利第 4，721，096 號；第 4，963，489 號；第 5，032，508 號；第 5，266，480 號；第 5，160，490 號；和第5，559，022號，它們中的每一個通過引用以其整體併入本文。
[0092]1.定義
[0093]本文使用的以下術語將具有所指示的意思:
[0094]細胞:包括來自任何有機體的細胞,有機體包括動物、植物、真菌、原生生物或無核原蟲類。在一個實施方案中，細胞源是動物或植物。在另一個實施方案中，動物是哺乳動物。在另一個實施方案中，哺乳動物是人。
[0095]細胞提取物:包括可以或不可以包括細胞微粒物質的溶解的或碎裂的細胞內容物。
[0096]粘附層:直接附接至三維支撐物或通過附著於本身直接附接至支撐物的細胞而間接連接的細胞。
[0097]經調節的培養基:包含胞外蛋白和細胞代謝物的製劑，其先前已經支持任何所需的真核細胞類型的生長，所述細胞已經以二維或三維被培養。還稱為「經調節的細胞培養基」或「經調節的細胞和組織培養基」。
[0098]基質細胞:具有或不具有疏鬆結締組織中存在的其他細胞和/或成分的成纖維細胞，包括(但不限於)內皮細胞、周細胞、巨噬細胞、單核細胞、漿細胞、肥大細胞、脂肪細胞、間充質幹細胞、肝儲備細胞、神經幹細胞、胰腺幹細胞、軟骨細胞、前軟骨細胞(prechondrocyte)等。
[0099]組織特有的或實質細胞:形成器官的不同於其支持骨架的必需和區別的組織的細胞。
[0100]二維細胞培養物:以單層(例如)在平旦表面等上培養的細胞。
[0101]三維骨架:三維支架主要由任何材料和/或形狀組成，所述材料和/或形狀(a)允許細胞附接至其(或可以被修飾為允許細胞附接至其)；和(b)允許細胞以多於一層生長。該支撐物接種有基質細胞以形成活的三維基質組織。骨架的結構可以包括網、海綿或可以由水凝膠形成。
[0102]三維基質組織或活的基質基質:已經接種有在支撐物上生長的基質細胞的三維骨架。由基質細胞加工的胞外基質蛋白沉積到骨架上，因此形成活的基質組織。活的基質組織可以支持稍後接種的組織特有的細胞的生長，以形成三維細胞培養物。
[0103]組織特有的三維細胞培養物或組織特有的三維構建體:已經接種有組織特有的細胞並被培養的三維活的基質組織。一般而言，用於接種三維基質的組織特有的細胞應包括該組織的「幹」細胞(或「儲備」細胞)；即，產生將成熟為形成組織實質的特有細胞的新細胞的那些細胞。
[0104]以下縮寫將具有所指示的意思:
[0105]BCS=小牛血清
[0106]BFU-E=紅系爆式形成單位
[0107]TGF-β =轉化生長因子-β
[0108]CFU-C=培養集落形成單位
[0109]CFU-GEMM=粒細胞、紅細胞、單核細胞、巨核細胞集落形成單位
[0110]CSF=集落刺激因子
[0111]DMEM=達爾伯克改良伊格爾培養基
[0112]EDTA=乙二胺四乙酸
[0113]FBS=胎牛血清
[0114]FGF=成纖維細胞生長因子
[0115]GAG=葡胺聚糖
[0116]GM-CSF=粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子[0117]HBSS=漢克平衡鹽溶液
[0118]HS=馬血清
[0119]IGF=胰島素樣生長因子
[0120]LTBMC=長期骨髓培養
[0121]MEM=最低必需培養基
[0122]PBL=外周血白細胞
[0123]PBS=磷酸鹽緩衝鹽水
[0124]F1DGF=血小板衍生生長因子
[0125]RPMI1640=洛斯維帕克紀念研究所培養基編號1640 (GIBCO, Inc.，GrandIsland, N.Y.)
[0126]SEM=掃描電子顯微術
[0127]VEGF=血管內皮生長因子
[0128]11.經代謝的經調節的生長培養基和經代謝的細胞提取物
[0129]在一個實施方案中，本公開內容提供通過包括以下的工藝製備的經代謝的經調節的生長培養基:(a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞以形成經調節的生長培養基和從經培養的細胞除去經調節的生長培養基；(b)培養酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露於經調節的生長培養基；(d)培養酵母細胞以使經調節的生長培養基的至少一部分代謝；和(e)收集經代謝的經調節的生長培養基。在一些實施方案中，細胞可以源自植物和/或動物源，包括人。
[0130]在另一個實施方案中，本公開內容提供通過包括以下的工藝製備的經代謝的細胞提取物:(a)提供細胞提取物；(b)培養酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露於細胞提取物；(d)培養酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和(e)收集經代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，細胞提取物通過以下來獲得:在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養細胞和從生長培養基除去所得到的細胞提取物。在一些實施方案中，細胞可以源自植物和/或動物源，包括人。
[0131]使胞外蛋白在經調節的生長培養基或細胞提取物例如生長因子、細胞因子和應激蛋白中代謝，在以下中打開了新的可能性:製備用於包括組織修復的各種各樣領域的產品，例如，治療創傷和其他組織缺陷例如外觀缺陷以及人和動物供給補充物。例如，已知生長因子在創傷癒合過程中起到重要的作用。通過本公開內容的代謝工藝將這些生長因子的至少一種活性給予經調節的細胞培養基或細胞提取物。
[0132]細胞的細胞因子和生長因子涉及到許多關鍵的細胞過程，包括細胞增殖、粘附、形態學外觀、分化、遷移、炎症反應、血管生成、和細胞死亡。研究已經證明，缺氧應激和對細胞的損傷誘導包括mRNA和蛋白的水平增加的響應，蛋白相應於生長因子例如I3DGF (血小板衍生生長因子)、VEGF (血管內皮生長因子)、FGF (成纖維細胞生長因子)和IGF (胰島素樣生長因子)(Gonzalez-Rubio, M.等人，1996，Kidney Int.50 (I):164-73 ；Abramovitch, R.等人，1997，Int J Exp.Pathol.78(2):57-70 ；Stein, 1.等人，1995，Mol Cell Biol.15(10):5363-8 ；Yang, ff.等人，1997，FEBS Lett.403 (2):139-42 ；ffest, N.R.等人，1995，J.Neurosc1.Res.40(5):647-59)。
[0133]生長因子，例如轉化生長因子，還稱為TGF-β，由某些應激蛋白在創傷癒合期間誘導。兩種已知的應激蛋白是GRP78和HSP90。這些蛋白穩定細胞結構且使細胞對不利狀態有抵抗力。二聚蛋白的TGF-β家族包括TGF-β 1、TGF-02和TGF-03且調節許多細胞類型的生長和分化。此外，該蛋白家族展示各種生物效應，刺激一些細胞類型的生長(Noda等人，1989，EndocrinologylM =2991-2995)和抑制其他細胞類型的生長(Goey 等人，1989, J.1mmunol.143:877-880 ；Pietenpol 等人，1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87 =3758-3762) 0還示出TGF-β增加包括膠原和纖連蛋白的胞外基質蛋白的表達(Ignotz 等人，1986, J.Biol.Chem.261:4337-4345)和加速創傷的癒合(Mustoe 等人，1987，Science迎1:1333-1335)。
[0134]另一種這樣的生長因子是H)GF。I3DGF最初被發現是間葉細胞衍生的細胞的有效促細胞分裂劑(Ross R.等人，1974，Proc.Natl.Acad.Sc1.USAU(4):1207-1210 ；KohlerN.等人，1974，Exp.Cell Res.87 =297-301) 0另外的研究已經表明，PDGF增加組織形成中的細胞構成和肉芽形成的速率。用I3DGF治療的創傷具有早期炎症反應的出現，包括中性白細胞和巨噬細胞類型在創傷部位處的增加。這些創傷還示出增強的成纖維細胞功能(Pierce, G.F.等人，1988.J.Exp.Med.167:974-987)。 PDGF 和 TGF-β 兩者均已經在動物研究中被示出增加膠原形成、DNA含量和蛋白水平(Grotendorst, G.R.等人，1985，J.Clin.1nvest.76:2323-2329 ；Sporn, Μ.B.等人，1983，Science (Wash DC)迅豆:1329)。已經表明TOGF在治療人創傷中是有效的。在人創傷中，TOGF-AA表達在經歷癒合的壓力潰瘍內增加。I3DGF-AA的增加相應於創傷的活化成纖維細胞、胞外基質沉積和有效血管形成的增加。此外，在慢性非癒合創傷中沒有看到F1DGF-AA的這樣的增加(Principles of TissueEngineering, R.Lanza 等人(編輯)，第 133-141 頁(R.G.Landes C0.TX1997)。具有誘導血管生成和創傷癒合的能力的許多其他生長因子包括VEGF、KGF和鹼性FGF。
[0135]A.牛.長培養基
[0136]用於細胞培養的生長培養基製劑在文獻中是熟知的，且許多是商購的。
[0137]預調節的培養基成分包括(但不限於)下面所描述的那些。另外，成分的濃度是本領域普通技術人員熟知的。參見，例如上文的Methods For Preparation OfMedia, Supplements and Substrate for Serum-free Animal Cell Cultures, supra。成分包括胺基酸(D-胺基酸和/或L-胺基酸兩者)，例如穀氨酸鹽、丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、半胱氨酸、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸以及它們的衍生物；酸溶性亞組例如硫胺、抗壞血酸、正鐵化合物、亞鐵化合物、嘌呤、穀胱甘肽和磷酸二氫鈉。
[0138]另外的成分包括糖、脫氧核糖、核糖、核苷、水溶性維生素、核黃素、鹽、微量金屬、脂質、乙酸鹽、磷酸鹽、HEPES、酚紅、丙酮酸鹽和緩衝劑。
[0139]常常使用在培養基製劑中的其他成分包括脂溶性維生素(包括A、D、E和K)類固醇和它們的衍生物、膽固醇、脂肪酸和脂質、吐溫80、2_巰基乙醇嘧啶以及各種補充物，包括血清(胎兒的，馬、小牛等)、蛋白(胰島素、轉鐵蛋白、生長因子、激素類等)、抗生素(慶大黴素、青黴素、鏈黴素、兩性黴素B等)、全蛋超濾液和附著因子(纖連蛋白、玻連蛋白、膠原、昆布氨酸、肌腱蛋白(tenascin)等)。
[0140]培養基可以需要或可以不需要補充有生長因子和其他蛋白例如附著因子，因為許多細胞構建體尤其是本申請中描述的三維細胞和組織培養物構建體本身將這樣的生長因子和附著因子以及其他產物加工到培養基中。
[0141]B.細朐培養物
[0142]1.細朐
[0143]任何細胞可以使用在細胞培養物中。例如，細胞可以是基質細胞、實質細胞、間充質幹細胞(血統定向或非定向的祖細胞)、肝儲備細胞、神經幹細胞、胰腺幹細胞和/或胚胎幹細胞。僅舉幾個例子，細胞可以包括(但不限於)骨髓、皮膚、肝、胰腺、腎、神經組織、腎上腺、黏膜上皮和平滑肌。包括基質的成纖維細胞和成纖維細胞樣細胞以及其他細胞和/或成分在來源上可以是胎兒的或成人的，且可以源自適宜的源例如皮膚、肝、胰腺、黏膜、動脈、靜脈、臍帶和胎盤組織等。這樣的組織和/或器官可以通過適當的活組織切片或在屍體解剖之後獲得。實際上，屍體器官可以用於提供基質細胞和成分的豐富供應。
[0144]包括基質的胚胎幹細胞和/或其他成分可以使用本領域已知的方法來分離。例如，最近，人胚胎幹細胞種群以及分離和使用這些細胞的方法已經被報告在Keller等人，Nature Med., 5:151-152 (1999), Smith Curr.Biol.8:R802-804 (1998)中；已經從原生殖細胞被分離，Shamblatt等人，PNAS95:13726-1373 (1998)；已經從胚細胞被分離，Thomason等人，Science282:1145-1147(1988)。間充質幹細胞的分離和培養是本領域已知的。參見Mackay 等人，Tissue Eng.4:415-428 (1988) ;William 等人,Am Surg.65:22-26 (1999)。這些細胞的接種在下文描述在部分5.3中。同樣地，神經幹細胞可以在以下中描述的方式被分離:Flax 等人，Nature Biotechnol., 16: 1033-1039 (1998);和 Frisen 等人，Cell.Mol.Life Sc1.，54:935-945(1998)。
[0145]細胞可以本領域已知的任何方式來培養，包括以單層、珠或以三維和通過任何方式(即，培養容器、滾瓶、連續流系統等)。細胞和組織培養的方法是本領域熟知的，且被描述在例如上文的 Cell & Tissue Culture:Laboratory Procedures, supra,下文的Freshney(1987), Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques, infra。
[0146]一般而言，利用的細胞系被仔細地篩選人和動物病原體。取決於應用，當僅不含病原體的細胞是可接受的時(例如，對於創傷癒合、食物添加劑等)，這樣的篩選可以具有關鍵的重要性。篩選病原體的方法是本領域熟知的。細胞類型，無論是以二維還是三維被培養，將影響經調節的培養基的性質。在一些實施方案中，細胞以二維被培養。在其他實施方案中，細胞以三維被培養。
[0147]a.某因工稈細朐
[0148]在一些實施方案中，細胞可以作為用於將基因產物引入到促進例如組織缺陷的修復和/或再生的培養基或提取物中的媒介物。細胞可以被基因工程為表達(例如)炎性媒介物例如IL-6、IL-8和G-CSF。細胞還可以或可選擇地被基因工程為表達抗炎因子，例如，抗 GM-CSF、抗 TNF、抗 IL-1、抗 IL-2 等。
[0149]在另一個實施方案中，細胞可以被基因工程為將基因表達到將發揮治療作用的培養基或提取物中，例如，在TGF-β的生產中以刺激軟骨生產，或其他因子例如BMP-13以促進軟骨形成、或促進基質細胞的遷移和/或基質沉積的刺激因子。因為構建體包括真核細胞，所以基因產物將被適當地表達和加工以形成活性產物。優選地，使用的表達控制成分應允許基因的調節表達，使得產物可以在培養物中被過度合成。通常，所選擇的翻譯啟動子和具體地啟動子成分，部分地取決於培養的組織和細胞的類型。能夠分泌蛋白的細胞和組織是優選的(例如，具有大量糙面內質網和高爾基體細胞器的那些)。過渡生產的基因產物然後將由工程細胞分泌到經調節的培養基中。
[0150]細胞可以被基因工程為調節一個或多個基因；或基因表達的調節可以是短暫的或長期的；或基因活性可以是不可誘導的或可誘導的。
[0151]細胞還可以被基因工程為「破壞(knock out) 」促進炎症的因子的表達。在下面討論用於降低目標基因表達水平或目標基因產物活性水平的負調節技術。如本文使用的「負調節」是指相對於在沒有調節處理的情況下的目標基因產物的水平和/或活性，目標基因產物的水平和/或活性下降。原產於該細胞的基因的表達可以使用許多技術來降低或破壞，例如，表達可以通過使用標準同源重組技術使完全基因失活(通常稱為「擊昏」)來抑制。通常，編碼蛋白的重要的區的外顯子(或該區的外顯子5』)由陽性可選擇的標記物(例如neo)間隔，阻止從目標基因生產正常mRNA且導致基因的失活。基因還可以通過在基因的一部分中產生缺失或失活插入，或通過刪除整個基因而失活。通過將具有兩個同源性的區域的構建體用於在基因組中遠離的目標基因，插入兩個區域的序列可以被刪除。Mombaerts等人，1991，Proc.Nat.Acad.Sc1.U.S.A.88:3084-3087?可選擇地，基因還可以通過刪除上遊或下遊表達成分而失活。
[0152]抑制目標基因的表達的反義分子和核酶分子還可以用於降低目標基因活性的水平。例如，抑制主要組織適合性基因群(HLA)的表達的反義RNA分子已經被表明關於免疫響應是最通用的。此外，適當的核酶分子可以被設計，如由例如Haseloff等人，1988，Nature—:585-591 ;Zaug 等人，1984，SciencegM:574-578 ;和 Zaug 和Cech, 1986，Science益1:470-475所描述的。更進一步地，三鏈螺旋分子可以用於降低目標基因活性的水平。這些技術由L.G.Davis等人編輯，Basic Methods in MolecularBiology,第 2 版，Appleton & Lange, Norwalk, Conn.1994 詳細地描述。
[0153]可用於對細胞進行基因工程的方法是本領域熟知的且在共同在審的美國專利4，963，489和5，785，964中進一步詳述，兩個專利的公開內容通過引用併入本文。例如，包含外源核酸例如編碼所關心的基因產物的重組體DNA構建體或支撐物，可以被構建和用於轉變或轉染基質細胞。攜帶外源核酸且能夠表達所述核酸的這樣的轉變的或轉染的細胞，被選擇且以本公開內容的三維構建體克隆擴展。
[0154]用於製備包含所關心的基因的DNA構建體的方法、用於轉化或轉染細胞的方法，和用於選擇攜帶並表達所關心的基因的細胞的方法是本領域熟知的。參見，例如，在以下中描述的技術:Maniatis 等人，1989, Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;Ausubel 等人，1989，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates &Wiley Interscience, N.Y.;和 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.。
[0155]細胞可以使用任何各種載體中的任何來設計，載體包括但不限於，整合病毒載體，例如，還原病毒載體或腺相關病毒載體；或非整合複製載體，例如，乳頭狀瘤病毒載體、SV40載體、腺病毒載體；或複製缺陷型病毒載體。當需要短暫表達時，非整合載體和複製缺陷型載體可能是優選的，因為可誘導的或構成的啟動子可以在這些系統中用於控制所關心的基因的表達。可選擇地，整合載體可以用於獲得短暫表達，只要所關心的基因受可誘導的啟動子控制。將DNA引入細胞中的其他方法包括使用脂質體、脂轉染、電穿孔、基因槍、或通過直接的DNA注射。
[0156]細胞優選地用核酸例如DNA來轉變或轉染，通過一種或多種適當的表達控制成分例如啟動子或增強子序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸部位以及其他、和可選擇的標記物來控制，即，與它們處於操作結合。在引入外來DNA之後，工程細胞可以允許在富集培養基中生長且然後轉到選擇的培養基。外來DNA中的可選擇的標記物給予針對選擇的抗性且允許細胞穩定地將外來DNA整合在諸如例如質粒上，進入它們的染色體並生長以形成灶，該灶又可以被克隆和擴展到細胞系。該方法可以有利地用於對將基因產物表達到培養基中的細胞系工程化。
[0157]任何啟動子可以用於驅動插入的基因的表達。例如，病毒啟動子包括(但不限於)CMV啟動子/增強子、SV40、乳頭狀瘤病毒、埃-巴二氏病毒、彈性蛋白基因啟動子和β-球蛋白。優選地，用於控制所關心的基因的表達的控制成分應允許基因的調節表達，使得產物僅當在體內需要時被合成。如果需要短暫表達，則構成的啟動子優選地用於非整合和/或複製缺陷型載體中。可選擇地，當需要時，可誘導的啟動子可以用於驅動插入的基因的表達。可誘導的啟動子可以建到整合和/或複製載體中。例如，可誘導的啟動子包括但不限於，金屬硫蛋白和熱休克蛋白。
[0158]根據一個實施方案，用於表達所關心的的外源基因的可誘導的啟動子是為如本文所公開的由於低溫保存和隨後的解凍而誘發的那些調節蛋白的天然啟動子的那些。例如，TGF-13、VEGF、或各種已知的熱休克蛋白的啟動子可以用作表達控制成分，即，可以可操作地結合至所關心的外源基因以在調節細胞培養基的組織構建體中表達所需的基因產物。
[0159]各種方法可以用於獲得被工程化到細胞中的基因產物的構成的或短暫的表達。例如，可以使用由Seldon等人，1987，Science236:714-718描述的轉核移植技術。如本文使用的「轉核」表明移植的細胞的核已經通過加入DNA序列通過穩定的或短暫的轉染而被改變。優選地，細胞被工程化為短暫地和/或在可誘導的控制下在手術後恢復時間期間表達這樣的基因產物，或被工程化為錨至基質細胞的嵌合融合蛋白，例如，被工程化為主要由受體或受體樣分子的細胞內和/或橫跨膜域組成的嵌合分子，作為胞外的域融合至基因產物。
[0160]此外，可能期望製備具有包含外來基因產物、生長因子、調節因子等的胞外基質的構建體，其然後在經調節的培養基中被發現。該實施方案是基於以下發現:在人基質細胞在三維支撐物骨架上生長期間，細胞在骨架上合成和沉積，原樣產生的人胞外基質在正常人組織中。胞外基質局部地由細胞分泌且不僅將細胞和組織結合在一起，而且影響其接觸的細胞的發育和行為。胞外基質包含各種結締組織蛋白，例如，在主要由氨基葡聚糖鏈的網絡組成的水合凝膠中交織的纖維形成蛋白。氨基葡聚糖是長的帶負電荷的多糖鏈的多相群，其(除了透明質酸)共價地鍵合至蛋白以形成蛋白聚糖分子。根據該實施方案，基質細胞可以被基因工程為表達所需的基因產物，或改變的基因產物形式，其將存在胞外基質中和最終存在細胞培養基中。
[0161]2.培養細朐
[0162]在一些實施方案中，細胞在二維細胞培養物中生長。在其他實施方案中，細胞在三維細胞培養物中生長。參見，例如，通過引用以其整體併入本文的美國專利第6，372，494號。用於細胞培養物中的基質細胞優選地包括成纖維細胞、間充質幹細胞、肝儲備細胞、神經幹細胞、胰腺幹細胞、和/或胚胎幹細胞，具有或不具有本文更充分地描述的另外的細胞和/或成分。
[0163]細胞可以通過本領域已知的任何方式來培養。優選地，在能夠實現無菌加工和處理的環境中培養細胞。細胞和組織培養的常規方式已經由於需要人監督和控制培養基而受限制。這限制了可以在單一時間培養的細胞和組織的量和從而限制了可以在單一時間獲得的經調節的細胞培養基的體積。由於該原因，優選的是，培養基以允許大規模生長(產生大規模經調節的培養基)的方式使用(例如)用於無菌大規模培養的設備，比如共同所有的美國專利5，763，267( 『267專利)中描述的設備來調節，為了所有的目的，通過引用以其整體併入本文。使用『267專利中描述的無菌封閉系統，將預調節的培養基從流體儲器運輸至入口歧管且均勻地分配至連續流系統中的培養物且可用於培養三維細胞和組織培養物，例如諸如Dermagraft#。特定地，『267專利中描述的設備包括多個柔性的或半柔性的處理室，該處理室包括一個或多個個體培養袋、多個硬的隔離物、入口流體歧管、出口流體歧管、流體儲器，和用於在系統內運輸流體的裝置。
[0164]在處理期間，將液體培養基從流體儲器運輸至入口歧管，入口歧管又將培養基均勻地分配至連接的處理室和內部培養袋中的每一個。還提供出口流體歧管以確保每一個處理室被均勻地填充和確保在處理期間形成的任何氣泡被從處理室除去。處理室是柔性的或半柔性的，以便在衝洗和應用培養的移植物期間提供便於最終用戶的處理。由於處理室的柔性，還提供硬的隔離物，硬的隔離物確保在處理期間在室內均勻的流體分布。
[0165]在另一個實施方案中，在用於組織培養物的無菌生長的設備中培養組織，如為了所有目的以其整體併入本文的美國專利第5，843，766 (『766專利)號中所描述的。『766專利公開了組織培養室，其中室是提供用於組織的生長的套管，組織可以在相同的無菌容器中生長，以冷凍形式被保存，和運往最終用戶。組織培養室包括套管，套管包括在套管內的基材，基材被設計為促進在基材的表面上的三維組織生長。套管包括幫助培養基的流入和流出的入口和出口。套管還包括至少一個流量分配器。在一個實施方案中，流量分配器是擋板，其用於分配在室內的培養基流以產生組織的連續的、均一的塊。在第二實施方案中，流量分配器是偏轉板、分配通道和流動通道的組合。在每一個實施方案中，套管還包括密封件以便確保在組織生長和儲存期間在室內部的無菌環境。
[0166]成纖維細胞將支持許多不同的細胞和組織在三維培養系統中生長，且因此，可以被接種到基質上以形成「一般的」基質支持基體，用於培養各種細胞和組織中的任一種。然而，在某些情況下，使用「特殊的」而不是「一般的」基質支持基體可能是優選的，在該情況下，基質細胞和成分可以從特定的組織、器官或個體獲得。此外，成纖維細胞和其他基質細胞和/或成分可以源自將在三維系統中培養的相同類型的組織。當培養組織時這可能是有利的，其中特殊的基質細胞可以起到特定的結構/功能作用，例如，動脈的平滑肌細胞、神經組織的神經膠質細胞、肝的庫柏法細胞等。
[0167]一旦接種到三維支撐物上，基質細胞將在骨架上增殖並沉積由基質細胞天然分泌的結締組織蛋白例如生長因子、調節因子和胞外基質蛋白。基質細胞和它們的天然分泌的結締組織蛋白基本上包圍骨架，因此形成活的基質組織，該活的基質組織將支持接種到本公開內容的三維培養系統中的組織特有的細胞的生長。實際上，當用組織特有的細胞接種時，三維基質組織將維持培養物的活躍增殖，持續長的時間段。重要地，因為網的開口允許培養物中的基質細胞離開，匯合的基質培養物沒有展示接觸抑制，且基質細胞繼續生長、分裂和保持功能上是活性的。
[0168]生長因子和調節因子由基質組織加工到培養基中。生長因子(例如但不限於，aFGF、PFGF、胰島素生長因子或TGF-β)、或天然的或改性的血液製品或其他生物活性的生物分子(例如但不限於，透明質酸或激素類)，增強三維骨架或支架的定植(colonization)並調節培養基。
[0169]在體內使用培養物之前可以改變基質細胞生長的程度，這取決於以三維組織培養生長的組織的類型。調節培養基的活的基質組織可以通過將它們植入體內而用作矯正結構。可選擇地，活的基質組織可以用另一種細胞類型接種並植入體內。基質細胞可以被基因工程為調節分泌到培養基中的蛋白產物的水平以提高從經調節的培養基獲得的回收產物的濃度。例如，基質細胞可以被基因工程為提高從經調節的培養基獲得的以下產物中的一種或多種的濃度。抗炎因子例如抗GM-CSF、抗TNF、抗IL-1、抗IL-2等。可選擇地，基質細胞可以被基因工程為「破壞」促進炎症的天然基因產物的表達，例如，GM-CSF, TNF、IL-UIL-2，或「破壞」 MHC的表達以便降低排斥的風險。
[0170]基質細胞以三維生長將維持基質細胞和組織特有的細胞兩者在培養物中的活躍增殖，持續比單層系統持續的時間更長的時間。此外，三維系統支持細胞在體外培養中的成熟、分化和分離，以形成類似於在體內發現的對應物的成人組織組分且將蛋白固定到更接近地類似生理比率的調節的培養基中。
[0171]a.三維基質組織的建立
[0172]三維支撐物或骨架可以是任何材料和/或形狀，該材料和/或形狀:(a)允許細胞附接至其(或可以被修飾為允許細胞附接至其)；和(b)允許細胞以多於一層生長。許多不同的材料可以用於形成骨架，包括但不限於:不可生物降解的材料，例如，尼龍(聚醯胺)、滌綸(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯基化合物(例如，聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE ;特氟隆)、thermanox(TPX)、硝酸纖維素、棉花；和可生物降解的材料，例如，聚乙醇酸(PGA)、膠原、膠原海綿、腸線、纖維素、明膠、葡聚糖、聚鏈烷酸酯等。這些材料中的任何可以例如被紡織、編織、針織等為網，以形成三維骨架。骨架又可以被塑造成矯正結構所需的任何形狀，例如管、繩、細絲等。某些材料例如尼龍、聚苯乙烯等是用於細胞附著的差的基材。當這些材料用作三維骨架時，可取的是在接種基質細胞之前預處理骨架以便增強基質細胞附著到支撐物。例如，在用基質細胞接種之前，尼龍骨架可以用0.1M乙酸來處理，並在聚賴氨酸、FBS和/或膠原中溫育以包覆尼龍。聚苯乙烯可以同樣地使用硫酸來處理。
[0173]當培養物被植入體內時，可以優選使用可生物降解的基質，例如諸如聚乙醇酸、膠原、膠原海綿、紡織膠原、腸線材料、明膠、聚乳酸、或聚乙醇酸和其共聚物。當培養物將被維持長的時間段或低溫保存時，不可降解的材料例如尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯類聚合物、特氟隆、棉花等可以是優選的。可以根據本公開內容使用的方便的尼龍網是ΝΠ?Χ?,其是具有210 μ m的平均孔徑和90 μ m的平均尼龍纖維直徑的尼龍過濾網(#3-210/36, Tetko, Inc.，N.Y.)。
[0174]具有或不具有下面所描述的其他細胞和成分的包括成纖維細胞、間充質幹細胞、肝儲備細胞、神經幹細胞、胰腺幹細胞和/或胚胎幹細胞的基質細胞，被接種到骨架上。此外，在疏鬆結締組織中存在的細胞連同成纖維細胞可以被接種到三維支撐物上。這樣的細胞包括但不限於平滑肌細胞、內皮細胞、周細胞、巨噬細胞、單核細胞、漿細胞、肥大細胞、月旨肪細胞等。如先前解釋，胎兒成纖維細胞可以用於形成將支持各種不同的細胞和/或組織的生長的「一般的」三維基質基體。然而，「特殊的」基質組織可以通過用源自將被培養的相同類型的組織和/或源自稍後接收根據三維系統在培養物中生長的細胞和/或組織的特定個體的成纖維細胞接種三維骨架來製備。
[0175]因此，在一個實施方案中，可以培養專門用於特定組織的基質細胞。例如，造血組織的基質細胞，包括但不限於成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞/單核細胞、脂肪細胞和網狀細胞，可以用於形成三維近匯合基質，用於在體外長期培養骨髓。造血基質細胞可以容易地通過以低的力例如3000xg離心從骨髓懸浮液中形成的「血沉棕黃層」獲得。在構成動脈的內壁的基質層中，可以加入高比例的未分化的平滑肌細胞以為蛋白提供彈性。肝的基質細胞可以包括成纖維細胞、庫柏法細胞、以及血管和膽管內皮細胞。同樣地，神經膠質細胞可以用作基質來支持神經細胞和組織的增殖；用於該目的的神經膠質細胞可以通過胚胎或成年腦的胰蛋白酶化或膠原酶消化來獲得(Ponten和Westermark, 1980,在Federof, S.Hertz,L.編輯「Advances in Cellular Neurobiology, ^ 第 I 卷，New York, AcademicPress，第209-227頁中)。細胞在三維基質細胞培養物中生長可以通過向骨架加入以下物質或用這些物質包覆支撐物來進一步增強:蛋白(例如，膠原、彈性纖維、網狀纖維)糖蛋白、葡糖氨基葡聚糖(例如硫酸肝素、硫酸軟骨素_4、硫酸軟骨素_6、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白等)、細胞基質、和/或其他材料。
[0176]此外，間充質幹細胞(血統定向或非定向的祖細胞)是用於接種到骨架上的有利的「基質」細胞。細胞可以分化為骨細胞、腱和韌帶的成纖維細胞、骨髓基質細胞、結締組織的脂肪細胞和其他細胞、軟骨細胞，這取決於內生的或補充的生長以及調節因子和其他因子，包括前列腺素、白細胞介素和天然存在的抑素，其調節增殖和/或分化。
[0177]成纖維細胞可以容易地通過分解作為成纖維細胞的源的適當的器官或組織而分離。這可以容易地使用本領域技術人員已知的技術來完成。例如，組織或器官可以用機械方法來分解和/或用消弱在鄰近細胞之間的連接的消化酶和/或螯合劑處理，使得可以將組織分散成單個細胞的懸浮液，而沒有明顯的細胞破裂。酶促離解可以通過切碎組織和用許多消化酶中的任何單獨地或組合地處理切碎的組織來完成。這些包括但不限於胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶、和/或透明質酸酶、脫氧核糖核酸酶、鏈酶蛋白酶、分散酶等。機械破壞還可以通過許多方法來完成，包括但不限於，僅舉幾個例子，使用研磨機、攪拌機、篩、勻漿器、壓力室或絕緣子(insonator)。對於組織解聚技術的綜述，參見 Freshney, Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,第 2 版，A.R.Liss, Inc.，New York, 1987，第 9 章，第 107-126 頁。
[0178]一旦組織已經簡化為單個細胞的懸浮液，懸浮液就可以被分為亞群，可以從該亞群獲得成纖維細胞和/或其他基質細胞和/或成分。這還可以使用用於細胞分離的標準技術來完成，包括但不限於，具體細胞類型的克隆和選擇、不需要的細胞的選擇性破壞(陰性選擇)、基於混合種群中的差別的細胞可凝集性的分離、凍-融程序、混合種群中的細胞的差別附著性質、過濾、常規離心和區帶離心、淘析離心法(逆流離心)、單位重力分離、逆流分布法、電泳和螢光活化細胞分選。對於無性選擇和細胞分離技術的綜述，參見 Freshney, Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,第 2 版，A.R.Liss, Inc., New York, 1987，第 11 和 12 章，第 137-168 頁。
[0179]成纖維細胞的分離可以例如如下進行:將新鮮的組織樣品徹底地洗滌並在漢克平衡鹽溶液(HBSS)中切碎以除去血清。將切碎的組織在新製備的離解酶例如胰蛋白酶溶液中溫育1-12小時。在這樣的溫育之後，離解的細胞被懸浮，通過離心做成丸並覆蓋在培養容器上。所有成纖維細胞將在其他細胞之前附著，因此，適當的基質細胞可以被選擇性地分離和生長。然後，分離的成纖維細胞可以生長成合流，從匯合的培養物中提起和接種到三維基質上(參見，Naughton等人，1987，J.Med.18 (3和4) 219-250)。用高濃度的基質細胞例如約IO6至5X IO7細胞/ml接種三維骨架將導致在較短的時間段內建立三維基質組織。
[0180]在接種基質細胞之後，應在適當的營養培養基中溫育三維骨架。如前所述的，許多商購的培養基例如RPMI1640、Fisher』 s、Iscove』 s、McCoy』 s等可以適於使用。重要的是，在溫育期期間，三維基質細胞培養物被懸浮或漂浮在培養基中以使增殖活性最大化。培養物被定期地「進料」，且回收和加工經調節的培養基，如下面部分5.6和5.7所描述的。因此，取決於待被培養的組織和所需的膠原類型，可以選擇適當的基質細胞來接種三維基質。
[0181]在溫育三維基質細胞培養物期間，可以從基質釋放增殖的細胞。這些釋放的細胞可以粘住培養容器的壁，在該處它們可以繼續增殖和形成匯合的單層。這應(例如)通過在進料期間除去釋放的細胞，或通過將三維基質培養物轉移至新的培養容器來防止或最小化。容器中存在匯合的單層將「停止」細胞在三維基質和/或培養物中的生長。除去匯合的單層或將培養物轉移至新容器中的新鮮培養基將恢復三維培養系統的增殖活性。應注意，如果需要的話，對經調節的培養基進行加工，使得其不包含任何全細胞(除非全細胞用於特殊應用)。這樣的除去或轉移應在具有超過25%合流的基質單層的任何培養容器中進行。可選擇地，培養系統可以被攪拌以防止釋放的細胞粘住，或代替地定期地進料培養物，培養系統可以被設置為使得新鮮的培養基連續地流過系統。流速可以被調節為使在三維培養物內的增殖最大化，和洗出和除去從培養物釋放的細胞，使得它們將不粘住容器的壁並生長至合流。
[0182]其他細胞例如實質細胞，可以在三維活基質組織上接種和生長。
[0183]b.將另外的細胞接種到細胞培養物中
[0184]一旦細胞培養物已經達到特定的生長程度，就可以將另外的細胞接種到細胞培養物中並連同細胞培養物的細胞一起培養。另外的細胞在活組織上在體外生長以形成自然組織的經培養的對應物，且通過以類似於生理水平的比率將胞外產物加工到培養基中來調節培養基。接種物中的高濃度細胞將有利地比低濃度更快地導致在培養物中增加的增殖。
[0185]選擇用於接種的細胞將取決於待被培養的組織，所述組織可以包括但不限於，僅舉幾個例子，骨髓、皮膚、肝、胰腺、腎、神經組織、腎上腺、黏膜上皮和平滑肌。這樣的細胞將特有的胞外蛋白例如某些生長因子加工到培養基中，導致優化用於某些組織特殊應用的培養基。
[0186]例如且不是作為限制，可以在活組織上培養各種上皮細胞。這樣的上皮細胞的實例包括(但不限於)角質形成細胞、口腔黏膜和胃腸(G.1.)道細胞。這樣的上皮細胞可以通過以下來分離:根據本領域已知的方法酶促處理組織，隨後使這些細胞在培養物中擴展和將上皮細胞應用至(例如)三維基質支撐物細胞基質。基質支撐物的存在提供了促進上皮細胞的正常分裂和分化的生長因子和其他蛋白。
[0187]一般而言，該接種物應包括該組織的「幹」細胞(還稱為「儲備」細胞)；即，產生新細胞的那些細胞，新細胞將成熟為形成組織的各種組分的特殊細胞。
[0188]接種物中使用的實質細胞或其他表面層細胞可以從通過使用用於獲得基質細胞的上述標準技術來分解所需的組織而製備的細胞懸浮液獲得。整個細胞懸浮液本身可以用於接種三維活基質組織。因此，包含在勻漿內的再生細胞將在基質上適當地增殖、成熟和分化，而非再生細胞將不會。可選擇地，特定的細胞類型可以使用用於分級基質細胞的上述標準技術從細胞懸浮液的適當部分分離。當「幹」細胞或「儲備」細胞可以容易地被分離時，這些可以用於優先地接種三維基質支撐物。例如，當培養骨髓時，基質可以用新鮮的或源自低溫保存樣品的骨髓細胞來接種。當培養皮膚時，三維基質可以用黑素細胞和角質形成細胞來接種。當培養肝時，三維基質可以用肝細胞來接種。當培養胰腺時，三維基質可以用胰腺內分泌細胞來接種。對於可以用於從各種組織獲得實質細胞的方法的綜述，參見，Freshney, Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique,第 2 版，A.R.Liss, Inc.，New York, 1987，第 20 章，第 257-288 頁。
[0189]實際上，在接種之前沉積在基質基體上的不同比例的各種類型膠原可以影響稍後接種的組織特有細胞的生長。例如，為了造血細胞的最佳生長，基質應優選地在初始基質中包含6:3:1的近似比率的膠原類型II1、IV和I。對於三維皮膚培養系統，膠原類型I和III優選地被沉積在初始基質中。被沉積的膠原類型的比例可以通過選擇加工適當的膠原類型的成纖維細胞來操縱或增強。這可以使用能夠激活補體且界定特定的膠原類型的適當的同種型或亞綱的單克隆抗體來完成。這些抗體和補體可以用於不利地選擇表達所需的膠原類型的成纖維細胞。可選擇地，用於接種基質的基質細胞可以是合成所需的適當的膠原類型的細胞的混合物。表1中示出各種類型的膠原的分布和來源。
[0190]表1
【權利要求】
1.一種用於防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的局部組合物，所述局部組合物包含: a.經代謝的經調節的生長培養基；和 b.合適的媒介物， 其中所述經代謝的經調節的生長培養基以所述局部組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在； 和，所述經代謝的經調節的生長培養基通過在足以滿足使酵母細胞在體外生長所需要的營養需求的生長培養基中培養所述酵母細胞以形成經調節的生長培養基來製備。
2.根據權利要求1所述的方法，其中至少一種蛋白質通過向受試者施用所述局部組合物而上調，其中所述至少一種蛋白質為胞外基質蛋白、修復蛋白、細胞連接蛋白或抗氧化蛋白。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述胞外基質蛋白是膠原蛋白或賴氨醯基羥化酶蛋白；或者其中所述胞外基質蛋白被C0L4A1基因或PLODl基因編碼。
4.根據權利要求2所述的方法，其中所述修復蛋白是纖連蛋白；或者其中所述修復蛋白被FNl基因編碼。
5.根據權利要求2所述的方法，其中所述細胞連接蛋白是內披蛋白；或者其中所述細胞連接蛋白被IVL基因 編碼。
6.根據權利要求2所述的方法，其中所述抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白；或者其中所述抗氧化蛋白被S0D2基因編碼。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫髮或後天缺陷。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發光度和均勻度下降；皮膚緊緻度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數量增加；或其組合。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預防或減少環境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊緻度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊緻或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態；增強自然唇色；增加唇量；促進手術後皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。
【文檔編號】A61K36/06GK103830282SQ201310559911
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2011年11月11日 優先權日:2010年11月12日
【發明者】J·V·格魯伯, S·饒, R·梅塔, S·蒿蒂 申請人:阿勒根公司, 奧麒個人護理產品公司