一種非定向交尾凡納濱對蝦全同胞家系批量製備方法與流程
2024-01-25 00:54:15
本發明屬於遺傳育種領域，具體涉及一種非定向交尾凡納濱對蝦全同胞家系批量製備方法。
背景技術：
凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei,又稱南美白對蝦)是我國水產養殖的支柱產業，在中國漁業經濟中佔有較大的比重。然而，我國凡納濱對蝦優質親蝦長期依賴進口，嚴重製約了我國對蝦產業的穩定、快速發展。因此，加強凡納濱對蝦遺傳育種研究將有助於我國對蝦產業快速健康發展，意義重大。
全同胞家系的製備是遺傳育種研究領域中最重要的一個環節。全同胞家系子代個體全部來自於同一個父母本，具有遺傳背景乾淨的優勢，有利於不同性狀分子標記的篩選，在良種選育、分子標記輔助育種、分子標記開發的工作中必不可少。
然而，現有的凡納濱對蝦全同胞家系製備方法仍存在一定的技術缺陷。現有的非定向交配方法：一般都採用標記物對親蝦進行標記，如在親蝦某個部位套上可識別的標識物，親蝦交配時便記下標識物，以便確定親本，但這一方法有時無法確定父本，母蝦會跟多條公蝦進行交尾，不能確定哪條公蝦的精莢成功打入了母蝦的納精囊中。現有的定向交配的方法：一般是在同一水體中放入1條或多條公蝦與1條母蝦配比，由於不能保證特定的組合是否成功交配，這一方法通常需要準備較多的組合才能得到較少的全同胞家系個數，再加上水體的追逐空間有限，經常會出現精莢打歪或精莢脫落等不利因素。
技術實現要素：
本發明的目的是彌補現有技術的不足，提供一種能夠批量製備全同胞家系的方法，即非定向交尾凡納濱對蝦全同胞家系批量製備方法。
本發明的非定向交尾凡納濱對蝦全同胞家系批量製備方法，包括以下步驟：
a、親本選擇：選擇雄蝦20g以上，雌蝦30g以上的健康個體作為親本；
b、親本處理：去除雌蝦一側眼柄，雄蝦不去除眼柄，將所有雌蝦與雄蝦個體的一側鬍鬚靠近根部剪下，剪下的鬍鬚分別單獨保存；
c、親蝦飼養：將步驟b的雌蝦和雄蝦分別在雌蝦池和雄蝦池中飼養；
d、親蝦交配：在上午(7-11時)，將步驟c中的性腺飽滿的雌蝦放入雄蝦池，使之自由追逐、交配；
e、雌蝦挑選：當晚18時至21時，全部撈出雄蝦池中的雌蝦進行逐個檢查，將雌蝦納精囊中具有飽滿精莢的雌蝦放在單獨的水體中產卵，微充氣；將納精囊中沒有精莢或精莢位置偏離納精囊的雌蝦全部放回雌蝦池中(經過交尾但納精囊中無精莢的雌蝦仍會產出未受精卵，按照步驟c中的方法飼養一周以上後，性腺重新發育飽滿)；
f、產卵處理：發現雌蝦產卵後立即撈出，將產卵後的雌蝦另一側鬍鬚剪下分別單獨保存，將產卵後雌蝦納精囊中剩餘的精莢液氮保存，處理完後將雌蝦放回雌蝦池中(按照步驟(3)飼養一周以上後，性腺會重新發育飽滿)；
g、親本追溯：提取所有親本鬍鬚的DNA，提取產卵雌蝦鬍鬚DNA作為母本DNA；提取產卵後雌蝦納精囊中的剩餘精莢DNA作為父本DNA；利用多態性豐富、擴增產物穩定的微衛星引物進行親權鑑定，確定父母本，具體可參照中國授權發明專利「進行凡納濱對蝦家系鑑定的多重微衛星鑑定體系及應用ZL201310340730.1」中所述的方法進行；
h、家系培育：對確定父本和母本來源的卵進行培育，得到全同胞家系。
優選，所述的親蝦飼養是選取活體新鮮餌料，每隔6-8小時投餵1次，投餵量以每次投餵兩小時後池底仍有少量剩餘為宜；
優選，所述的家系培育是對確定父本和母本來源的卵，自母蝦產卵後，水體中均勻布置氣室進行微充氣，產卵後第三天開始加入角毛藻液，保持水體藻類密度在4.5萬個/ml以上，每天加入1-3ppm的酵母粉，虹吸法排水；待發育到仔蝦後，投餵蝦片和配合飼料，即得到全同胞家系。
本發明的有益效果是：
本發明針對現有的凡納濱對蝦家系製備技術的缺陷，設計通過非定向交尾、剪取對蝦鬍鬚組織提取DNA、取產卵後雌蝦納精囊中的剩餘精莢作為父本來源的依據等方法，利用目前較為成熟的微衛星親子鑑定技術確定父母本個體，製備出全同胞家系。本發明的方法採用非定向隨機交配效率高與微衛星親子鑑定準確率高相結合的方法，彌補了現有凡納濱對蝦家系製備技術的不足，將有利於凡納濱對蝦遺傳育種工作的進行。
附圖說明：
圖1是產卵後精莢的圖。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
實施例1：
1、親本選擇：一般選取體重20g以上(雄蝦20g以上，雌蝦30g以上)的健康個體作為後備親本，親本逐個識別，第一對遊泳足具有開叉結構或具有精莢的個體為雄蝦，無分叉結構、無精莢或有明顯卵巢的個體為雌蝦，雌雄分開飼養。
2、親本處理：用燒紅的鑷子或剪刀將雌蝦一側眼柄絞掉或剪掉，雄蝦不剪眼柄；將所有雌蝦與雄蝦個體的一側鬍鬚靠近根部剪下，每個個體的鬍鬚在95％酒精-20℃中單獨保存，試管編號管理，雌蝦在雌蝦池中飼養，雄蝦在雄蝦池中飼養。
3、親蝦飼養：選取活體新鮮餌料，每隔6-8小時投餵1次，投餵量以每次投餵兩小時後池底仍有少量剩餘為宜；雌蝦按照投餵3次青蟲後投餵1次紅蟲的方法進行投喂，雄蝦按照投餵2次青蟲、1次生蠔肉、1次魷魚、1次紅蟲的次數比例進行投喂。
4、親蝦交配：在上午(7-11時)將性腺飽滿的雌蝦小心放入雄蝦池中，使之自由追逐、交配。
5、雌蝦挑選：當晚18時至21時，全部撈出雄蝦池中的雌蝦進行逐個檢查；將雌蝦納精囊中具有飽滿精莢的雌蝦放在單獨的水體中產卵，微充氣；將納精囊中沒有精莢或精莢位置偏離納精囊的雌蝦全部放回雌蝦池中(經過交尾但納精囊中無精莢的雌蝦仍會產出未受精卵，按照步驟3中的方法飼養一周以上後，性腺重新發育飽滿)。
6、產卵處理：每隔半小時檢查雌蝦是否產卵；發現雌蝦產卵後立即撈出(產卵後精莢會自動脫落，防止雌蝦將殘餘精莢攝食乾淨)，將產卵後的雌蝦另一側鬍鬚剪下95％酒精-20℃中保存，將產卵後雌蝦納精囊中剩餘的精莢液氮保存，試管編號管理，處理完後將雌蝦放回雌蝦池中(按照步驟3飼養一周以上後，性腺會重新發育飽滿)。產卵後精莢如圖1所示。
7、親本追溯：提取所有親本鬍鬚的DNA，-80℃保存；提取產卵雌蝦鬍鬚DNA作為母本DNA；提取產卵後雌蝦納精囊中的剩餘精莢DNA作為父本DNA；利用多態性豐富、擴增產物穩定的微衛星引物進行親權鑑定，確定父母本，具體可參照中國授權發明專利「進行凡納濱對蝦家系鑑定的多重微衛星鑑定體系及應用ZL201310340730.1」中所述的方法進行。
8、家系培育：對確定父本和母本來源的卵，自母蝦產卵後，水體中均勻布置氣室進行微充氣；產卵後第三天開始加入角毛藻液，保持水體藻類密度在4.5萬個/ml以上，每天加入1-3ppm的酵母粉，虹吸法排水；待發育到仔蝦後，投餵蝦片和配合飼料，即得到全同胞家系。具體培育方法可參照中國發明專利「一種凡納濱對蝦小水體育苗方法ZL201410076358.2」中所述的方法進行。