尖吻蝮蛇血凝酶-b的製作方法

2023-05-10 19:43:26 1

專利名稱：尖吻蝮蛇血凝酶-b的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種絲氨酸蛋白酶，具體地說是一種尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶-B，本發明還涉及其分離純化方法。
背景技術：
蝮亞科(Crotalinae)蛇毒中存在一類與血液凝固相關的蛋白酶，通常稱之為「類凝血酶」(thrombin-like enzyme,簡稱TLC)。類凝血酶與凝血酶(thrombin)的表觀作用相似，均可以使血漿中纖維蛋白原轉化為纖維蛋白而「凝固」。然而，兩種酶作用機理不同，類凝血酶不激活凝血系統中X III因子，其與纖維蛋白原作用僅產生非交聯纖維蛋白，不會導致血栓形成，其形成的凝血塊可被5M尿素溶解；而凝血酶能夠激活凝血系統中X III 因子，其與纖維蛋白原作用形成交聯纖維蛋白，可導致血栓形成，其形成的凝血塊不能被5M尿素溶解。近50年來的科學研究發現在40多種蛇毒中含有類凝血酶成分，有30餘種得到分離純化，其中有10餘種類凝血酶的全部或部分胺基酸序列得到闡明。已發現的TLC分子量多在29 45kD之間，大多數為酸性糖蛋白。在以往已經發現的蛇毒TLC中，蛋白質一級結構多為單鏈。其商品化典型代表產品「立 Ε雪」(Reptilase)系由瑞士 Solco Basle公司生產，是由巴西矛頭蝮蛇(Bothrops.atiOx)蛇毒中分離出的一種凝血酶，該酶前體由255個胺基酸構成，N端有24個胺基酸形成的引導肽，活性酶含231胺基酸，SDS-PAGE分子量34kD。含6個鏈內二硫鍵(位點7_139，26-42,74-230,1 18-184，150-163，174-199)，為單鏈糖蛋白(糖基化位點為 Asn146』 225)，脫去糖基後的分子量為255 17Da。另一個已經商品化的產品是義大利RAVIZZ公司生產的「Botropase」,該凝血酶是從美洲矛頭蝮蛇(Bothrops. jararaca)蛇毒中分離得到的。活性酶含231胺基酸，在胺基酸序列上與Iteptilase比較在14個位點上有差別。此外，國內學者沈居仁等2006年從中國尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分離得到一種高活性血凝酶，該酶為單鏈，SDS-PAGE分子量36±2kD，等電點為6. 59，比活為2000U-3000U/mg，N-末端15個胺基酸序列為VIGGNECDTNEEHFL。以蛇毒原料重量計收得率為O. 03%。到目前為止，商品化的蛇毒血凝酶種類較少，因此尋找適合產業化的高活性高收率的蛇毒血凝酶新品種尤顯必要。本發明人從我國廣西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus,俗稱五步蛇)的蛇毒中分離純化得到一種高活性血凝酶-B。

發明內容
本發明的目的在於提供一種蛇毒血凝酶-B，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離得到的一種類凝血酶(TLC)。本發明的另一個目的在於提供了一種分離純化上述血凝酶-B的方法。
本發明血凝酶-B是從中國尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分離得到的高活性血凝酶(命名為「血凝酶-B」)，其具有SEQ ID No. I所示的胺基酸序列。該酶具有如下特徵①由236個胺基酸構成的單鏈，SDS-PAGE分子量約為35kD，等電點pi為6. 0，②含6個鏈內二硫鍵(位點7-141，28-44，78-234，120-188，152-167，178-203)。③在 Asn77』100』229位點上具有由5種不同單糖構成的雜合多聚糖修飾。④酶活性可被苯甲基磺醯氟(PMSF)完全抑制，表明其是一種絲氨酸蛋白酶。⑤具有較好的熱穩定性，40°C恆溫60天酶活性可保持 90%ο應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的 胺基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個胺基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發明蛋白還包括SEQ ID No. I所示胺基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個胺基酸，具有同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白質。本領域技術人員可以根據本發明血凝酶-B的N端胺基酸序列，設計合成寡核苷酸探針，從尖吻蝮蛇毒腺組織提取mRNA，反轉錄並構建cDNA文庫，通過上述探針篩選cDNA文庫，並對篩選出的陽性克隆子分別進行測序克隆分析，從而得到編碼本發明蛋白的基因。也可以根據本發明血凝酶-B的胺基酸序列直接設計合成編碼本發明蛋白的基因。本發明還提供上述血凝酶-B的純化方法，其包括如下步驟I)、蛇毒預處理；2)、將預處理後的蛇毒溶液上經預平衡的DEAE — Sephrose FF陰離子交換層析柱，用 O. OlM pH7. O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02 和 O. 06M NaCl 的 O. OlM pH7. O 7. 5的PBS分段洗脫，收集O. 06MNaCl溶液的洗脫液；3)、將上述洗脫液超濾濃縮至小體積後經透析去除NaCl ；4)、將透析後的溶液再次上樣至經過預平衡的DEAE — S^hrose FF層析柱，用O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02,0. 04,0. 06Μ NaCl 的 O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的PBS分段洗脫，收集O. 06Μ NaCl溶液洗脫液中的第三個洗脫峰；5)、將上述收集液超濾濃縮至小體積後經80%硫酸銨沉澱，12000g離心30分鐘分
離沉澱。6)、用PBS適量溶解沉澱,經Sephadex_G75進一步純化,再經透析除鹽後直接冷凍乾燥。其中，步驟I)蛇毒預處理的方法是將蛇毒用適量預冷的O. 01MpH7. O 7. 5PBS溶解，離心取上清液進行透析(透析袋截留分子量為7，000D 10，000D)。通過預處理可以去除不溶的雜質以及小分子多肽，並降低溶液離子強度。具體地說可通過如下步驟進行蛇毒的預處理稱取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍體積預冷的O. OlM pH7. O 7. 5的PBS於4 8 V的層析櫃中攪拌溶解3(Γ60分鐘，於O0C >5, 000^10, OOOg離心1(Γ20分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉澱再次加入蛇毒重量5 10倍體積預冷的PBS攪拌懸浮，再次離心。合併兩次離心上清液於透析袋中，於4 8C對O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS透析12 24小時，期間換液2 4次，以去除小分子多肽和降低溶液離子強度。其中，步驟2)和步驟4)採用O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS預平衡DEAE — SephroseFF層析柱，然後再上樣。
其中，步驟3)透析的目的是去除溶液中存在的NaCl。步驟3)和步驟5)中大體積洗脫液濃縮方式為超濾濃縮(膜截留值5000-10000Da)。其中，步驟6)中採用S印hadeX_G75分子篩的目的是進一步將兩次陰離子柱層析收集物中的蛋白質按分子量大小進行分離純化。具體地將沉澱用PBS溶解後上柱，用O. OlMpH7. 4PBS洗脫液洗脫，收集洗脫液第一個峰。經本發明方法純化的血凝酶-B比活力不低於2000U/mg，還原和非還原SDS-PAGE均為一條帶；HPLC分析純度95%以上。該酶具有較好的熱穩定性，40°C恆溫60天酶活性可保持90%。以蛇毒凍乾粉原料重量計，本法純化收得率為O. 25% - O. 3%。本發明血凝酶-B具有良好的凝血活性，可作為製成各種止血藥物的原料藥，即本發明還包括含有所述尖吻蝮蛇血凝酶-B的止血藥物。該藥物可以是凍乾粉原藥、凍乾粉注射劑、止血貼劑、止血粉劑、止血片劑、止血膏劑或者止血液體噴霧劑，用於需要止血以減少出血量的各種醫療情況。也可用來預防出血，避免或減少手術部位及手術後出血。


圖I顯示純化後血凝酶-B的SDS-PAGE —條帶。圖2顯示純化後血凝酶-B的HPLC分析結果。圖3血凝酶-B雜合糖基化結構示意圖。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所採用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規技術。本發明中涉及到的百分號「％」，若未特別說明，是指質量百分比；但溶液的百分t匕，除另有規定外，是指溶液IOOml中含有溶質若干克；液體之間的百分比，是指在20°C時容量的比例。本發明中類似「用蛇毒重量10倍體積預冷的」表述，其中的重量和體積的單位分別是g和ml。實施例I蛇毒血凝酶-B的純化取30g尖吻蝮蛇蛇毒凍乾粉(批號20090701，廣西蛇毒研究所)，用蛇毒重量10倍體積預冷的O. OlM pH7. 4的PBS於4°C的層析櫃中攪拌溶解30分鐘，於4°C、IOOOOg離心15分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉澱再次加入蛇毒重量10倍體積預冷的PBS攪拌懸浮，再次離心。合併兩次離心上清液於透析袋(截留分子量為10，000D)中，在4°C層析櫃中對O. OlM pH7. 4的PBS透析24小時，期間換液3次。將預處理後的蛇毒溶液上樣到經過O. OlM pH7. 4PBS預平衡的DEAE — Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱,先用O. OlMpH7. 4PBS洗柱，再分別用含O. 02Μ、0. 06Μ NaCl的O. OlM ρΗ7. 4的PBS分段洗脫，收集O. 06ΜNaCl溶液的洗脫峰，共得1960ml。經酶活測定(參照附錄①或②方法)和電泳分析，目的物出現在O. 06M NaCl溶液的洗脫峰收集液中。採用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(O. IM2CUt off IOk膜)超濾濃縮至200ml，將該200ml超濾濃縮液傾入透析袋(10，000D)中，用2000ml O. OlM pH7. 4的PBS於4°C透析24小時，期間更換溶液3次。將透析後的酶溶液上樣到經過預平衡的DEAE — Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱,用O. OlM pH7. 4的PBS洗柱,再分別用O. 02M、0. 04M、0. 06M NaCl 的 O. OlM ρΗ7· 4 的 PBS 分段洗脫，收集 O. 06Μ NaCl 溶液洗脫液的第三個洗脫峰，共得660ml。用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(O. IM2CUt off 5k膜)超濾濃縮至120ml，將該120ml經80%硫酸銨沉澱4°C過夜，次日12，OOOg 4°C離心30分鐘，離心沉澱用IOml的O. OlM pH7. 4PBS懸浮溶解，立即上樣到S印hdex_G75層系柱，用O. OlMpH7. 4PBS洗脫液洗脫，收集洗脫液第一個峰65ml，經酶活測定確認存在目的產物。將該65ml濃縮液裝入透析袋中，用無離子水進行透析24小時，期間更換溶液3次，每次2000ml。透析後體積為73ml，直接冷凍乾燥。獲得凍乾物81mg，測定酶比活為2500U/mg，最終收率O. 27%。還原和非還原SDS-PAGE均為一條帶(見圖1)，電泳分子量大致為35kD。HPLC純度96.2% (見圖2)。等電聚焦電泳測定該酶等電點pi為6. O。經Edman酶解和肽圖質譜進行胺基酸和糖基化測定，其胺基酸序列如SEQ ID No. I所示。該血凝酶含236個胺基酸，僅按胺基酸計算分子量為26116. 7Dalton ;鏈內含6個
一 XiT 蝕 /-i-. I- Wr n 7 n 141 η 28 η 44 η 78 η 234 η 120 η 188 η 152 η 167 η 178 η
—硫鍵，位點為Cys-Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys2°3。糖基化位點為Asn77G2F4S，Asn1(l° - Hybrid, Asn229_G2F4S，糖基化結構由5種不同單糖的雜合多聚糖構成(見圖3)。實施例2蛇毒血凝酶-B的純化取30g尖吻蝮蛇蛇毒凍乾粉(批號20090701，廣西蛇毒研究所)，按與實施例I相同的方法進行預處理。將經預處理的蛇毒溶液按實例I相同的方法進行第一次DEAE-Sephrose FF柱層析，經酶活測定和電泳分析目的物出現在O. 06MNaCl的洗脫峰中，合併洗脫收集液，共得2000ml,採用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(O. IM2CUtofflOk膜)超濾濃縮至210ml，將該210ml超濾濃縮液傾入透析袋(10，000D)中，用2000ml O. OlM pH7. 4PBS於4°C透析24小時，期間更換溶液3次。透析後的酶液上樣至DEAE-Sephrose FF柱中，按實例I相同的方法進行第二次層析。血凝酶出現在O. 06MNaCl溶液洗脫液的第三個洗脫峰中，收集該峰洗脫液得648ml。用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(O. IM2CUt off 5k膜)超濾濃縮至130ml,將該130ml經80%硫酸銨沉澱4°C過夜，12，OOOg 4°C離心30分鐘，沉澱用IOml的0.01M pH7. 4PBS懸浮溶解，立即上樣到Sephdex-G75層系柱，收集洗脫液第一個峰68ml，經酶活測定確認。將該68ml按實例I相同的方法進行透析後體積為78ml，直接冷凍乾燥。獲得凍乾物85mg，測定酶比活力為2460U/mg，最終收率O. 28%。SDS-PAGE為一條帶，其電泳分子量大致為35kD。HPLC純度96. 0%。實施例3尖吻蝮蛇血凝酶-B的絲氨酸蛋白屬性實驗將實施例I分離得到的血凝酶-B用生理鹽水稀釋至酶活lU/ml。用生理鹽水配製I %的牛纖維蛋白原(Sigma公司)溶液。用異丙醇溶解苯甲基磺醯氟(PMSF, Merck公司),溶液濃度為4mg/ml。實驗操作步驟如下(I)取1%牛纖維蛋白原溶液2ml，37°C下恆溫5分鐘。(2)取三支小試管，分別標註1#、2#、3#，每管加入20(^1的lU/ml血凝酶-C溶液。(3)分別向1#試管加入10 μ I蒸餾水，2#試管加入10 μ I異丙醇，3#試管加入10 μ I PMSF,於37° C水浴保溫5分鐘。(4)按試管編號順序分別單獨進行凝集試驗觀察。向試管中加入恆溫好的1%牛纖維蛋白原溶液200 μ 1，立即計時，同時輕輕搖動混勻，於37°C水浴中靜置，觀察試管中凝集反應的情況。以溶液呈現完全凝固狀態時終止計時。結果見表一表一、PMSF對凝集時間的影響
權利要求
1.尖吻蝮蛇血凝酶-B，其具有SEQID No. I所示的胺基酸序列或該序列經替換、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸得到的具有同等功能的胺基酸序列。
2.如權利要求I所述的尖吻蝮蛇血凝酶-B，其特徵在於，鏈內含有6對二硫鍵，在Asn77'100' 229位點上具有雜合多聚糖修飾。
3.含有權利要求I或2所述尖吻蝮蛇血凝酶-B的藥物。
4.如權利要求3所述的藥物，其為凍乾粉原藥、凍乾粉注射劑、止血貼劑、止血粉劑、止血片劑、止血膏劑或止血液體噴霧劑。
5.權利要求I或2所述血凝酶-B的純化方法，其包括如下步驟 1)、蛇毒預處理； 2)、將預處理後的蛇毒溶液上經預平衡的DEAE— S^harose Fast Flow陰離子交換層析柱，用 O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 2 和 O. 6Μ NaCl 的 O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS分段洗脫，收集O. 06MNaCl溶液的洗脫峰； 3)、將上述洗脫液超濾濃縮後透析去除NaCl； 4)、將透析後的溶液再次上經預平衡的DEAE— Sepharose Fast Flow層析柱,用O. OlMpH7. O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02,0. 04,0. 06M NaCl 的 O. OlM pH7. O 7. 5 的 PBS 分段洗脫，收集O. 06M NaCl溶液的第三個洗脫峰； 5)、將上述洗脫收集液用80%硫酸銨沉澱，離心收集沉澱； 6)、用PBS適量溶解沉澱,經Sephadex_G75進一步純化,再經透析除鹽，冷凍乾燥。
6.如權利要求5所述的方法，其中，步驟I)蛇毒預處理的方法是將蛇毒用適量預冷的O.OlM pH7. O 7. 5的PBS溶解，離心取上清液進行透析。
7.如權利要求5所述的方法，其中，步驟I)蛇毒預處理的方法是稱取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍體積預冷的O. 01MpH7. O 7. 5的PBS於4 8°C的層析櫃中攪拌溶解30 60分鐘，於4°C、5，000^10, OOOg離心1(Γ20分鐘，將離心上清液傾入透析袋，離心沉澱再用蛇毒重量5 10倍體積預冷的PBS攪拌懸浮，再次離心，合併兩次離心上清液裝入透析袋中，於4 8。。對O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS透析12 24小時，期間更換溶液2 4次。
8.如權利要求5所述的方法，其中，步驟2)和步驟4)採用O.OlM ρΗ7. O 7. 5的PBS預平衡DEAE — Sepharose Fast Flow層析柱,然後上樣。
9.如權利要求5 8任一項所述的方法，其中，步驟3)採用分子截留值為5，00(T10，000D的超濾膜進行超濾濃縮。
10.如權利要求51任一項所述的方法，其中，步驟6)純化的方法是將步驟5)收集的沉澱用PBS溶解後，上SephadeX-G75層析柱，用O. OlM pH7. 4PBS洗脫液洗脫，收集洗脫液第一個峰。
全文摘要
本發明提供了一種尖吻蝮蛇血凝酶-B，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離到的一種高活性血凝酶，該酶為由236個胺基酸組成的單鏈糖蛋白，具有SEQ ID No.1所示的胺基酸序列。鏈內含有6對二硫鍵；SDS-PAGE分子量約35kD，脫糖基化後的酶分子量26116.7Da；等電點pI 6.0。酶分子在Asn77,100,229位點上具有雜合多聚糖修飾。該酶為絲氨酸蛋白酶。本發明還提供了該酶的分離純化方法，包括通過預處理去除不溶物，再通過兩次陰離子交換柱層析和一次Sephdex-G75分子篩層析，收集活性洗脫峰，經透析、凍幹，即得高純度蛇毒血凝酶。其比活力不低於2000U/mg，HPLC分析純度可達95%以上，以蛇毒原料重量計收得率為0.25%－0.30%。
文檔編號C12N9/74GK102925422SQ20121045898
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者孫狄, 王錫娟 申請人:北京康辰藥業有限公司