離子液體用於螺旋藻Fe-SOD酶的提取的製作方法
2024-01-24 17:20:15
離子液體用於螺旋藻Fe-SOD酶的提取的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種超氧化物歧化酶的提取方法，特別設及一種從螺旋藻中提取含鐵超氧化物歧化酶的方法。將螺旋藻原料進行機械粉碎，加入適量水浸泡放入超聲波破碎機中對螺旋藻細胞進行破壁處理。利用離子液體、磷酸氫二鉀及水形成的離子液體雙水相體系對處理後螺旋藻液中的Fe-SOD進行選擇性的萃取。萃取液經磷酸鹽緩衝溶液反萃取得到超氧化物歧化酶的粗酶液。對粗酶液進行熱變性法和凝膠柱層析法進行純化，純化後的酶液經濃縮後進行真空乾燥得到超氧化物歧化酶精粉。離子液體雙水相體系經反萃取分離出蛋白質和酶後，可以直接應用於下一次的萃取過程，多次重複利用不影響離子液體的萃取效率。
【專利說明】離子液體用於螺旋藻Fe-SOD酶的提取
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種超氧化物歧化酶的提取方法，特別設及一種從螺旋藻中提取含鐵超氧化物歧化酶的方法。
【背景技術】
[0002]超氧化物歧化酶(SOD)是一類廣泛存在於生物體內的金屬酶，是一種具有特定生物催化功能的蛋白質，由蛋白質和金屬離子組成，它廣泛存在於自然界的動物、植物以及一些微生物體內。1938年Keilin從牛血中分離出一種含Cu的血銅蛋白，1953年又從小牛肝、鯨肝分離出肝銅蛋白。目前，根據所含金屬離子(輔基)的不同，SOD可分為以下四種類型:第一類為Cu/Zn-SOD，呈藍綠色，相對分子量約為32k道爾頓，來源於動物血、豬肝、牛肝以及菠菜葉、麵包酵母中，在某些原核生物中也存在；第二類為Mn-SOD，呈紫紅色，相對分子量約為40k道爾頓，主要存在於原核細胞和真核細胞以及線粒體的基質中，在高等植物中的過氧化物酶體中也含有。第三類為Fe-SOD，呈黃褐色，相對分子量約為38.7k道爾頓，主要存在真核生物如藻類，部分高等植物如油菜、檸檬、菠蘿、甜橙、番茄、銀杏等體內也存在。第四類為N1-SOD，是近年來才發現的一種新型S0D，目前只有從鏈球菌中分離得到，對其研究及報導較少。
[0003]人們最早從動物的血液中提取SOD製成產品，由於國際上狂牛症的蔓延，從動物血中提取的S0D，給人們在使用上帶來一些危險因素。從藻類中提取S0D，使用安全性非常高。螺旋藻是一種富含蛋白質、維生素、必需胺基酸、礦物質和必需脂肪酸的絲狀微藻，其細胞壁不是由纖維素組成，而是由一些多糖類物質構成，易於消化吸收，具有極高的營養價值。螺旋藻也是極易大規模工業化生產的微藻類之一。螺旋藻中富含超氧化物歧化酶，並且僅含有Fe-SOD，從其中`提取Fe-SOD，不僅原料豐富，而且成本低。
[0004]很多研究表明，活性氧(02_、.0H,H2O2>'02>R00.)能與蛋白質、核酸和脂類發生反應，導致膜脂過氧化、鹼基突變、DNA鏈的斷裂和蛋白質的損傷等。在動物體，活性氧導致細胞壞死、過敏反應、癌變或其他病理過程。在植物體內，活性氧可導致植物代謝失活、細胞死亡、光和作用速率降低，甚至造成植物品質降低、產量下降等。超氧化物歧化酶是能夠催化超氧陰離子自由基02_發生歧化反應，平衡機體代謝過程中產生的過多自由基，減輕或消除自由基對機體的危害，受到全世界學術界廣泛關注，使之成為涉及分子生物學、微生物學、醫學等學科領域及醫藥、化工、食品等生產行業的一個熱門研究課題。超氧化物歧化酶也是近年來應用最廣泛的酶，具有抗衰老、免疫調節、抑制腫瘤、調節血脂、抗輻射、消炎和美容等功效。
[0005]當兩種聚合物(或一種聚合物與一種鹽)溶於同一溶液時，由於聚合物溶液之間(或聚合物溶液與鹽溶液之間)的不相溶性，使得當聚合物(或鹽濃度)達到一定值時，就會形成互不相溶的兩相，由於這兩相中水的含量都很高，因此稱為雙水相系統。雙水相萃取技術是由Albertsson於20世紀50年代後期開發的一種高效而溫和的生物分離技術。70年代以後，眾多科學家發展了雙水相萃取技術在生物分離過程中的應用。離子液體是近年來迅速發展起來的一種全新綠色介質和功能材料。離子液體雙水相萃取技術是近年來興起的新的生物質分離技術，該體系一般是由親水性離子液體、無機鹽(如磷酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物等)和水形成的雙水相體系，它綜合了離子液體和雙水相體系的優點。作為一種高效的新型綠色分離體系，離子液體雙水相具有分相時間短、粘度低、萃取過程不易乳化、萃取率高、分離條件溫和、對生物活性物質不破壞、易於放大、且離子體系可以且易回收利用等優點，廣泛用於生物活性物質的分離和純化，如大多數酶和蛋白質等都能用雙水相體系進行分離純化。離子液體雙水相萃取蛋白質機理屬於液-液萃取，當蛋白質進入雙水相體系後，由於表面性質、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的作用和溶液環境的影響，使其在上、下相中的濃度不同，即各成分在兩相間的選擇性分配，從而達到萃取分離的目的。蛋白質與離子液體作用，主要有鹽析作用；與輔助鹽萃取劑發生配位作用生成配合物，配合物被萃取到離子液體中；或者調節pH，使蛋白質的疏水基團暴露出來，從而萃取到離子液體中等。
[0006]本發明以螺旋藻為原料，採用離子液體雙水相體系對螺旋藻中的Fe-SOD分離純化，以期建立一種簡便、高效的SOD分離純化路線。
【發明內容】
[0007]本發明是為解決常規SOD粗提過程中，萃取劑對酶選擇性較差且酶易變性失活的缺點，提出採用離子液體雙水相體系高效選擇性的萃取螺旋藻中的Fe-SOD。該技術生產方法簡單易行，適合工業化生產過程。
[0008]本發明的技術方案由以下部分組成。
[0009]I)螺旋藻原料的預處理。對乾燥螺旋藻原料進行機械粉碎,藻粉中加入10倍質量的水，溫度為18-32°C時浸泡2_6h。浸泡結束後，將其放入超聲波破碎機中，開啟超聲，對螺旋藻細胞進行破壁處理。
[0010]2)離子液體雙水相萃取。將離子液體、K2HPO4按比例加入到進行破壁處理的螺旋藻液中，攪拌萃取30-90min，當體系出現明顯分層時，萃取過程結束。過濾分離去除固體，液體部分進行靜置分層，下層為含有蛋白`質的離子液體層。
[0011]3)Fe-SOD酶的反萃取。將含有蛋白質的離子液體層進行分離後，向其中加入pH值為7.2的磷酸鹽緩衝溶液，攪拌60-90min後，蛋白質溶解於緩衝溶液中，而與離子液體相分離，緩衝溶液層為粗酶液。分離後的離子液體層可以直接用於下一次萃取過程。
[0012]4)蛋白質的分離。將粗酶液緩慢升溫至60°C,保溫反應15-30min。降溫至0_4°C,離心分離蛋白質，其濾液為Fe-SOD酶溶液。
[0013]5)Fe-SOD的純化。將Fe-SOD酶溶液進行超濾和納濾處理，所得濾液繼續採用
[0014]Sephadex G-100凝膠柱子層析分離。層析液採用聚乙二醇(PEG-20000)濃縮後，進行真空乾燥，得Fe-SOD酶精粉。
[0015]上述的離子液體為的陽離子部分為咪唑衍生物，陰離子部分為活性染料結構，其結構式如I所示。
[0016]
H3C.八 Vr
(W )2 xI[0017]式中R=-CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -CH2CHOHCH2OH。X 為離子液體帶負電荷活性染料
部分，具有如式2所示的結構。
[0018]
【權利要求】
1.離子液體用於螺旋藻Fe-SOD酶的提取方法，其特徵在於離子液體、磷酸氫二鉀及水形成雙水相體系用於提取螺旋藻中的超氧化物歧化酶粗酶液，其中離子液體具有式(I)所示結構
2.根據權利要求1所述的離子液體用於螺旋藻Fe-SOD酶的提取方法，其特徵在於離子液體雙水相體系的構成為離子液體的質量濃度為20-35%，磷酸氫二鉀的質量濃度為17-25%。
【文檔編號】C12N9/02GK103756981SQ201410029467
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】李美鳳 申請人:李美鳳