腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
2024-02-03 10:49:15
專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種腺苷脫氮酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定 腺苷脫氨酶活性濃度的方法，屬於醫學檢驗測定技術領域。 疼豕孜不
醫學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關 系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，
腦脊液鑑別診斷，重症聯合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝 硬化，肝癌等疾病鑑別的重要診斷標誌。
腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化
法。據申請人了解，目前國際上普遍採用紫外光法，其測定原理是
腺苷(白色結晶粉末)+水(H20 )腺苷脫氨酶肌苷(Inosine ) + 氨離子(MC)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現，因 此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大 小。然而，此方法無法用一般醫院的可見光分析儀測定，而需要使用 專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣應用。
檢索發現，申請號為03128092.7 、申請日為2003.05.29 、名稱 為《一種測定腺苷脫氨酶的試劑及其製法》的中國專利申請公開了應 用酶反應產物氧化型煙醯氨輔酶配製的測定試劑。該發明所指的酶法 測定試劑並不加入測定反應所需的還原型煙醯氨輔酶或其類似物，而 加入其反應產物氧化型煙醯氨輔酶或其類似物，及其相應的生成還原 型輔酶所需的酶和底物系統，通過在試劑內形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應系統，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環 還原為還原型煙醯氨輔酶或其類似物，當被還原的還原型煙醯氨輔酶 或其類似物達到一定的濃度時，該發明所指的酶法試劑就可達到測定 樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。該發明的特點在於為腺苷 脫氨酶的測試提供一個內源合成腺苷脫氨酶反應所需要的還原型煙醯 氨輔酶的腺苷脫氨酶試劑。其缺點之一為，這個系統在生成反應所需 要的還原型煙醯氨輔酶的同時，也抵消了部分腺苷脫氨酶試劑(腺苷 脫氨酶偶聯穀氨酸脫氫酶反應必定將還原型煙醯氨輔酶氧化成氧化型 煙醯氨輔酶)的活性，造成試劑測試的準確性大大降低。其缺點之二 是，該試劑在正式測試前必須事先反應一段時間，以便能夠產生足夠 的還原型煙醯氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟急的結果，給測試帶 來很大的不便。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法
(Enzymatic Recycling Method)、酶比色 去(Enzymatic Colorimetric
Method)及酶聯法(Couple Reaction)技術，計量通過酶聯反應生成
吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)，所導
致在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定腺苷脫氨酶活性濃
度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的腺苷脫氨酶診斷
試劑盒，採用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分
析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、
準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法原理如下 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子
氨離子+ oc-酮戊二酸+還原型輔酶穀氨酸脫氫酶穀氨酸
+輔酶+水
穀氨酸+水+氧穀氨酸氧化酶氨離子+ a-酮戊二酸+
過氧化氫
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亞胺色原+水 這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)將腺
苷酶解產生氨。
穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC 1.4丄3或 EC 1.4丄4)、穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)
使氨不斷地被重複循環利用，並同時不斷地循環擴增產出過氧化氫。
過氧化物酶將過氧化氫與還原型色原體組合作用，最終將無色的還 原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器， 在400—700nm (根據還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染 料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)， 含量高低的光吸收大小，通過測量400^700mn (根據還原型色原體組 合的不同而定)處吸光度上升的速度，得出腺苷脫氨酶活性濃度大小 測定結果。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考 慮，如下成分關係的本發明腺苷脫氨酶診斷試劑盒較為理想 緩衝液 lOOmmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
穀氨酸脫氫酶 100000 U/L
穀氨酸氧化酶
a-酮戊二酸 過氧化物酶
8000 U/L 16 mmol/L 30000 U/L
還原型色原體組合A 6mmol/L 抗幹擾劑 30 mmol/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任-
個組合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基^^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4-雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-齊基苯胺
4- 氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
1^乙基~~>^- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2.4- 雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3.5- 雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本發明的腺苷脫氨酶活性診斷試劑盒可以是單劑，包括 緩衝液、穩定劑、Ot-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸 氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、抗幹擾劑。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩衝液、穩定劑、(X-酮戊二酸、還原型輔酶、過氧化物酶、還 原型色原體組合、抗幹擾劑。 試劑2
緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶。
a-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶、過氧 化物酶、還原型色原體組合在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試 劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體 試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩衝液、穩定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶。 試劑2 緩衝液、穩定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、抗幹擾劑。
試劑3
緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶。
ot-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶、過氧
化物酶、還原型色原體組合在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以 不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配 製成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明,
實施例-
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液100mmol/L
穩定劑 還原型輔f
穀氨酸氧化酶
a-酮戊二酸
過氧化物酶
4-氨基抗砒
石碳酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L 150000U/L 謹0 U/L 16 mmol/L 30000 U/L 2 mmol/L 10 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑； 使用前，加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，測
試主波長505nm,測試副波長600nm，被測樣品與試劑的體積比例為 1/25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於 生化分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的速度，從而測算出腺 苷脫氨酶活性的濃度大小。 實施例二
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩衝液10Ommol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 a-酮戊二酸 過氧化物酶
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 10Ommol/L 緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
穀氨酸脫氫酶 120000 U/L
穀氨酸氧化酶 8000 U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用，
14
0.25 mmol/L 16 mmol/L 30000 U/L 0.2 mmol/L
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C,反應時間10分鐘，測試 主波長546nm，測試副波長600nm，被測樣品與試劑的體積比例為1/20，
反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約l 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫 氨酶活性的濃度大小。
實施例三腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括-試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 10Ommol/L
穩定劑
還原型輔酶
a-酮戊二酸
50 mmol/L
0.25 mmol/L
16 mmol/L
-甲基-2-苯噻唑酮腙
0.6 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑
過氧化物酶
雙甲基苯胺
50 mmol/L 40000 U/L 2 mmol/L
試劑
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑
50 mmol/L
100000U/L
穀氨酸氧化酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，測試 主波長578nm，測試副波長660nm，被測樣品與試劑的體積比例為1/30, 反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約l 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於 生化分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的速度，從而測算出腺 苷脫氨酶活性的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好。
權利要求
1.一種酶循環擴增法(Enzymatic Recycling Method)的腺苷脫氨酶活性濃度測定方法，其方法原理如下腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子氨離子+α-酮戊二酸+還原型輔酶 穀氨酸脫氫酶 穀氨酸+輔酶+水穀氨酸+水+氧 穀氨酸氧化酶 氨離子+α-酮戊二酸+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應物置於可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度，得出腺苷脫氨酶活性濃度大小測定結果。腺苷脫氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)作為作用酶，功能為將腺苷酶解產生氨。穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作為循環酶，將氨不斷地被重複循環利用，並同時不斷地擴增產生過氧化氫。過氧化物酶作為顯色酶，將過氧化氫與還原型色原體組合作用發生顯色反應。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，主要成分包括緩衝液 20——500 mmol/L 穩定劑1- 50mmol/L 還原型輔酶0.1-0.35 mmol/L 穀氨酸脫氫酶 2000——500000 U/L穀氨酸氧化酶0.1-20mmol/L a-酮戊二酸 2-20 mmol/L 過氧化物酶500——500000 還原型色原體組合 0.1-20mmol/L抗幹擾劑 1-50 mmol/L其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用； 也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化物 酶(EC1.11丄7)、還原型色原體組合及抗千擾劑組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特徵在於-由緩衝液、穩定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1,2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化物 酶(EC1.11丄7)、還原型色原體組合及抗幹擾劑組成雙劑試劑；試 劑l，由緩衝液、穩定劑、ot-酮戊二酸、還原型輔酶、過氧化物酶、 還原型色原體組合及抗幹擾劑組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、 穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶及抗幹擾劑組成。oc-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶、過氧化物酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶 (glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化物酶(EC1.11丄7)、還原型色原體組合及抗幹擾劑組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫 氫酶組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、過氧化物酶、還原型色原 體組合及抗幹擾劑組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、穀氨酸氧化 酶組成。a-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶、 過氧化物酶及抗幹擾劑在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不 限。
6. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特徵在於還包括穩定劑14000 mmol/L或0.1%-100°/。體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
7. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特徵在於所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2'-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基-"N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2.4- 雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒3.5- 雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2'-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發明涉及一種酶循環擴增法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、腺苷、α-酮戊二酸、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、穩定劑及抗幹擾劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出腺苷脫氨酶活性濃度的大小。
文檔編號C12Q1/25GK101096700SQ20061008557
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優先權日2006年6月26日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司