用於治療腎病症的方法

2023-12-01 16:14:06 4

專利名稱：：用於治療腎病症的方法
技術領域：
：本發明涉及VEGFR調控劑的治療用途，包括利用VEGFR激動劑來治療腎病症的方法。
背景技術：
：經由兩種酪氨酸激酶受體即在內皮細胞上表達的Fltl(VEGFR-l)和Flkl(KDR/VEGFR-2)的活化，血管內皮生長因子(VEGF-A)調節多種血管功能，包括內皮細胞分化和存活(參見例如Ferrara，N.，etal.ThebiologyofVEGFanditsreceptors.iVWMed9:669-676(2003))。最近的研究鑑定出多種非內皮細胞上的VEGF受體表達，包括造血幹細胞，說明VEGF配體/受體系統有非血管調節功能。參見例如Autiero,M.，etal.Placentalgrowthfactoranditsreceptor,vascularendothelialgrowthfactorreceptor-1:noveltargetsforstimulationofischemictissuerevascularizationandinhibitionofangiogenicandinflammatorydisorders./77zra附6T/ae附oW1:1356-1370(2003)。在腎臟中，VEGF受體主要見於腎小球前、腎小球、腎小球後(參見例如Thomas,S.,et.al.Vascularendothelialgrowthfactorreceptorsinhumanmesangiuminvitroandinglomerulardisease.J爿m5bcJVgp/zw/11:1236-12433(2000))和小管周內皮細胞以及腎小球繫膜細胞，但不見於足細胞。參見例如Gruden,G.,etal.,1997.Mechanicalstretchinducesvascularpermeabilityfactorinhumanmesangialcells:mechanismsofsignaltransduction./VocAto/v4caJ爿94:12112-12116(1997);Harper,S丄,etal.Expressionofneuropilin-1byhumanglomerularepithelialcellsinvitroandinvivo.C""101:439-446(2001);及Takahashi,T"etal.Proteintyrosinekinasesexpressedinglomeruliandculturedglomerularcells:Flt-1andVEGFexpressioninrenalmesangialcells.所oc/^附Ao;/^Cbmm柳209:218-226(4-6)(1995)。在正常成人腎臟中，VEGF國A表達在腎小球足細胞和管內皮細胞中最突出，在腎小球繫膜中較低，但在內皮細月包中才企測不到。參見例^口Noguchi，K"etal.Activatedmesangialcellsproducevascularpermeabilityfactorinearly-stagemesangialproliferativeglomerulonephritis.J爿w5bcAAep/zra/9:1815-1825(1998);及Simon，M.，etal.Expressionofvascularendothelialgrowthfactoranditsreceptorsinhumanrenalontogenesisandinadultkidney.」w-J"屍/z戸.0/268:F240畫250issn:0002-9513(1995)。根據表達的定位，認為VEGF-A主要經由靶向腎小球和小管周內皮細胞的旁分泌或近分泌(juxtacrine)效應器功能在腎穩態和腎小球濾過中發揮調節作用。多項研究評估了VEGF-A在腎發育過程中及在腎損傷模型中的作用。參見例如deVriese，A.S.etal.Antibodiesagainstvascularendothelialgrowthfactorimproveearlyrenaldysfunctioninexperimentaldiabetes./爿w*Soc臉//2ra/12:993-1000(2001);Eremina,V.etal.Glomerular-spedficalterationsofVEGF-Aexpressionleadtodistinctcongenitalandacquiredrenaldiseases./C7/"/"ves111:707-16(2003);Kang,D.H"etal.Impairedangiogenesisintheremnantkidneymodel:II.Vascularendothelialgrowthfactoradministrationreducesrenalfibrosisandstabilizesrenalfunction./爿附iSbcTVep/zra/12:1448-57(2001);Masuda，Y.etal.Vascularendothelialgrowthfactorenhancesglomerularcapillaryrepairandacceleratesresolutionofexperimentallyinducedglomerulonephritis.勘《/PaAo/159,599-608(2001);及Ostendorf，T.etal.VEGF(165)mediatesglomerularendothelialrepair./C7/"/"veW104:913-23(1999)。VEGF-A的失調是腎疾病(包括腫瘤、糖尿病和腎小球腎炎)實驗模型中的共同特徵(參見例如Khamaisi,M.，etal.emergingroleofVEGFindiabetickidneydisease.iVep/zra/D/a/7>"mp/aw/18:1427-1430(2003》及Schrijvers,B.F.，etal..Theroleofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inrenalpathophysiology./"f65:2003-2017(2004))。VEGF-A及其受體在患有1型和2型糖尿病至少某段時期的實驗動物或人中上調，而VEGF-A水平降低與多種進行性腎疾病中剩餘腎中的腎小球硬化症和小管間質性纖維化的發生有關。參見例如Honkanen,E"etal.Decreasedexpressionofvascular4endothelialgrowthfactor.in.idiopathicmembranousglomerulonephritis:relationshipstoclinicalcourse.爿m/《/o"ey42:1139-1148(2003);Korbet,S.M.，etal.Theracialprevalenceofglomerularlesionsinnephroticadults.爿附J"27:647-51(1996);Sivridis,E"etal.Plateletendothelialcelladhesionmolecule-1andangiogenicfactorexpressioninidiopathicmembranousnephropathy.」w/A7t/"eyZXs41:360-365(2003》及Srivastava，T.,etal.Highincidenceoffocalsegmentalglomerulosclerosisinnephroticsyndromeofchildhood.屍e^^7Vep/zra/13:13-8(1999)。FSGS的主要組織病理學特徵之一是胞外基質(ECM)沉積物的積累或腎小球硬化症。腎小球硬化症的發病機理未知，而且腎小球內存在的三種細胞類型(足細胞、內皮或腎小球繫膜細胞)中哪一種參與纖維化過程未知。腎小球繫膜細胞隨胞外基質(ECM)生成增加而複製，作為對腎損傷的腎小球應答的一部分，不管損傷的類型，例如在腎小球腎炎或糖尿病性腎病中。此過程損傷腎小球濾過，導致腎小球硬化和末期腎衰竭。參見例如Buschhausen，L.,etal.Kidneyfibrosisimpairsglomerularultrafiltrationandresultsinglomerularsclerosisandend-stagerenalfailure.RegulationofmesangialcellfUnctionbyvasodilatorysignalingmolecules.C"Womsc51:463-469(2001)。在腎小J^更化症轉基因模型中(參見例如Shih,N.Y.，etal.CongenitalnephroticsyndromeinmicelackingCD2-associatedprotein5We"ce286:312-315(1999))或在患者中(參見例如Srivastava,T.,etal.Synaptopodinexpressioninidiopathicnephroticsyndromeofchildhood.A7d"ey59:118-125(2001))鑑定到的足細胞異常說明這些細胞可能在腎小球疤形成的啟動中發揮作用。其它模型暗示內皮或腎小球繫膜細胞牽涉硬化過程(參見例如Schnaper,H.W.，etal.TGF-betasignaltransductionandmesangialcellfibro卿esis.」附JT/z;wb/ie"a/284:F243-252(2003))。在腎小球硬化症的許多模型中(以及在FSGS臨床中)，ECM積累常常表現出在腎小球繫膜中開始。腎小球中的所有三種細胞類型都與疾病進展有關，而且可能以某種方式有助於疾病進展。根據顯示原代人腎小球繫膜細胞應答VEGF刺激而增殖增加(Onozaki,A.,etal..RapidchangeofglucoseconcentrationpromotesmesangialcellproliferationviaVEGF:inhibitoryeffectsofthiazolidinedione.5Zo//z;AyCommw"317:24-29(2004))、誘導膠原合成(Amemiya，T.,etal.VascularendothelialgrowthfactoractivatesMAPkinaseandenhancescollagensynthesisinhumanmesangialcells,ift^ey56:2055-2063(1999))和一氧化氮生成增力口(Trachtman,H.，etal.Effectofvascularendothelialgrowthfactoronnitricoxideproductionbyculturedratmesangialcells,5/oc/ze附5/c^/;asi^yCo附ww"245:443-446(1998))的研究，認為VEGF-A對腎小球繫膜細胞具有功能性作用。還可參見l列^口Thomas,S.，etal.Vascularendothelialgrowthfactorreceptorsinhumanmesangjuminvitroandinglomerulardisease./」附SociVep/zra/11:1236-1243(2000)。然而，不管在體外腎小球繫膜細胞對VEGF-A刺激的應答性，腎發育過程中腎小球繫膜細胞中VEGF-A生成改變的效果和所牽涉的VEGF受體的本質仍然未知。需要探索和理解VEGF和VEGF受體在腎中和在腎的各細胞類型中的生物學功能。理解這些分子的生物學功能可以通向腎疾病的治療。本發明解決這些和其它需要，正如閱讀以下公開內容後將會顯而易見的。發明概述本發明提供了用於治療受試者中的腎疾病的方法。例如，本發明的方法包括對患有腎疾病的受試者施用有效量的VEGFR調控劑。可用於本發明的VEGFR調控劑包括但不限於例如對至少一種或多種VEGF受體特異性的激動劑，諸如VEGF、VEGFR-1(Flt-1)激動劑、能選擇性結合Flt-l的Flt-l選擇性VEGF變體(Flt-sel)、能結合和活化Flt-l的生長因子諸如PIGF或VEGF-B、抗VEGFR-1激動性抗體(例如單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體)、小分子Fltl激動劑等。在本發明的一個實施方案中，所述VEGFR調控劑是Fltl激動劑。在一個實施方案中，所述VEGFR-l激動劑與血管發生劑(例如VEGF)、別的VEGFR1配體或激動劑、VEGFR2配體、VEGFR-2(KDR)選擇性變體、抗VEGFR-2激動性抗體、VEGF-C、VEGF-D、能結合和活化VEGFR1和/或VEGFR2的生長因子等聯合施用。可以通過本發明治療的腎疾病包括但不限於炎性腎疾病(例如特徵為炎性細胞改變、免疫複合物沉積(例如IgM沉積)、補體激活(例如Clq、C3和C4的激活)或其組合)、腎炎、腎小球硬化症、腎小球腎炎(腎衰竭)(例如可以通過蛋白尿、腎小球硬化、高血壓、腎腎小球繫膜細胞的存活時間縮短(decreasedsurvival),ecm合成的基因表達升高、基質降解降低和/或這些因素的組合確定的)、病灶性節段性腎小球硬化(FSGS)等。在本發明的某些實施方案中，所述受試者患有導致腎疾病的感染。在某些實施方案中，所述腎疾病的特徵為VEGF水平降低。在本發明的某些實施方案中，所述疾病包含腎的各細胞類型(例如腎小球繫膜細胞、足細胞、和/或內皮細胞)的改變。在本發明的某些實施方案中，投遞給受試者的本發明藥劑是蛋白質或多肽。在本發明的某些實施方案中，本發明的藥劑可以通過系統性(全身性)投遞系統施用給受試者。所述系統性投遞系統可以包括緩釋製備物，其包含藥劑(例如純化的藥劑)和聚合物基質。在一個實施方案中，施用細胞製備物，其包含表達重組形式藥劑的哺乳動物細胞(例如CHO細胞)。或者，本發明的主題藥劑可以經由腎靶向基因投遞載體來施用，所述腎耙向基因投遞載體包含編碼所述藥劑的核酸。可以使用已經為了基因療法完善建立的病毒或非病毒載體，例如腎靶向基因投遞載體。還提供了包含VEGFR調控劑的製品和試劑盒，以及診斷試劑盒和方法。附圖筒述圖l，小圖a-h，圖示了Fltl-Cre轉基因小鼠使用ROSA26LacZ報導抹系的表徵和Fltl-Cre;VEGF-loxP小鼠的生成。(a)Fltl-Cre+;VEGF(1。xP/+)和Fit1-Cre-;VEGF^洲一小鼠雜交產生的子代的基因型頻率。所有所得基因型的小鼠以預期孟德爾比例出生。(b)Fltl-Cre+;VEGF^洲—小鼠的存活曲線。降低的存活在出生後4周明顯可見，而且>95%的這些小鼠到12周齡時死亡。(c)7.5周齡Fltl-Cre-與Fltl-Cre+;VEGF一p^^小鼠相比腎重對體重比率百分比。Fltl-Cre+;VEGFd。洲。刑腎重量顯著小於對照的。Fltl-Cre-,n=25;Fltl-Cre+;Vegf一p/i。xp),n=10;*p<0.0001。(d)(右)切除自4周齡Fltl-Cre+;VEGF^^小鼠的腎的典型外觀，與(左)WT和表型正常的腎相比。Fltl-Cre+;VEGFG。迴。^腎頻繁嚢腫且外觀蒼白。(e)(頂)用以檢測4-5周齡Fltl-Cre;VEGF-loxP小鼠尿液中存在的蛋白質的銀染。自3隻小鼠(代表小圖頂圖所示每種基因型)取1^L尿液進行SDS-PAGE和銀染。在Fltl-Cre+,VEGF(1°xP/1°xP)小鼠的尿液中檢測到豐富的蛋白質，但是Fltl-Cre+,VEGF^p^或Fltl-Cre-小鼠沒有，指示條件性VEGF敲除中的嚴重蛋白尿。(底)來自Fltl-Cre;VEGF-loxP小鼠的尿液使用針對清蛋白製備的抗體的Western印跡分析。(f)7.5周齡Fltl-Cre;VEGF-loxP小鼠中的血液尿素氮(B.U.N.)水平。Fltl-Cre+;VEGF(loxP/loxP),n=9;Fltl-Cre+;VEGF(loxP/+)，n=8;Fltl-Cre-,n=16;直<0.0001。(g)7.5周齡Fltl-Cre;VEGF-loxP小鼠中的血清肌酸酐水平。Fltl-Cre+;vegf(i。洲。xp),n=9;Fltl-Cre+;vegf(1。xP/+),n=8;Fltl-Cre-，n=16;承p值<0.05。(h)MAP測量過程中的均值動脈血壓(MAP)和均值心率。(左軸和柱)MAP+/-標準偏差描繪為黑色柱。Fltl-Cre+;VEGFG。遷。刑中的MAP與Fltl-Cre-小鼠相比顯著升高。(右軸和正方形)在MAP測量過程中記錄每隻小鼠的心率，均值測量結果顯示為黑色正方形+/-標準偏差。條件性VEGF敲除中的均值心率與對照相比沒有顯著不同。Fltl-Gre+;VEGF(loxP/loxP),n=5;Fltl-Gre陽，n=10;"p值<0.005。圖2，小圖a-c，圖示了Fltl-Cre轉基因和VEGF-A在腎小球的腎小球繫膜細胞中共表達(a)(左)來自7.S周齡小鼠腎的切片使用VEGF-A反義探針進行原位雜交的H&E染色的亮視野圖像。(右)左小圖所示圖像的暗視野照片。VEGF-A表達在年齡匹配的Fit1-Cre+;VEGF(1°xP/1。xP)'J、鼠的腎小球內顯著降低。(b)18.5天齡胚胎Fltl-Cre+;VEGF^^"小鼠腎切片使用親和純化的、針對Cre重組酶製備的抗血清的免疫組織化學染色。(頂)由Fltl基因啟動子驅動的Cre重組酶表達(褐色)在腎小球內的內皮細胞和腎小球繫膜細胞(me)中都檢測到。(底)Flt-Cre表達顯示於內皮細胞(en)中，遍及小管-間質/髓質隔室，作為對照。(c)分離自7周齡Fltl-Cre;VEGF-loxP小鼠的總腎RNA的實時RT-PCR分析。Cre重組酶、Fltl、Flkl、和VEGF-A的相對RNA單位(RRU)相對於GAPDH水平標準化，且由標準曲線計算(Gerberetal.，2000)。Fltl-Cre+;VEGF(iox歸)，n=6;Fltl-Cre+;VEGF(loxP/+)，n=6;Fltl-Cre.,n=6;承p值<0.05。圖3，小圖a-m，示意性圖示了2-7周齡Fltl-Cre;VEGF-LoxP小鼠腎的組織學分析及分離自5周齡Fltl-Cre;VEGF-LoxP小鼠的腎的透射電子顯微照片(a)2周齡Flt1-Cre+;VEGF^^。Wd、鼠的腎皮質用H&E染色並以低放大倍數照相。標示了皮質嚢肺的邊界(點線)，而且由外周細胞組成且明顯缺乏腎小球毛細胞環的腎小球明顯可見。(b)H&E染色的2周齡WT腎小球切片。(c)H&E染色的2周齡Fltl-Cre+;VEGF一P"—小鼠腎小球切片。在(b)中其WT同窩幼仔中觀察到的緊密毛細管環表現為缺失。(d)H&E染色的2周齡Fltl-Cre+;VEGF^洲。xPM、鼠腎小球切片，其腎小球毛細管擴大，並被豐富的ECM沉積所遮掩。(e)來自7周齡Fltl-Cre-小鼠的腎小球用H&E染色的典型外觀。(f)H&E染色的7周齡Fltl-Cre+;VEGFG。洲。^小鼠腎小球切片。在此階段，條件性VEGF敲除的腎小球顯著擴大，而且豐富的ECM沉積侵害腎小球毛細管和尿液空間(urinaryspace)。(g和h)Fltl-Cre-(g)和Fltl-Cre+;VEGFd。必1。,(h)7周齡腎中內皮細胞使用a-CD31的免疫組織化學染色。在突變腎中檢測到較少的CD31陽性內皮細胞。(i和j)Fltl-Cre-(i)和Fltl-Cre+;VEGFd。x飾刑①7周齡腎中通過原位雜交檢測到的TGF-P表達。在條件性VEGF-A敲除腎中檢測到TGF-P的顯著上調。(k和l)用以檢測Fltl-Cre-(k)和Fltl-Cre+;VEGF('。洲1^)(1)7周齡小鼠腎中a-平滑肌肌動蛋白(ot-SMA)的免疫組織化學染色。遍及條件性VEGF敲除的腎小球可檢測到增加的a-SMA染色，反映了剩餘腎小球繫膜細胞的活化。(m)(頂)透射電子顯微照片證明了Fltl-Cre+;VEGF^xP^司腎與(底)Fltl-Cre-腎的眾多缺陷。(左)在患病腎中有足細胞足突(粉融合(箭頭)的區域，而在對照中有清楚的足突。(中)在腎小球繫膜(me)中，在與免疫介導的腎小球腎炎一致的內皮下位置可以看到眾多電子緻密沉積物(de),其在Flt-Cre.腎中不存在。(右)在具有晚期損傷的腎小球中，在Fltl-Cre+;VEGFG。xP^刑腎中看到顯著增厚的和起皺的腎小球基底膜。在對照中看到開窗的內皮細胞(fenestratedendothelialcell)(en),但是在條件性VEGF敲除中缺失。圖4，小圖a-b,示意性圖示了Fltl-Cre+;VEGF^P"。^小鼠中腎衰竭的進展與IgM沉積和補體激活有關(a)Fltl-Cre+;VEGFG。週。刑與Fltl-Cre湘比(黑條)及Fltl-Cre+;VEGFd。xP")與Fltl-Cre-匹配器官相比(灰條)腎、肺、和心組織中單核細胞/巨噬細胞(MAC-l，F4/80)、B細胞(CD45R)和T細胞(Thy-l)語系的細胞上表達的基因的RNA水平的倍數變化。表達水平已經相對於鼠GAPDH特異性的探針/引物集標準化。表達的統計學顯著倍數變化以星號標註，p值〈0.005。Fltl-Cre+;vegf('。必旨)，n=6;Fltl-Cre+;vegf(1。xP/+)，n=6;Fltl國Cre-,n=6。(b)5周齡Fltl-Cre-和Fltl-Cre+，VEGF('。必旨)小鼠腎中(左)單核細胞/巨噬細胞和(右)T細胞語系的細胞的免疫組織化學/焚光染色，分別使用a-F4/80抗體和a-CD4抗體。單核細胞/巨噬細胞和T細胞子集被募集入條件性VEGF-A敲除(小鼠)的腎組織。圖5,小圖a-f，圖示了VEGF-A和Fltl缺陷腎小球繫膜細胞的體外分析(a)用以創建Fltl-loxP小鼠的基因尋靶策略。尋靶載體設計成在包含Fltl基因的翻譯起始密碼子(ATG)的第一外顯子的上遊導入側翼為兩個loxP位點(LoxPl和LoxP2)的PGK-Neo盒，及在第一外顯子的3，導入第三loxP位點(LoxP3)。Cre重組酶表達後，選擇已經在LoxPl和LoxP2之間經歷重組的胚胎幹(ES)細胞克隆並用以生成Fltl-loxP小鼠。顯示了用於通過Southern印跡篩選尋靶事件和重組的PCR擴增的基因組DNA探針(5，Pr,3，Pr)的位置。指出了用於此篩選的限制酶位點的位置和尋靶載體的區域的長度(以千鹼基為計)。E:EcoRI;H:HindIII;K:Kpnl;kb:千鹼基。(b)提取自WT和被耙向的(Targ.)ES細胞克隆及提取自感染了編碼LacZ(LZ)或Cre重組酶(Cre)基因的腺病毒的FitiG。g。,腎J、球繫膜細胞(Mes.)的基因組DNA的Southern印跡分析。將來自各細胞的基因組DNA或者用EcoRI或者用HindIII和KpnI二者消化以分析分別在Fltl基因被靶向的區域5，端或3，端的尋耙事件和loxP重組。每個小圖的左邊和右邊分別指出了每條泳道中檢測到的預期片段的長度(以千鹼基計)。(c)感染了腺病毒的腎小球繫膜細胞中的VEGF-A表達。自WT和VEGF(l°xP/1°xPM、鼠分離腎小球繫膜細胞，並感染編碼LacZ(Ad-LacZ)或Cre重組酶(Ad-Cre)的腺病毒。分離總RNA,並進行定量實時PCR以分析VEGF-A表達。相對於GAPDH標準化後，結果表述成相對RNA單位(RRU)，並且使用來自WT小鼠的總腎RNA生成每種引物/探針集的標準曲線。(d)感染了腺病毒的腎小球繫膜細胞中的Fltl表達。自WT和Flt嚴^。,小鼠分離腎小球繫膜細胞，並感染Ad-LacZ和Ad-Cre。分離RNA,並通過定量RT-PCR分析Fltl表達。結果如(c)中所述表述。(e)VEGF-A和Fltl缺陷腎小球繫膜細胞的體外存活。計算Ad-LacZ和Ad-Cre處理之間的細胞計數比率，並標準化為對WT細胞獲得的數值的百分比。VEGF-A和Fltl缺陷腎小球繫膜細胞都展現與WT腎小球繫膜細胞相比顯著降低的體外存活。與WT細胞相比的存活的統計學顯著差異以星號標註*值<0.05;"p值O.Ol。Fltl缺陷的和VEGF缺陷的腎小球繫膜細胞還展現顯著不同的體外存活，p<0.05。(f)在存在中和性VEGF抗體(a-VEGF)或對照抗體(對照IgG)時培養的感染了Ad-LacZ的腎小球系10膜細胞的存活。在VEGF-A或Fltl在遺傳上消除時明顯可見的降低的腎小球繫膜細胞存活不能通過在存在ot-VEGF時培養腎小球繫膜細胞來重演。圖6，小圖a-d，圖示了分離自7周齡Fltl-Cre;VEGF-loxP小鼠的總腎RNA的實時RT-PCR分析，用以檢測不同形式膠原的表達。膠原otl型I(a)、膠原a2型I1(b)、膠原o^型IV(c)和膠原al型XVIII(d)的相對RNA單位(RRU)相對於甘油醛-3-脫氫酶(GAPDH)水平標準化，且由標準曲線計算。發明詳述定義在詳細描述本發明之前，應當了解本發明不限於特定的組合物或生物學系統，它們當然可以有所變化。還應了解本文所用術語僅出於描述具體實施方案的目的，並非意圖對其進行限制。在用於本說明書和所附權利要求時，單數形式"一個"、"一種"、"該"和"所述"包括複數的對象，除非另有明確說明。因此，例如，提及"一個/種分子"任選包括兩個/種或更多個/種此類分子的組合，諸如此類。腎炎即腎臟的炎症。腎炎的跡象(例如尿液中的血液和/或蛋白質及受損的腎功能等)取決於免疫應答的類型、位置和強度，影響腎小管、腎小管、腎小管周圍組織、或血管的炎症。"腎炎相關疾病，，包括但不限於例如原發性腎小球病(急性瀰漫性增生性腎小球腎炎、鏈球菌後腎小球病、非鏈球菌後腎小球病、新月體腎小球腎炎、模型腎小球病、類脂性腎病(lipoidnephrosis)、病灶性節段性腎、球硬化(focalsegmentalglomerulonephritis)、才莫型增生性腎、球腎炎(membranoproliferativeglomerulonephritis)、IgA腎病、病灶性增生性腎小J求腎炎(focalproliferativeglomerulonephritis),和'lt性腎小J求腎炎)、系統性疾病(系統性紅斑狼痴、糖尿病、澱粉樣變(amyloidosis)、古德帕斯丘氏(Goodpasture)症候群、節結性多動脈炎、韋格納氏(Welgener)肉芽肺病、亨諾-許蘭(Henoch-Schonlein)紫癜、和細菌性心內膜炎)、和遺傳性病症(阿爾波特氏(Alport)症候群、薄膜疾病(thinmembranedisease)、和法布裡氏(Fabry)病)。"腎病症候群"是由影響腎臟的許多疾病所致症狀的集合，導致嚴重的、長時間的蛋白質從尿液中丟失、血液蛋白質(尤其是清蛋白)水平降低、過量的鹽和水滯留在體內、和血液脂肪(脂質)水平升高。腎病症候群可以是由任何腎小球病或多種疾病引起的。典型的是，該症候群在3或4個月內進展成完全腎衰竭。"急性腎病症候群，，或"急性腎小球腎炎"指常常導致尿液中突然出現血、尿液中有血細胞團塊(管型(cast))和不同量的蛋白質的腎小球炎症。急性腎病症候群可以在鏈球菌感染後發生，諸如咽喉鏈球菌感染(strepthroat)。因為與中和鏈球菌的抗體一起結成團塊的來自死亡鏈球菌的抗原的積累，腎小球遭到損傷。這些團塊(免疫複合物)覆蓋腎小球的膜並幹擾它們的濾過功能。急性腎病症候群也可以是由對其它感染的反應引起的，諸如人造身體部分(假體)的感染、細菌性心內膜炎、肺炎、腹腔臟器膿腫、禽痘、傳染性肝炎、梅毒、和痴疾。最後三種感染可以引起腎病症候群，而非急性腎病症候群。"慢性腎病症候群"或"慢性腎小球腎炎"指在數種疾病中發生的病症，在所述疾病中在數年時段裡腎小球遭到損傷且腎功能退化。腎小球病即腎小球的疾病，其是毛細管叢的疾病。在腎小球疾病中，它是每個腎小管起點處毛細管環形成的叢的疾病。腎小球病的類型包括但不限於例如(1)急性腎病症候群；(2)快速進展的腎病症候群；(3)腎病症候群；和(4)慢性腎病症候群。因為腎小球遭到損傷，正常情況下不從血流中濾出的物質(諸如蛋白質、血、白細胞、和碎片)可穿過腎小球並進入尿液。微小的血塊(微血栓)可以在供應腎小球的毛細管中形成。腎小球硬化症是一種退行性腎疾病，其導致常常與腎動脈硬化或糖尿病有關的腎小球中玻璃狀沉積物(hyalinedeposit)或結疤。典型的是，有循環中炎性細胞的濾過、間質纖維化和管萎縮。由數種因素引起的腎小球損傷致使蛋白尿，其中蛋白質結合可溶性免疫球蛋白A(slgA)、slgG和sIgM，在基底膜上形成免疫複合物。這些免疫複合物發揮炎性淋巴細胞的趨化因子的功能，其在患病區域中引起過度的免疫應答(BohleAetal.，A^"ey67(Suppl.):186S-188S(1998))。在管受到炎性細胞損傷時，與腎小球相連接的血管也受到損傷並堵塞。結果是，腎小球受到不利影響並變質。這些腎小球變化伴隨有組織纖維化並進展成最終的腎衰竭(參見例如RatscchekMetal.，C7/"iV—ra/25:221-226(1986);BohleAetal,C7,"iVep/zra/29:28-34(1998);BohleAetal.，iC^/"ey說ood屍mwies19:191-195(1996))。一種類型是病灶性節段性腎小球硬化(FSGS)，其是具有增厚基底膜和增多腎小球繫膜基質的腎小球毛細管的節段性塌陷(segmentalcollapse),其常常導致蛋白尿和腎機能不全。參見例如Kamannaetal.,/似to/.i/^topa決o/.13:169-179(1998);Wehrmannetal"C7/".A^//zra/.33:115-122(1990);Mackensen-Haen,etal.，C//".A^p/zm/.37:70-77(1992)。它可以引起永久的腎衰竭。術語"腎小球繫膜"(mesangium)指支持腎的腎小球中毛細管環的組織，由腎小球繫膜細胞和腎小球繫膜基質構成。已知腎小球繫膜細胞維持腎小球的環結構，以及具有吞噬功能或調節腎小球血流的能力。腎小球繫膜細胞具有血管緊張素II受體，並生成血小板激活因子、前列腺素、IV型膠原、纖連蛋白等。腎小球繫膜基質是圍繞腎小球繫膜細胞的胞外基質成分。術語"VEGF受體"或"VEGFR"在用於本文時指VEGF的細胞受體，通常是在血管內皮細胞上找到的細胞表面受體，及其保留與VEGF結合能力的片段和變體(諸如胞外結構域的片段或截短形式)。VEGFR的一些例子包括文獻中稱為Flt-l(在本文中也可與"VEGFR-1"互換使用)和KDR/Flk-1(在本文中也可與"VEGFR-2"互換使用)的蛋白激酶受體。參見例如DeVriesetal.Scz.ewce，255:989(1992);Shibuyaetal.Owcogewe,5:519(1990);Matthewsetal.Prac.艦爿cac/.5W"88:9026(1991);Te腿netal.O"cog騰，6:1677(1991);及Termanetal.5z'oc/zewi5/op/2j^.Cowww".,187:1579(1992)。Flt-l(fms樣酪氨酸激酶)和KDR(激酶結構域區)受體以高親和力結合VEGF。Flk-l(胎肝激酶-l)，KDR的鼠同系物，與人KDR共享85。/。的序列同一性。FerraraA:W"ey/"f/.56:794-814(1999)。Flt-1和KDR/Flk-1二者都具有胞外結構域(ECD)中的七個免疫球蛋白(Ig)樣結構域、單個跨膜區和共有的酪氨酸激酶(TK)序列，其被激酶插入結構域中斷。Flt-l具有對rhVEGF^的最高親和力，Kd為大約10-20pM。KDR具有對VEGF的較低親和力，Kd為大約75-125pM。VEGFR的核酸序列和胺基酸序列易於由本領域技術人員獲取和得到。其它VEGF受體包括那些可以用VEGF交4關標記的，或可以用KDR或Flt-1免疫共沉澱的。已經鑑定了能結合VEGF^但不能結合VEGFm的一種別的VEGF受伴，其是神經纖毛蛋白(neuropilin)1。Sokeretal.CW/92:735-45(1998)。同工型(isoform)特異性VEGF結合受體也是介導神經元細胞導向的腦衰蛋白(collapsing)/信號素(semaphoring)家族的受體。Flt-l和KDR受體主要作為血管內皮細胞表面上的結合受體存在，儘管它們也可以存在於非內皮細胞中。還已經找到了一些可溶形式的VEGFR。例如，已經在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中鑑定了編碼可變剪接的可溶形式的Fit-1(sFlt-l)的cDNA，其缺少第七個Ig樣結構域、跨膜序列、和胞質結構域。Kendalletal,腸c/z麼歷—,Co畫.226:324-328(1996)。術語"VEGF"和"VEGF-A"可互換使用，指165個胺基酸的血管內皮細胞生長因子及相關的121個、145個、183個、189個和206個胺基酸的血管內皮細胞生長因子，如Leungetal.,Science246:1306(1989);Houcketal.，Mol,Endocrin.5:1806(1991);及Robinson&Stringer,Jowrwa/o/Ce〃5b/ewce,144(5):853-865(2001)所述，及其天然存在等位形式和加工形式。術語"VEGF"還用於指例如包含165個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子的胺基酸第8-109位或第l-109位、保留生物學活性的多肽片段。本申請中可能通過例如"VEGF(8-109)，，、"VEGF(1-109)，，或"VEGF165"來提及任何此類形式的VEGF。天然VEGF"片段"的胺基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。例如，天然VEGF片段中的第17位胺基酸(曱硫氨酸)也是天然VEGF中的第或Flt-l受體的結合親和力。"血管發生因子，，或"血管發生劑，，指刺激血管發育，例如促進血管發生(angiogenesis)、內皮細胞生長、血管穩定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長因子。例如，血管發生因子包括但不限於例如VEGF和VEGF家族的成員(A、B、C、D和E)、P1GF、PDGF家族、成纖維細胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素(angiopoietin))、ANGPTL3、ANGPTL4、ephrin等。它還包括加速傷口癒合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族的成員、及TGF-oc和TGF-P。參見例長口KlagsbrunandD，Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39;StreitandDetmar(2003)Oncogene22:3172-3179;F固m&Alitalo(1999)NatureMedicine5(12):1359-1364;Tonini等(2003)Oncogene22:6549-6556(例如列舉已知血管發生因子的表l);Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206。"天然序列"多肽包括與衍生自自然界的多肽具有相同胺基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可具有來自任何哺乳動物的天然存在多肽的胺基酸序列。此類天然序列多肽可以從自然界分離，或者可通過重組或合成手段生成。術語"天然序列"多肽明確涵蓋該多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結構域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。"分離的"多肽指已經鑑定且與由其天然環境的成分分開和/或回收的多肽。多肽的天然環境的汙染性成分指將會干擾其診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在某些實施方案中，將多肽純化至(1)根據Lowry法的測定，多肽重量超過95%或重量超過基酸序列的程度，或(3)根據使用考馬斯藍或銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE,達到同質。既然多肽的天然環境的至少一種成分不會存在，那麼分離的多肽包括重組細胞內的原位多肽。然而，分離的多肽通常通過至少一個純化步驟來製備。多肽"變體"意指與相應的天然序列多肽或其片段具有至少約80%胺基酸序列同一性的生物學活性多肽。此類變體包括例如在多肽的N-末端和/或C-末端添加或刪除一個或多個胺基酸殘基的多肽。通常，變體與天然序列多肽或其片段將具有至少約80%的胺基酸序列同一性，或者至少約90%的胺基酸序列同一性，或者至少約95%或更多的胺基酸序列同一性。術語"變體"在用於本文時指本文所述蛋白質變體和/或在天然蛋白質序列中包含一處或多處胺基酸突變的蛋白質。任選的是，所述一處或多處胺基酸突變包括胺基酸替代。用於本發明的其變體可通過本領域眾所周知的多種方法來製備。在本發明的某些實施方案中，本發明方法中所採用的VEGF包含重組VEGF，65。胺基酸序列變體可通過例如VEGFDNA或VEGFRDNA中的突變來製備。此類變體包括例如VEGF或VEGFR胺基酸序列內的殘基刪除、插入或替代。可以進行刪除、插入和替代的任何組合以獲得具有期望活性的最終構建物。將在編碼變體的DNA中進行的突變絕不能將序列置於讀碼框之外，而且優選不會產生能產生二級mRNA結構的互補區。EP75,444A。變體的製備任選通過編碼天然蛋白質的DNA中的核苷酸定點誘變或噬菌體展示技術，由此產生編碼所述變體的DNA,然後在重組細胞培養物中表達該DNAo儘管用於引入胺基酸序列變異的位點是預先決定的，然而突變本身不必預先決定。例如，為了優化指定位點處突變的後果，可以在目標密碼子或區域進行隨機誘變，並對所表達的變體篩選期望活性的最佳組合。用於在具有已知序列的DNA中預先決定的位點進行替代突變的技術是眾所周知的，諸如例如位點特異誘變。本文所述變體的製備可通過噬菌體展示技術來實現，諸如那些PCT出版物WO00/63380中所記載的。在選出這樣的一個克隆後，可以取出突變後的蛋白質區並置入適用於蛋白質生產的載體，一般是可用於轉化適宜宿主的那種類型的表達載體。胺基酸序列刪除的範圍一般是約l-30個殘基，任選1-10個殘基，任選l-5個殘基或更少，而且通常是連續的。胺基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，從一個殘基至長度本質上不受限制的多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。序列內插入(即天然蛋白質序列內的插入)的範圍一般可以是約1-10個殘基，任選l-5個，或任選l-3個。末端插入的例子包括在N-末端融合信號序列(無論對宿主細胞是異源的或同源的)以便於由重組宿主分泌。別的變體有那些其中天然蛋白質的至少一個胺基酸殘基已經消除並在它的位置插入了不同殘基的變體。此類替代可依照表l所示進行。變體還可包含本文所述的非天然胺基酸。胺基酸可以根據其側鏈特性的相似性如下分組(A丄丄ehninger,祝oc/zem^7,第2版，pp.73匿75,WorthPublishers,NewYork,(1975)):(1)非極性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不帶電荷的、極性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)石威性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，天然存在殘基可以基於共同的側鏈特性如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威性的:His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;(6)芳香力矣的Trp、Tyr、Phe。表l16tableseeoriginaldocumentpage17"天然存在的胺基酸殘基"(即由遺傳密碼編碼的胺基酸殘基)可以選自丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬醯胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);穀氨醯胺(Gln);穀氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);組氨酸(His);異亮氨酸(He);亮氨酸(Leu);賴氨酸(Lys);甲硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);絲氨酸(Ser);蘇氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和纈氨酸(Val)。"非天然存在的胺基酸殘基"指上文所列天然存在胺基酸殘基以外的，能夠在多肽鏈中與鄰近胺基酸殘基共價結合的殘基。非天然存在胺基酸殘基的例子包括例如正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它胺基酸殘基類似物，諸如那些Ellmanetal.,MeA.202:301-336(1991)及美國專利申請出版物20030108885和20030082575中所記載的。簡而言之，這些規程牽涉用非天然存在胺基酸殘基活化阻抑型tRNA,接著體外或體內轉錄並翻譯RNA。參見例如美國專利申請出版物20030108885和20030082575;Norenetal.，5W認e244:182(1989);及Ellmanetal.,supra。本領域技術人員使用常規篩選測定法可以容易地評估替代、刪除或插入的效果。例如，通過噬菌體展示選出的VEGF變體可以在重組細胞培養物中表達，並任選從該細胞培養物中純化。然後可以對VEGF變體評估KDR或Flt-l受體結合親和力和其它生物學活性，諸如本領域已知的或本申請中公開的生特徵的合適篩選測定法中篩選。例如，可能希望VEGF變體與天然VEGF相比免疫學特徵的變化，諸如對給定抗體的親和力。此類變化可以通過竟爭性免疫測定法來測量，該測定法可以依照本領域已知技術來進行。VEGF變體的各受體結合親和力可以通過本領域已知的和下文實施例中進一步描述的ELISA、RIA、和/或BLAcore測定法來測定。在本發明的一個實施方案中，本發明的VEGF變體還在反映誘導toR受體磷酸化能力的KIRA測定法中展現出活性。在本發明的一個實施方案中，本發明的VEGF變體誘導內皮細胞增殖，或者，額外還誘導內皮細胞增殖(其可以通過本領域已知方法來測定，諸如HUVEC增殖測定法)。本發明涵蓋在本文中公開的特定VEGF變體，除此之外，還涵蓋用於本發明的Keytetal.J所o/.C7zem.271:5638-5646(1996)中4皮露的VEGF變體。"百分比(％)胺基酸序列同一性"在本文中定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與選定序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序列同一性目的的對比可以本領域技術範圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可決定用於測量對比的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為本發明目的％胺基酸序列同一性值是如下所述使用序列比較電腦程式ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech公司編寫，已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.，20559),並以美國版權註冊號TXU510087註冊，公眾可通過Genentech公司(SouthSanFrancisco,California)獲4尋。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX作業系統，例如數碼UNIXV4.0D上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。為本發明目的，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)、或針對(against)給定胺基酸序列B的。/。胺基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列B的某一Q/。胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算分數X/Y乘100的胺基酸殘基數，且其中Y是B中的胺基酸殘基總數。可以領會，若胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等，則A相對於B的。/。胺基酸序列同一性將不等於B相對於A的％胺基酸序列同一性。術語"調控，，在用於本文時指降低、抑制、減少、改善、升高、增加或增強VEGFR基因功能、表達、活性或與VEGFR基因有關的表型。術語"VEGFR調控物"或"VEGFR調控劑"或"VEGFR調控化合物"指能活化(例如激動劑)其表達或能抑制(例如拮抗劑或抑制劑)VEGFR的活性或其表達的分子。術語"激動劑"用於指有能力經由天然VEGFR受體發信號的藥劑。術語"激動劑"在VEGFR受體生物學作用的語境中定義。在本發明的某些實施方案中，VEGFR調控物包括但不限於VEGFR激動劑(例如Fltl激動劑)、能結合VEGFR受體的配體(例如VEGF、VEGF選擇性變體、P1GF、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D)。本發明別的激動劑包括但不限於例如具有激動劑活性的VEGFR變體、VEGFR激動性抗體等。VEGFR拮抗劑指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或幹擾VEGFR活性(例如細胞增殖或生長、遷移、粘附或代謝，包括其與配體(例如VEGF、VEGF選擇性變體、P1GF和VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D)結合)的分子。VEGFR拮抗劑包括例如抗VEGFR抗體及其抗原結合片段、能特異性結合VEGFR由此使其隔絕與一種或多種配體結合的受體分子及衍生物、抗VEGFR抗體和VEGFR拮抗劑諸如受體的小分子抑制劑。其它VEGFR拮抗劑還包括VEGFR的拮抗性變體、反義分子(例如VEGFR-siRNA)、RNA適體、和針對VEGFR或其受體的核酶。在某些實施方案中，拮抗性VEGFR抗體是19術語"抗VEGFR抗體，，指能以足夠親和力和特異性結合VEGFR的抗體。在本發明的某些實施方案中，本發明的抗VEGFR抗體可以在靶向和幹擾其中牽涉VEGFR活性的疾病或疾患時用作治療劑。一般而言，抗VEGFR抗體通常不會結合其它VEGFR同系物。術語"抗體，，以最廣義使用，包括單克隆抗體(包括全長的或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段(見下文)，只要它們展現出期望的生物學活性。除非另有說明，貫穿本說明書，表述"多價抗體"用於指包含三個或更多個抗原結合位點的抗體。多價抗體通常改造成具有三個或更多個抗原結合位點，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗體。"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結合位點，因此保留了與抗原結合的能力。此定義所涵蓋的抗體片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1結構域；(ii)Fab'片段，其是在CH1結構域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片l爻；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1結構域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1結構域及CH1結構域C-末端的一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單臂的VL和VH結構域；(vi)dAb片段(Wardetal.,A^w341:544-546(1989))，其由VH結構域組成；(vii)分離的CDR區；(viii)F(ab')2片段，包含通過鉸鏈區的二硫鍵相連的兩個Fab'片段的二價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv;scFv)(Birdetal"5We"ce242:423-426(1988)和Hustonetal.,iWJ5"(^ZXi)85:5879-5883(1988));(x)"雙抗體"，其具有兩個抗原結合位點，包含在同一條多肽鏈中相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)(參見例如EP404,097;WO93/11161;和Hollingeretal.，P亂胸/.爿c^/.5W.,90:6444-6448(1993));(xi)"線性抗體"，其包含一對串聯的Fd區段(VH-CHl-VH-CHl)，與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapataetal.,屍rato'w8(10):1057-1062(1995)和美國專利5,641,870)。術語"單克隆抗體，，在用於本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原。此外，與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語"單克隆"不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，依照本發明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohleretal.，A^we256:495(1975)記載的雜交瘤方法來製備，或者可通過重組DNA方法來製備(參見例如美國專利No.4,816,567)。"單克隆抗體"還可使用例如Clacksonetal.,7Va/wre352:624-628(1991)或Marksetal.，《/Mo/.所o/.222:581-597(1991)中記載的技術從噬菌體抗體庫分離。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No.4,816，567和Morrisonetal.,A/"af/.^cat/.5W.園81:6851-6855(1984》。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一^:而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環對應於非人免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫J求蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫^^蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恆定區。更多細節參見Jonesetal.,7V^w321:522-525(1986);Riechmannetal.,7VWw332:323-329(1988);和Presta，Cwr.所o/.2:593-596(1992)。"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸序列和定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已知的多種技術來生成。在一個實施方案中，人抗體是從噬菌體文庫選擇的，該嗟菌體文庫表達人抗體(Vaughanetal.,A^ffwreS/ofec/wo/ogy14:309-314(1996);Sheetsetal"/WyiS(775^」95:6157-6162(1998);HoogenboomandWinter,JMo/,^o/.227:381(1991);Marksetal.,/Mo/.所o/.222:581(1991》。21人抗體還可通過將人免疫球蛋白基因座導入內源免疫球蛋白基因已經部分或完全滅活的轉基因動物例如小鼠來生成。在受到攻擊時，觀察到人抗體生成，它在所有方面與在人體中看到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體全集。這種方法記載於例如美國專利No.5，545，807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016，及以下科學出版物Marksetal.，5/o/Tec/z"o/ogv10:779-783(1992);Lonbergetal.，A^wre368:856-859(1994);Morrison,Ato匿368:812-13(1994);Fishwildetal.，7Vaf騰腸fec/z"o/ogy14:845-51(1996》Neuberger，淑髒飾tec/wo/ow14:826(1996);LonbergandHuszar,/"/^7./m附柳o/.13:65-93(1995)。或者，人抗體可通過生成針對耙抗原的抗體的人B淋巴細胞的永生化來製備(此類B淋巴細胞可從個體回"文，或者可在體夕卜免疫)。參見例^口Coleetal.，Afowoc/ow"/a"<iC朋cerT7zera昆AlanR.Liss，p.77(1985》Boerneretal.，《/7m扁wo/.147(l):86-95(1991);美國專利No.5，750，373。術語"可變的"指可變域中的某些部分在抗體序列間差異顯著且用於每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性並非均勻分布於抗體的整個可變域。它集中於輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區的三個區段。可變域中相對保守得多部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR,它們大多採取P-摺疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成P-摺疊片結構一部分的三個高變區連接。每條鏈中的高變區通過FR一^常接近地保持在一起，並與另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結合^f立點的形成(參見Kabata/.，》Se《wewcaso/o/7mmwwo/og/ca//"&ms^，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術語"高變區，，在用於本文時指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區一般包含來自"互補決定區"或"CDR"的胺基酸殘基(例如輕鏈可變域中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變域中的殘基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabatefa/"Se《wewceso/iV她/rao//mwwwo/og/ca//wemst，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,(1991))和/或那些來自"高變環"的殘基(例如輕鏈可變域中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變域中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk,/Mo/.196:901-917(1987))。"框架區"或"FR，，殘基指可變域中那些除此處定義的高變區殘基以外的殘基。根據其重鏈恆定域的胺基酸序列，完整抗體可歸入不同的"類"。完整抗體有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可進一步分為"亞類"(同種型),例如IgG!(包括非A和A同種異型)、IgG2、IgG3、IgG4、IgA!和IgA2。將與不同類的抗體對應的重鏈恆定域分別稱作a、S、s、y和P。不同類的免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的。根據其恆定域的胺基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體的"輕鏈"可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡巾白(K)和拉姆達(人)。術語"Fc區，，用於定義免疫球蛋白重鏈的C-端區域，其可以通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體而產生。Fc區可以是天然序列Fc區或變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義為自Fc區的大約Cys226位置或大約Pro230位置的胺基酸殘基至羧基末端的區段。免疫球蛋白的Fc區一般包含兩個恆定域，即CH2結構域和CH3結構域，而且任選包含CH4結構域。"Fc區鏈"在本文中指Fc區的兩條多肽鏈之一。人IgGFc區的"CH2結構域，，(也稱為"Cg2，，結構域)通常自大約第231位胺基酸延伸至大約第340位胺基酸。CH2結構域的獨特之處在於它沒有與另一結構域緊密配對。而是，有兩個N-連接的分支的碳水化合物鏈介於完整天然lgG分子的兩個CH2結構域之間。推測該碳水化合物可能提供結構域-結構域配對的替代且有助於穩定CH2結構域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206"CH3結構域，，包含Fc區中CH2結構域C-端的一段殘基(即自IgG的大約第341位胺基酸殘基至大約第447位胺基酸殘基)。CH3區在本文中可以是天然序列CH3結構域或變異CH3結構域(例如在其一條鏈中有引入的"隆起"(protroberance)而在其另一條鏈中有相應引入的"空腔"(cavity)的CH3結構域；參見美國專利No.5，821，333，明確收入本文作為參考)。此類變異CH3結構域可用於生成如本文所述的多特異性(例如雙特異性)抗體。"鉸鏈區"通常定義為自人IgGl的約Glu216或約Cys226至約Pro230的區段(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區可以通過將第一個和最後一個形成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置於相同位置而與IgGl序列對比。鉸鏈區在本文中可以是天然序列鉸鏈區或變異鉸鏈區。變異鉸鏈區的兩條多肽鏈通常每條多肽鏈保留至少一個半胱氨酸殘基，使得變異鉸鏈區的兩條多肽鏈可在兩條鏈之間形成二硫鍵。本文中優選的鉸鏈區是天然序列人鉸鏈區，例如天然序列人IgGl鉸鏈區。"功能性Fc區"擁有天然序列Fc區的至少一項"效應器功能"。例示性的"效應器功能"包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)聯合，而且可以使用本領域已知的用於評估此類抗體效應器功能的多種測定法來評估。在本發明的某些實施方案中，本發明的抗體可以具有改變的Fc區，導致改變的效應器功能，例如增強的功能或減弱的功能。"天然序列Fc區"包含與在自然界中找到的Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。"變異Fc區"包含由於至少一處胺基酸修"飾而與天然序列Fc區有所不同的氨基S菱序列。優選的是，變異Fc區具有與天然序列Fc區或與親本多肽的Fc區相比至少一處胺基酸替代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽的Fc區中具有約1處至約10處胺基酸替代，優選約1處至約5處胺基酸替代。變異Fc區在本文中將典型地與天然序列Fc區和/或與親本多肽的Fc區擁有例如至少約80%的序列同一性，或至少約90%的序列同一性，或至少約95。/。的序列同一性。"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性，，和"ADCC"指由細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，隨後引起靶細胞溶解。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達FcyRIII，而單核細胞表達FcyRI、FcyRII和FcYRIII。RavetchandKinet，iev./mwimo/.9:457-492(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No.5，500，362或5，821,337中所記載的。可用於此類測定法的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes""/.，(175^95:652-656(1998)中所披露的。"人效應細胞"指表達一種或多種FcR並行使效應器功能的白細胞。典型的是，該細胞至少表達Fc7RIII並行使ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性丁細胞和嗜中性粒細>9包，一般優選PBMC和NK細胞。效應細胞可以/人其天然來源分離，例如如本文所述/人血液或PBMC分離。術語"Fc受體"和"FcR'，用於描述結合抗體Fc區的受體。在一個實施方案中，FcR是天然序列人FcR。在一個實施方案中，FcR是結合IgG抗體的FcR(y受體)，包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcYRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的胺基酸序列，區別主要在其胞質結構域中。活化受體FcyRIIA在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcYRIIB在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪氨酸的抑制基序(ITIM)(綜述參見Daeron,爿"做.iev./wmw"o/.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見RavetchandKinet，Jww.iev.//wwwwo/.9:457-492(1991);Capel&a/.，Immunomethods4:25-34(1994》deHaasda/"/丄a6.C7/w.Me<i,126:330-41(1995)。術語"FcR"在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑑定的。術語"Fc受體"或"FcR"還包括新生兒受體，FcRn,它負責將母體IgG4爭牙多糹合月臺JL(Guyerefa/,，J/mmwwo/.117:587(1976)和Kim&//附mwwo/.24:249(1994))和調節免疫球蛋白的動態平衡。測量對FcRn的結合的方法是已知的(參見例如GhetieandWard,/wmw"o/7bcfcz_y18(12):592-598(1997);Ghetieetal.，胸廳5/她由o/ogy，15(7):637-640(1997);Hintonetal.,所o/.C7zem279(8):6213-6216(2004);andWO2004/92219(Hintonetal.))。可測定人FcRn高親和力結合多肽與人FcRn的體內結合和血清半衰期，例如在表達人FcRn的轉基因小鼠或經轉染的人細胞系中，或者在施用了具有變異Fc區的多肽的靈長類動物中。WO2000/42072記載了乂於FcR的結合得到改良或消除的抗體變體。還可參見例如Shieldsetal.J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。"補體依賴性細胞毒性"和"CDC"指在存在補體時靶物的溶解。補體激活途徑是由補體系統第一組分(Clq)結合與關聯抗原複合的分子(例如抗體)起始的。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如Gazzano-Santoroda/,，//扁,/.MeAocfe202:163(1996)中所記載的。"親和力成熟的"抗體指在抗體的一個或多個CDR中具有一處或多處改抗體。優選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領域已知規程來生成。Marks"歷o/Tec/z"o/ow10:779-783(1992)記載了通過VH和VL結構域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了CDR和/或框架殘基的隨機誘變Barbas"a/.，屍rac.^c^/.tZSJ91:3809-3813(1994);Schier"a/.,Ge"e169:147-155(1995);Yelton"a/"//www"o/.155:1994-2004(1995);Jacksonda/.，//附mw"o/.154(7):3310-9(1995);Hawkins"a/"Mo/.226:889-896(1992)。抗體的"功能性抗原結合位點"指能夠結合靶抗原的位點。抗原結合位點的抗原結合親和力不必像衍生該抗原結合位點的親本抗體那樣強，但是結合抗原的能力必須是使用已知用於評估抗體對抗原結合的多種方法之任一可測量到的。此外，本文中多價抗體的每個抗原結合位點的抗原結合親和力不必在量上相同。對於本文中的多聚體抗體，功能性抗原結合位點的數目可以使用超速離心分析來評估。依照這種分析方法，將靶抗原與多聚體抗體以不同比例混合，並計算複合物的平均分子量，其中假設不同數目的功能性結合位點。將這些理論值與得到的實際實驗值進行比較以評估功能性結合位點的數目。具有規定抗體的"生物學特徵"的抗體指擁有該規定抗體區別於其它結合相同抗原的抗體的一項或多項生物學特徵的抗體。為了篩選能結合抗原上感興趣抗體所結合的表位的抗體，可以實施常規交叉阻斷測定法，諸如v4w"'6o血s,」丄a6orato^yMawwa/,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所記載的。"多肽鏈"指其中其每個結構域通過肽4建(不同於非共價相互作用或二好4建)與其它結構域相連的多肽。"柔性接頭"在本文中指包含兩個或更多通過肽鍵相連的胺基酸殘基且為由其連接的兩段多肽(諸如兩個Fd區)提供更多旋轉自由的肽。所述旋轉自由容許由柔性接頭連接的兩個或更多抗原結合位點各自更高效的接近靶抗原。合適的柔性接頭肽序列的例子包括gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、和gly-gly-gly-ser。"二聚化結構域"是由至少兩個胺基酸殘基(一般是半胱氨酸殘基)或者至少兩個肽或多肽(其可以具有相同或不同的胺基酸序列)結合形成的。所述肽或多肽可以經由共價和/或非共價結合而彼此相互作用。本文中的二聚化結構域的例子包括Fc區；鉸鏈區；CH3結構域；CH4結構域；CH1-CL對；具有改造的"結節"(knob)和/或"突起"(protruberance)的"界面，，，如美國專利No.5,821，333所述，明確收入本文作為參考；亮氨酸拉鏈(例如jun/fos亮氨酸拉鏈，參見Kostelneyetal.，//mm""o/"148:1547-1553(1992);或酵母GCN4亮氨酸拉鏈)；異亮氨酸拉鏈；受體二聚體對(例如白介素-8受體(IL-8R);和整聯蛋白異二聚體，諸如LFA-l和GPIIIb/IIIa)或其二聚化區；二聚配體多肽(例如神經生長因子(NGF)、神經營養因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成員、和腦衍生神經營養性因子(BDNF);參見Arakawaetal.歷o/.CTzem.269(45):27833-27839(1994)及Radziejewskietal.所oc/zew.32(48):1350(1993))或其二聚化區；一對能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基；一對肽或多肽，各自包含至少一個半胱氨酸殘基(例如約1個、2個或3個到約10個半胱氨酸殘基)使得可以在所述肽或多肽之間形成二硫鍵(下文的"合成鉸鏈，，)；及抗體可變域。本文中最優選的二聚化結構域是Fc區或鉸鏈區。短語"刺激細胞增殖，，涵蓋在體外或在體內提高細胞相對於未處理細胞或減輕處理細胞(reducedtreatedcell)的生長和/或繁殖程度的步驟。細胞培養中細胞增殖的升高可通過在暴露於目的分子之前和之後對細胞計數來檢測。增殖程度可通過顯微鏡檢驗匯合程度來定量。細胞增殖還可使用本領域已知的測定法(例如胸苷摻入測定法)和商品化測定法來定量。短語"抑制細胞(reducedtreatedcell)的生長和/或繁殖程度的步驟。它可以如上所述來定量。為了治療的目的，"受試者"指任何動物。一般而言，動物指哺乳動物。為了治療的目的，"哺乳動物，，指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，及動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、貓、牛、綿羊、豬等。典型的是，哺乳動物指人。與一種或多種其它治療劑"聯合"施用包括同時(共同)施用和/或任何次序的序貫施用。術語"有效量"或"治療有效量，，指藥物有效治療受試者中的疾病或病症的量。在腎疾病的情況中，藥物的有效量可以減輕/減少症狀或者減輕或消27除疾病。"處理"和"治療"(treatment)指治療性處置和預防性或防範性措施二者。需要治療的受試者包括那些早就患有病症的以及那些要預防病症的受試者。"病症"指任何會受益於本發明的分子的治療的疾患，例如參見本文損傷腎病症。這包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使受試者傾向於所討論病症的病理狀況。"轉染"指宿主細胞對表達載體的攝取，無論任何編碼序列事實上是否表達。普通技術人員知道許多轉染方法，例如CaP04和電穿孔。當宿主細胞內出現此載體運轉的任何跡象時，通常承認轉染是成功的。"轉化"指將DNA導入生物體，使得該DNA可複製，或是作為染色體外元件或是作為染色體整合成分(integrant)複製。根據所用宿主細胞，使用適於此類細胞的標準技術進行轉化。採用氯化4丐的4丐處理，如Cohen，屍rac.A^/.爿cac/.Sc/.(X/S々，69:2110(1972)及Mandeletal.Mo/.Ao/"53:154(1970)所述，通常用於具有堅固細胞壁屏障的原核生物或其它細胞。對於沒有此類細胞壁的哺乳動物細胞，常常採用GrahamandvanderEb,Fra/ogy，52:456-457(1978)的磷酸釣沉澱法。哺乳動物細胞宿主系統轉化的一般情況描述於1983年8月16日公告的Axel的美國專利No.4,399,216。對酵母的轉化通常依照VanSolingenetal./5a".，130:946(1977)及Hsiaoetal.屍rac.A^"^a^/.5W,(77S",76:3829(1979)的方法進行。然而，還可使用將DNA導入細胞的其它方法，諸如通過核注射或通過原生質體融合。腎疾病腎小球基質積累的一項關鍵決定因素是ECM合成與溶解之間的平衡(參見<列^口Schnaper，H.W.(1995).Balancebetweenmatrixsynthesisanddegradation:adeterminantofglomerulosclerosis.屍Wa/rTVep/zra/9，104-111)。當該平衡遭到破壞時，腎病症就發生了。例如，腎小球硬化症就是正常的、功能性的腎小球組織被胞外基質(ECM)的積累沉積物置換的過程。長期暴露於對腎小球硬化症的當前治療(例如類固醇、環孢菌素等)常常誘發對數種器官的副作用。另外，所述的當前治療未必能中斷或逆轉疾病的進展，因而仍然需要進一步的治療，諸如腎透析或腎移植。具有VEGF下調的腎疾病通常與腎小球硬化症和自身免疫性沉積物有關。參見例如Shulman，K.,etal.Expressionofvascularpermeabilityfactor(VPF/VEGF)isalteredinmanyglomerulardiseases./爿附<SociVe//2ra/7:661-666(1996a);Noguchi，K.，etal.Activatedmesangialcellsproducevascularpermeabilityfactorinearly-stagemesangialproliferativeglomerulonephritis./爿w5bc9:1815-1825(1998);Shulman，K.,etal.Expressionofvascularpermeabilityfactor(VPF/VEGF)isalteredinmanyglomerulardiseases./-^w-Soc-A^p/wx)/7:661-666issn:1046-6673(1996b);Wada,Y.，etal.(2002).Impairmentofvascularregenerationprecedesprogressiveglomerulosclerosisinanti-Thy1glomerulonephritis.《油e7/w61:432-443);及Y腿，H.T.,etal.(2002).Angiopoietincorrelateswithglomerularcapillarylossinanti-glomerularbasementmembraneglomerulonephritis.61:2078-2089。本申請描述了VEGF-A和VEGFR在腎細胞中在腎發育過程中的功能。對此類功能的幹擾在小鼠中誘發腎小球硬化症。本發明提供了使用VEGFR調控物治療受試者中的病理性腎疾患的方法。短語"病理性腎疾患，，可以與"腎病症"或"腎疾病"或"腎疾病"互換使用，指任何結構性和/或功能性的腎異常。VEGFR的調控物包括但不限於VEGFR配體(例如VEGF(A、B、C、D和/或E))、Flt-l激動劑(例如Flt選擇性VEGF變體、VEGF-B、PIGF)、VEGFR激動性抗體、VEGFR激動性小分子等，其可以是治療腎疾病(例如炎性腎疾病、腎小球硬化症等)的治療劑。在某些實施方案中，所述腎疾病是由感染引起的。在某些實施方案中，所述受試者正在用其它藥劑治療腎疾病，例如類固醇、環孢菌素等。在本發明的某些實施方案中，對受試者施用有效量的Fltl激動劑以治療病理性腎疾患。在本發明的一個實施方案中，KDR激動劑或其它血管發生因子可以與Fltl激動劑聯合施用，例如以低於Fltl可以通過提供血管發生刺激導致最大治療好處的比率。在本發明的某些實施方案中，KDR激動劑或其它血管發生因子可以與Fltl激動劑聯合施用，例如以高於Fltl的比率或等比率。在另一個實施方案中，可以使用優先活化Flt-l而非KDR的VEGF變體以組合安全性和療效的最佳特徵。在某些實施方案中，VEGF是與Fit1激動劑聯合施用的。病理性腎疾患的治療可以由本領域技術人員來評估，例如通過組織學分析和免疫細胞化學，通過尿液分析，例如血液尿素氮(B.U.N)、血清肌酸酐等，通過測量平均動脈血壓等。在本發明的某些實施方案中，所述炎性腎疾病的特徵為以下各項，而且治療通過以下各項來評估炎性細胞的改變、免疫複合物沉積(例如IgM沉積)、或患病腎小球中的補體激活(例如Clq、C3和C4的激活)。在本發明的某些實施方案中，所述腎疾病包含腎小球繫膜細胞的改變，例如VEGF水平的降低，而治療將會具有相反效果。在本發明的某些實施方案中，腎小球腎炎是由以下各項確定的，而且治療通過測量以下各項來評估蛋白尿、腎小球硬化、高血壓、或其組合。還可通過測定以下各項來評估腎細胞(例如腎小球繫膜細胞)的存活、ECM合成的基因表達或基質降解。在此類情況中，所述腎小球腎炎可以通過以下各項來確定腎小球繫膜細月包存活時間縮短(decreasedsurvivalofkidneymesangialcells)、ECM合成的基因合成升高、基質降解的降低、或其組合，而治療將會具有相反效果。本發明的組合物及其生產本發明涉及能夠調控腎中的VEGFR(例如VEGFR-l和VEGFR-2)活性的各種藥劑的用途。術語"藥劑"或"化合物"在用於本文時廣泛地指具有可鑑定的分子結構和物理化學特性的任何物質。能夠調控VEGFR活性的藥劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物(peptidomimetic)、製藥學藥劑(pharmacologicalagent)及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。本發明所涵蓋的VEGFR調控劑可以是VEGFR的激動劑。例如，VEGFR激動劑可以是生長因子配體(例如VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、P1GF等，典型地是VEGF、VEGFB和/或P1GF)或能結合VEGFR胞外結構域並觸發其信號轉導活性的抗體。或者，VEGFR激動劑可以是能結合VEGFIU包質結構域並介導其酪氨酸磷酸化的小分子化合物。在一個實施方案中，本發明的激動劑是對Flt-l"選擇性的"或"特異性的"，即它排他性地或優選地調控Flt-l而非其它受體酪氨酸激酶諸如KDR。在另一個實施方案中，本發明的激動劑是對KDR"選擇性的"或"特異性的"，即它排他性地或優選地調控KDR而非其它受體酪氨酸激酶諸如Flt-1。在一個方面，本發明的VEGFR激動劑包含能夠選擇性結合Flt-l的VEGF變體多肽(下文稱為"Flt-l選擇性VEGF變體"或"Fltl-sel"或"Fltlsel，，)。在一個方面，所述VEGFR激動劑是VEGF-B或P1GF,其能選擇性結合Fltl。Flt-sel及其製備方法是已知的，描述於下文實施例。涉及Flt-sel的別的公開內容可以參見例如PCT公開號WO00/63380及Lietal./所o/.C7zem.275:29823-29828(2000)。在本發明的某些實施方案中，Flt-sel變體包含一處或多處胺基酸突變，並展現出對Flt-l受體的結合親和力等於或大於(^)天然VEGF對Flt-l受體的結合親和力，甚至更優選的是，此類VEGF變體展現出對KDR受體的結合親和力小於(勺天然VEGF所展現的對KDR的結合親和力。當此類VEGF變體對Flt-l受體的結合親和力大致等於(未變化)或大於(升高了)天然VEGF而且該VEGF變體對KDR受體的結合親和力小於天然VEGF或幾乎消除時，為本文目的，該VEGF變體的結合親和力視為對Flt-l受體是"選擇性的"。在本發明的一個實施方案中，本發明的Flt-l選擇性VEGF變體具有小至少10倍的對KDR受體的結合親和力(與天然VEGF相比)，甚至更優選具有小至少100倍的對KDR受體的結合親和力(與天然VEGF相比)。VEGF變體的各自結合親和力可以通過ELISA、RIA、和/或BIAcore測定法來測定，它們是本領域已知的且記載於PCT公開號WO00/63380中。在本發明的有些方面，腎治療的各種方法進一步包括使用能夠調控KDR活性的藥劑。例如，KDR激動劑可以與Flt-l激動劑聯合施用以治療腎疾病。在一個方面，所述KDR激動劑包括VEGF(以及VEGF-C或VEGF-D)或能夠選擇性結合KDR的VEGF變體多肽(下文稱為"KDR選擇性VEGF變體"或"KDR-sel"或"KDRsel")。KDR-selVEGF變體及其製備方法詳細記載於例如PCT公開號WO00/63380及Lietal./所o/.CTzem.275:29823-29828(2000)。在一個實施方案中，所述KDR-sel包含一處或多處胺基酸突變，並展現出對KDR受體的結合親和力等於或大於(2)天然VEGF對KDR受體的結合親和力，甚至更優選的是，此類VEGF變體展現出對Flt-l受體的結合親和力小於(勺天然VEGF所展現的對Flt-l的結合親和力。當此類VEGF變體對KDR受體的結合親和力大致等於(未變化)或大於(升高了)天然VEGF而且該VEGF變體對Flt-l受體的結合親和力小於天然VEGF或幾乎消除時，為本文目的，該VEGF變體的結合親和力視^7對KDR受體是"選擇性的"。在本發明的一個實施方案中，本發明的KDR-sel具有小至少10倍的對Flt-l受體的結合親和力(與天然VEGF相比)，甚至更優選具有小至少100倍的對Flt-l受體的結合親和力(與天然VEGF相比)。VEGF變體的各自結合親和力可以通過ELISA、RIA、和/或BIAcore測定法來測定，它們是本領域已知的。在本發明的一個實施方案中，本發明的KDR-sel還在反映誘導KDR受體磷酸化能力的KIRA測定法中展現出活性。在本發明的一個實施方案中，本發明的KDR選擇性VEGF變體另夕卜/或者誘導內皮細胞增殖(其可以通過已知方法來測定，諸如HUVEC增殖測定法)。在一個方面，本發明的VEGFR調控劑是通過重組方法生產的。這些方法中所使用的分離的DNA在本文中理解為指化學合成的DNA、cDNA、染色體或染色體外DNA,有或無3'和/或5'側翼區。在本發明的某些實施方案中，VEGFR調控劑是通過重組細胞培養物中的合成製備的。關於此類合成，需要編碼VEGF或VEGFR或其變體的核酸。編碼VEGF分子的DNA可以從垂體濾泡細胞獲得，例如牛垂體濾泡細胞，其通過(a)從這些細胞製備cDNA文庫，(b)用編碼VEGF或其片段(長度可達或超過100個鹼通過限制酶分析和核酸測序分析所述克隆以鑑定全長克隆。如果cDNA文庫中不存在全長克隆，那麼可以使用本文中首次公開的核酸序列信息從各克隆回收適宜片段，並在各克隆共同的限制性位點處連接以裝配編碼VEGF的全長克隆。或者，基因組文庫可提供期望的DNA。一旦此DNA自文庫得到鑑定和分離，將它連接入可複製載體供進一步克隆或表達。在重組表達系統的一個例子中，編碼本發明多肽(例如VEGF)的基因等通過用包含編碼例如VEGF的DNA的表達載體轉化而在細胞系統中表達。在本發明的某些實施方案中，優選轉化能夠實現這樣的加工的宿主細胞，即在培養物培養液或宿主細胞的周質中獲得多肽，即獲得分泌的分子。在本發明的一些方面，所述Flt-l激動劑包括能選擇性結合併活化Flt-l的生長因子。已經鑑定了能特異性結合Flt-l但非KDR的數種天然存在VEGF同源物，包括但不限於胎盤生長因子(PIGF)和VEGF-B。PIGF具有與VEGF的血小板衍生生長因子樣結構域共享53%同一性的胺基酸序列。Parketal./所o/.C7ze肌269:25646-54(1994);Maglioneetal.(9"cogewe8:925-31(1993)。與VEGF—樣，不同種類的PIGF源自mRNA的可變剪接，而且蛋白質以多聚體形式存在。參見例如Parketal.,wpra。PIGF-l和PIGF-2二者都以高親和力結合Flt-l,但是都不能與KDR相互作用。參見例如Parketal.,w/ra。VEGF-B以兩種同工型產生(167個和185個殘基)，也表現出特異性結合Fit-1。Pepperetal.iVoc.扁.JcW.5W.95:11709-11714(1998)。與長型VEGF相似，VEGF-B以膜結合蛋白質形式表達，而且可以在添加肝素後以可溶形式釋放。VEGF-B和VEGF在共表達時還能夠形成異二聚體。Olofssonetal.iVoc.iVW/.爿o^.(7&493:2576-2581(1996)。可用於本發明的化合物包括能在RTK的胞內酪氨酸激酶結構域處發揮其調控功能的有機小分子。在某些優選的實施方案中，採用小分子激動劑來刺激酪氨酸磷酸化，由此激活相應的信號傳導途徑。可用於本發明的化合物包括激動性抗體。本發明的抗體典型地是對受體(諸如Flt-l)特異性的。在本發明的某些實施方案中，本發明的抗體包括抗Flt-l抗體。在本發明的一個實施方案中，所述抗Flt-l抗體能選擇性結合Flt-l並調控Flt-l，而不影響KDR功能。在本發明的一個實施方案中，所述抗Flt-l抗體是激動性抗體Ogonistantibody)。用途本發明提供了治療腎疾病的方法，例如通過促進腎小球繫膜細胞存活，通過施用有效量的VEGFR激動劑。本發明的存活促進效果可以在體外或在體內評估，使用本領域已知的方法和本文中描述的方法。例如，可以評估膠原合成的i秀導(參見例^口Amemiya,T.,etal.VascularendothelialgrowthfactoractivatesMAPkinaseandenhancescollagensynthesisinhumanmesangialcells.ii:W"e_y56:2055-2063(1999))和監測一氧化氮生成(參見例如Trachtman,H.，etal.Effectofvascularendothelialgrowthfactoronnitricoxideproductionbyculturedratmesangialcells,歷0c/2em5一—Comww"245:443-446(1998))。在培養過程中使用本領域已知的方法評估細胞增殖，包括但不限於測量DNA合成的速率、錐蟲藍染料排除/血球計計數、或流式細胞術。還可參見侈'J^口Onozaki，A"etal.RapidchangeofglucoseconcentrationpromotesmesangialcellproliferationviaVEGF:inhibitoryeffectsofthiazolidinedione._5/oc/zew5/0//7;^Com附w"317:24-29(2004)。在一個方面，本發明提供了使用VEGFR激動劑來上調或下調在調節腎活性中重要的因子(例如表2)的基因表達的方法。用於檢測靶細胞/組織中mRNA表達或蛋白質表達水平的方法和技術是本領域技術人員知道的。例交測定法來檢測，其中在適於雜交及後續檢測和測量的條件下使用能夠與多核香酸雜交的探針。可用於檢測各種細胞類型中的基因表達的方法包括但不限於Southern雜交(Southern/Mo/.脂.98:503-517(1975))、Northem雜交(參見例如Freemanetal.P賜.扁.爿c^/.5b/."SL480:4094-4098(1983))、限制性內切核酸酶製圖(Sambrooketal.(2001)Afo/ecw/"rC7om'"g，爿丄a6orafto^yAfawwa/'3ni五dColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)、RNA酶寸呆護溯'J定;^(Cwrew/iVotoco/sMo/ecw/arJohnWileyandSons,NewYork,1997)、DNA序列分析、和聚合物鏈式反應擴增(PCR;美國專利No.4,683,202,4，683,195和4,889，818;Gyllensteinetal.屍rac胸/.JcW.5W.園85:7652-7657(1988);Ochmanetal.120:621-623(1988);及Lohetal.5W露e243:217-220(1989))接著Southem雜交(其中使用對基因特異的探針)。可以採用本領域普遍知道的其它擴增方法。可以操縱用於Northern或Southem印跡分析的雜交條件的嚴格性以確保具有與所用特定探針具有期望相關程度的核酸的檢測。細胞或組織樣品中基因的表達也可以使用原位雜交技術來檢測和定量，依照例如CWre"/屍ratoco/sMo/ecw/arJohnWileyandSons,NewYork,1997。蛋白質水平可以使用對蛋白質特異性的抗體通過免疫測定法來檢測。可以使用本領域知道的多種免疫測定法，包括但不限於竟爭性和非竟爭性測定系統，使用諸如以下技術放射免疫測定法、ELISA(酶聯免疫吸附測定法)、"三明治/夾心式，，免疫測定法、免疫放射測定法、凝膠擴散沉澱素反應、免疫擴散測定法、原位免疫測定法(使用膠體金、酶或放射性同位素標記物)、Western印跡分析、沉澱反應、凝集測定法(例如凝膠凝集測定法、hemagglutination觀寸定法)、4卜體結合觀'J定法(complementfixationassay)、免疫螢光測定法、蛋白A測定法、免疫電泳測定法等。在一個實施方案中，抗體結合是通過檢測一抗上的標記物來檢測的。在另一個實施方案中，所述一抗是通過檢測二抗或試劑對一抗的結合來檢測的。在又一個實施方案中，二抗是經標記的。本領域知道許多手段可用於在免疫測定法中檢測結合，而且它們在本發明的範圍內。抗體.，或者本文34所述其它抗體。例示性的抗體包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗體片段、多特異性抗體、異源偶聯抗體、多價抗體、效應器功能抗體等。在本發明的某些實施方案中，所述抗體是激動性抗體。多克隆抗體本發明的抗體可以包括多克隆抗體。製備多克隆抗體的方法是熟練技術人員知道的。例如，針對VEGFR的多克隆抗體在動物中生成，通過一次或多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來醯亞氨基苯曱醯基磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R'N:C二NR(其中R和W是不同的烴基)，將相關抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質偶聯可能是有用的，例如匙孔i戚血藍蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過將例如100嗎或5昭蛋白質或偶聯物(分別用於兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和並將該溶液皮內注射於多個部位，將動物針對VEGFR、免疫原性偶聯物或衍生物進行免疫。l個月後，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量l/5-l/10的肽或偶聯物對動物進行加強免疫。7-14天後，採集動物的血液並測定血清的抗體滴度。對動物進行加強免疫直到滴度達到平臺(plateau)。典型地是，將動物用相同抗原但與不同蛋白質和/或通過不同交聯劑偶聯得到的偶聯物進行加強免疫。偶聯物還可在重組細胞培養中作為蛋白質融合物來製備。同樣，適當使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應答。單克隆抗體單克隆抗體可使用最初由Kohler""/.，A^/w256:495(1975)記載的雜交瘤方法來製備，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No.4，816,567)來製備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠或短尾猴(macaquemonkey)，以引發生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結合用於免疫的蛋白質。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然後，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜叉瘤細胞(Goding,Mowoc/owa/屍n.w一/es屍racf/ce，pp.59-103,AcademicPress,1986)。將如此製備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，所述培養基典型地含有抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃噤呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤的培養基典型地將含有次黃噤呤、氨基喋呤和胸普(HAT培養基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。典型的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩定的高水平生成抗體、並對諸如HAT培養基的培養基敏感的。在這些細胞中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)獲4尋的MOPC-21和MPC-ll小鼠腫瘤及可從美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Maryland,USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也已記載用於生成人單克隆抗體(Kozbor,J/mmwwo/.133:3001(1984);Brodeura/"Mowoc/owa/rec/zm々w&s^pp/Zc^'om1,pp.51-63，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987)。可對雜交瘤細胞正在其中生長的培養液測定針對VEGFR的單克隆抗體的生成。可以通過免疫沉澱或通過體外結合測定法，諸如力t射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。此類技術和測定法是本領域知道的。單克隆抗體的結合親和力可通過例如MunsonandPollard,^加/.107:220(1980)的Scatchard分析來測定。在鑑定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞後，該克隆可通過有限稀釋規程進行亞克隆並通過標準方法進行培養(Goding,Mo"oc/o朋//V7'w一/es戶rac"ce，pp.59-103，AcademicPress,1986)。適於這一目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進行體內培養。可通過常規免疫球蛋白純化規程，諸如例如蛋白A-SepharoseTM、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養液、腹水或血清適當分開。單克隆抗體也可以通過重組DNA方法來製備，諸如美國專利No.4,816，567中所記載的。編碼單克隆抗體的DNA易於使用常規規程分離和測序(例如通過使用能夠特異性結合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核香酸探針)。以雜交瘤細胞作為此類DNA的來源。一旦分離，可將DNA置於表達載體中，然後將該表達載體轉染到原本不生成免疫球蛋白蛋白質的宿主細胞中，諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。抗體的重組生產在下文中有更詳細的描述。在另一個實施方案中，可以從使用McCafferty"A^w348:552-554(1990)所記載的技術構建的噬菌體抗體庫分離抗體或抗體片段。Clackson"a/"A^m352:624-628(1991)和Marks^a/"/Mo/,所o/.222:581-597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。後續出版物記載了通過鏈改組(Marks"a/.，10:779-783(1992))，以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse^a/.，M/c.爿c/A21:2265-2266(1993))，生成高親和力(nM範圍)的人抗體。如此，這些技術是用於分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替代方法。還可以修飾DNA，例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恆定域的編碼序列代替同源鼠序歹'J(美國專利No.4,816,567;Morrison"屍rac.7Vw/.爿c^/.5W.USA81:6851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接。典型地是，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恆定域，或者用它們替代抗體的一個抗原結合位點的可變域，以產生嵌合二價抗體，其包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結合位點。人源化抗體和人抗體本發明的抗體可以包括人源化抗體和人抗體。人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常常稱作"輸入，，殘基，它們典型地取自"輸入"可變域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進行(Jonesda/"淑騰321:522-525(1986);Riechmannda/.,淑訓332:323-327(1988);Verhoeyen""/.,5We"ce239:1534-1536(1988)),通過用嚙齒類CDR序列替代相應的人抗體序列。因此，此類"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利第4，816，567號)，其中本質上少於整個人可變域用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體典型地是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。用於構建人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對於降低抗原性非常重要。依照所謂的"最適"(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人可變域序列的整個文庫進行篩選。然後選擇與嚙齒類最才妻近的人序歹'J作為人源4元體的人才匡架(FR)(Simsefa/.,//mmw"o/.151:2296(1993);Chothia，/M/.編.196:901(1987》。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用於數種不同的人源化抗體(Carteref"/.,屍rac.A^/.爿cadUSA89:4285(1992);Presta《//mww"o/.151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化後保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學特性。為了實現這一目標，依照一種典型的方法，通過^f吏用親本和人源源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得的，且為本領域技術人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基並進行組合，從而獲得期望抗體特徵，諸如對靶抗原的親和力提高。一般而言，CDR殘基直接且最實質地涉及對抗原結合的影響。或者，現在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫後生成人抗體完整全集的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(Jh)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移大量人種系免疫球蛋白基因將導致在抗原攻擊後生成人抗體。參見例如Jakobovitsda/.,A^/.爿cad.5"c/.90:2551(1993);Jakobovitsd"/.,胸騰362:255-258(1993);Brugge腿nn"a/"腸r/"/m扁肌7:33(1993》及DuchosalWa/.她/Mre355:258(1992)。人抗體還可以衍生自噬菌體展示庫(Hoogenboomefa/.,/Mo/.所o/.，227:381(1991);Marks"a/.，《/A/o/.S/o/.，222:581-597(1991);Vaughanda/,7V<^we胸ec/z14:309(1996》。人抗體還可以使用本領域已知的多種技術來生產，包括噬菌體展示庫(HoogenboomandWinter,/Mo/.腸/"227:381(1991);Marksetal.，J!Mo/.5/o/.，222:581(1991))。依照這種技術，將抗體V結構域基因以符合讀碼框的38方式克隆入絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，並在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎進行的選擇也導致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種格式進行；綜述參見例如Johnson，KS.andChiswell,DJ.,Cwqp/"S/n^"5/o/3:561571(l"3)。V基因區段的數種來源可用於噬菌體展示。例如，Clackson"/.，A^ww352:624-628(1991)從衍生自經免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗D惡唑酮抗體。例如通過基本上遵循Marksda/.，《/Mo/.所o/.222:581-597(1991)或Griffithda/.,J12:725-734(1993)所記載的技術，可以自未免疫人供體構建V基因全集和分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利No.5，565，332和5，573,905。Cole等人和Boemer等人的技術也可用於製備人克隆抗體(Coleetal.,Mo"oc/o"a/^w他Wesaw/Ca"cerT7zerapjv1，AlanR.Liss，p.77(1985)及Boerneretal,，J.Immunol.,147(1):86畫95(1991))。還可以由體外激活的B細胞來生成人抗體(參見美國專利No.5,567,610和5，229,275)。抗體片段抗體片段也包括在本發明內。已經開發了用於生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimotoetal.,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992》Brennanetal.，Science229:81(1985))。然而，現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，抗體片段可以從上文討論的噬菌體抗體庫中分離。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段並化學偶聯以形成F(ab')2片段(Carteretal.,Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養物分離F(ab')2片段。用於生成抗體片段的其它技術對於熟練從業人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見W093/16185;美國專利No.5,571,894;及美國專利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整結合位點、缺少恆定區的唯一類型；如此，它們適於在體內使用時降低非特異性結合。可構建sFv融合蛋白以生成效應器蛋白質在sFv的氨基或羧基末端的融合。參見AntibodyEngineering,Borrebaeck編,supra。抗體片段還可以是"線性抗體"，例如如美國專利No.5,641，870中所記載的。此類抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。多特異性抗體(例如雙特異性的)本發明的抗體還包括例如多特異性抗體，其具有對至少兩種不同抗原的特異性。儘管此類分子通常只會結合兩種抗原(即雙特異性抗體，BsAb),但是此表述在用於本文時涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。BsAb的例子包括一個臂針對細胞抗原而另一個臂針對細胞毒性觸發分子的BsAb,諸如抗FcyRI/抗CD15、抗pl85HE^/FcyRI11(CD16)、抗CD3/抗惡性B細胞(1D10)、抗CD3/抗pl85HE112、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結腸癌)、抗CD3/抗黑色素細胞刺激激素類似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經細胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相關抗原(AMOC-31)/抗CD3;—個臂特異性結合細胞上的抗原而另一個臂結合毒素的BsAb，諸如抗皂草素/抗Id-l、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蕙麻毒蛋白A鏈、抗幹擾素-a(IFN-a)/抗雜交瘤獨特型、抗CEA/抗長春花生物鹼類；用於轉變酶活化的前體藥物的BsAb,諸如抗CD30/抗鹼性磷酸酶(其催化磷酸絲裂黴素前體藥物轉變成絲裂黴素醇)；可用作溶纖劑的BsAb，諸如抗血纖維蛋白/抗組織型纖溶酶原激活物(tPA)、抗血纖維蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA);用於將免疫複合物靶向細胞表面受體的BsAb，諸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcyRI、FcyRII或FcyRIII);用於傳染病治療的BsAb，諸如抗CD3/抗單純皰滲病毒(HSV)、抗T細胞受體:CD3複合物/抗流感病毒、抗FcyR/抗HIV;用於體外或體內腫瘤檢測的BsAb，諸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗pl85HE^/抗半抗原；作為疫苗佐劑的BsAb;及作為診斷工具的BsAb，諸如抗家兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生長素抑制素/抗物質P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗卩-半乳糖苷酶。三特異性抗體的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。在本發明的一個實施方案中，雙特異性抗體是抗Flt-l激動劑/抗整聯蛋白a-8。雙特異性抗體可以製備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab，)2雙特異性抗體)。用於構建雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統生產基於兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein"a/.,A^ww305:537-539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈和輕l連的隨才幾分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產物產量低。類似的規程披露於WO93/08829及TrauneckerWa/,，五MS(9J10:3655-3659(1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。優選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定域進行融合。優選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，並共轉染到合適的宿主生物體中。在用於構建的三種多肽鏈比例不等時提供期望最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。由於免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發現這種不對稱結構便於將期望的雙特異性複合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露於wo94/04690。關於生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Sureshda/.，M"/zofife五"z戸o/柳121:210(1986》依照W096/27011中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養物回收的異二聚體的百分比最大化。優選的界面包含抗體恆定域的至少部分CH3結構域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產生與大側鏈相同或相似大小的補償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產物諸如同二聚體提高異二聚體產量的機制。文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來製備雙特異性抗體。Brennan"a/.，5We"ce229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的規程。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩定鄰近的二硫醇並防止分子間二好d建的形成。然後將產生的Fab，片段轉變為硫代硝基苯曱酸酯(TNB)衍生物。然後將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成Fab'-硫醇，並與等摩爾量的另一種Fab'-TNB4汙生物混合，以形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進展便於從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby"a/.，J175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，並在體外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表達VEGF受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤耙物的溶解活性。還記載了從重組細胞培養物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny^a/.,///wmw"o/.148(5):1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，然後重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用於生成抗體同二聚體。Hollinger&a/.，屍rac.A^/.」c^/.5W.L/iSJ90:6444-6448(1993)記載的"雙抗體"技術提供了構建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VO，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和Vt結構域與另一個片段上的互補Vi^和VH結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還才艮道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體構建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gmbera/"/扁,/.152:5368(1994)。設想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可製備三特異性抗體。Tuttdj:/wmw"o/.147:60(1991)。異源偶聯抗體雙特異性抗體包括交聯或"異源偶聯"抗體，它們是本發明的抗體。例如，異源偶聯物中的一種抗體可與親合素偶聯，另一種抗體與生物素偶聯。例如，此類抗體已經建議用於將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(美國專利No.4,676,980)，及用於治療HIV感染(WO91/00360,WO92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交聯方法來製備異源偶聯抗體。合適的交聯劑是本領域眾所周知的，連同許多交聯技術一起披露於美國專利No.4,676,980。多價抗體本發明的抗體包括多價抗體。多價抗體可以比二《介抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原的細胞的內在化(和/或異化)。本發明的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達而生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。優選的二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體將包含Fc區及Fc區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。本文中優選的多價抗體包含(或由其組成)三個至大約八個但優選四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(優選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，Fc是Fc區的一條多肽鏈，X1和X2代表胺基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中的多價抗體優選進一步包含至少兩條(和優選的四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文設想的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進一步包含CL結構域。效應器功能工程改造可能希望在效應器功能方面修飾本發明的抗體，從而增強例如抗體在治療疾病中的效力。例如，可向Fc區中引入半胱氨酸殘基，A/v而4吏得在該區中形成鏈間二碌^建。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內在化能力。參見Caronetal.，J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.，J.Immunol.148:2918-2922(1992)。為了延長抗體的血清半衰期，可如例如美國專利第5,739,277號中所述將補救受體結合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用於本文時，術語"補救受體結合表位"指IgG分子(例如IgGi、IgG2、IgG3或lgG4)的Fc區中負責延長IgG分子體內血清半衰期的表位。其它抗體^f奮飾本文還設想了抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質性質聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。還可將抗體包載於例如通過凝聚技術或通過界面聚合製備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(甲基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統中(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術披露於7em/"gto"SP/za，acew".ca/)SWewces，第16版，Osol,A.編,1980。脂質體和納米顆粒本發明的多肽可以配製成脂質體。例如，本發明的VEGFR調控物也可以配製成免疫脂質體。含有多肽的脂質體可通過本領域已知方法來製備，諸如Epsteinetal.，Proc,Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwangetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030(1980);美國專利4,485，045和4，544，545。循環時間延長的脂質體披露於美國專利5，013,556。一般而言，脂質體的配製和使用是本領域技術人員所知道的。可用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物通過反相蒸發法生成特別有用的脂質體。將脂質體擠過具有設定孔徑的濾器，產生具有期望直徑的脂質體。可如Martinetal.，J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述，將本發明的多肽(例如抗體的Fab，片段)經二硫化物交換反應與脂質體偶聯。納米顆粒或納米膠嚢還可以用於誘捕(entrap)本發明的多肽。在一個實施方案中，生物可降解的polyalky-cyanoacrylate納米顆粒可以與本發明的多肽一起使用。其它用途抗VEGFR抗體具有多種功用。例如，抗VEGFR抗體可用於VEGFR或VEGFR片段的診斷測定法，例如用於檢測其在特定細胞、組織、或血清中的表達，用於疾病檢測(例如本文所述病症)等。在一個實施方案中，VEGFR抗體用於選擇用本文提供的方法治療的患者群。可以使用本領域已知的多種診斷測定技術，諸如竟爭性結合測定法、直接或間接三明治測定法和免疫沉澱觀寸定法，以異相或同相(heterogeneousorhomogeneousphase)進行(Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.(1987)pp.147-158)。診斷測定法中所使用的抗體可以用可檢測模塊(moiety)標記。可檢測模塊應當能夠直接或間接產生可檢測信號。例如，可檢測模塊可以是放射性同位素，諸如311、14C、32P、3、或1251;螢光或化學發光化合物，諸如異硫氰酸螢光素、羅丹明或螢光素；或酶，諸如鹼性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。可以採用本領域知道的用於將抗體與可檢測模塊偶聯的任何方法，包括下列文獻中所記載的那些方法Hunteretal.，Nature144:945(1962);Davidetal.,Biochemistry13:1014(1974);Painetal.，J.Immunol.Meth.40:219(1981);Nygren,J.Histochem.AndCytochem.30:407(1982)。抗VEGFR抗體還可用於/人重組細胞培養物或天然來源親和純化VEGFR。在該過程中，使用本領域眾所周知的方法將針對VEGFR的抗體固定化在合適的支持物上，諸如Sephadex樹脂或濾紙。^接著使固定化抗體^l妄觸含有待純化VEGFR的樣品，然後用合適的溶劑清洗支持物，所述溶劑將會基本上清除樣品中除VEGFR以外的所有物質，而蛋白質結合到固定化抗體上。最後，用另一種合適的溶劑清洗支持物，所述溶劑將會從抗體上釋放VEGFR。載體、宿主細胞和重組方法
技術領域：
：本發明的多肽可以使用易於獲得的技術和材料重組生產。為了重組生產本發明的多肽，例如多肽VEGFR調控劑，分離編碼它的核酸，並插入可複製載體，用於進一步克隆(DNA擴增)或表達。可以使用常規流程容易地分離編碼本發明多肽的DNA並測序。例如，通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核香酸探針，分離並測序編碼多克隆抗體的DNA。可以獲得許多載體。載體構件通常包括但不限於下列一種或多種信號序列、複製起點、一種或多種標記基因、增強子元件、啟動子、和轉錄終止序列。信號序列構件本發明的多肽不僅可以直接重組生產，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽典型地是成熟蛋白質或多肽的N-末端處的信號序列或具有特異性切割位點的其它多肽。所選擇的異源信號序列典型地是受到宿主細胞識別並加工(即受到信號肽酶切割)的。對於不識別和加工天然多肽信號序列的原核宿主細胞，所述信號序列用例如選自鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列的原核信號序列取代。為了酵母分泌，天然信號序列可以用例如酵母轉化酶前導序列、a因子前導序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a因子前導序列)、酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵母葡萄糖澱粉酶前導序列、或WO90/13646中記載的信號取代。在哺乳動物細胞表達中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純皰滲gD信號。將此類前體區(precursorregion)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼本發明多肽的DNA連才妄。複製起點構件表達和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細胞中複製的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴於宿主染色體DNA而複製的序列，包括複製起點或自主複製序列。眾所周知多種細菌、酵母和病毒的此類序列。來自質粒pBR322的複製起點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，2!x質粒起點適合於酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用於哺乳動物細胞中的克隆載體。一般而言，哺乳動物表達載體不需要複製起點構件(SV40起點的使用通常可能只是因為它包含早期啟動子)。選擇基因構件表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標誌。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨節青黴素、新黴素、曱氨蝶呤或四環素；(b)補足營養缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由複合培養基獲得的必需營養物，例如用於芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而倖免於選擇方案。此類顯性選擇的例子使用藥物新黴素、黴酚酸和潮黴素。適於哺乳動物細胞的選擇標誌的另一個例子是那些能夠鑑定有能力攝取抗體核酸的細胞的選擇標誌，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬石克蛋白-I和-II典型地是靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉化子在含有曱氨蝶呤(Mtx),DHFR的一種竟爭性拮抗劑的培養基中進行培養來鑑定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在採用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。或者，可以通過細胞在含有針對選擇標誌的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那黴素、新黴素或G418的培養基中的生長來選擇經編碼本發明多肽、野生型DHFR蛋白質、和另一種選擇標誌諸如氨基糖香3'-磷酸轉移酶(APH)的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包含內源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利No.4,965,199。適用於酵母的選擇基因是存在於酵母質粒Yrp7中的^7基因46(Stinchcomb""/.，Atoww282:39(1979))。《p7基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變抹，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了選擇標誌。Jones,Gew"/a85:12(1977)。酵母宿主細胞基因組中存在&;/損傷隨之提供了用於通過在缺少色氨酸時的生長來檢測轉化的有效環境。類似的，用攜帶丄^2基因的已知質粒補Alew2缺陷型酵母菌林(ATCC20,622或38,626)。此外，衍生自1.6pm環狀質粒pKDl的載體可用於轉化克魯維氏酵母屬酵母。或者，報導了用於在乳酸克魯維氏酵母中大規模生產重組小牛凝乳酶的表達系統。VandenBerg，歷o/rec/mo/ow8:135(1990)。還披露了用於由克魯維氏酵母屬的工業用菌林分泌成熟重組人血清清蛋白的穩定多拷貝表達載體。Fleerda/.,腸/7fec/mo/，9:968-975(1991)。啟動子構件表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與編碼本發明多肽的核酸可操作連接。適用於原核宿主的啟動子包括//za4啟動子、P-內醯胺酶和乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統、和雜合啟動子諸如tac啟動子。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用於細菌系統的啟動子還將包含與編碼本發明多肽的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區，它位於起始轉錄的位點上遊大約25至30個鹼基處。在許多基因的轉錄起點上遊70至80個^5鹹基處找到的另一種序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達載體。適用於酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。作為具有通過生長條件控制轉錄的額外優點的誘導型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區。適用於酵母表達的載體和啟動子進一步記載於EP73，657。酵母增強子也可以有利的與酵母啟動子一起使用。47在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄本發明多肽受到例如從病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B肝病毒和典型的猿猴病毒40(SV40)基因組，從異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，及從熱^f木克啟動子獲得的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細胞系統相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒複製起點。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No.4,419,446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統。美國專利No.4,601,978中記載了該系統的一種改良。關於在小鼠細胞中在來自單純皰滲病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人l3-幹擾素cDNA還可參見Reyesda/.,A^mw297:598-601(1982)。或者，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重複序列作為啟動子。增強子元件構件常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細胞對編碼本發明多肽的DNA的轉錄。現在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。通常使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40複製起點晚期一側的增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒複製起點晚期一側的增強子、和腺病毒增強子。關於激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv,A/a/w297:17-18(1982)。可以將增強子剪接到載體中，位於多肽編碼序列的5'或3'位置，但是通常位於啟動子的5'位點。轉錄終止構件用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。此類序列通常可以從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區域包含在編碼本發明多肽的mRNA的非翻譯部分中轉錄成聚腺普酸化片段的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苦酸化區。參見WO94/11026及其中披露的表達載體。宿主細胞的選擇和轉化適於克隆或表達本文載體中的編碼本發明多肽的DNA的宿主細胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細胞。適於此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Esc/zeWc/^)例如大腸埃希氏菌(五.co//)、腸桿菌屬(五"&ra6acfer)、歐文氏菌屬(五rvWm'a)、克雷伯氏菌屬(i:/efo/e〃a)、變形菌屬CPra&w)、沙門氏菌屬(iSa/wowe〃a)仿H口鼠i^寒沙、門氏菌(5"a/mowe〃a0^/z/mw7'wm)、妙、雷氏菌屬(5"erra"a)例如粘質沙雷氏菌(5^ra"amarcayc(ms)、志賀氏菌屬(57z/ge〃a)、以及芽孢桿菌屬(_60"7//)諸如枯草芽孢桿菌(及wto'fe)和地衣芽孢桿菌(及//c/^m/wmz》(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬CP化wcfowo"os)諸如銅綠假單胞菌CP"en^'"o^)、和鏈黴菌屬(5^e/to^ycas)。典型地是，大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，儘管其它菌^f朱諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31，537)和大腸桿菌W3110(ATCC27，325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是編碼本發明多肽的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒糖酵母(&cc/wrawycas的麵包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可獲得許多其它屬、種和菌抹且可用於本發明，諸如粟酒裂殖糖酵母(5b/z/zwacc/zaramyc^pcw^e);克魯維酵母屬(幻w"mmycay)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K/acto)、脆壁克魯維酵母(/rag/fc)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(義.6w/伊Wcw力(ATCC16,045)、威克克魯維酵母(Kw/cA:era附")(ATCC24,178)、Kwa/"z'(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(《.^wc^/z/A^wm)(ATCC36，906)、耐熱克魯維酵母(《.//^moto/erara)和馬克思克魯維酵母(i:mwx/am^);亞羅酵母屬(Kmnv/a)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(屍/c/z/a/aWw7、)(EP183,070);假絲酵母屬(Ow^/^);瑞氏木黴(7Wc/zo&m7aew'a)(EP244,234);並且並造脈孢菌(iVewrasporacrawra);許旺酵母屬(Sc/waww'omycas)，諸如"i午旺酵母(&/wa"w/om_yc&socc/eWa(毛蟲)、i矣及^f尹蟲i^4ecfesaegy/"(蟲丈子)、白糹丈j尹蟲iL4ecfesa/6c^/c^s(蟲丈子)、黑腹果蟲乾ZVcwo/7/n'/awe/awogoy&r(果蟲乾)和家香Bom6yxmon'等宿主。公眾可獲得多種病毒林用於轉染，例如苜蓿尺^C4wtograp/zaca/z/or"/caNPV的L-1變體和家蠶5owxmon'NPV的Bm-5抹，而且此類病毒可依照本發明用作本文中的病毒，特別是用於轉染草地夜蛾細胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和菸草的植物細胞培養物作為宿主。然而，脊推動物細胞得到最多關注，而且培養(組織培養)中脊推動物細胞的繁殖已經成為常規流程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40轉化的猴腎CV1系(C0S-7，ATCCCRL1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培養中生長而亞克隆的293細胞，Graham"7!Wra/.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞ADHFR(CHO，UrlaubWa/"屍rac.A^/.v4cad5W.77:4216(1980》；小鼠塞託利(sertoli)細胞(TM4:Mather,所o/.23:243-251(1980》；猴腎細胞(CV1，ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2，HB8065);小鼠乳瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細胞(Matherda/"爿"""/sTV-KJcad5W,383:44-68(1982);MRC5細胞；FS4細胞；和人肝瘤系(HepG2)。用上文所述用於生產本發明多肽的表達或克隆載體轉化宿主細胞，並在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規營養培養基中進行培養。培養宿主細胞可以在多種培養基中培養用於生產本發明多肽的宿主細胞。商品化培養基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM,Sigma)、用於腎細胞的正常生長培養基等適於培養宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記載的任何培養基作為宿主細胞的培養基Ham"a/.，MeA,58:44(1979);Barnes"a/"J""/.傷oc/zem,102:255(1980);美國專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122，469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利覆審30，985。任何這些培養基可以根據需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、4丐、鎂和磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾範圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養條件，諸如溫度、pH等，就是先前為表達而選擇用於宿主細胞的，這對於普通技術人員而言是顯而易見的。多肽純化在使用重組技術時，本發明的多肽，例如多肽VEGFR調控劑，可以在細胞內、在周質空間中生成，或者直接分泌到培養基中。可以從培養物的培養液或者從宿主細胞溶胞液回收本發明的多肽。如果是膜結合的，那麼可以用合適的去汙劑溶液(例如Triton-X100)或通過酶促裂解從膜上釋放。本發明環、超聲處理、機械破碎或細胞裂解劑。可能希望從重組細胞蛋白質或多肽純化本發明的多肽。以下規程是合適的純化規程的例子通過離子交換柱上的分級；乙醇沉澱；反相HPLC;矽土上的層析，肝素SEPHAROSETM上的層析，陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱、DEAE等)上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE;硫酸銨沉澱；利用例如SephadexG-75的凝膠過濾；用蛋白ASepharose柱去除雜質諸如IgG;及用金屬螯合柱結合表位標記形式的本發明多肽。可以釆用多種蛋白質純化方法，此類方法是本領域已知的，而且記載於例如Deutscher,MeAoA五w2ymo/ogy，182(1990);Scopes,/Vofe/w屍wnyco^.ow.'屍n'w")/asawd屍rac"ce，Springer-Verlag,NewYork(1982)。所選純化步驟取決於例如所用純化方法的本質和所生成的具體本發明多肽。例如，可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化由細胞製備的抗體組合物，典型的純化技術是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決於抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。蛋白A可用於純4匕基於人yl、y2或Y4重鏈的4元體(Lindmark"/wmwwo/.62:1-13(1983))。蛋白G推薦用於所有小鼠同種型和人y3(Gusse^/.,￡M50/5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質。物理穩定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能夠獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含CH3結構域，則可使用BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)進行純化。根據待回收的抗體，也可使用其它蛋白質純化技術，例如上文所述。還可參見Carter"a/.,Ao/7k^"o/ogy10:163-167(1992)，其記載了用於分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的規程。對本發明多肽的共價<務飾本發明多肽，例如多肽VEGFR調控劑等的共價修飾包括在本發明的範圍內。如果適當，它們可通過化學合成或者通過酶促或化學切割所述多肽來進行。將多肽的其它類型共價修飾引入分子，其通過將多肽的目標胺基酸殘基與能夠與選定側鏈或N-或C-末端殘基反應的有機衍生化試劑反應，或者通過將修飾後的胺基酸或非天然的氨基g交摻入正在增長的多肽鏈，例如Ellmanetal.,￡"2ym.202:301-336(1991);Norenetal.，5We"ce244:182(1989);及美國專利申請20030108885和20030082575。半胱氨醯殘基最常見的是與a-卣代乙酸(鹽/酉旨)(和相應的胺)反應，諸如氯乙酸或氯乙醯胺，以得到羧曱基或羧醯氨曱基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨醯殘基還可以通過與溴代三氟丙酮、a-溴代-(3-(5-imidozoyl)丙酸、氯乙醯基磷酸(鹽/酯)、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡咬基二錄"匕物、曱基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯曱酸(鹽/酯)、2-氯汞基-4-硝基酚、或(4-)氯-7-硝基苯並-2-氧-l,3-二唑反應而衍生化。組氨醯殘基通過與二乙基-焦-碳酸(鹽/酯)在pH5.5-7.0反應而衍生化，因為此試劑相對特異於組氨醯側鏈。對溴苯曱醯甲基溴化物也是有用的；此反應通常在pH6.0的0.1M二曱胂酸鈉中進行。賴氨醯和氨基末端殘基與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應。與這些試劑的衍生化具有逆轉賴氨醯殘基電荷的效果。適於衍生化含a-氨基的殘基的其它試劑包括亞氨基酯，諸如皮考啉亞氨酸曱西旨(methylpicolinimidate)、磷酸吡噴醛酯、吡。多醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、鄰曱基異脲、2,4-戊二酮、和與乙醛酸(glyoxylate)的轉氨酶催化反應。精氨醯殘基通過與一種或數種常規試劑反應來修飾，其中有苯甲醯甲醛(phenylglyoxal)、2,3-丁二酮、1，2-環己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化由於胍官能基的高pKa所以需要在鹼性條件下進行反應。此外，這些試劑可以與賴氨酸以及精氨酸s-氨基反應。酪氨醯殘基可以進行特異性修飾，對在酪氨醯殘基中引入光譜標記物特別感興趣，其通過與芳香族重氮化合物或四硝基曱烷反應。最常見的是，使用N-乙醯基咪唑和四硝基曱烷分別形成鄰乙醯基酪氨醯種類和3-硝基衍生物。用1251或1311碘化酪氨醯殘基以製備帶標記的蛋白質供放射免疫測定法使用。羧基側鏈基團(天冬氨醯或穀氨醯)通過與碳二亞胺(R-N=C=N-R，)反應而進行選擇性修飾，碳二亞胺中的R和R，是不同的烷基，諸如l-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4，4-二曱基戊基)碳二亞胺。此外，通過與銨離子反應將天冬氨醯和穀氨醯殘基轉變成天冬醯胺醯和谷醯胺醯殘基。谷醯胺醯和天冬醯胺醯殘基常常脫醯胺，分別成為相應的穀氨醯和天冬氨醯殘基。這些殘基在中性或鹼性條件下脫醯胺。這些殘基的脫醯胺形式落入本發明的範圍。其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨醯或蘇氨醯殘基羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈a-氨基的曱基化(T.E.Creighton,6Vn/CwreMo/ecw/ar屍ra/eWes，W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983)),N-末端胺的乙醯化，及任何C末端羧基的醯胺化。另一類型的共價修飾包括向本發明的多肽，例如多肽VEGFR調控劑等化學或酶促偶聯糖苷。這些規程的優點在於它們不需要在具有N-或O-連接糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生多肽。取決於所使用的偶聯模式，可以將糖附著於(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基諸如半胱氨酸的巰基，(d)游離羥基諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基，(e)芳香族殘基諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)穀氨醯胺的醯胺基。這些方法可參閱1987年9月11日公布的WO87/05330和AplinandWriston，C及CCW/.iev.Aoc/7ew.pp.259-306(1981)。本發明多肽上存在的任何碳水化合物模塊的消除可通過化學或酶促方法實現。化學的脫糖基化作用需要使多肽暴露於化合物三氟曱磺酸或等效化合物。此處理導致除連接糖(linkingsugar)(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整。化學的脫糖基化作用參閱Hakimuddinetal.，^/0/7/7;Ay.259:52(1987)和Edgeetal.,^wa/.歷oc/ze肌118:131(1981)。例如多肽(例如抗體)上的，石友水化合物才莫塊的酶促切割可通過使用多種內切和外切糖苷酶來實現，參閱Thotakuraetal.，Me仇五"2ymo/.138:350(1987)。本發明多肽的另一類型的共價修飾包括將多肽連接至多種非蛋白質性質聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美國專利No.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791，192或4，179,337所列方式。藥用配製劑為了依照本發明方法的體內用途，使用本領域已知的且適於特定用途的方法和技術將本發明的治療性化合物施用於受試者。在一個優選的實施方案中，所述化合物是在藥物學可接受劑量以藥用組合物的形式施用的。一方面，本發明涵蓋治療性蛋白質藥劑的蛋白質製備物用於施用治療性蛋白質藥劑(例如重組蛋白質製備物)的用途。一方面，本發明涵蓋哺乳動物細胞製備物用於施用治療性蛋白質藥劑(例如多肽VEGFR調控劑等)的用途。本文中所使用的哺乳動物細胞已經用編碼所述蛋白質的異源基因轉染，如上文詳述的。在一個實施方案中，施用所使用的宿主細胞是CHO細胞。已知本發明使用的感興趣分子(諸如VEGFR調控劑，例如VEGF、VEGFR變體、VEGF變體(例如Flt-sel或KDR-sel)、VEGFR抗體、VEGFR小分子調控物等)的的治療用配製劑通過將具有期望純度的多肽或小分子與任選的製藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑混合來製備，以凍幹劑型或水溶液的形式貯存(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第20片反，Osol,A.編，2000)。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬複合物(如Zn-蛋白質複合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如tweentm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。活性成分還可包載於例如通過凝聚技術或通過界面聚合製備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物傳遞系統中(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米月交嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類4支術7>開於例如《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第20版，Osol,A.編，2000。還可參見Johnsonetal.，iVaf.MW.,2:795-799(1996);Yasuda，歷omedT7zw"27:1221-1223(1993);Horaetal.，歷o/7fec/^o/ogv，8:755-758(19卯)；Cleland，"DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems,"inKzcc/weZ)&y/g".'7Tze/Sw6w"z'/^咖v朋f^praac/，PowellandNewman,eds,(PlenumPress:NewYork,1995),pp.439-462;WO97/03692，WO96/40072，WO96/07399;及美國專利No.5，654，010。在某些實施方案中，用於體內施用的配製劑是無菌的。這可容易地通過使用無菌濾膜過濾來實現。可製備持續釋放配製劑。持續釋放配製劑的合適例子包括含有本發明多肽的固體疏水性聚合物半透性基質，該基質以定型產品的形式存在，如薄膜或微膠嚢。持續釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-穀氨酸和Y-乙基-L-穀氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)聚合物、及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙S臾乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠持續釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當膠嚢化多肽在體內長時間維持時，它們可能由於暴露於37。C的潮溼環境而變性或聚集，導致生物學活性損失和免疫原性可能改變。可根據相關機制來設計合理的穩定化策略。例如，如果發現聚集機制是經由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那麼可通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍幹、控制溼度、採用適宜添加劑和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。還可參見例如美國專利No.6,699,501，其記載了具有聚電解質覆蓋物的膠嚢。還涵蓋可以通過基因療法將本發明的治療性蛋白質藥劑(例如VEGFR調控物，例如VEGF、VEGFR變體、VEGF變體(例如Fltl-sel或KDR-sel)、VEGFR抗體等)導入受試者。基因療法指通過給受試者施用核酸進行的療法。在基因療法的應用中，為了實現治療上有效的基因產物的體內合成，例如為了替換缺陷基因，將基因引入細胞。"基因療法"包括通過單次處理實現持久效果的傳統基因療法及涉及一次或重複施用治療上有效的DNA或mRNA的基因治療劑施用二者。反義RNA和DNA可作為治療劑用於阻斷某些基因的體內表達。早已顯示可以將短反義寡核苷酸輸入細胞，在那裡它們起抑制劑的作用，儘管由於細胞膜對它們的攝取受限制因而它們的胞內濃度低(Zamecniketal.,屍rac.iVa"爿cad83:4143-4146(1986))。可以修飾寡核苷酸以增強它們的攝取，例如通過用不帶電荷的基團取代它們帶負電荷的磷酸二酯基團。關於基因療法的方法的全面綜述參閱例如Goldspieletal.,C7/"/ca/屍/7^macy12:488-505(1993);WuandWu,5/oAera/_y3:87-95(1991);Tolstoshev,爿肌Tev.屍/zar腿co/.7bx/co/.32:573-596(1993);Mulligan,5We"ce260:926-932(1993);MorganandAnderson,j朋.Aev.說oc/z綴62:191-217(1993);及May,7X87EC//11:155-215(1993)。重組DNA
技術領域：
普遍知道的、可以使用的方法參閱Ausubel等人編(1993)CwreW屍ratoco/sMo/ecw/arJohnWiley&Sons,NY和Kriegler(1990)GWe7hm^rawewA/"說ofec/z"o/ogy11:205-210(1993))。例如，體內核酸轉移技術包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰滲病毒、慢病毒、逆轉錄病毒或腺伴隨病毒)和基於脂質的系統(可用於脂質介導的基因轉移的脂類有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進行的轉染。在基因療法中使用病毒載體的例子可參閱Clowesetal.，/C7/"./騰"93:644-651(1994);Kiemetal"83:1467-1473(1994);SalmonsandGunzberg,Gewe77zerap_y4:129-141(1993);GrossmanandWilson,Cz#tOp/",Ge"e"csow/Deve/.3:110-114(1993);Boutetal.,//wma"Gewe77^rajc[y5:3-10(1994);Rosenfeldetal.，5Wewce252:431-434(1991);Rosenfeldetal.，CW/68:143-155(1992);Mastrangelietal.，/C//"./"veW.91:225-234(1993);及Walshetal"/Voc.編.Med204:289-300(1993)。在有些情況中希望與靶向靶細胞的藥劑一起提供核酸來源，諸如對細胞表面膜蛋白或靶細胞特異性的抗體、針對靶細胞上受體的配體等。若採用脂質體，則可以使用與胞吞作用有關的細胞表面膜蛋白結合的蛋白質耙向和/或促進攝取，例如對特定細胞類型有向性的衣殼蛋白或其片段、針對在循環中經歷內在化的蛋白質的抗體、靶向胞內定位並延長胞內半衰期的蛋白質。受體介導的胞吞作用的技術參閱例如Wuetal.，《/祝o/.O^m.262:4429-4432(1987)和Wagneretal.，A^/.^cad5W.87:3410-3414(1990)。關於基因標記和基因療法方案的綜述參閱Andersonetal.，5We"ce256:808-813(1992)。例如，用於基因療法的病毒載體或非病毒載體以及遺傳修飾的腎細胞已經用於在腎中投遞外來基因。多種載體通過不同路徑注射入腎細胞，經由動脈內、輸尿管內或薄壁組織/實質內注射(BoschRJetal.,(1993)A^/zra/1:49-54;及YeXetal.，(2001)77zw12:141-148)。薄壁組織/實質內注射的主要限制在於它引起一些腎損傷。在有些情況中，還可以使用將轉基因離體投遞至腎，之後移植入接受者。劑量和施用本發明藥用組合物的劑量和期望藥物濃度可以隨所設想的特定用途而變化。適宜施用劑量或路徑的確定完全在普通醫師的技術範圍內。動物實驗為人體治療的有效劑量的確定提供了可靠指導。可以遵循Mordenti,J.andChappell,W."Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics"7bjdcoA:/we/to朋t/臉wZ>wgZ)eve/opwe械Yacobietal.，Eds"PergamonPress,NewYork1989,pp.42-96中所述原理進行有效劑量的物種間定標。根據疾病的類型和嚴重程度，大約lng/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)VEGFR調控物是施用於患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開施用，或者是通過連續輸注。在採用體內施用VEGFR調控物時，正常劑量的範圍可以是每天約10ng/kg至高達100mg/kg哺乳動物體重或更多，優選約lHg/kg/天至10mg/kg/天，取決於施用路徑。文獻中提供了有關具體劑量和投遞方法的指導；參閱例如美國專利4，657,760;5,206,344;或5,225，212。預期不同配製劑將對不同治療用化合物和不同病症有效，即例如耙向一種器官或組織的方式投遞。對於根據狀況，在數天或更長時間內進行重複施用來說，持續進行治療，直到出現期望的疾病症狀被抑制。然而，其它劑量方案可能也是有用的。典型地是，臨床醫師將會施用本發明的分子，直至劑量達到提供所需生物學效應。可以通過常規技術和測定法來容易地監測本發明療法的進展。本發明的治療性組合物可以通過任何合適的手段施用，包括但不限於腸胃外、皮下、腹膜內、肺內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、表面、和鼻內施用。腸胃外灌注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下的施用。此外，治療性組合物適合通過脈衝灌注(pulseinfiision)施用，特別是使用劑量逐漸下降的調控物。在某些實施方案中，治療性組合物通過注射給予，例如靜脈內或皮下注射，這部分地取決於施用是暫時的或長期的。多種藥劑的使用也包括在本發明內。如本文所述，VEGFR調控物可以與一種或多種治療劑聯合。聯合施用包括使用分開的配製劑或單一藥用配製劑的共施用，和/或任一次序的序貫施用。例如，VEGFR激動劑可以在別的治療劑(例如血管發生劑)之前、之後、交替，或者可以同時給予。在一個實施方案中，有一段時間所有兩種(或多種)活性劑同時發揮其生物學活性。為了預防或治療疾病，VEGFR調控物的合適劑量取決於將要治療的疾病的類型(如上文所定義的)、疾病的嚴重性和進程，施用藥劑是用於預防目還是治療目的、先前的治療、患者臨床史和對藥劑的應答，以及主治醫生的判斷力。適合在一次或在一連串治療中將藥劑施用給患者。在聯合治療方案中，本發明的組合物以治療有效量或治療協同量施用。在用於本文時，治療有效量指導致所針對疾病或疾患得到減輕或抑制的VEGFR調控物及一種或多種其它治療劑的共施用量或者本發明組合物的施用量。治療協同量指協同地或顯著地減輕或消除與特定疾病有關的狀況或症狀所必需的VEGFR調控物及一種或多種其它治療劑(例如本文所述)的量。製品在本發明的另一個實施方案中提供了包含可用於上文所述病症治療和方法的物質的製品。所述製品包括容器、標籤和包裝插頁。合適的容器包括例如藥瓶、藥管、注射器等。所述容器可以用多種材料製成，諸如玻璃或塑料。所述容器裝有有效治療所述腎疾病的組合物，可以具有無菌存取口(例如所述容器可以是帶有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或藥瓶)。582007所述組合物中的至少一種活性藥劑是VEGFR調控物。容器上或與容器有關的標籤指明該組合物用於治療腎疾病。所述製品可進一步包括第二容器，其中裝有藥劑學可接受的緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。本發明的製品可進一步包括從商業和用戶立場出發需要的其它物質，包括別的緩衝液、稀釋劑、濾器、針頭、和注射器。任選的是，包括與將VEGFR調控物用於本文所述病症的用法和劑量有關的一組指令，一般是書面指令。試劑盒所包含的指令一般包括關於病症治療的劑量、給藥方案、和施用路徑的信息。VEGFR調控物的容器可以是單位劑量容器、散裝/大量包裝(例如多劑量包裝)或亞單位劑量容器。實施例應當理解，本文所述實施例和實施方案僅用於例示目的，據此本領域技術人員知道各種變更或變化，而且它們在本申請的精神和範圍及所述權利要求的範圍之內。本文中所引用的所有出版物、專利、和專利申請完整收入本文作為參考用於所有目的。實施例l:Fltl/VEGFR-1介導的腎小球繫膜細胞中VEGF-A的新自分泌調節環的鑑定我們生成了轉基因小鼠，由此消除了表達VEGF受體-1(Fit-1/VEGFR-1)的細胞中的VEGF基因。我們發現，消除腎小球繫膜細胞中的VEGF-A基因在l-3月齡小鼠中導致以蛋白尿、腎小球硬化、高血壓和死亡為特徵的進行性腎衰竭。患病腎小球展現出足細胞中VEGF-A表達降低及炎性細胞數目增力口、免疫複合物沉積和補體激活。幹擾腎小球繫膜細胞中的自分泌環誘導獨特的腎變化，讓人聯想到與腎VEGF水平降低有關的人腎病理學狀況。在體外，VEGF-A-和Flt-l-缺陷的腎小球繫膜細胞展現出細胞存活時間縮短(deseasedcellsurvival)及通向ECM合成和基質降解降低的基因表達轉變。這些發現鑑定出足細胞中VEGF-A與VEGFR-1間調節ECM生成和VEGF表達的新自分泌環。在腎細胞(例如腎小球繫膜細胞)中刺激VEGFR1可以是治療與VEGF-A水平降低有關的進行性腎'j、球硬化症治療策略。Fit-1:fms樣酪氨酸激酶；GBM:腎小球基底膜；VEGF:血管內皮生長因子；VEGFR:VEGF受體；VEGFR-1:VEGF受體；Flt-l:fms樣酪氨酸激酶；VEGFR-2:VEGF受體，KDR(或Flkl);WT:野生型；WT-1:維爾姆斯氏(Wilm)瘤核蛋白-l(Wilm，stumornuclearprotein-l);ECM:胞外基質。才才泮+和方法VEGF-loxP和Flt1-Cre小鼠的生成和ROSA26報導林的培養VEGF-loxP小鼠如先前所述生成(參見例如Gerber,H.P.,etal.VEGFisrequiredforgrowthandsurvivalinneonatalmice.Development126:1149-1159(1999a))。簡言之，在VEGF-loxP小鼠中，VEGF外顯子3的側翼為loxP位點，導致發生loxP重組的細胞中沒有VEGF等位基因。將VEGF-loxP小鼠與Fltl-Cre小鼠培育，在後者中Fltl啟動子的3.1kb片段(參見例如Gerber，H.P.，etal.Differentialtranscriptionalregulationofthetwovascularendothelialgrowthfactorreceptorgenes.Flt-1,butnotFlk-1/KDR，isup-regulatedbyhypoxia.JBiolChem272:23659-23667(1997))驅動Cre重組酶表達。Fltl-Cre小鼠如下生成，如先前所述將包含驅動Cre表達的Fltl啟動子3.1kb片段的構建物顯微注射入小鼠卵子前核。參見Hogan,B.，etal.(eds.).Manipulatingthemouseembryo,(ColdSpringHarborLaboratorPress,1994)。為了監測Cre重組酶表達，將Flt-CRE+;VEGF少洲。刑或Flt-Cre+小鼠與ROSA26報導抹雜交(參見例如Mao，X.，etal.ImprovedreporterstrainformonitoringCrerecombinase-mediatedDNAexcisionsinmice.ProcNatlAcadSciUSA96，5037-5042(1999)),由此P-半乳糖普酶的遍在表達受到轉錄/翻譯終止信號的抑制。此"終止物片段"側翼為loxP位點，發生Cre介導的切除，導致在表達Cre重組酶的細胞中表達P-半乳糖苷酶基因。Fltl-loxP小鼠的生成涵蓋鼠Fltl基因座外顯子l的16kb基因組Flt-lDNA克隆如下分離，即篩選細菌人工染色體文庫，其中使用如下引物切下跨越Fltl翻譯起始密碼子上遊3.0-1.6kb的1.4kbHindIII基因組DNA片段，並平末端克隆入TNLOXl-3尋靶載體的Notl位點。隨後，通過平末端連接將2.0kbHindlII/BstXI基因組DNA片段克隆入TNLOX1-3的唯一Ascl位點，位於PGK-nec/盒下遊和緊挨LoxP3的5，。此2.0kb片段包含如下區域，Fltl基因啟動子、轉錄起始位點和Fltl基因的外顯子l。最後，將2.0kbBstXI/Bsml基因組DNA片段補平末端並克隆入PmeI位點，緊挨第三個loxP位點的3'，以生成60稱為TKNeoFltl-l的尋靶載體。將TKNeoFltl-l測序，並進4亍限制性內切核酸酶消化，以驗證loxP位點和基因組DNA插入物的序列和取向。將尋靶載體通過SalI消化線性化，並取20嗎電穿孔入衍生自129Sv抹的TCL1和R1ES細胞。將ES細胞和小鼠胚胎成纖維細胞在存在鼠白血病抑制因子(LIF)時維持培養，如先前所述(參見例如Gerber,H.P.,etal.VEGFisrequiredforgrowthandsurvivalinneonatalmice.Development126:1149-1159(1999a))。將ES細胞在電穿孔後用G418(400)ig/ml)進行正選擇24小時，並在此選4奪9天後挑取各個克隆，培養並通過Southern印跡分析篩選陽性重組事件。將來自抗性克隆的基因組DNA用EcoRI(用於分析尋靶事件的5，末端)或者用HindIII和KpnI(用於分析靶物基因組區的3，末端)二者消化。用於篩選靶物區的5，和3，末端的探針使用如下引物對通過PCR生成5'探針(639nt):Flt-LOX.1123F(GATGGCCTTGAGTATATCCTG(SEQIDNO:l))和(834nt):Flt-LOX.9733F(GGAAACTATGTGGCTGATCTC(SEQIDNO:3))和Flt-LOX.10567R(GTGAGAGCCAAGATCGAGGAG(SEQIDNO:4))。兩個獨立的ES細胞克隆，稱為W5和弁F7鑑定為同源重組體且由編碼Cre重組酶的表達載體(pMC-Cre)瞬時轉染，如先前所述(參見例如Gerber，H.P.,etal.VEGFisrequiredforgrowthandsurvivalinneonatalmice.Development126:1149-1159(1999a))。挑取經轉染的ES克隆以獲得各個克隆，並根據PGK-nec^盒的刪除和LoxP1與LoxP2之間的重組通過Southern印跡和PCR進行篩選。在Southern印跡分析以外，所選擇的克隆還通過PCR分析，其中使用引物Flt-LOX.236F(TAGACTCTGCGCGCCATAACT(SEQIDNO:5))和Flt-LOX.2629R(CACTAAGAAGGCAGAGGCCAA(SEQIDNO:6》。Flt-LOX.236F與緊挨LoxP3的5，且與LoxP3的頭6個核苷酸交疊的DNA退火，與Flt-LOX.2629R(其與同源的3，臂下遊的DNA同源)組合使用，只會自包含LoxP3的DNA生成PCR產物。將這些引物用於進一步確認第三loxP位點沒有進行重組。將衍生自^15和弁F7且其中PGK-neoR盒被清除的一個ES細胞克隆(分別稱為弁15.C1.H1和弁F7.A.E11)注射入3.5日C57B1/6J胚泡的嚢胚腔(參見例如Hoganetal.,etal.(eds.).Manipulatingthemouseembryo,(ColdSpringHarborLaboratorPress)(1994))。將嵌合雄性小鼠與C57B1/6J雌性小鼠交配，並對子代通過PCR分析檢測LoxPl/2和LoxP3來篩選種系傳遞。用於篩選LoxPl/2存用於篩選LoxP3存在的PCR引物是Flt-LOX.236F和Flt-LOX.2629R。然後將Fltl-LoxP(+A)小鼠交配以生成不攜帶含lox(floxed)的Fltl等位基因的Fltl-LoxP(-/-)、攜帶單一含1((!1(^6(1)的？111等位基因的？111七(《(+/-)、和兩個？111等位基因都包含1(^位點的？1^丄(《(+/+)小鼠。將Fltl-loxP小鼠典型地通過PCR基因分型，其中使用？11丄0乂.1335和？10/)乂.320711寡核香酸。原位雜交VEGF和TGF-(3的原位雜交使用通過PCR擴增生成的反義和有義探針進行，所述PCR擴增中使用對鼠TGF-(3(正向5'-CACCGCGACTCCTGCTGCTTT(SEQIDNO:9);反向5，-GGGGGTTCGGGCACTGCTT(SEQIDNO:10);探針長度609nt)和大鼠VEGF(正向5，-CAACGTCACTATGCAGATCATGCG(SEQIDNO:11);反向5'畫TCACCGCCTTGGCTTGTCA(SEQIDNO:12);探針長度348nt)特異性的引物。自7.5周齡小鼠中切出腎組織，在4%福馬林中固定，並石蠟包埋。將5pm厚的切片脫石蠟，在4pg/ml蛋白酶K中於37。C除蛋白質30分鐘，並進一步加工供原位雜交，如先前所述(參見例如Gerber,H.P.，etal.VEGFcoupleshypertrophiccartilageremodeling,ossificationandangiogenesisduringendochondralboneformation.NatMed5:623畫628(1999b))。將33P誦UTP標記的有義和反義探針與切片於55。C雜交過夜。將未雜交的探針通過在20嗎/mlRNA酶A中於37。C溫育30分鐘除去，接著是高嚴格性清洗，即於55。C在0.1X標準鹽水檸檬酸鹽(SSC)中溫育2小時，並通過分級乙醇脫水。將載玻片浸入NBT2核蹤跡乳劑(nucleartrackemulsion,EastmanKodak),在裝有乾燥劑的密封塑料載玻片盒中於4。C曝光4-6周，顯影並用蘇木精和曙紅(H&E)復染。電子顯微鏡將來自4-5周齡VEGF-loxP、Fltl-Cre小鼠的皮層腎組織片在0.1M甲次砷酸鹽緩沖液中的2。/。曱醛、2.5。/。戊二醛中於4。C固定過夜。清洗後，將樣品在水性1%鋨中後固定2小時，在水中清洗，通過分級乙醇和環氧丙烷脫水，並在EPONATE12(TedPella，Inc.Redding,Ca)中包埋。在ReichertUltracutUCT切片機上切出超薄切片，用乙酸鈾醯(uranylacetate)和檸檬酸鉛復染，並在PhilipsCM12透射電子顯微鏡中於80kV檢查。用GATANRetractableMultiscan數碼相才幾記錄圖^f象。LacZ染色為了LacZ染色完整胚胎9.5日齡胚胎或來自l周齡小鼠的組織，將組織在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中解剖，並用PBS中的4。/。低聚曱醛(PFA)於4。C固定1小時。三次漂洗緩衝液(PBS中5mM乙二醇-雙(氨基乙基醚)-四乙酸(EGTA),0.01%脫氧膽酸鹽，0.02%NP-40,2mMMgCl2)中30分鐘清洗後，將胚胎在染色溶液(漂洗緩衝液，含5mMK3Fe(CN)6,5mMIQFe(CN)6，lmg/ml5-溴-4-氯-3-P引咮基-P-D-半乳糖苦(X-gal))中於37。C溫育過夜。然後將組織在PBS中的4%PFA中於4。C後固定30分鐘，轉移入70%乙醇，並用LeicaMZFLIII解剖顯微鏡、SPOT數位相機和SPOT高級照相軟體照相，或者為石蠟包埋和切片加工。組織學分析和免疫細胞化學為了組織學分析，將組織在10%中性緩衝的福馬林中固定12-16小時，轉移至70%乙醇，並石蠟包埋。使用切片機(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)切出5nm切片，並用蘇木精和曙紅(H&E)染色。將石蠟包埋的切片通過免疫組織化學分析，其中使用針對Cre重組酶(EMDBiosciences.Novagen，SanDiego,California),CD31(MEC13.3,BDBiosciencesPharmingen,SanDiego，California)(用於才全觀'J所有內皮細月包)、VEGFR-2/Flk-l(MALK畫l,Genentech,Inc.SouthSanFrancisco,California)(主要標記非動脈血管內皮)、和a平滑肌肌動蛋白(DakoCytomationCalifornia,Inc.,Carpinteria,CA)(檢測發育中的和活化的腎小球繫膜細胞和平滑肌細胞)製備的抗體。為了檢測胞外基質成分，使用針對膠原IV(ChemiconInternation，Temecula,California)和層粘連蛋白(Chemicon)製備的抗體。染色基本上如先前戶斤述進4亍(參見例長口Gerber，H.R，etal.VEGFisrequiredforgrowthandsurvivalinneonatalmice.Development126:1149-1159(1999a))。為了免疫螢光研究，將切出的腎縱向解剖，在O.C.T.化合物(TissueTek,SakuraFinetekU.S.A.,Inc.,Torrance,CA)中包埋，並以5-10jam切片。為了鑑定表達小鼠VEGF的腎小球細胞類型，將冷凍切片與識別小鼠VEGF(ot-VEGF,GenentechInc.)的人源化單克隆抗體以20iig/ml的濃度一起溫育，其中聯合整聯蛋白a8親和純化的家兔抗血清(1/200，用以檢測腎小球繫膜細胞，UlrichMuller,TheScrippsResearchInstitute,LaJolla，CA々齎贈)、大鼠抗小鼠CD31(BDPharmingen)(用以檢測內皮細胞)或家兔抗小鼠維爾姆斯氏肺瘤核蛋白(WT-1;SantaCruzBiotechnologyInc.,2ng/ml)(用以;險測足細月包)。隨後將切片清洗並與AlexaFluor-594偶聯的山羊抗人IgG及AlexaFluor-488偶聯的山羊抗大鼠或山羊抗家兔IgG二抗以4嗎/ml(Invitrogen)溫育。為了鑑定表達Fltl-Cre轉基因的腎小球細胞類型，將冷凍切片與抗P-半乳糖普酶(RocklandImmunochemicalsInc.;200iug/ml)溫育，接著是AlexaFluor畫594偶聯的山羊抗家兔IgG。WT-l抗體和抗整聯蛋白ot8用AlexaFluor-488標記，即依照製造商使用用於家兔IgG(Invitrogen)的Zenon標記技術。然後將CD31抗體或AlexaFluor-488標記的抗WT-l或抗整聯蛋白a8應用於經清洗的切片。在此項研究中，抗卩-Gal染色反映了發育的任何或所有階段中的Fltl-Cre轉基因表達，因為Cre重組酶介導的切除不可逆地消除在其它情況中普遍表達的ROSA26基因啟動子的抑制，所述ROSA26基因啟動子在這些小鼠中驅動抗(3-Gal表達(Maoet.al.,ImprovedreporterstrainformonitoringCrerecombinase-mediatedDNAexcisionsinmice.ProcNatlAcadSciUSA96:5037-42(1999))。為了檢測免疫球蛋白沉積，一系列異硫氰酸焚光素(FITC)偶聯的對小鼠免疫球蛋白(Ig)每一種類和同種型特異性的大鼠單克隆抗體(BDBiosciencesPharmingen，SanJose，CA)以4pg/ml濃度在經封閉的冷凍切片上溫育1.5小時。Ig沉積使用親和純化的、FITC偶聯的針對特定類和同種型小鼠Ig製備的多克隆抗體(SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,AL)來確認。小鼠補體系統的Clq、C3和C4成分使用大鼠單克隆抗體(HyCultBiotechnologyb.v.，Uden,TheNetherlands)(以5pg/ml)和AlexaFluor-594偶聯的山羊抗大鼠IgG(Invitrogen)(作為第二試劑)來4企測。T細胞和單核細胞-巨噬細胞譜系的細胞分別使用針對CD4(BDBiosciences,Pharmingen,SanJose,California)和F4/80(SerotecInc.,Raleigh,NC)製備的抗體和標準染色方案來鑑定。對於所有免疫細胞化學研究，包括陰性對照，即用純化的Ig(匹配所省略一抗的濃度、物種和同種型)替換一抗。為了檢測小鼠腎中的低氧(hypoxia)，給4周齡Fltl-Cre-和Fltl-C"e+;VEGF(1°xP/1°xP)d、鼠腹膜內注射鹽酸派莫硝唑(pimonidazolehydrochloride,HypoxyprobeTM-l，ChemiconInternational,Temecula，California,60mg/kg)。注射後l小時，將小鼠通過頸脫位法安樂死，切出腎並在10%福馬林中固定過夜，然後脫水並在石蠟中包埋。然後將5pm石蠟包埋切片加工並用HypoxyprobeTM~1Mab1染色，如HypoxyprobeTM-1試劑盒製造商(Chemicon64Intemational)所述，其中排除了鏈黴親合素過氧化物酶溫育，用鏈黴親合素-AlexaFluor594(Invitrogen)替換以容i午焚光觀'J。將濃度與HypoxyprobeTM-Mabl所用濃度匹配的小鼠IgGl用作一抗非特異性染色的同種型對照。作為附加的陰性對照，將分離自未注射HypoxyprobeTM-l的小鼠的腎切片與HypoxyprobeTM~Mabl溫育。實時定量RT-PCR分析使用STAT60法(TEL-TEST"B",Friendswood，TX)自5_7.5周齡小鼠的組織分離RNA，並在RneasyQuick旋轉柱(Qiagen，Valencia,CA)上純化。如先前所述進行實時定量RT-PCR分析(參見例如Gerber，H.P.，etal.Completeinhibitionofrhabdomyosarcomaxenograftgrowthandneovascularizationrequiresblockadeofbothtumorandhostvascularendothelialgrowthfactor.CancerRes60:6253-6258(2000))，其中使用100ng總RNA、AppliedBiosystemsRT-PCR試劑和96孔4各式的Model7700SequenceDetector(AppliedBiosystems)。RT-PCR條件為48。C30分鐘，95°C10分鐘，及40個循環的95。C30秒和60。C90秒。結果使用S叫uenceDetectionSoftware(AppliedBiosystems)分析，並4吏用StatView軟體(SASInstituteInc.,Cary，.NorthCarolina)通過ANOVA進行統計學分析。通過相對於甘油醛-3-脫氫酶(GAPDH)水平的標準化，得到每份樣品的相對RNA當量。血清化學和血液學參數將7.5周齡小鼠通過C02吸入安樂死，並通過心臟穿刺收集血液入乙二胺四乙酸(EDTA)包被的管(Microtainer，BectonDickinsonandCompany,FranklinLakes,NewJersey》使用CellDyn3700(AbbottLaboratories,AbbottPark,Illinois)測量血液學細胞計數。通過收集入血清分離管(Microtainer,BectonDickinsonandCompany,FranklinLakes,NewJersey)得到血清，並4吏用RocheCobasIntegra400儀器(RocheDiagnostics,Indianapolis,Indiana)測量血清參婆丈。尿液分析自4-5周齡小鼠被動收集尿液。使用尿檢試紙條(Chemstrip10withSG,RocheDiagnosticsCorp.,Indianapolis,Indiana,USA)^j"來自每種基因型的小鼠的代表性尿液樣品測試蛋白質、血液、葡萄糖和酮類的存在。蛋白尿如下進一步驗證，加載lul尿液到4-20。/。梯度tris/甘氨酸凝膠(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)上並進行SDS-PAGE，接著銀染或Western印跡(用於小鼠清蛋白)，其中以20(Vg/ml使用親和純化的山羊抗血清(BethylLaboratoriesInc.,Montgomery,TX)。均值動脈血壓的測量將小鼠麻醉，即吸入異氟烷至發揮效果(Aerrane，BaxterCaribeInc.)。通過在頸部做出的腹中線切口，將一導管(聚乙烯管，PE-IO，Becton-Dickinson)置於右頸總動脈中，並用絲線固定到位。使用AcqKnowledge硬體和軟體(BiopacSystems,Inc.,SantaBarbara,CA)悽史字收集15分鐘的血壓測量。統計學分析除了互補DNA微陣列數據分析(見別的部分)以外的所有統計學分析使用StatView軟體(SASInstituteInc.,U.S.A.)通過方差分析(ANOVA)進行，除非另有說明。分離腎小球和腎小球繫膜細胞培養物依照文獻(Takemotoetal.，Anewmethodforlargescaleisolationofkidneyglomerulifrommice.AmJPathol161:799-805(2002))中的方法進行小鼠腎小球分離，並置於用腎小球繫膜細胞培養基(Dulbecco氏改良的Eagle培養基(DMEM)，20%胎牛血清(FCS)，2mM穀氨醯胺，100U/mL青黴素，lOOpg/mL鏈黴素)中的20pg/mL纖連蛋白(SigmaCorp,StLouis,Missouri)包被的盤上。將腎小球在5%C02、95%空氣的加溼氣氛中於37。C溫育6-7天，期間腎小球貼壁而且匯合細胞單層覆蓋盤。使用這種技術，得到能夠傳代至少5次的腎小球繫膜細胞的均質培養物。腎小球繫膜細胞形態學表現為與腎小球繫膜細胞的已出版的光學顯微鏡報告一致(Meneetal.，Phospholipidsinsignaltransductionofmesangialcells.AmJPhysiol256:F375-386(1989))。腎小球繫膜細胞對ot-波形蛋白(DakoCytomation)和^t月/LJ求蛋白(ZymedLaboratories,Inc，SouthSanFrancisco,California)免疫染色陽性，且對CD31(BDBiosciencesPharmingen,SanJose，California)和乙醯基化低密度脂蛋白攝取(BiomedicalTechnologies,Inc,Stoughton,Massachusetts)陰性。另外，將所有腎小球繫膜細胞在D-纈氨酸替換的極限必需培養基(MEM)中培養至少3天，其阻斷成纖維細胞的體外生長(GilbertandMigeon,(1975》D-valineasaselectiveagentfornormalhumanandrodentepithelialcellsinculture.Cell5:11-17)。自VEGFG。郝一和Flt^。洲,小鼠及來自相同克隆但不攜帶基因組loxP位點的WT小鼠建立腎小球繫膜細胞培養物。為了腎小球繫膜細胞存活研究，將腎小球繫膜細胞以105個細胞/孔的密度鋪入6孔盤，並在含20%FCS的腎小球繫膜細胞培養基中溫育過夜。然後吸出培養基，並更換為無血清培養基，其含有表達LacZ(Ad-LacZ)(作為對照)或Cre重組酶(Ad-Cre)(誘導loxP位點之間的重組並分別在VEGFG。迴。x"和Flt嚴洲。刑細胞中導致VEGF或Fltl基因消除(ablation))的腺病毒。腺病毒在存活研究中以感染複數(MOI)IOOO使用。以10嗎/mL向培養基中添加中和性抗小鼠VEGF抗體(a-VEGF，G6-23-IgG)(Genentech，Inc.SouthSanFrancisco,California)或對照同種型匹配抗體(ControlIgG)，以及MOI為1000的Ad-LacZ。添加腺病毒後4天，將剩餘貼壁細胞用PBS清洗，胰蛋白酶處理，並使用Z2CoulterParticleCount和SizeAnalyzer(BeckmanCoulter,Inc.Fullerton,California)i十悽t。自每種基因型(genotype)的小鼠(每種基因型『5-7隻小鼠)分離腎小球繫膜細胞。在每隻提供細胞的小鼠中對每種病毒對2-5個平行孔計數。計算Ad-LacZ和Ad-Cre處理間的細胞計數比，並標準化為對照組所得數值的百分比。互補DNA微陣列自4隻WT小鼠和4隻VEGF一p〃—小鼠製備腎小球繫膜細胞。在第2或3代，將腎小球繫膜細胞在含Ad-LacZ或Ad-Cre(MOI為100)的無血清培養基中培養5天。使用STAT60方法和RneasyQuickSpinColumn分離RNA，如"實時定量RT-PCR"部分所述。用於製備互補RNA(cRNA)和陣列雜交/掃描的方法是由Affymetrix(Affymetrix，Inc.SantaClara，Califomia)提供的。使用cDNA合成試劑盒(SuperScriptChoice,GIBCO/BRL，GrandIsland,NewYork)和T7-(dT)24寡聚物引物(BiosearchTechnologies,Inc，Novato，California,CustomSynthesis)將5pg總RNA轉變成雙鏈cDNA。在親和樹脂(SampleCleanupModuleKit,Affymetrix,Inc.SantaClara,California)上並通過乙醇沉澱來純化雙鏈cDNA。第二鏈合成後，在體外轉錄反應(EnzoBiochem,Inc.Farmingdale，NewYork)中使用T7RNA聚合酶和生物素標記的核苦酸自cDNA樣品生成帶標記物的cRNA。將帶標記物的cRNA在親和樹脂(樣品清潔模塊試劑盒，Affymetrix)上純化。帶標記物的cRNA的量通過測量260nm吸光度並使用260nm的l個OD對應於40pg/mlRNA的換算關係來測定。將20pgcRNA通過在40mMTris-乙酸(pH8.1),lOOmM乙酸鉀，和30mM乙酸鎂中於94。C溫育30分鐘而片段化。然後將樣品與小鼠基因組4302.0陣列在設定為60rpm的電轉烤爐中於45。C雜交19小時。將陣列在AffymetrixFluidics工作站和掃描儀中清洗，染色，並掃描。數據分析使用AffymetrixGeneChip分析軟體進行。基因表達由AffymetrixMAS5.0信號值概述，其是在對數標度上分析的。對每個探針集應用方差分析，其中考慮病毒效果(viruseffect)(Ad-LacZ或Ad-Cre)、基因型效果(genotypeeffect)(WT或VEGFd。洲。^))、和VEGF基因消除效果(effectofVEGFgeneablation)。使用VEGF(1。xP/1。xP^i^&數變化、基因表達差異的證據(來自t檢驗的p值)的強度和基因表達的最小絕對信號作為標準組合來篩選受到基因消除效果顯著影響的探針集。這些標準設定為最小倍數變化為2倍，p值0.05，且絕對信號>50。比較了WT和VEGF缺陷的腎d、球繫膜細胞之間基因表達的變化。為了依照Affymetrix提供的基因本體論分類法(geneontologyclassification)將顯著失調的基因歸類，我們獲取了2004年8月9日版本的基因本體論(GeneOntology,GO)分層法(hierarchies)。將NetAffy資料庫用於將每種Affymetrix探針集與LocusLing因鑑定聯繫起來。自NCBILocusLink站點下載loc2go文件(可以在網際網路上得到，ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/refs叫/LocusLink/)，其用於將基因和GO概念(concept)聯繫起來。使用具有GO註解的整個基因集和受到VEGF基因消除(geneablation)影響的基因集，在GO分層(hierarchy)上計算基因聯繫的分布。對於每個GO概念，生成2x2列聯表(two-by-twocontingencytable)，代表GO概念的存在與否對基因消除效果的存在與否。進行聯繫的卡方分析以確定統計學顯著性。計算優勢比(oddratio),即將GO概念的敲除影響基因的觀測數除以預期數。自IOOO份自舉(bootstrap)樣品得到優勢比的95%置信區間。樣i陣列悽t據還通過使用IngenuityPathwaysAnalysis(IPA;IngenuitySystems,www.ingenuity.com)進行分析。將其表達受到顯著的差異調節(p值〈4e-3)的探針的標識符加載入定位至基因的應用。使用IngenuityPathwaysKnowledgeBase(IPKB)中所包含的信息，將這些探針所定位的基因用於生成分子網絡。為了功能分析，使用IPKB將這些相同基因與生物學功能和/或疾病聯繫起來。使用Fischer精確檢驗來計算p值，其測定歸為該數據集的每種生物學功能和/或疾病<又由於偶然性發生的可能性。結果發育過程中的Fltl-Cre轉基因表達重演內源Fltl表達Fltl基因的3.1kb啟動子片段先前已鑑定和表徵為足以介導暴露於低氧條件的瞬時轉染的內皮細胞或Hep3B細胞中升高的報導基因表達(參見例如Gerber,H.P.,etal.Differentialtranscriptionalregulationofthetwovascular68endothelialgrowthfactorreceptorgenes.Flt-l，butnotFlk-1/KDR，isup-regulatedbyhypoxia.JBiolChem272:23659-23667(1997))。將由相同3.1kbFlt-l啟動子片段組成的構建物插入Cre重組酶基因的上遊，用於生成轉基因小鼠。選擇在成年腎中具有最高LacZ表達的株系用於詳細的轉基因表達分析。9.5天轉基因胚胎的全標本染色揭示了與內源Fltl基因表達一致的血管表達樣式。還可參見例如Fong，G.H.,etal.Regulationofflt-1expressionduringmouseembryogenesissuggestsaroleintheestablishmentofvascularendothelium.DevelopmentalDynamics207:1-10(1996)。在新生小鼠中，LacZ陽性細胞存在於多種組織中，包括心、脾、肺、睪丸、和皮膚。與先前描述Flt-l在腎內皮和腎小球繫膜細胞中表達的報告一致(參見例如Takahashi,T.,etal.Proteintyrosinekinasesexpressedinglomeruliandculturedglomerularcells:Flt-1andVEGFexpressioninrenalmesangialcells.BiochemBiophysResCommun209:218-226(1995))，LacZ陽性細胞見於小管周內皮細胞和腎小球中央區內細胞，其中內皮和腎小球繫膜細胞典型地位於5日齡Fltl-Cre+;ROSA+小鼠。Flt-CRE+;VEGF(l°xP/l°xPW、鼠發生腎小球腎炎並在4-12周齡經歷末期腎衰竭Flt-CRE+;VEGF^洲。刑小鼠以預期的孟德爾比例出生(圖l，小圖a)，然而自4周齡起明顯可見存活降低，超過95。/。的Flt-CRE+;VEGF一^。^小鼠到12周時死亡(圖l，小圖b)。更嚴格的檢驗揭示了缺少脾和腎質量的Flt-CRE+;VEGFG。xP/i—小鼠顯著減少。見圖L小圖￡。還有減少的腎血管化和囊腎損傷的出現，指示雙側腎疾病。見圖r，小圖d。具有LacZ陽性血管結構的其它器官，諸如肺、肝、心、腦和骨骼肌，不展示形態學、重量或血管化的任何顯著變化。尿液分析揭示了4-5周齡Flt-CRE+;VEGF^艦一小鼠中超過500mg/dL的蛋白尿。在Flt-CRE+;VEGFd。洲,而非Flt畫CRE+;VEGF(1。xP/-^Fltl-CreJ、鼠的尿液中，銀染和Western印跡分析揭示了大量的清蛋白，指示缺陷的腎小球濾過屏障功能。見圖l，小圖e。血液化學分析揭示了Flt-CRE+;VEGF—P"。^小鼠中與對照小鼠相比血液尿素氮(B.U.N.)和血清肌苷水平的4倍增長(見圖1，小圖f和g)，而鈉、鉀、氯化物和鉤的血清水平不受影響。與腎衰竭相關病理學一致，Flt-CRE+;VEGFG。^。^轉基因小鼠相對於Flt-CRF對照同窩幼仔血壓顯著升高。見圖l，小圖h。聯合起來看，這些可以指示Flt-CRE+;VEGF(1。xP/1°xPM、鼠逐漸形成與蛋白尿和高血壓有關的腎功能障礙，最終達到末期腎衰竭。腎小球繫膜細胞中的Fltl-Cre轉基因表達和VEGF-A^因消除使用免疫組織學方法，我們在4周齡Fltl-Cre+;VEGF(1°xP/1°xPM、鼠的腎小球中共定位了VEGF-A表達和表達ot-維爾姆斯氏腫瘤核蛋白的足細胞(參見例^口Haas,C.，etal.MHCantigensininterferongamma(IFNgamma)receptordeficientmice:IFNgamma-dependentup-regulationofMHCclassIIinrenaltubules.Kidney畫Int48:1721-7issn:0085-2538(1995)),強調了VEGF-A表達主要局限於足細胞。在4周齡Flt1-Cre+;VEGFG。x池^;ROSA26+d、鼠腎的冷凍切片用抗體染色以檢測腎小球繫膜細胞(抗整聯蛋白a8)、內皮細胞(抗CD31)、和足細胞(抗WT-1)以及用a-VEGF共染色切片以鑑定表達VEGF-A的腎小球細胞類型時，在腎小球足細胞和腎小球繫膜細胞中檢測到VEGF-A。合併的圖像指示VEGF-A表達在WT-1陽性足細胞中可檢測到且是顯著的，但是在腎d、球繫膜細胞中可檢測到較低的VEGF-A表達。VEGF-A的原位雜交證實了VEGF-A在足細胞中高水平表達，如7周齡小鼠Fltl-Cre-腎小球外周豐富銀顆粒所示。見圖2，小圖a。整聯蛋白a8陽性腎小球繫膜細胞(參見例如Hartner，A.,etal.,Alpha8integrininglomerularmesangialcellsandinexperimentalglomerulonephritis.KidneyInt56:1468-80(1999))與VEGF-A的共染色揭示了4周齡小鼠腎小球繫膜細胞中較弱但顯著的表達。見圖2,小圖a。然而，我們在所分析的任何腎切片中未能檢測到VEGF-A/CD31雙重陽性內皮細胞，與先前所述腎小球內皮細胞中缺乏VEGF-A—致。參見例如Simon,M.etal.Expressionofvascularendothelialgrowthfactoranditsreceptorsinhumanrenalontogenesisandinadultkidney.Am-J-Physiol268:F240-50issn:0002-9513(1995);及Noguchi，K.etal.Activatedmesangialcellsproducevascularpermeabilityfactorinearly-stagemesangialproliferativeglomerulonephritis.JAmSocNephrol9:1815-25(1998)。為了確定胚胎和出生後發育過程中表達Cre重組酶的腎小球細胞類型，採用了免疫螢光組織化學，其中使用檢測(3-半乳糖苷酶的抗體(抗(3-Gal)。4周齡Fltl-Cre+;VEGF(!。洲,小鼠腎切片的分析揭示了Fltl-Cre+;VEGF(1。xP/loxP)與Fltl-Cre+;VEGF(1°xP/+)同窩幼仔相比(3-Gal/整聯蛋白a8雙重陽性腎小球繫膜細胞數目和染色的增加。然而，我們沒有檢測到對(3-Gal和足細胞標誌物WT-l或內皮細胞標誌物CD31雙重陽性的細胞。免疫組織化學揭示了在腎小球繫膜細胞而非腎小球內皮細胞中檢測到Fltl-Cre轉基因，而已知表達Flt-l的管內皮細胞是陽性的。見圖2，小圖b。基因組PCR揭示了胚胎發育過程中(E17.5和E18.5)的腎中和來自l周齡Fltl-Cre+;VEGF(1°xP/wtM、鼠腎的腎小球繫膜細胞外植體中(在擴增7-10天後)顯著水平的VEGF消融。這些發現與先前的報告一至丈(參見例^口Takahashi,T.etal.Proteintyrosinekinasesexpressedinglomeruliandculturedglomerularcells:Flt畫landVEGFexpressioninrenalmesangialcells.BiochemBiophysResCommun209:218-26(1995)),"i兌明腎小球內的腎小球繫膜細胞可表達VEGF-A和Fltl二者，且進一步支持Fltl-Cre+;VEGF(1°xP/1。xP)小鼠腎小球中的VEGF基因消除至少在腎小球繫膜細胞中發生的觀念。VEGF-A基因消除可發生於其它腎小球細胞或腎小球隔室以外的細胞，它們在我們的測定法中沒有檢測到，它們可間接有助於觀察到的腎小球變化。RNA的定量基因表達證實了Fltl-Cre+;VEGFG。洲。x。腎中的組織損傷和正在進行中的修復過程引起Cre重組酶的顯著上調(見圖2，小圖c)。相伴的，檢測到Flkl(VEGFR-2)和VEGF-A的下調(圖2，小圖c),與VEGF-A基因消除和腎小球血管分布降低一致(圖3,小圖g和h)，而Flt-l水平保持不變。Fltl-Cre+;VEGF^。洲。刑腎的原位雜交實驗揭示了到7周齡時所有腎小球細胞類型中顯著降低的VEGF-A表達。1周齡腎的VEGF和B-Gal表達的免疫組織化學分析鑑定出3種主要腎小球類另，J:l)在缺乏卩-Gal染色時表達正常水平VEGF的腎小球；2)展示降低的VEGF和點狀卩-Gal表達的腎小球；及3)在存在卩-Gal高染色時檢測不到VEGF水平。腎小球繫膜細胞中的VEGF基因消除可發生於整個出生後發育過程，而且可以與降低的足細胞VEGF表達和/或足細胞細胞死亡有關。在這些實驗中，所述發現鑑定了足細胞的VEGF表達是腎小球繫膜細胞中VEGF自分泌調節環的下遊靶物。發現低氧上調VEGF-A和VEGFR-1二者的表達(參見例如Gerber,H.P.，etal.Differentialtranscriptionalregulationofthetwovascularendothelialgrowthfactorreceptorgenes.Flt-l，butnotFlk畫l/KDR，isup-regulatedbyhypoxia.JBiolChem272:23659-67(1997)),而且增加的腎低氧報告腎小球腎炎。參見例如Nangaku,M.Mechanismsoftubulointerstitialinjuryinthekidney:finalcommonpathwaystoend-stagerenalfailure.InternMed43:9-17(2004)。在使用Hypoxyprobe-Mabl對4周齡Fltl-Cre+;VEGF一胸5^的腎小球分析低氧區時，與野生型同窩幼仔相比，增加的低氧一致性地見於條件性敲除小鼠，指示低氧可以經上調Flt-CRE而加速VEGF基因消除(geneablation)。低氧的區域變化聯合各個腎小球內疾病進展嚴重性的變化可以解釋Fltl-Cre轉基因的頻繁性病灶表達和腎小球內皮細胞(其直接接觸正常含氧量循環)中轉基因表達的缺失。Flt-CRE+;VEGFJ。xp^xp)特基因小鼠腎小球的病理生理學變化分析Flt-Cre+;VEGF一p"。^小鼠中發生的組織病理學變化以了解導致腎衰竭的細胞事件。異常腎小球結構在Flt-Cre+;VEGF(1°xP/1°xPM、鼠中明顯可見，該結果可見於根據光學顯微鏡檢術在第2、3、和7周的檢查。在2周齡小鼠中，在整個腎皮質中存在嚢腫(cyst)(圖3，小圖a),而且可辨認出兩種類型的腎小球結構，它們在外觀上與其年齡匹配的WT同窩幼仔的腎小球截然不同(圖3,小圖b)。在2周齡Flt-Cre+;VEGF^迴。司小鼠中，頻繁觀察到由非細胞核心(acellularcore)周圍的足細胞組成的發育不足腎小球(圖3，小圖a和c)。具有這種外觀的腎小球可喪失功能，這是由於缺失毛細管環，而且它們可喪失此階段後的發育，因為在7周齡小鼠的腎中沒有相似結構的證據(圖3，小圖e和f)。2-3周齡Flt-Cre+;VEGF^w旨M、鼠腎內的許多腎小球顯著擴大並在整個腎小球中展示豐富的嗜曙紅、蛋白質性質沉積及毛細管環的缺失或現存毛細管環的崩潰(圖3，小圖d)。這些腎小球具有與7周齡Flt-Cre+;VEGF一p^"小鼠典型腎小球相似的外觀，其展示腎小球硬化症、纖維化、和病灶性間質性腎炎(圖3，小圖f)。在每個腎內，各個腎小球受到不同程度的影響，具有中度至重度的明顯變化。另外，觀察到襯有移行上皮的大嚢肺(圖3，小圖a)，及充滿蛋白質性質物質的擴張的皮質小管的離散組(比較圖3，小圖e和f)。與WT腎中的觀察結果相比，降低的細胞性(cellularity)在Flt-Cre+;VEGF—p/i。刑小鼠的整個腎小球中明顯可見，其可部分歸於內皮細胞數目減少(比較圖3，小圖g和h)。在許多硬化的腎小球中，Flt-Cre+;VEGF一池^)腎中降低的CD31染色伴有廣泛的層粘連蛋白和病灶性膠原IV沉積，這是根據RT-PCR(圖6，a-d)和免疫組織化學染色的測定的。例如，在7周齡小鼠的腎切片中，層粘連蛋白沉積在小管中檢測到且遍及患病腎的腎小球，而且與野生型同窩幼仔相比，在患病組織中檢測到增加的膠原IV染色。另外，在腎疾病中頻繁上調的轉化生長因子-(3(tgf-P)(圖3，小圖i和j)，即腎小球纖維化和組織損傷的介導物，(綜述見Schnaper,H.W.，etal.TGF-betasignaltransductionandmesangialcellfibrogenesis.AmJPhysiolRenalPhysiol284:F243-52(2003))，以及a-平滑肌肌動蛋白(圖3，小圖k和l),即激活的腎'J、球繫膜細胞的標誌物，在受損的腎中都顯著升高。透射電子顯微鏡檢術對腎切片的超微結構分析鑑定出腎小球繫膜的缺陷和其它與病灶性腎小球硬化症一致的特徵，包括Flt-CRE+;VEGF(1。xP/1。xP,中足細胞足突融合和腎小球繫膜基質的擴增(圖3,小圖m)。儘管內皮在有些腎小球中表現為健康的，但是在具有更多嚴重損傷的腎小球中觀察到開孔(fenestration)的喪失和腎小球基底膜的大量擴增。另外，在發育不足的腎小球中存在腎小球繫膜細胞的喪失和電子緻密沉積物(圖3，小圖m)。腎小球繫膜細胞中的VEGF基因消除與免疫球蛋白M(IgM)沉積物和補體激活有關循環中的淋巴細胞升高表明了Flt-CRE+;VEGF^xP^x。小鼠腎中升高的免疫應答的證據。腎RNA關於單核細胞/巨噬細胞、B細胞和T細胞譜系標誌物(分別為CDllb、F4/80、CD45R和Thy-l)的實時定量RT-PCR分析檢測到Flt-CRE+;VEGFG。洲。x"小鼠腎中的免疫滲入物，對照同窩幼仔中沒有(圖4，小圖a)。免疫組織化學分析揭示了Flt-Cre+;VEGF^洲。,小鼠腎中表達F4/80和CD4(T細胞子集的標誌物)的細胞數目增加。見圖4,小圖b。免疫細胞滲入表現為對腎組織特異性的，因為這些細胞譜系標誌物在Flt-Cre+;VEGF一P",轉基因小鼠的肺或心中沒有升高。在所分析抗體的Ig亞類中，發現IgM在患病腎小球中沉積，但IgG、IgA、IgD或IgE不然，例如通過來自5周齡Fltl-Cre+;VEGFG^旨M、鼠的腎皮質組織的免疫螢光染色，其中使用對IgM特異性的單克隆抗體和對IgG的每種小鼠同種型特異性的單克隆抗體。另外，檢測到補體途徑Clq、C3、和C4蛋白質的顯著增加(例如通過採用對該途徑的Clq、C3和C4成分特異性的單克隆抗體的免疫螢光)，特別是在Flt-Cre+;VEGFG。^,腎的腎小球中，與WT腎相比。在l周齡小鼠中檢測到增加的Clq、C3和C4，表明補體介導的細胞溶胞可以顯著促成Flt-Cre+;VEGF(1°xP/1。xPM、鼠中的腎損傷。沒有檢測到具有單倍體不足足細胞選擇性VEGF刪除的小鼠腎中補體介導的損傷的證據。VEGF基因消除在體外不利地影響腎小球繫膜細胞存活VEGF在腎小球繫膜細胞中經內部自分泌環起作用的證據為了調查VEGF-A和Fltl基因消除對體外培養的腎小球繫膜細胞的影響，我們生成了對於Fltl等位基因具有條件性等位基因(conditionalallele)的小鼠(Fltl-lx/1°xP)。見圖5，小圖a。生成了其中小鼠Fltl基因的外顯子l側翼為loxP位點的尋靶載體，並用於小鼠胚胎千細胞中的同源重組。Flt^。洲。x"小鼠以預期的孟德爾頻率出生，表明兩個loxP位點的存在不幹擾小鼠發育。自腎小球分離物得到來自WTVEGFG。xp^^和F1U一p"。^小鼠的腎小球繫膜細胞的均質製備物，並感染表達LacZ的對照腺病毒(Ad-LacZ)或表達Cre重組酶的腺病毒(Ad-Cre)。Fltl和VEGF-A基因體外消融頻率通過Southern印跡分析(圖5,小圖b)和實時RT-PCR(圖5,小圖c和d)來監觀ll,發現為〉95。/o。Flt-l或VEGF-A基因在腎小球繫膜細胞中的消融引起細胞存活的顯著降低(圖5，小圖e)，表明VEGF以由Fltl介導的細胞自主方式調節腎小球繫膜細胞存活。添加中和性VEGF抗體(a-VEGF,G6-23)對腎小球繫膜細胞存活沒有影響(圖5，小圖f)。因為G6-23自胞內隔室排出，所以重演在VEGF-A-或Fltl-缺陷腎小球繫膜細胞中觀察到的腎小球繫膜細胞存活降低的失敗指示VEGF-A可能經內部自分泌環起作用。Fltl缺陷腎小球繫膜細胞存活的降低大於由VEGF-A缺陷單獨引起的，說明Fltl的其它配體，諸如P1GF或VEGF-B,可能也有幫助。腎小球繫膜細胞中的VEGF基因消除誘導與ECM生成增加一致的基因表達變化我們對在VEGF-A缺陷腎d、球繫膜細胞中差異表達的基因進行了基因本體論(GO)分析。在選擇大於2倍(絕對值)的變化和〈0.05的p值(Student'st檢驗)時，我們發現了11810種所分析的基因中有480種在VEGF-A缺陷腎小球繫膜細胞中與WT腎小球繫膜細胞相比顯著上調。各類上調基因與所有基因對照集之間GO註解的比較揭示了涉及調節趨化性、結構完整性或ECM生成、細胞遷移和體液防禦機制方面的基因的顯著差異是顯著過度呈現的(over-represented)(表2)。我們對在VEGF-A缺陷腎'J、球繫膜細胞中下調的基因進行了相同的分析，鑑定出顯著過度呈現的六類。這六類中三類屬於蛋白水解基因超類(super-class),—類包括涉及細胞通訊的基因(表2)。使用IngenuityPathways系統進行的信號途徑分析進一步揭示了屬於定義為細胞生長和增殖、細月包裝配、組織(organization)和調和(compromise)途徑亞類的基因的表達在VEGF缺陷腎小球繫膜細胞中顯著改變(表2)。我們還鑑定出屬於涉及蛋白質合成、細胞死亡、細胞-細胞信號傳導和免疫應答的分子網絡的類的46。/。-57。/。的基因的表達受到VEGF缺陷的顯著影響(表2)。與腎小球繫膜基質積累或腎小球疾病有關的候選基因在VEGF-A缺陷腎d、球繫膜細胞中也顯著失調。其中，tgf-(31(參見例如Schnaper，H.W.,etal.TGF-betasignaltransductionandmesangialcellfibrogenesis.AmJPhysiolRenalPhysiol284:F243-252(2003))、血管生成素-l(angiopoietin-l)(參見例如Satchell，S.C.，andMathieson,P.W,Angiopoietins:microvascularmodulatorswithpotentialrolesinglomerularpathophysiology.JNephrol16:168-178(2003))、和COX國2(綜述見Nasrallah,R.&Hebert,R丄.Prostacyclinsignalinginthekidney:implicationsforhealthanddisease.AmJPhysiolRenalPhysiol289:F235-46(2005))上調，而血小板衍生生長因子受體-p(Pdgfr-P)和Pdgf-c(綜述見Betsholtz,C.etal.Roleofplatelet-derivedgrowthfactorinmesangiumdevelopmentandvasculopathies:lessonsfromplatelet-derivedgrowthfactorandplatelet-derivedgrowthfactorreceptormutationsinmice.CurrOpinNephrolHypertens13:45-52(2004))下調。體外VEGF-A缺陷腎小球繫膜細胞中基因表達變化突顯了通向ECM腎小球繫膜成分積累的轉變，並鑑定出VEGF-A以細胞自主方式調節這些過程。表2:腎小球繫膜細胞中與VEGF缺陷有關的基因表達變化在VEGF-A缺陷腎小球繫膜細胞中或是上調或是下調的那些基因中的顯著過度呈現的基因本體論類別(geneontologyclass)在VEGF-缺陷腎小球繫膜細胞中上調的基因本體論家族本體論倍數富集P值結構分子活性2.1p=0.006趨化性3.2p=0.006細胞遷移中的調節7.0p=0.001體液防雄卩機制8.9p=0.003在VEGF缺陷腎小球繫膜細胞中下調的基因本體論家族(geneontologyfamily)本體論倍數富集P值絲氨酸型內肽酶活性6.6p=aoooi糜蛋白酶活性6.5胰蛋白酶活性6.3.p=0.002細胞通訊11.3,p=0.008IngenuityPathwaysAnalysis鑑定出其表達在VEGF-A缺陷腎d、球繫膜細胞中顯著差異調節的基因所表現的功能途徑根據FunctionalPathways歸為在VEGF缺陷腎小球繫膜細胞中的表達顯著改變的基因基因途徑/功能上調的基因下調的基因％所代表的網絡中的基因細胞生長和增殖，ADD3，APPBP2，GPX1,HBEGF,100%細月包裝配和糹且織，ARF6，ARID4A，HSPA1B,細胞調和(cellularCEACAM1,LAMP1，compromise)FCGR1A,FRAP1,LGALS1，ING1,MC3R,MFGE8,NCL,NR3C1,PIK3R2，PIK3R1,PLK4,PPP1R15A,PRAP1,PTPRP,RHOD,RPS6，SDC2,TGFBR1,SERPI懇，VAV3SMARCA4，SMARCB1，TMSB10,TNFRSF1A,TRIM28,VEGF蛋白質合成，翻譯UBE2V2ACTN4，FAU，57%後修飾，癌RPL12,RPL22，RPL26,RPL29,RPL18A，翻譯後修飾，細胞死亡，免疫學疾病細胞-細胞信號傳導和相互作用，血液系統發育和功能，免疫應答細胞死亡，基因表達，細胞周期ABCC3，CP,DBT,FCGR1A，H2畫D1，KIF3CGAS7，ITGB4BP，RIN2，STXPB5EFNA4,PARC,SESN1,UBE2D3ING1，PEX6,TCF7L2,RPL23A，RPL37A，RPLP2，RPS2,RPS3，RPS13,RPS26,RPS28ATP5H,MAFF，49%MYH9,NUTF2，P4HB,PP1B,RPS11,SLC7A1,ST3GAL3,TNK1，TPD52L2E1F2S2，49%FCGR3A,GNB2L1，PDGFC,PDGFRB，PFKP,PTPN11,RAPGEF1，SLC9A3R1，SRP14,TBC1D10A,YWHAB,YWHAQCKAP4,FLII,46%GPI，HBEGF,HSPH1,PAXIP1L，PHC2，SSRP1，TADA3L77與腎發育過程中降低的VEGF表達有關的腎病理學鑑定出腎小球繫膜細胞中由Flt-l介導的VEGF-A的細胞自主功能，而且描述了此調節機制在腎發育過程中的作用。提供了對此調節機制的幹擾可引起一些與腎小球硬化症有關的病理生理學特徵的證據。此模型中的進行性腎衰竭代表了發育損傷模型，而非腎小球腎炎的成年發作模型。此模型中的腎病理學和與腎中較低VEGF水平有關的人腎疾病之間有一些相似性(參見例如Schrijvers,B.F.，etal"Theroleofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inrenalpathophysiology.KidneyInt65:2003-17(2004))，例如在腎小球損傷、硬化、和炎性沉積物和補體激活中。參見例如Isselbacher,K丄etal.Harrison'sPrinci.plesofInternalMedicine,(1994)(McGraw-HillInc.,NewYork)。Flt-Cre+;VEGF(1°xP/1°xPM、鼠M示患病腎中IgM沉積物積累及Clq、C3和C4激活的遺傳模型。我們的發現不同於先前在具有足細胞特異性VEGF-A單倍體缺陷的9-12周齡小鼠中的觀察結果，後者在缺乏免疫複合物形成時發生末期腎衰5曷。參見1"列^口Eremina，V.etal.Glomerular-specificalterationsofVEGF-Aexpressionleadtodistinctcongenitalandacquiredrenaldiseases.JClinInvest111:707-16(2003)。大多數調查原代細胞分離物中及健康的和患病的腎中VEGFR1和/或VEGF-A表達的報告鑑定出腎小球繫膜細胞最有可能共表達這兩種基因(參見《列^口Thomas,S.etal.Vascularendothelialgrowthfactorreceptorsinhumanmesangiuminvitroandinglomerulardisease.JAmSocNephrol11:1236-43(2000);Gruden,G.etal.Mechanicalstretchinducesvascularpermeabilityfactorinhumanmesangialcells:mechanismsofsignaltransduction.ProcNatlAcadSciUSA94:12112-6(1997);Harper,S丄etal.Expressionofneuropilin畫lbyhumanglomerularepithelialcellsinvitroandinvivo.ClinSci(Lond)101:439-46(2001);Takahashi，T,etal.Proteintyrosinekinasesexpressedinglomeruliandculturedglomerularcells:Flt-1andVEGFexpressioninrenalmesangialcells.BiochemBiophysResCommun209:218-26(1995);Simon,M.etal.Expressionofvascularendothelialgrowthfactoranditsreceptorsinhumanrenalontogenesisandinadultkidney.Am-J-Physiol268(1995);及Noguchi,K.etal.Activatedmesangialcellsproducevascularpermeabilityfactorinearly-stagemesangialproliferativeglomerulonephritis.JAmSocNephrol9:1815-25(1998))，而非足78細胞(已知其表達最高水平的VEGF-A)(參見例如Berse，B.，etal.Vascularpermeabilityfactor(vascularendothelialgrowthfactor)geneisexpresseddifferentiallyinnormaltissues,macrophages,andtumors.MolecularBiologyoftheCell3:211-20(1992);及Brown,L.F.etal.Expressionofvascularpermeabilityfactor(Vascularendothelialgrowthfactor)byepidermalkeratinocytesduringwoundhealing.JournalofExperimentalMedicine176:1375-9(1992))或內皮細胞(其表達VEGFR-1)(參見例如Thomas，S.etal.Vascularendothelialgrowthfactorreceptorsinhumanmesangiuminvitroandinglomerulardisease.JAmSocNephrol11:1236-43(2000))。在Fltl-Cre+,VEGF^x亂。x。，ROSA26化合物轉基因小鼠中在發育過程中的各個階段沒有檢測到Cre陽性足細胞。非轉化足細胞中VEGFR-l/2表達的缺失與先前的報告(參見i"列^口Gruden，G.etal.Mechanicalstretchinducesvascularpermeabilityfactorinhumanmesangialcells:mechanismsofsignaltransduction.ProcNatlAcadSciUSA94:12112-6(1997);Harper,S.J.etal.Expressionof腦ropilin隱lbyhumanglomerularepithelialcellsinvitroandinvivo.ClinSci(Lond)101:439-46(2001);及Takahashi，T.etal.Proteintyrosinekinasesexpressedinglomeruliandculturedglomerularcells:Flt-1andVEGFexpressioninrenalmesangialcells.BiochemBiophysResCommun209:218-26(1995))和我們自己的觀察結果一致。然而，SV40大T抗原轉化原代小鼠足細胞導致VEGFR-1和VEGF-A在一些轉化的足細胞細胞系中的表達。參見例如Chen，S.etal.Podocyte-derivedvascularendothelialgrowthfactormediatesthestimulationofalpha3(IV)collagenproductionbytransforminggrowthfactor-beta1inmousepodocytes.Diabetes53:2939-49(2004)。提供了腎小球發育中受VEGF控制的兩種調節機制存在的證據l)足細胞和腎小球毛細管內皮細胞之間的旁分泌機制，有人提出其涉及開孔和/或腎小球濾過率的誘導和維持(綜述見Schrijvers,B.F.,etal.Theroleofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inrenalpathophysiology.KidneyInt65:2003-17(2004));和2)腎小球繫膜細胞中調節ECM生成和足細胞功能的自分泌環，包括VEGF表達。其中足細胞中的VEGF生成是腎小球繫膜細胞中VEGF自分泌作用的下遊功能的模型可以說明這兩種細胞類型之任一中具有VEGF缺陷的小鼠中表型的交疊。腎小球繫膜VEGF-A缺陷還導致在足細胞特79異性、VEGF單倍體不足小鼠中沒有發現的一組別的腎變化，包括滲入性炎性細胞的存在(圖4a-b)和腎小球基底膜的擴增(expansion)(圖3m)。這些發現說明在VEGF-A表達的整體降低以外，受影響的細胞類型可代表腎病理學的關鍵決定因素。施用刺激VEGF信號傳導的化合物，特別是VEGFR-1，對於與腎小球硬化有關的腎疾病子集的治療可以是有益的。遺傳和生化滅活VEGF之間對腎小球繫膜細胞的差異效果內部自分泌VEGF-A效應器功能作為調節機制的進一步證據檢測腎d、球繫膜細胞中VEGF的細胞自主功能的前提條件是足細胞衍生的VEGF-A經旁分泌或近分泌信號傳導挽救VEGF-A缺陷腎小球繫膜細胞的明顯失敗。不限於單一模型，足細胞VEGF表達作為腎小球繫膜細胞中VEGF自分泌環的下遊功能的鑑定為足細胞不能挽救VEGF-A缺陷腎小球繫膜細胞提供了合理性解釋。VEGF-A在調節造血幹細胞(HSC)存活中的細胞自主功能先前有才艮告。參見例如Gerber，H.P.etal.VEGFregulateshaematopoieticstemcellsurvivalbyaninternalautocrineloopmechanism.Nature417，954-8(2002)。類似的，對在培養物中培養的腎小球繫膜細胞施用中和VEGF-A的抗體(G6-23)對腎小球繫膜細胞數目沒有影響，這與VEGF-A或Fltl缺陷的細胞相反。不限於一種理論，這些發現說明自分泌信號傳導可以代表更一般性的調節機制，將多種細胞類型中VEGF控制血管形成的旁分泌功能與非血管發生效應器功能分開(綜述見Gerber,H.P.&Ferrara,N.TheroleofVEGFinnormalandneoplastichematopoiesis.JMolMed81:20畫31(2003))。實施例2:VEGF的VEGFR選擇性變體選擇性結合和活化特定VEGF受體(諸如KDR或Flt-l)的VEGF變體的生成和表徵是本領域已知的，記載於例如Lietal./編.O亂275:29823(2000);Gilleetal./B/o/.C/zew.276:3222-3230(2001);PCT公開號WO00/63380和97/08313;及美國專利No.6,057,428，將其公開內容明確收入本文作為參考。具體而言，具有對Flt-1受體的高選擇性的VEGF變體通過組合大大影響KDR結合但不影響Flt-l結合的四處突變而生成。lie43、lie46、Gin79和/或lie83的突變顯示了這些殘基的側鏈對於緊密結合KDR是至關重要的，但是對Flt-l結合是不重要的。Lietal.(2000)sw/ra。Flt-sel變體通過位置Ile43、He46、Gin79和Ile83處的丙氨酸替代而構建，其中使用Kmikeletal.A/eAoA五w2ym0/.204:125-139(1991)記載的定點誘變法。此特定Flt-sel變體也可以用標識I43A/I46A/Q79A/I83A來表示。位置43、46、79和83的這四處丙氨酸替代的相應密碼子分別是GCC/GCC/GCG/GCC。物學活性。Lietal.(2000)ra/ra。例如，使用可溶性放射免疫受體結合測定法(RIA)實施了定量結合測量。在該測定法中，天然VEGF(8-109)對KDR和Flt-1的親和力分別為0.5nM和0.4nM。發現Fltl-sel在此測定法中具有降低至少470倍的KDR結合親和力。在ELISA中對各個點突變體觀察到Flt-l結合略有降低，Flt-sel變體對Flt-l的親和力與天然蛋白質基本上相同。認為本說明書足以使本領域技術人員能實施本發明。應當理解，本文所述實施例和實施方案僅用於例示目的。事實上，除了本文所顯示和記載的那些內容之外，本發明的各種修改對於本領域技術人員而言根據前文描述將是顯而易見的且落入所附權利要求的範圍。本文中所引用的所有出版物、專利、和專利申請完整收入本文作為參考用於所有目的。權利要求1.一種治療腎病症的方法，該方法包括對患有腎疾病的受試者施用有效量的VEGFR調控劑，其中所述VEGFR調控劑包括Flt1激動劑。2.權利要求l的方法3.權利要求l的方法4.權利要求l的方法5.權利要求l的方法6.權利要求l的方法7.權利要求l的方法8.權利要求7的方法細胞改變、免疫複合物沉積或補體激活。9.權利要求8的方法，其中所述免疫複合物沉積是IgM沉積。10.權利要求8的方法，其中所述補體激活包括Clq、C3和C4的激活。11.權利要求l的方法，其中所述腎疾病包括腎小球腎炎(腎衰竭)。12.權利要求ll的方法，其中所述腎小球腎炎是通過蛋白尿、腎小球硬化或高血壓確定的。13.權利要求12的方法，其中所述腎小球腎炎是通過腎腎小球繫膜細胞的存活時間縮短、ECM合成的基因表達升高、或基質降解降低確定的。14.權利要求ll的方法，其中所述腎小球腎炎是病灶性節段性腎小球硬化(FSGS)。15.權利要求l的方法，進一步包括施用有效量的第二藥劑，其中所述第二藥劑是血管發生劑。16.權利要求l的方法，進一步包括施用有效量的第二藥劑，其中所述第二藥劑是第二Fltl激動劑。17.權利要求15的方法，其中所述血管發生劑是VEGF。18.權利要求2的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。19.權利要求2的方法，其中所述抗體是嵌合的、人源化的或人的抗體。20.權利要求l的方法，其中所述受試者患有引起腎疾病的感染。，其中所述Fltl激動劑是Fltl激動性抗體。，其中所述Fltl激動劑是VEGFAFltl選擇劑。，其中所述Fltl激動劑是VEGFA、P1GF或VEGFB。，其中所述Fltl激動劑是Fltl的小分子激動劑。,其中所述腎疾病的特徵為VEGF水平降低。，其中所述腎疾病是炎性腎疾病。，其中所述炎性腎疾病的特徵為患病腎小球中的炎性全文摘要提供了治療受試者中的腎病症的方法，其通過對受試者施用有效量的VEGFR激動劑，例如Flt1激動劑。所述激動劑由在製藥學可接受載體中包含用於活化Flt1的VEGFR激動劑，例如VEGF、針對Flt1的抗體、Flt1配體、Flt1小分子活化劑、或Flt1選擇劑的組合物構成。文檔編號A61K38/18GK101454018SQ200780019536公開日2009年6月10日申請日期2007年3月26日優先權日2006年3月27日發明者拿破崙·費拉拉,梅甘·鮑德溫,漢斯-彼得·格伯申請人:健泰科生物技術公司