埃坡黴素衍生物的製作方法

2023-12-08 03:48:16 2

專利名稱：埃坡黴素衍生物的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗腫瘤劑。更具體地，本發明涉及作為抗腫瘤藥物的埃坡黴素B類似物，即順式和反式-12，13-環丙基埃坡黴素B和順式和反式-12，13-環氧埃坡黴素B。
概述本發明涉及具有有效對抗多種細胞系、包括耐-Taxol腫瘤細胞的細胞毒活性的埃坡黴素B類似物，即順式和反式-12，13-環丙基埃坡黴素B和順式和反式-12，13-環氧埃坡黴素B。本發明的示範性實施方案包括如

圖1中顯示的化合物3、6和8-14以及如圖11中顯示的化合物3、49和50-60。本發明的另一方面涉及該化合物作為細胞毒性劑的用途。
本發明的一個方面涉及式(I)所表示的化合物，或者當有成鹽基團存在時涉及式I化合物的鹽 其中當式I化合物為順式-異構體時，X為氧或CH2，當式I化合物為反式-異構體時，X為CH2；當式I化合物為順式-異構體且X為氧時，則R1為甲基且R為選自下組的基團
其中R2為選自-Me、-Cl、-Br、-SMe和-CF3的基團；當式I化合物為順式異構體且X為CH2時，則R1為甲基且R為選自下組的基團 其中R2為選自-Me、-Cl、-Br、-SMe和-CF3的基團；當式I化合物為反式異構體且X為CH2時，則R1為甲基或氫；其中，當R1為甲基時，R為選自下組的基團 且當R1為氫時，R為選自下組的基團 當使用化合物和鹽等的複數形式時，這也可用於指單個化合物或鹽等。
鹽主要是式I化合物的可藥用鹽。
該鹽由帶有鹼性氮原子的式I化合物例如以酸加成鹽的形式形成，優選與有機或無機酸形成，特別是可藥用鹽。適宜的無機酸例如是氫滷酸如鹽酸、硫酸或磷酸。適宜的有機酸例如是羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、正十二烷酸、乙醇酸、乳酸、2-羥基丁酸、葡萄糖酸、葡糖單羧酸(glucosemonocarboxylic acid)、富馬酸、琥珀酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、葡萄糖二酸、乳糖二酸、胺基酸如穀氨酸、天冬氨酸、N-甲基甘氨酸、乙醯氨基乙酸、N-乙醯基天冬醯胺或N-乙醯基半胱氨酸、丙酮酸、乙醯乙酸、磷酸絲氨酸、2-或3-甘油磷酸、馬來酸、羥基馬來酸、甲基馬來酸、環己烷羧酸、苯甲酸、水楊酸、1-或3-羥基萘基-2-羧酸、3，4，5-三甲氧基苯甲酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙醯氧基苯甲酸、4-氨基水楊酸、鄰苯二甲酸、苯乙酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甲磺酸或乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、1，5-萘-二磺酸、N-環己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基或N-丙基-氨基磺酸或其它有機質子酸如抗壞血酸。
帶有成鹽基團的式I化合物的鹽可按照本身已知的方法製備。因此式I化合物的酸加成鹽可例如通過用酸或適宜的陰離子交換劑處理得到。
通常鹽可轉化為游離化合物，例如通過用適宜的鹼性試劑處理，例如用鹼金屬的碳酸鹽、碳酸氫鹽或氫氧化物、通常用碳酸鉀或氫氧化鈉處理。
為了分離或純化的目的，也可以使用不可藥用鹽，例如苦味酸鹽或高氯酸鹽。只有可藥用鹽或游離化合物(當出現這種情形時，為藥物製劑的形式)可用於治療用途，因此是優選的。
鑑於新化合物的游離形式與其鹽形式、包括那些例如在純化或鑑定新化合物中用作中間體的鹽形式之間的密切關係，以上和以下提到的任何游離化合物在適當和有利時應理解為還是提及相應的鹽。
本發明的另一方面涉及式II所表示的化合物
在式II中，R為選自下述結構的基團 本發明該方面的優選實施方案包括下式表示的化合物 和 本發明的另一方面涉及式III表示的化合物
在式III中，R為選自下述結構的基團 本發明該方面的優選實施方案以下式表示 和 本發明的另一方面涉及以下結構表示的化合物 本發明的另一方面涉及以下結構表示的化合物
本發明的另一方面涉及式IV表示的化合物 其中R為選自以下結構所表示基團的基團 本發明該方面的優選實施方案包括以下結構表示的化合物
本發明的另一方面涉及以式V表示的化合物 其中R為選自-Me、-Cl、-Br、-SMe和-CF3的基團。本發明該方面的優選實施方案包括以下結構表示的化合物
本發明的其它方面涉及以下結構表示的化合物 本發明的另一方面是合成上述任一化合物或其中間體的方法，如說明書中所描述的，特別涉及製備式I、II、III、IV或V化合物的方法，其中，在第一步中將式VI化合物任選在催化劑條件下通過酯化反應而縮合， 其中X和R具有前述所定義的任一含義且PG為羥基官能團的保護基，和在第二步中脫去保護基，由此得到式I的內酯(lacton)。
此處所用的術語「羥基保護基」指對酸不穩定的羥基保護基，該基團是已知的那些。保護基的特性是它們本身易於除去，即沒有不希望的副反應，通常通過溶劑分解、還原、光解除去，或者也可通過酶活性、例如在與生理條件相似的條件下除去，並且它們不存在於終產物中。專業人員知道或易於確定哪些保護基團適合於上下文中所提及的反應。
通過保護基對羥基進行保護、保護基本身以及它們的裂解反應例如在標準參考著作中述及，如J.F.W.McOmie，「有機化學中的保護基」，Plenum出版社，倫敦和紐約1973；T.W.Greene，「有機合成中的保護基」，Wiley，紐約1981；「肽」；第3卷(編者E.Gross和J.Meienhofer)，Academic出版社，倫敦和紐約1981；「有機化學方法」，Houben Weyl，第4版，第15卷/I，Georg Thieme Verlag，斯圖加特1974；H.-D.Jakubke和H.Jescheit，「胺基酸、肽和蛋白質」，Verlag Chemie，Weinheim，DeerfieldBeach，巴塞爾1982以及Jochen Lehmann，「碳水化合物的化學單糖及衍生物」，Georg Thieme Verlag，斯圖加特1974。
優選的保護基為對酸不穩定的甲矽烷基醚，如叔丁基二甲基甲矽烷基(TBS)醚、三乙基甲矽烷基(TES)醚、三異丙基甲矽烷基(TIPS)醚、二乙基異丙基甲矽烷基(DEIPS)醚、異丙基二甲基甲矽烷基(IPDMS)醚或thexyldimethylsilyl(TDS)醚。
附圖簡述圖1顯示了所選擇的天然和設計的埃坡黴素的結構。灰色部分指本研究中合成的化合物。
圖2所顯示的圖表公開了於37℃時在微管結合位點(50nM)競爭性配體對螢光紫杉烷(taxoid)Flutax-2(50nM)的替換。
圖3顯示了通過Stille偶合來合成2-(甲硫基)噻唑埃坡黴素B(3)。
圖4顯示了反式-環丙基埃坡黴素B類似物(1-6、8、10和12-14)的反向合成分析。
圖5顯示了醛32的構建。
圖6顯示了乙烯基碘化合物20c-g的構建。
圖7顯示了埃坡黴素類似物8-14的合成。
圖8所顯示的表公開了埃坡黴素1至14以及紫杉醇對用紫杉醇或埃坡黴素A所選擇的1A9人卵巢癌細胞和β-微管蛋白突變細胞系的細胞毒性。
圖9所顯示的表公開了埃坡黴素1-8、10-14以及紫杉醇對人表皮樣癌細胞系的微管蛋白聚合潛能和細胞毒性。
圖10所顯示的表公開了埃坡黴素類似物與微管的紫杉烷結合位點的結合親和性。
圖11顯示了各種所設計的埃坡黴素A和B類似物的一系列結構以及埃坡黴素A和B的結構。
圖12的流程圖顯示了由乙烯基碘化合物15合成多種類似物的最後步驟。
圖13的流程圖顯示了合成圖12的流程圖中所用的錫烷所需的步驟。
圖14的流程圖顯示了用於構建埃坡黴素B的環丙基類似物的骨架的合成路線。
圖15的流程圖顯示了在環丙基類似物48和50的合成中所用的最終步驟。
圖16的表顯示埃坡黴素48、50和51-60對用紫杉醇或埃坡黴素A所選擇的人癌細胞和β-微管蛋白突變細胞系的細胞毒性。
圖17的表顯示所選擇的埃坡黴素對人表皮樣細胞系KB-3和KB-8511的細胞毒性(IC50，nM)。
本發明的另一方面涉及用於治療哺乳動物中增殖性疾病的、含有治療劑量的如上所表示的式I、II、III、IV或式V範圍內的化合物的藥物組合物。在特別優選的模型中，哺乳動物為人。
發明詳述本發明公開了通過化學合成和生物學評價而構建一系列具有不同側鏈的環氧和環丙基埃坡黴素的有機合成構建和生物學評價。目前所關注的埃坡黴素庫的設計是基於現有的構效關係(SAR)的知識，特別是基於下述事實(1)埃坡黴素B(2)的效力比埃坡黴素A(1)強得多；(2)在噻唑部分用甲硫基替換甲基可增強效力(Nicolaou，K.C.等人，Angew.Chem.1998，110，2120-2153；Angew.Chem.Int.Ed.1998，37，2014-2045；Nicolaou，K.C.等人，Tetrahedron 2002，58，6413-6432；Nicolaou，K.C.等人，Angew.Chem.1998，110，89-92；Angew.Chem.Int.Ed.1998，37，84-87)；(3)用於替換噻唑環的雜環如吡啶(Nicolaou，K.C.等人，Chem.Biol.2000，7，593-599.)為生物學活性需要維持氮的正確位置；以及(4)環丙環可替換環氧部分而不損失活性(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323；Nicolaou，K.C.等人，ChemBioChem.2001，2，69-75；Johnson，J.A.等人，Org.Lett.2000，2，1537-1540.)。由這些見解可認為，埃坡黴素3、6和8-14(圖1)以及48、50和51-60(圖11)是化學合成和生物學評價的主要候選者。對這些化合物進行生物學評價可確定甲硫基噻唑側鏈是改善埃坡黴素就細胞毒性和微管蛋白聚合性質而言的生物學活性的所希望的藥效基團。活性增強可通過三種不同的生物學分析法來證明，在所述的分析法中在細胞和體外均確定了測試化合物的效應。
埃坡黴素類似物的設計與化學合成作為最初的研究方向，我們決定證明與埃坡黴素B系列上的甲基取代基相比，通過甲硫基所賦予的埃坡黴素骨架的效力增強。如圖3所示，通過將錫烷16(Nicolaou，K.C.等人，Bioorg.Med.Chem.1999，7，665-697)與乙烯基碘化合物15(Nicolaou，K.C.等人，Chem.Eur.J.2000，6，2783-2800)Stille偶合(80％產率)，由此合成甲硫基噻唑埃坡黴素B(3)。所觀察到的類似物3對一系列腫瘤細胞系的高效力(參見表1)鼓舞我們繼續設計和合成整個甲硫基類似物家族以及多種新的含吡啶的埃坡黴素。
所設計的埃坡黴素類似物(51-60)可按照收斂(convergent)方法由乙烯基碘化合物15(Nicolaou，K.C.等人，Chem.Eur.J.2000，6，2783-2800)以及相應的芳族錫烷合成，如圖12所示(試劑和保護基的縮寫參見附圖詳述)。因此，當存在PdCl2(MeCN)2、CuI和AsPh3時、在DMF中於環境溫度下進行15與適宜錫烷(64a-d、66a-d、67和68)的Stille偶合，以指定的產率直接生成所預期的埃坡黴素(51-60)。所需要的芳族錫烷按照圖13所概述製備。因此，對於噻唑化合物64a-64d，將商業購得的2，4-二溴噻唑(64)與相應的硫醇在NaH存在下反應，通過替換更具反應活性的2-溴取代基而首先生成中間體硫化物(63a-63d)。隨後使這些物質與Me3SnSnMe3在Pd(PPh3)4存在下、在甲苯中於100℃偶合，通過第二個溴殘基的發應得到所預期的產物64a-64d。吡啶基錫烷66a-66d由易於得到的2-溴吡啶65a、65b(Virgilio，N.J.Org.Chem.1973，38，2660-2664)、65c(Nicolaou，K.C.等人，Tetrahedron 2002，58，6413-6432)以及65d(Testaferri，L.等人，Tetrahedron1985，41，1373-1384)通過金屬-滷素交換(nBuLi)、之後用nBu3SnCl將所得的2-鋰衍生物淬滅(Gilman，H.等人，J.Org.Chem.1951，16，1788-1791)來相似地合成。錫烷67(Dinnell，K.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，1237-1240)和68(Jessie，S.；Kjell，U.Tetrahedron 1994，50，275-284)可按照相應的文獻方法由各自的滷化物製備。
圖4以反向合成的模式概括了構建環丙基埃坡黴素B類似物所遵循的途徑。基於我們以前所報導的方法，所採用的次序需要Charette環丙烷化反應(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323；Charette，A.B.等人，J.Am.Chem.Soc.1998，120，11943-11952)以在合成中較早地建立12，13-環丙基位點、根據我們最優化方法的羥醛縮合反應(Nicolaou，K.C.等人，Chem.Eur.J.2000，6，2783-2800)以構建具有兩個立體中心的C6-C7鍵、Nozaki-Hiyama-Kishi偶合(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323；Takai，K.等人，Tetrahedron Lett.1983，24，5281-5284；Jin，H.等人，J.Am.Chem.Soc.1986，108，5644-5646)以引入側鏈、以及Yamaguchi大環內酯化反應(Inanaga，J.等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.1979，52，1989-1993；Mulzer，J.等人，Synthesis 1992，215-228；Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.1997，119，7974-7991)以完成大環結構。因此，關鍵的結構單元18或69以及19和20被定義為這些構建的起點。相應的埃坡黴素A類似物的構建預計按照與我們以前所報導的方法相同的方法進行(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323)。
圖5和圖14概括了由易於獲得的香葉醇(18或69)合成所需的醛32或82。由此，18的Charette環丙烷化(Et2Zn-CH2I2，在手性配體21存在下)(Charette，A.B.等人，J.Am.Chem.Soc.1998，120，11943-11952)以87％產率和93％ee提供了環丙基醇22或以80％產率和95％ee提供了環丙基醇71。將22或71中的羥基進行保護(NaH-BnBr)(試劑和保護基的縮寫參見流程圖中的文字說明)、之後將餘下的雙鍵臭氧分解(O3；NaBH4)，分別以總產率89％或83％得到化合物23或72。醇23或72向相應的碘化物的轉化(24的產率為95％或73的產率為91％)通過甲磺醯化並隨後與NaI反應來完成。(-)-丙醛SAMP腙(25)(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.1997，119，7974-7991；Enders，D.Aymmetric Synth.1984，3，275-339；Enders，D.；Klatt，M.Synthesis 1996，1403-1418)與碘化物24或73的烷基化在LDA影響下生成化合物26或75(產率分別為84％、87％)，化合物26或75裂解(MeI；HClaq)生成產率為86％的醛17或產率為91％的76。通過對衍生於醛17的MTPA酯進行1H NMR分析，測得所得的C-8差向異構體的比例為約97∶3(Tsuda，M.；Endo，T.；Kobayashi，J.J.Org.Chem.2000，65，1349-1352以及其中引用的參考文獻)。在以前定義的條件[LDA(2.4當量)，酮19(2.3當量)，-78至-40℃，30分鐘；然後醛17或76，-78℃，5分鐘](Nicolaou，K.C.等人，Chem.Eur.J.2000，6，2783-2800)下將酮19和醛17或76羥醛縮合得到羥醛產物27或78，該產物以非對映體純的形式分離(81％產率)。隨後將27或28中的仲醇以TBS醚(TBSOTf，2，6-二甲基吡啶)形式進行保護，之後將TBS伯基(HF·py)選擇性裂解，生成總產率為88％的醇28或總產率為86％的醇79。將該化合物逐步氧化為羧酸(DMP；然後NaClO2)，然後將該羧酸保護為TMSE酯29或80(TMSE-OH，EDC，4-DMAP)，總產率為75％或73％。將29或80中的二苄醚氫解，之後用DMP氧化，生成醛30或82(84％產率，87％產率)，該醛經由乙烯醚31(約1∶1 E∶Z比率)被順利地同系化(NaHMDS-MeOCH2PPh3Cl；然後PPTS)為所欲得的較高級的醛32或83，總產率為82％。
側鏈(流程圖4中的20a-g和流程圖15中的64a-d、66a-d、84a和84b)或者如以前所報導合成(20a、20b和84a)(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323)、(84b)(Nicolaou，K.C.等人，J.Tetrahedron 2002，58，6413-6432)，或者如流程圖4所示由相應的芳基滷化物(33(Ellingboe，J.W.等人，J.Med.Chem.1994，37，542-550)、37、38、39)合成。將4-羥甲基-2-吡啶基溴化合物33保護為三苯甲基醚(TrCl，4-DMAP，100％)，之後將所得的芳基溴化合物34與丙炔[Pd(PPh3)2Cl2-CuI，96％]Sonogashira偶合(Arcadi，A.等人，Tetrahedron 1994，50，437-452)，生成炔屬化合物35，該化合物作為乙烯基碘化合物20c的前體(n-BuLi；然後(n-Bu3Sn)2、CuCN、MeOH；然後I2，80％產率)。將35中的三苯甲基改變為MOM基團[HCl(g)、CHCl3；然後NaH、MOM-Cl，總產率34％](Betzer，J.-F.等人，TetrahedronLett.1997，38，2279-2282)，通過將所得中間體36暴露於上述對35轉化為20c所述同樣的條件下，可生成乙烯基碘化合物20d(67％產率)。相似的化學方法可分別用於由37-39構建乙烯基碘化合物20e-20g，如流程圖4所示。
兩個關鍵性的鍵形成和兩個伴隨的脫保護將關鍵的結構單元32(在本研究中為埃坡黴素B類似物而製備)、40(如以上對埃坡黴素A類似物所述製備)(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323)和20a-g(側鏈)從目標埃坡黴素類似物中分離。第一步操作是醛32和40與乙烯基碘化合物20a-g的Nozaki-Hiyama-Kishi偶合(Takai，K.等人，Tetrahedron Lett.1983，24，5281-5284；Jin，H.等人，J.Am.Chem.Soc.1986，108，5644-5646)。該碳-碳鍵的形成反應在這種情況下極好地進行(CrCl2，NiCl2，4-t-BuPy，DMSO)，在TBAF誘導形成羧酸後，得到流程圖5和15中指定產率的偶合產物(41a、41b、41d-g、42c、42e、85和88)(如C-15非對映異構體的約1∶1混合物)。然後使羥酸非對映異構體的每種混合物(41a、41b、41d-g、42c、42e、85和88)進行Yamaguchi大環內酯化反應(2，4，6-三氯苯甲醯氯，4-DMAP)(Inanaga，J.等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.1979，52，1989-1993；Mulzer，J.等人，Synthesis 1992，215-228)，得到指定(非最佳的)產率的所希望的15(S)內酯及其15(R)差向異構體。在此時分離兩種差向異構體可通過其在矽膠上顯著不同的Rf值而易於達到。用20％TFA/CH2Cl2(43a、43b、43e-g、44c、44e、86和89)或用TMSBr-4MS/CH2Cl2、之後用20％TFA/CH2Cl2(43d)使被保護的衍生物醚最終脫保護，生成指定(非最佳的)產率的埃坡黴素6、8-14(流程圖5和15)。對色譜純和光譜純的化合物進行如下所述的生物學評價。
化學生物學通過細胞毒性、體外微管蛋白聚合以及微管蛋白結合分析評價了所合成的埃坡黴素的生物學活性。細胞毒性首先在一組卵巢癌細胞系、包括親代細胞系(1A9)和三種耐藥的細胞系中進行評價，所述三種耐藥細胞系即耐紫杉醇細胞株(Giannakakou，P.等人，J.Biol.Chem.1997，272，17118-17125)1A9/PTX10和lA9/PTX22以及耐埃坡黴素細胞株(Giannakakou，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，97，2904-2909)1A9/A8。這些耐藥細胞系含有不同的獲得性的β-微管蛋白突變，該突變可影響藥物-微管蛋白相互作用並導致紫杉烷和埃坡黴素-驅使的微管蛋白聚合受損。這些生物學研究的結果在表1中進行了概括(Skehan，P.等人，J.Natl.Cancer Inst.1990，82，1107-1112)。還使用了一組人表皮樣癌細胞系進行細胞毒性和體外微管蛋白聚合分析，包括親代細胞系(KB-31)和耐紫杉醇(由於Pgp過表達)細胞系(KB-8511)。這些研究的結果在表2中進行了概括(Nicolaou，K.C.等人，Chem.Biol.2000，7，593-599；Meyer，T.等人，Int.J.Cancer 1989，43，851-856)。
一般而言，測試化合物對1A9人卵巢癌細胞和KB-31人表皮樣癌細胞的體外微管蛋白聚合效力和細胞毒性性質之間存在良好的一致性。與對天然存在的埃坡黴素A和B所觀察到的原始結果一致，沒有一種此處所測試的埃坡黴素A或B的類似物表現出是藥物-溢出泵P-糖蛋白(Pgp)的良好的底物。這一點是顯然的，因為這些類似物中的每種對Pgp過表達細胞系KB-8511沒有交叉耐藥性，相比之下，一種已知的Pgp底物紫杉醇對KB-5811細胞的活性低224倍(參見圖9和圖17)。值得注意的是，與埃坡黴素A(1)和埃坡黴素B(2)相比，所有的埃坡黴素類似物表現出對β-微管蛋白突變更具活性(參見圖8和圖16，RR值)。與對PTX10(β270)和A8(β274)細胞的相對抵抗力(RR)值為9.4-24.9的Epo A(1)和Epo B(2)相比，這對於RR值為1.6-9.3的化合物10-14、52、54、58和60而言更加明顯(圖8)。另外，在本研究中，與以前的報導(Nicolaou，K.C.等人，ChemBioChem 2001，2，69-75；Giannakakou，P.等人，J.Biol.Chem.1997，272，17118-17125；Giannakakou，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，97，2904-2909)相一致，我們發現紫杉醇-選擇性突變PTX22(β364)對埃坡黴素和該報導中所測試的所有埃坡黴素類似物保留了幾乎全部的敏感性(RR值3.3)。
被取代的埃坡黴素B類似物對1A9人卵巢癌細胞和KB-31人表皮樣癌細胞的相對效力方面具有普遍的一致性。總體而言，這些細胞毒性分析的結果揭示了埃坡黴素家族中就構效關係而言的令人感興趣的信息。首先，其中C12-C13環氧部分被環丙烷環替代的化合物4和6是此處所給出的所有埃坡黴素B類似物中最有效的兩種化合物。這一結果再次證明，C12-C13環氧部分對如上所指出的生物學活性並不是必需的(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323；Nicolaou，K.C.等人，ChemBioChem.2001，2，69-75；Johnson，J.A.等人，Org.Lett.2000，2，1537-1540)。化合物4對1A9人卵巢癌細胞的活性比母體埃坡黴素B(2)強6倍(圖6)，這進一步證明用甲硫基替換噻唑側鏈上的甲基使活性增加。這一結果與以前對C12-C13環氧沒有被替代的埃坡黴素B做相似的替換(即化合物3)所得的數據一致(Nicolaou，K.C.等人，Tetrahedron 2002，58，6413-6432)。後一化合物(3)的活性比母體埃坡黴素B的活性高約2倍，而化合物4的活性比埃坡黴素B的活性高6倍。這一結果使對1A9細胞系更具活性的埃坡黴素B類似物化合物4得以合成，並且提示環氧被環丙烷部分替代以及噻唑部分上的甲基被甲硫基替代可起協同作用，使得觀察到的生物學活性增強。有趣的是，用較大的部分取代噻唑環的甲基(化合物7-10)(發現化合物7對1A9細胞系的IC50值為2.5nM)使得生物學活性與埃坡黴素B相比降低(圖6和7)。
在帶有吡啶環的5-位被取代的吡啶側鏈的埃坡黴素B類似物(化合物55-57和59)中，甲硫基類似物(化合物57)是最有效的，其次是溴取代的衍生物(化合物55)，再次是氯取代的衍生物(化合物56)。當甲硫基由吡啶環的5位(化合物57)重新定位至6位(化合物58)時，活性降低，IC50值由0.4nM(化合物57)降為3.3nM(化合物58)(圖16)。另外，將吡啶環5位上的甲硫基(化合物57)用三氟甲基(化合物59)替換使得活性下降10倍。最後，所合成埃坡黴素B類似物中活性最低的是化合物60，在化合物60中用帶甲硫基取代基的嘧啶側鏈替換了母體化合物的噻唑側鏈。
除了上述的生物學分析外，通過螢光紫杉烷替換分析法(Andreu，J.M.；Barasoain，I.Biochemistry 2001，40，11975-11984)測定了每種埃坡黴素類似物的相對效力。這些實驗的目的是比較微管在其紫杉烷位點結合所研究的埃坡黴素類似物的平衡常數。於37℃測定每種埃坡黴素類似物對充分表徵的螢光紫杉烷Flutax-2與微管結合的抑制(Souto，A.A.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34，2710-2712；Díaz，J.F.等人，J.Biol.Chem.2000，275，26265-26276；Abal，M.等人，Cell.Motil.Cytoskeleton 2001，49，1-15)(圖2)。表3中顯示的所得解離平衡常數表明，在所測試的埃坡黴素類似物中埃坡黴素A(1)的親和性最低(Kd＝34±4)。在該分析法所測定的配體中最強的配體是化合物3，其Kd值為0.64±0.24nM，其次是化合物8、11-13，其Kd值相似，包括在1.6至1.9nM之間。可能除了化合物13外，所測試的類似物的結合親和性反映了它們各自在細胞生長抑制和體外微管蛋白聚合分析中的活性。
從此處所採用的所有三種生物學測定的總體而言，可得出就埃坡黴素家族構效關係的結論。首先，C12甲基的加入不會增強反式環丙基系列的活性(化合物5對6、7對8、9對10)，這一點與順式環氧系列中的結果相反，在順式環氧系列中埃坡黴素B(2)的活性至少比埃坡黴素A(1)高10倍。這可能是由於C12甲基在順式和反式化合物的不同取向或順式和反式化合物之間的綜合構象差異，但細節仍有待說明。第二，與天然的2-甲基噻唑側鏈相比，2-甲硫基噻唑側鏈的引入使活性增強(化合物2對3、5對11和6對12)。這種效果以前在埃坡黴素C和D類似物中觀察到(Nicolaou，K.C.等人，Angew.Chem.1997，109，2181-2187；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1997，36，2097-2103；還參見Sinha，S.C.等人，ChemBioChem 2001，2，656-665)。第三，在吡啶側鏈系列中用甲硫基替換甲基使效力降低(化合物8對13)，這一點與上述噻唑側鏈所得的結果相反。該結論基於細胞毒性和體外微管蛋白聚合數據，而在螢光紫杉烷替換分析中，在吡啶側鏈中用甲硫基替換甲基對親和性是沒有影響的。這種偏差可能僅僅反映了測試化合物的細胞吸收和滲透性的差異或者兩種微管蛋白分析法的敏感性的差異。儘管存在偏差，但這些數據可清楚地看到，在噻唑側鏈引入甲硫基比在吡啶側鏈引入甲硫基更有利，這可能是由於兩種側鏈骨架不同的立體要求。與以前由順式吡啶埃坡黴素類似物得到的數據一致(Nicolaou，K.C.等人，Chem.Biol.2000，7，593-599)，將吡啶側鏈的甲硫基由5-位(化合物13)重新定位至6位(化合物14)使得活性顯著降低。第四，由其中5-甲基吡啶側鏈(化合物7和8)被5-羥甲基吡啶側鏈(化合物9和10)取代的化合物7對9和8對10得到混合的結果。該取代在對1A9人卵巢癌細胞的細胞毒性分析法中沒有顯示差異(表1)，在該細胞毒性分析法中每對化合物均得到非常相似的IC50值(例如化合物7和9的IC50值分別為0.6和0.7nM，化合物8和10的IC50值為1.7nM)。另一方面，在人表皮樣癌細胞KB-31中，化合物10的活性比其對應化合物8的活性強2倍，其IC50分別為0.44和0.9nM。鑑於可能解釋結果差異的兩種人癌細胞系的生長速率之間的差異小，我們可得出下述結論5-羥甲基吡啶側鏈的引入不大可能增強活性，至少不能增強埃坡黴素家族的反式-12，13-環丙基類似物的活性。
由於這些性質，該化合物適合用於治療增殖性疾病、特別是腫瘤疾病、包括轉移灶；例如實體瘤如肺腫瘤、乳房瘤、結腸直腸瘤、前列腺瘤、黑素瘤、腦瘤、胰腺瘤、頸瘤、膀胱瘤、成神經細胞瘤、咽喉腫瘤，而且還包括血細胞增殖性疾病如白血病；還適合用於治療對用微管解聚抑制劑治療有響應的其它疾病如銀屑病。
式I化合物可單獨或與一種或多種其它治療劑組合施用，可能的組合療法採取固定的組合形式或者本發明的化合物與一種或多種其它治療劑交錯施用或分別施用，或者組合施用固定組合與一種或多種其它治療劑。此外，式I化合物還可與化學療法、放射療法、免疫療法、手術介入或它們的組合聯合施用用於腫瘤治療。長期療法與如上所述的其它治療策略中的輔助療法同樣是可能的。其它可能的治療是在腫瘤消退之後維持患者狀態的療法，或者甚至是例如在處危患者中的化學保護療法。
可能用於組合的治療劑特別是一種或多種抗增殖化、細胞生長抑制或細胞毒性化合物，例如一種或多種化學治療劑，選自經典的化療劑、多胺生物合成抑制劑、蛋白激酶、尤其是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶如蛋白激酶C抑制劑，或者酪氨酸蛋白激酶如表皮生長因子受體蛋白酪氨酸激酶抑制劑、細胞因子、負生長調節劑如TGF-β或IFN-β、芳香酶抑制劑和經典的細胞抑制劑。
本發明的化合物不僅用於(預防性和優選治療性地)治療人，而且可用於治療其它溫血動物，例如有商業用途的動物，例如嚙齒類動物如小鼠、家兔或大鼠或豚鼠。它們也可在上述測試體系中作為參比標準與其它化合物進行比較。
式I化合物也可用於診斷目的，例如使用從溫血動物「宿主」、特別是人中得到的腫瘤並植入小鼠以測試它們在用該化合物治療後的生長的降低，研究它們對所述化合物的敏感性，並由此改善對在原宿主中腫瘤性疾病的可能的治療方法的檢測和確定。
立體異構混合物、例如非對映異構體的混合物可按照本身已知的方法、通過適宜的分離方法而分離成其相應的異構體。因此非對映異構混合物可通過分步結晶、色譜法、溶劑分配以及相似的操作分離成各個非對映異構體。這種分離可在起始化合物之一的階段進行或者在式I化合物本身中進行。對映異構體可通過形成非對映異構的鹽來分離，例如通過與對映體純的手性酸形成鹽，或者通過使用具有手性配體的色譜底物的色譜法、例如通過HPLC。(旋對映異構體的分離通常在中間階段進行)。
藥物製劑、方法及用途本發明還涉及含有式I化合物作為活性成分且可特別用於治療上述提及疾病的藥物製劑。用於向溫血動物、特別是人腸內施用如經鼻、口含、直腸或特別是口服施用以及胃腸外施用如靜脈內、肌內或皮下施用的製劑是特別優選的。該製劑僅含有活性成分或者優選地還含有可藥用載體。活性成分的劑量取決於所治療的疾病以及種屬、年齡、體重和個體狀況、個體藥動學數據以及施用方式。
用於抑制增殖性疾病、優選腫瘤的式I化合物的精確劑量取決於多種因素，包括宿主、所治療病症的性質和嚴重程度、施用方式以及所使用的具體化合物。然而通常，當式I化合物以1-300mg/kg體重/周期(一周期＝3-6周)的單劑量或對大多數大型靈長類而言以每治療周期50-5000mg的單劑量經胃腸外例如腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、瘤內或經直腸或經腸內施用、如口服、優選靜脈內或口服、更優選靜脈內施用時，可得到令人滿意的對腫瘤的抑制效果。優選的每3-6周的治療周期靜脈內單劑量為1-75mg/kg體重，或者對大部分大型靈長類而言，每日劑量為50-1500mg。典型的靜脈內劑量為45mg/kg，每3周一次。
通常，開始給予較小劑量，之後逐漸增加劑量，直到確定治療宿主的最佳劑量。劑量的上限由副作用確定，並且可通過對所治療宿主的試驗來確定。
本發明還涉及用於預防性或特別是治療性地治療人或動物體的方法中的藥物製劑、製備該藥物製劑(特別是用於治療腫瘤的組合物形式)的方法以及治療上述疾病、主要是腫瘤性疾病、特別是上述那些腫瘤性疾病的方法。
本發明還涉及製備含有式I化合物作為活性組分(活性成分)的藥物製劑的方法以及式I化合物在製備該藥物製劑中的用途。
優選適於施用於患有對微管解聚抑制有響應的疾病、例如銀屑病或特別是腫瘤性疾病的溫血動物、特別是人或有商業用途的動物的藥物組合物，該組合物含有相應有效量的式I化合物或當有成鹽基團存在時其可藥用鹽以及至少一種可藥用載體。
同樣優選的是用於對需要該治療、特別是患有腫瘤性疾病或其它增殖性疾病的溫血動物、特別是人或有商業用途的哺乳動物預防性或特別是治療性地治療所述疾病的藥物組合物，該組合物含有對所述疾病預防或特別是治療活性量的新的式I化合物或其可藥用鹽作為活性成分。
藥物製劑含有約0.000001％至95％的活性成分，其中單劑施用形式優選含有約0.00001％至90％，多劑施用形式當為胃腸外施用製劑時優選含有約0.0001至0.5％，或者當為腸內施用製劑時優選含有1％至20％的活性成分。單位劑型為例如包衣或未包衣的片劑、安瓿、小瓶、栓劑或膠囊。其它劑型為例如軟膏、霜劑、糊劑、泡沫劑、酊劑、唇膏、滴劑、噴霧劑或分散體等。實例為含約0.0002g至約1.0g活性成分的膠囊。
本發明的藥物製劑以本身已知的方法製備，例如通過常規混合、制粒、包衣、溶解或冷凍乾燥法製備。
適於胃腸外施用的製劑主要是水溶形式、例如水溶性鹽形式的活性成分的水溶液[例如在生理鹽水中，通過將在聚乙二醇如聚乙二醇(PEG)300或PEG400中的溶液稀釋獲得]或者含有增粘劑如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖以及如果合適的話還含有穩定劑的水性注射混懸液。活性成分、必要時可與賦性劑一起還可以是凍乾物的形式，在胃腸外施用之前通過加入適宜的溶劑而還原成溶液。
例如用於胃腸外施用的溶液也可用作輸液。
類似地，本發明涉及治療上述病理狀況之一、特別是對微管解聚抑制有響應的疾病、特別是相應的腫瘤性疾病的過程或方法。式I化合物可以以本身或藥物組合物的形式預防性或治療性地優選以對所述疾病有效的量施用於需要該治療的溫血動物、例如人，所述化合物特別地以藥物組合物的形式使用。當個體體重為約70kg時，所施用的本發明化合物的劑量為約0.1mg至約1g、優選約0.5m至約200mg。施用優選例如每1至4周、例如每周、每兩周、每三周或每四周進行。
本發明還特別涉及式I化合物或其可藥用鹽、特別是作為優選化合物的式I化合物或其可藥用鹽本身或含至少一種可藥用載體的藥物製劑的形式用於治療性和預防性治療一種或多種上述疾病的用途。
本發明還特別涉及式I化合物或其可藥用鹽、特別是作為優選化合物的式I化合物或其可藥用鹽在製備用於治療性或預防性治療一種或多種上述疾病的藥物製劑中的用途。
實驗部分概述除非特別指出，所有反應在氬氣氣氛下、使用無水溶劑在無水條件下進行。無水溶劑通過使它們通過商業購得的活化氧化鋁柱獲得。所有所購試劑為最高級的商購質量，並且不需要另外純化即可使用。反應通常通過在0.25mm E.Merck矽膠板(60F-254)上進行的薄層色譜法監測。E.Merck矽膠(60，粒徑0.040-0.063mm)用於快速柱色譜法。製備級薄層色譜法(PTLC)分離在0.25、0.50或1mm E.Merck矽膠板(60F-254)上進行。熔點(mp)未經校正，用Thomas-Hoover Unimelt毛細管熔點儀記錄。旋光度用Perkin-Elmer 241旋光儀記錄。NMR譜圖用Bruker DRX-600、DRX-500、AMX-400或AC-250儀器記錄，並且使用殘餘的未氘化溶劑作為內部參比校準。所有標記的碳原子如C15參考埃坡黴素A(1)的標號(參見圖1)。IR譜圖用Perkin-Elmer 1600系列FT-IR光譜儀記錄。高分辨質譜用PerSeptive Biosystems VoyagerTMIonSpec質譜儀(MALDI-FTMS)或API100 Perkin-Elmer質譜儀(ESI)記錄。
埃坡黴素3的合成乙烯基碘化合物15與錫烷16的Stille偶合將Pd2(dba)3(CHCl3(3.9mg，3.8μmol)、AsPh3(4.6mg，15μmol)和CuI(7.2mg，38μmol)在DMF(除氣，0.5mL)中的溶液於25℃加入碘化物15(10mg，19μmol)(Nicolaou，K.C.等人，Chem.Eur.J.2000，6，2783-2800)與錫烷16(11mg，38μmol)(Nicolaou，K.C.等人，Bioorg.Med.Chem.1999，7，665-697)在DMF(除氣，0.5mL)中的溶液中，將所得溶液攪拌2小時。加入水(10mL)，將混合物用EtOAc(3(10mL))萃取。合併有機相併用水(30mL)和鹽水(30mL)洗滌，乾燥(Na2SO4)。在蒸發揮發性物質後，將殘餘物通過快速柱色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 2∶1(1∶1))純化，得到白色固態的埃坡黴素3(7.2mg，72％)；TLC Rf＝0.29(矽膠，己烷∶EtOAc 1∶1)；[α]D22-53(c 0.51，CH2Cl2)；IR(膜)νmax3472(br)，2967，2920，1731，1684，1461，1420，1378，1249，1143，1032，973，879，732，667cm-1；MALDI-FTMS m/z 562.2267(MNa+)，C27H41NO6S2Na的計算值為562.2267。
醛32的構建醇23於0℃攪拌下，向環丙基醇22(4.08g，24mmol)(Charette，A.B.等人，J.Am.Chem.Soc.1998，120，11943-11952)於DMF(40mL)中的溶液中逐份加入氫化鈉(1.45g，36mmol，60％，在礦物油中)。於25℃攪拌0.5小時後，將混合物冷卻至0℃，將苄基溴(4.3mL，36mmol)在2分鐘內加入，於25℃繼續攪拌12小時。將反應用NH4Cl(飽和，50mL)終止，混合物用EtOAc(3(50mL)萃取，合併萃取液並用鹽水(2(100mL))洗滌、乾燥(Na2SO4)並蒸發。將殘餘物溶於CH2Cl2∶MeOH 4∶1(60mL)中，並將溶液於-78℃用臭氧處理(100L/h，約5g O3/h)21分鐘。(注意必須避免反應較長時間，以防止二苄醚氧化成相應的苯甲酸酯)。過量的臭氧通過充N21分鐘除去，然後加入少量NaBH4(2.75g，73mmol)(警告！放熱！)，之後加入甲醇(20mL)。將混合物經1小時溫熱至25℃，加入NH4Cl(飽和，20mL)終止反應。將混合物用CH2Cl2(2(50mL))萃取，合併萃取液並用鹽水(100mL)洗滌、乾燥(Na2SO4)並蒸發。將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc5∶2)純化，得到黃色油狀的23(5.07g，89％)。TLC Rf＝0.20(矽膠，己烷∶EtOAc 3∶1)；[α]D22-7.5(c 1.76，CHCl3)；IR(膜)νmax3390(br)，2933，2859，1452，1070，739，698cm-1；MALDI-FTMS m/z 257.1519(MNa+)，C15H22O2Na的計算值為257.1512。
碘化物24向環丙基醇23(10.08g，43.0mmol)於無水CH2Cl2(100mL)中的0℃溶液中加入甲磺醯氯(4.2mL，54mmol)，之後滴加三乙胺(9.0mL，65mmol)。立即開始形成白色沉澱。將混合物於25℃攪拌1小時，然後加入NH4Cl(飽和，50mL)和水(50mL)，分離各相。水相用EtOAc(100mL)萃取，合併有機相併用鹽水洗滌、乾燥(Na2SO4)並蒸發。將殘餘物溶於無水丙酮(200mL)中，加入碘化鈉(19.3g，129mmol)。將最初幾乎澄清的溶液回流40分鐘，在此期間形成白色沉澱。加入水(100mL)，將混合物用乙醚(500+250mL)萃取。合併萃取液，乾燥並蒸發，將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)純化，得到無色油狀的24(14.16g，95％)。TLC Rf＝0.66(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)；[α]D22-16(c 2.05，CHCl3)；IR(膜)νmax2916，2848，1453，1217，1098，1073，735，697cm-1；ESI-MS m/z 367(MNa+)，C15H21IONa的計算值為367。
腙26將n-BuLi(13.1mL，21.0mmol，1.6M，在己烷中)於-78℃加入在THF(10mL)中的二異丙胺(2.94mL，21.0mmol)中，製得LDA溶液，然後將溶液溫熱至0℃，攪拌10分鐘。向該LDA溶液中加入丙醛SAMP腙25(3.32g，19.5mmol)(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.1997，119，7974-7991；Enders，D.Aymmetric Synth.1984，3，275-339和Enders，D.等人，Synthesis 1996，1403-1418)，並將混合物於0℃攪拌6小時，在此期間形成白色沉澱。將混合物冷卻至-98℃(MeOH/N2(l)浴)，於0.5小時內加入碘化物24(5.16g，15.0mmol)在THF(20mL)中的溶液。然後將反應混合物經14小時溫熱至-10℃，然後用NH4Cl(飽和，10mL)終止反應。將混合物用EtOAc(100mL+2(50mL))萃取，合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 6∶1(4∶1)純化，得到黃色油狀的腙26(4.88g，84％)。TLC Rf＝0.38(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)；[α]D22-61(c 1.45，CHCl3)；IR(膜)νmax2926，1454，1097，736，697cm-1；MALDI-FTMS m/z387.3008(MH+)，C24H39N2O2的計算值為387.3006。
醛17將腙26(3.82g，9.9mmol)在碘甲烷(10mL)中的溶液於60℃(回流冷凝)加熱3小時，然後冷卻至25℃。蒸發過量的碘甲烷，痕量通過油泵真空除去。將殘餘的黃色漿狀物與3N HCl(190mL)和戊烷(190mL)於25℃劇烈攪拌3小時，分離各相，水相用戊烷(100mL)萃取。合併有機相、乾燥(Na2SO4，NaHCO3)並蒸發，得到黃色油狀的醛17(2.38g，88％)。[α]D22+2(c 1.3，CHCl3)；IR(膜)νmax2931，2856，1724，1454，1095，1074，736，698cm-1；MALDI-FTMS m/z 297.1830(MNa+)，C18H26O2Na的計算值為297.1825。
由於C8(埃坡黴素標號)的立體構型不穩定，該醛應當立即用於下一步驟。C8的dr如下評價將17的樣品用在甲醇中的過量NaBH4處理10分鐘。反應用NH4Cl(飽和)終止，混合物用EtOAc萃取，將萃取液乾燥(Na2SO4)並蒸發。將殘餘物用(R)-(-)-MTPACl(2-3當量)、過量三乙胺和在CH2Cl2中的4-DMAP處理3小時。通過製備級TLC純化，得到(S)-MTPA酯樣品，其通過1H NMR分析測得的dr＝97∶3，以C8處經校正的絕對立體構型作為主要的異構體(Tsuda，M.等人，J.Org.Chem.2000，65，1349-1352)。使用(S)-(+)-MTPACl得到類似的結果。
羥醛產物27將n-BuLi(7.5mL，12mmol，1.6M，在己烷中)於-78℃加入在THF(12mL)中的二異丙胺(1.68mL，12mmol)中，製得LDA溶液，然後將溶液暫時溫熱至0℃，最終冷卻至-78℃。2分鐘內滴加酮19(4.63g，11.5mmol)(Nicolaou，K.C.等人，J.Am.Chem.Soc.1997，119，7974-7991)在THF(12mL)中的溶液，並將混合物於-78℃攪拌1小時，然後於-40℃攪拌0.5小時。再次將其冷卻至-78℃，通過套管在1分鐘內加入預冷卻至-78℃的醛17(1.37g，5.0mmol)在THF(25mL)中的溶液，注意確保在轉移期間保持升溫最少。將混合物攪拌5分鐘，然後通過快速注入AcOH(1.4mL)在THF(4.2mL)中的溶液以終止反應。於-78℃5分鐘後，將混合物溫熱至25℃，並在NH4Cl(飽和，50mL)與乙醚(50mL)之間分配。將水相用乙醚(2(50mL))萃取，合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶乙醚20∶1(6∶1))純化，得到回收的酮19(1.71g，4.25mmol)，之後得到非對映純形式的羥醛產物27(2.73g，81％)。TLC Rf＝0.34(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)；[α]D22-40(c 1.0，CHCl3)；IR(膜)νmax3502(br)，2954，2928，2856，1681，1472，1255，1098，836，776cm-1；MALDI-FTMS m/z699.4796(MNa+)，C39H72O5Si2Na的計算值為699.4816。
醇28將羥醛產物27(2.71g，4.0mmol)與2，6-二甲基吡啶(1.40mL，12mmol)在CH2Cl2(25mL)中的溶液冷卻至-20℃，然後滴加TBSOTf(1.84mL，8.0mmol)。將混合物於-20℃攪拌1小時，然後加入NH4Cl(飽和，25mL)終止反應。將混合物溫熱至25℃，分離各相，將水相用CH2Cl2(25mL)和乙醚(25mL)萃取。合併有機相、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物通過矽膠塞、用己烷∶乙醚10∶1洗脫過濾。將濾液蒸發，將所得甲矽烷基醚粗品(3.14g，4.0mmol，99％)溶於THF(40mL)中。於0℃向其中加入HF吡啶配合物(6.4mL)與吡啶(18mL)在THF(32mL)中的冷(0℃)溶液中(該溶液通過於0℃將HF吡啶配合物緩慢加入吡啶在THF中的溶液來製備；警告！HF吡啶具有高度腐蝕性。將HF吡啶加入吡啶-THF溶液時產生大量的熱，必須攪拌並在冰浴上冷卻，以防止噴濺)，將所得溶液於25℃攪拌4小時。混合物用EtOAc(100mL)稀釋、放置在冰浴上、小心加入NaHCO3(飽和，100mL)以及保證完全中和所需量的固態NaHCO3來終止反應(警告！起沫)。將混合物用EtOAc(3(100mL))萃取，合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)純化，得到無色油狀的28(2.40g，89％)。TLC Rf＝0.39(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)；[α]D22-26(c 1.1，CHCl3)；IR(膜)νmax3458(br)，2929，2856，1693，1472，1462，1255，1093，986，836，775cm-1；MALDI-FTMS m/z 699.4807(MNa+)，C39H72O5Si2Na的計算值為699.4816。
酯29將醇28(2.40g，3.5mmol)、Dess-Martin periodinane(3.75g，8.8mmol)、NaHCO3(0.74g，8.8mmol)和水(76μL，4.2mmol)在CH2Cl2(80mL)中混合，所得懸浮液攪拌1小時。混合物用乙醚(200mL)、水(100mL)和NaHCO3(飽和，100mL)稀釋，然後過濾。分離各相，水相用乙醚(2(100mL))萃取。合併萃取液，乾燥(Na2SO4)並蒸發，殘餘物通過矽膠塞、用己烷∶EtOAc 6∶1洗脫過濾。將濾液蒸發，所得醛粗品(2.15g，3.2mmol，90％)溶解於THF(80mL)、t-BuOH(145mL)和2-甲基-2-丁烯(25mL)的混合物中。向該溶液中加入NaH2PO4(0.95g，6.7mmol)和NaClO2(1.14g，10mmol)在水(31mL)中的溶液，所得混合物劇烈攪拌1小時。通過蒸發除去揮發物，使殘餘物在EtOAc(100mL)和鹽水(100mL)之間分配。分離各相，水相用EtOAc(3(100mL))萃取。合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物溶於DMF(5mL)中，再次蒸發除去痕量的t-BuOH。將如此所得的酸粗品(2.4g，約3.2mmol＞100％)再次溶於DMF(10mL)中，向其中加入2-(三甲基甲矽烷基)乙醇(1.83mL，12.7mmol)、EDC(0.92g，4.8mmol)和4-DMAP(40mg，0.33mmol)。將所得懸浮液攪拌14小時，之後得到澄清溶液。加入水(10mL)，混合物用乙醚(3(50mL)萃取。合併萃取液，並用水-鹽水混合物(100+100mL)洗滌，乾燥(Na2SO4)並蒸發。將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 10∶1)純化，得到粘稠淺黃色油狀的29(2.08g，74％)。TLC Rf＝0.57(矽膠，己烷∶EtOAc 10∶1)；[α]D22-33(c 1.2，CHCl3)；IR(膜)νmax2954，2930，2856，1735，1695，1472，1385，1252，1090，988，836，776cm-1；MALDI-FTMS m/z 813.5315(MNa+)，C44H82O6Si3Na的計算值為813.5311。
醛30在二苄醚29(2.08g，2.63mmol)在EtOH∶EtOAc 1∶1(50mL)中的溶液中加入20％Pd(OH)2/C(2.1g，60％溼度)，將混合物氫化1小時。然後通過硅藻土過濾以除去催化劑，將濾液蒸發，殘餘物與苯共蒸發以除去痕量的EtOH。將所得醇粗品(1.89g，約2.6mmol，＞100％)溶解於CH2Cl2(60mL)中，加入Dess-Martin periodinane(2.76g，6.5mmol)、NaHCO3(0.55g，6.5mmol)和水(56μL，3.1mmol)，將所得懸浮液攪拌1小時。混合物用乙醚(150mL)、水(75mL)和NaHCO3(飽和，75mL)稀釋，然後過濾。分離各相，水相用乙醚(2(75mL))萃取。合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 15∶1)純化，得到粘稠油狀的醛30(1.55g，84％)。TLC Rf＝0.24(矽膠，己烷∶EtOAc 15∶1)；[α]D22-47(c 1.3，CHCl3)；IR(膜)νmax2954，2856，1734，1703，1251，1173，1084，988，837，776cm-1；MALDI-FTMS m/z 721.4671(MNa+)，C37H74O6Si3Na的計算值為721.4685。
烯醇醚31向MeOCH2PPh3Cl(3.09g，9.0mmol)於THF(20mL)的0℃溶液中滴加NaHMDS(8.5mL，8.5mmol，1M，在THF中)。出現紅色。將混合物於0℃攪拌0.5小時，然後冷卻至-40℃。加入醛30(2.12g，3.0mmol)在THF(7mL)中的溶液，將混合物在2小時內溫熱至-10℃。反應用NH4Cl(飽和，15mL)終止，分離各相，水相用EtOAc(2(75mL))萃取。合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc30∶1)純化，得到無色粘稠油狀的烯醇醚31(1.85g，84％，通過1H NMR測得烯烴順式反式約1∶1)。TLC Rf＝0.23(矽膠，己烷∶EtOAc 30∶1)；[α]D22-36(c 1.2，CHCl3)；IR(膜)νmax2954，2930，2856，1735，1695，1251，1171，1105，988，836，776cm-1；MALDI-FTMS m/z 749.4996(MNa+)，C39H78O6Si3Na的計算值為749.4998。
醛32向烯醇醚31(847mg，1.16mmol)於二噁烷∶水9∶1(12mL)的溶液中加入對-甲苯磺酸吡啶鎓(2.34g，9.31mmol)，將混合物於70℃攪拌，直到TLC表明反應完全(6-10小時)。然後用NaHCO3(飽和，15mL)終止反應，混合物用EtOAc(3(50mL))萃取。合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 15∶1)純化，得到無色粘稠油狀的32(681mg，82％)。TLC Rf＝0.29(矽膠，己烷∶EtOAc 15∶1)；[α]D22-34(c 1.0，CHCl3)；IR(膜)νmax2954，2856，1731，1695，1251，1086，988，836，776cm-1；MALDI-FTMS m/z 735.4823(MNa+)，C38H76O6Si3Na的計算值為735.4842。
乙烯基碘化合物20c-g的構建2-溴-5-[(三苯甲基氧基)甲基]吡啶34將三苯甲基氯(3.90g，14mmol)、4-DMAP(2.08g，17mmol)和2-溴-5-羥甲基吡啶33(1.88g，10mmol)(Ellingboe，J.W.等人，J.Med.Chem.1994，37，542-550)溶於DMF(15mL)中，並將溶液於80℃攪拌48小時。在此期間形成白色沉澱。冷卻後，將混合物用NaHCO3(飽和，25mL)稀釋，並用EtOAc(3(50mL))萃取。合併萃取液，並用加有幾滴NaOH(1M)的鹽水(2(100mL))萃取。在乾燥並蒸發後，將固態殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 15∶1)純化，得到白色固態34(4.46g，100％)。TLC Rf＝0.30(矽膠，己烷∶EtOAc 15∶1)；IR(膜)νmax3057，1448，1086，764，700，632cm-1；MALDI-FTMS m/z 430.0792(MH+)，C25H21BrNO的計算值為430.0801。
芳基溴(34、37、38和39)與丙炔的Sonogashira偶合(通用方法)在Ar(g)下，向芳基溴34、37、38或39(3.5mmol)於DMF(3mL)和二異丙胺(2.5mL)中的暫時去氧(充Ar)溶液中加入Pd(PPh3)2Cl2(25mg，36μmol)和CuI(13mg，70μmol)，然後用丙炔(1atm，球形瓶)替換該惰性氣氛。將混合物於25℃攪拌3小時。在此期間形成沉澱，並且反應混合物轉化為深棕色。加入水(15mL)，將混合物用EtOAc萃取，合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發。通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc混合物)得到純的1-芳基丙炔。
丙炔基吡啶35褐色泡沫(96％)；TLC Rf＝0.23(矽膠，己烷∶EtOAc5∶1)；IR(膜)νmax3057，2229，1594，1560，1478，1448，1075，702cm-1；MALDI-FTMS m/z 390.1851(MH+)，C28H24NO的計算值為390.1852。
吡啶36將三苯甲基醚35(1.38g，3.54mmol)在CHCl3(15mL)中的溶液冷卻至0℃，然後用HCl(g)飽和。於0℃1小時後，加入NaHCO3(飽和，50mL)終止反應，分離各相。水相用CH2Cl2(50mL)萃取，合併有機相、乾燥(Na2SO4)並蒸發。通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 1∶2+5％MeOH)得到黃色粘稠油狀的5-羥甲基-2-丙-1-炔基吡啶(0.36g，69％)。TLC Rf＝0.29(矽膠，己烷∶EtOAc 1∶2+5％MeOH)；IR(膜)νmax3262，2916，2230，1596，1561，1023，838cm-1；MALDI-FTMS m/z 148.0754(MH+)，C9H10NO的計算值為148.0757。向該醇(0.40g，2.7mmol)在THF(10mL)中的0℃溶液中加入NaH(0.13g，3.3mmol，60％，在油中)。攪拌5分鐘後，加入氯甲基甲醚(0.25mL，3.3mmol)，並將混合物於0℃攪拌1小時。然後用NaCl(飽和)終止反應，並加入幾滴NaOH(1M)。混合物用EtOAc(3(50mL))萃取，合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc 1∶1)純化，得到淺黃色油狀的36(0.26g，50％)。TLC Rf＝0.41(矽膠，己烷∶EtOAc 1∶1)；IR(膜)νmax2947，2230，1595，1560，1478，1149，1104，1047，919，830cm-1；MALDI-FTMS m/z 192.1014(MH+)，C11H14NO2的計算值為192.1019。
37的Sonogashira偶合產物反應非常緩慢，可能由於Pd與硫醚部分配位；因此，使用10mol％Pd(PPh3)2Cl2和20mol％CuI。得到棕色油狀的產物(42％)。TLC Rf＝0.37(矽膠，己烷∶EtOAc 15∶1)；IR(膜)νmax3110，2914，2240，1493，1417，1278，1037，966，735cm-1；MALDI-FTMS m/z170.0092(MH+)，C7H8NS2的計算值為170.0093。
38的Sonogashira偶合產物棕色油(97％)；TLC Rf＝0.21(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)；IR(膜)νmax2908，2226，1567，1531，1461，1431，1361，1108，1008，832cm-1；MALDI-FTMS m/z 164.0527(MH+)，C9H10NS的計算值為164.0528。
39的Sonogashira偶合產物黃色油(70％)；TLC Rf＝0.36(矽膠，己烷∶EtOAc 20∶1)；IR(膜)νmax2924，2231，1566，1554，1431，1156，1140，790cm-1；MALDI-FTMS m/z 164.0526(MH+)，C9H10NS的計算值為164.0528。
錫氫化(Hydrostannylation)-碘化反應(通用方法)這是對以前報導的方法(Betzer，J.-F.等人，Tetrahedron Lett.1997，38，2279-2282)的修改。向六丁基錫(hexabutylditin)(10.1mL，20mmol)於無水THF(40mL)的-78℃溶液中加入n-BuLi(12.9mL，20mmol，1.55M，在己烷中)，並將所得澄清溶液於-40℃攪拌30分鐘。然後將其通過套管轉移至CuCN(0.90g，10mmol)在THF(2mL)中的-78℃懸浮液中。形成澄清黃色溶液，該溶液於-40℃攪拌5分鐘，之後重新冷卻至-78℃。然後加入無水甲醇(23mL，0.57mol)，生成紅色溶液，將紅色溶液於-40℃攪拌15分鐘，之後加入芳基丙炔(5.0mmol)在THF(5mL)中的溶液。將該桔紅色溶液於-10℃攪拌過夜(沉澱出一些Cu和/或Cu2+鹽)，然後冷卻至-20℃，之後加入甲醇(10mL)。於-20℃15分鐘後，加入水(10mL)，在繼續攪拌15分鐘，同時溫熱至25℃。混合物用乙醚萃取，有機相用鹽水洗滌、乾燥(Na2SO4)並蒸發，通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc混合物)得到中間體乙烯基錫烷，將其溶解於CH2Cl2(5mL)中。然後於0℃將碘(1.05當量)在CH2Cl2(每克I2，40mL)中的溶液滴加入該溶液中。在最後幾滴之後，I2顏色固定，使反應於0℃繼續進行5分鐘。接著將溶劑蒸發，殘餘物溶解於乙醚中。加入KF(在水中的1M溶液，3當量)和Na2S2O3(飽和，每mmol底物10mL)，混合物於25℃攪拌15分鐘，在此期間形成白色沉澱。混合物通過硅藻土過濾，有機相干燥(Na2SO4)並蒸發。將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc混合物)純化，得到預期的乙烯基碘化合物。
乙烯基碘化合物20c白色渾濁薄膜(80％)。TLC Rf＝0.25(矽膠，己烷∶EtOAc 20∶1)；IR(膜)νmax3060，2919，1619，1596，1484，1443，1373，1214，1061，985，873，761，703，632cm-1；MALDI-FTMS m/z 518.0990(MH+)，C28H25INO的計算值為518.0975。
乙烯基碘化合物20d.黃色油(67％)。TLC Rf＝0.51(矽膠，己烷∶EtOAc4∶1)；IR(膜)νmax2924，1716，1619，1596，1481，1372，1211，1149，1102，1045，918，873，609，517cm-1；MALDI-FTMS m/z 320.0142(MH+)，C11H15INO2的計算值為320.0142。
乙烯基碘化合物20e中間體乙烯基錫烷易於脫甲錫烷基(protodestannylated)；因此，該中間體的快速色譜法必須使用己烷∶EtOAc∶Et3N 50∶1∶1作為洗脫液進行，如此所得的乙烯基錫烷含有其它丁基錫化合物。按照通用方法，混合物用足夠的I2(約2當量I2)處理，以在加入結束後仍保留有棕色。在快速色譜法(己烷∶EtOAc 50∶1)之後，得到黃色油狀的乙烯基碘化合物20e(74％)。TLC Rf＝0.41(矽膠，己烷∶EtOAc50∶1)；IR(膜)νmax3102，2923，1620，1423，1300，1065，1035，964，863，723，562cm-1；MALDI-FTMS m/z 297.9215(MH+)，C7H9INS2的計算值為297.9216。
乙烯基碘化合物20f黃色固體(80％)。TLC Rf＝0.19(矽膠，己烷∶EtOAc 40∶1)；IR(膜)νmax2919，1619，1567，1467，1431，1373，1108，1067，1014，961，867，820，521cm-1；MALDI-FTMS m/z 291.9655(MH+)，C9H11INS的計算值為291.9651。
乙烯基碘化合物20g黃色油(83％)。TLC Rf＝0.28(矽膠，己烷∶EtOAc40∶1)；IR(膜)νmax2919，1620，1549，1425，1155，1138，1061，991，961，861，785，732，550cm-1；MALDI-FTMS m/z 291.9653(MH+)，C9H11INS的計算值為291.9651。
埃坡黴素類似物8-144的合成醛(34、40)與乙烯基錫烷(20a-g)的Nozaki-Hiyama-Kishi偶合反應(通用方法)向醛32(107mg，0.15mmol)、必需的乙烯基碘化合物20(0.45mmol)以及4-叔丁基吡啶(665μL，4.5mmol)於DMSO(3mL)中的暫時真空除氣溶液中加入無水CrCl2(184mg，1.5mmol)和無水NiCl2(4mg，0.03mmol)。將混合物於25℃攪拌3小時，之後加入另一份乙烯基碘化合物(0.45mmol)，繼續攪拌3小時。重複該操作一次，之後攪拌過夜。然後用水(5mL)終止反應，加入吡啶(1mL)以防止Cr-產物配合物被萃取入水相，混合物用EtOAc(3(25mL)萃取。合併萃取液並用鹽水(2(100mL))洗滌、乾燥(Na2SO4)並蒸發。進行快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc混合物)得到偶合產物，在大多數情形下該產物不能從過量的4-叔丁基吡啶中分離。
20a和32的產物黃色油(85％，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLC Rf＝0.26(矽膠，己烷∶EtOAc 4∶1)；[α]D22-25(c 0.36，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2943，2860，1731，1696，1467，1384，1290，1249，1173，1079，985，832，773cm-1；MALDI-FTMS m/z 860.5128(MNa+)，C44H83NO6SSi3Na的計算值為860.5141。
20b和32的產物該偶合產物不能從4-叔丁基吡啶中分離，以粗混合物形式進行TBAF脫保護(見下文)。
20d和32的產物該偶合產物不能從4-叔丁基吡啶中分離，以粗混合物形式進行TBAF脫保護(見下文)。
20e和32的產物黃色玻璃狀(78％，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLC Rf＝0.40(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)；[α]D22-28(c 2.0，CHCl3)；IR(膜)νmax3416(br)，2929，2856，1732，1694，1472，1251，1037，988，836，776cm-1；MALDI-FTMS m/z 906.5021(MH+)，計C45H85NO6S2Si3Na的計算值為906.5018。
20f和32的產物該偶合產物不能從4-叔丁基吡啶中分離，以粗混合物形式進行TBAF脫保護(見下文)。
20g和32的產物該偶合產物不能從4-叔丁基吡啶中分離，以粗混合物形式進行TBAF脫保護(見下文)。
20c和40的產物黃色玻璃狀(87％，由醛40兩步得到，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLC Rf＝0.15(矽膠，己烷∶EtOAc 4∶1)；[α]D22-23(c 0.19，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2931，2861，1731，1690，1467，1384，1355，1249，1167，1061，985，832，773，703cm-1；MALDI-FTMS m/z 1112.6634(MNa+)，C65H99NO7Si3Na的計算值為1112.6621。
20e和40的產物無色玻璃狀(59％，為C15差向異構體的約1∶1的混合物)。TLC Rf＝0.27(矽膠，己烷∶EtOAc 5∶1)；[α]D22-28(c 2.0，CHCl3)；IR(膜)νmax3396(br)，2928，2855，1734，1693，1472，1251，1037，988，836，775cm-1；MALDI-FTMS m/z 892.4861(MNa+)，C44H83NO6S2Si3Na的計算值為892.4862。
TBAF脫保護(通用方法)將Nozaki-Hiyama-Kishi偶合的產物混合物溶於THF(1.5mL)中，於0℃加入TBAF(1M，在THF中，0.30mL，0.30mmol)。在0℃1小時後，加入另一份TBAF(0.30mL，0.30mmol)，將混合物於25℃攪拌1小時。用NH4Cl(飽和，5mL)終止反應，混合物用EtOAc(4(20mL))萃取。合併萃取液、乾燥(Na2SO4)並蒸發，將殘餘物通過快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc混合物)純化，得到所希望的羥酸，為C15差向異構體的約1∶1混合物(在該階段不可分開)。
羥酸41a將脫保護的反應混合物快速通過矽膠塞過濾，將該粗產物(73％產率，由醛32得到)不經進一步純化即進行Yamaguchi大環內酯化反應(見下文)。
羥酸41b黃色固體(57％，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLCRf＝0.19(矽膠，己烷∶EtOAc 2∶1)；[α]D22-6(c 1.0，CHCl3)；IR(膜)νmax3369(br)，2930，2857，1783，1694，1471，1251，1085，1084，988，836，775cm-1；MALDI-FTMS m/z 768.5028(MNa+)，C42H75NO6Si2Na的計算值為768.5025。
羥酸41d黃色玻璃狀(49％，由醛32兩步得到，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLC Rf＝0.20(矽膠，己烷∶EtOAc 1∶1)；[α]D22+1(c 0.19，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2933，2858，1694，1600，1563，1463，1382，1357，1251，1145，1096，1046，989，834，772，666cm-1；MALDI-FTMS m/z 806.5437(MH+)，C44H80NO8Si2的計算值為806.5417。
羥酸41e黃色固體(79％，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLCRf＝0.37(矽膠，己烷∶EtOAc 2∶1)；[α]D22-23(c 2.3，CHCl3)；IR(膜)νmax3356(br)，2929，2856，1712，1472，1253，1085，1038，988，836，776cm-1；MALDI-FTMS m/z 806.4282(MNa+)，C40H73NO6S2Si2Na的計算值為806.4315。
羥酸41f無色玻璃狀(63％，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLCRf＝0.21(矽膠，己烷∶EtOAc 2∶1)；[α]D22-3(c 0.44，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2933，2858，1693，1467，1253，1086，984，833，774cm-1；MALDI-FTMS m/z800.4754(MNa+)，C42H75NO6SSi2Na的計算值為800.4746。
羥酸41g黃色玻璃狀(46％，由醛32兩步得到，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLC Rf＝0.46(矽膠，己烷∶EtOAc 2∶1)；[α]D22-11(c 0.19，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2933，2858，1706，1557，1463，1426，1364，1251，1083，989，834，772，666cm-1；MALDI-FTMS m/z 800.4746(MNa+)，C42H75NO6SSi2Na的計算值為800.4746.
羥酸42c將脫保護的反應混合物快速通過矽膠塞過濾，該粗產物(46％產率，由醛32得到)不經進一步純化即進行Yamaguchi大環內酯化反應(見下文)。
羥酸42e淺黃色玻璃狀(66％，為C15差向異構體的約1∶1混合物)。TLC Rf＝0.39(矽膠，己烷∶EtOAc 2∶1)；[α]D22-20(c 1.0，CHCl3)；IR(膜)νmax3354(br)，2928，2856，1713，1471，1253，1087，988，836，775cm-1；MALDI-FTMS m/z 792.4161(MNa+)，C39H71NO6S2Si2Na的計算值為792.4153。
Yamaguchi大環內酯化反應(通用方法)向羥酸(95μmol)於無水THF(8mL)中的0℃溶液中加入三乙胺(79μl，0.57mmol)和2，4，6-三氯苯甲醯氯(40μl，0.23mmol)。在0℃攪拌1小時後，於75℃將所得溶液用注射器泵在2小時內加入4-DMAP(26mg，0.21mmol)在甲苯(20mL)中的溶液中。於75℃繼續攪拌1小時，之後減壓蒸發甲苯。將殘餘物直接進行快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc混合物)，得到大環內酯及其(15R)-差向異構體，易於分離。在所有情形下，所希望的(15S)-差向異構體在極性較弱的(15R)-差向異構體之後被洗脫。
大環內酯43a無色玻璃狀(28％，由醛32與乙烯基碘化合物20a的Nozaki-Hiyama-Kishi偶合產物兩步得到)；TLC Rf＝0.21(矽膠，己烷∶EtOAc 20∶1)；[α]D22-33(c 0.56，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2932，2855，1739，1689，1465，1383，1252，1181，1153，1099，1066，1017，984，869，836，776cm-1；MALDI-FTMS m/z 734.4639(MH+)，C40H72NO5SSi2的計算值為734.4664。
大環內酯43b無色玻璃狀(28％)；TLC Rf＝0.27(矽膠，己烷∶EtOAc10∶1)；[α]D22-28(c 1.0，CHCl3)；IR(膜)νmax2929，2856，1740，1695，1472，1384，1253，1100，1020，986，836，775cm-1；MALDI-FTMS m/z 728.5109(MH+)，C42H74NO5Si2的計算值為728.5106。
大環內酯43d黃色玻璃狀(35％)；TLC Rf＝0.14(矽膠，己烷∶EtOAc6∶1)；[α]D22-28(c 0.12，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2931，2861，1737，1690，1596，1467，1378，1249，1149，1102，1049，985，832，773cm-1；MALDI-FTMS m/z810.5116(MNa+)，C44H77NO7Si2Na的計算值為810.5130。
大環內酯43e該產物以粗混合物形式分離，不經進一步純化直接進行Global脫甲矽烷基化反應(見下文)。
大環內酯43f無色玻璃狀(45％)；TLC Rf＝0.20(矽膠，己烷∶EtOAc10∶1)；[α]D22-0.30(c 0.10，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2933，285，1737，1668，1463，1382，1357，1251，1102，1015，983，871，834，772cm-1；MALDI-FTMS m/z760.4799(MH+)，C42H74NO5SSi2的計算值為760.4820。
大環內酯43g黃色玻璃狀(37％)；TLC Rf＝0.47(矽膠，己烷∶EtOAc10∶1)；[α]D22-14(c 0.31，CHCl3)；IR(膜)νmax2929，2856，1740，1696，1557，1461，1431，1379，1250，1099，107，979，836，774cm-1；MALDI-FTMS m/z760.4802(MH+)，C42H74NO5SSi2的計算值為760.4820。
大環內酯44c無色玻璃狀(33％，由醛40與乙烯基碘化合物20c的Nozaki-Hiyama-Kishi偶合產物兩步得到)；TLC Rf＝0.46(矽膠，己烷∶EtOAc 10∶1)；[α]D22-17(c 0.56，CH2Cl2)；IR(膜)νmax2931，2861，1743，1696，1467，1378，1249，1161，1073，1020，985，873，833，773，703，579cm-1；MALDI-FTMS m/z 972.5969(MH+)，C60H86NO6Si2的計算值為972.5988。
大環內酯44e無色玻璃狀(47％)；TLC Rf＝0.31(矽膠，己烷∶EtOAc15∶1)；[α]D22-19(c 0.50，CHCl3)；IR(膜)νmax2929，2855，1741，1697，1472，1254，1102，1036，986，836，775cm-1；MALDI-FTMS m/z 774.4056(MNa+)，C39H69NO5S2Si2Na的計算值為774.4048。
Global脫甲矽烷基化反應(通用方法)將大環內酯溶於在CH2Cl2中的20％v/v TFA，將溶液於25℃放置3小時，之後不經加熱蒸發揮發物。將殘餘物溶於EtOAc中，該溶液用NaHCO3(飽和)洗滌、乾燥(Na2SO4)並蒸發。經快速色譜法(矽膠，己烷∶EtOAc混合物)得到純的埃坡黴素。
埃坡黴素6無色玻璃狀(73％)；TLC Rf＝0.25(矽膠，己烷∶EtOAc2∶1)；[α]D22-34(c 0.11，CH2Cl2)；IR(膜)νmax3472(br)，2931，1732，1684，1456，1378，1258，1179，1149，1067，1043，1012，973，873，732cm-1；MALDI-FTMS m/z 506.2931(MH+)，C28H44NO5S的計算值為506.2935。
埃坡黴素8無色玻璃狀(48％)；TLC Rf＝0.52(矽膠，己烷∶EtOAc1∶1)；[α]D22-54(c 0.30，CHCl3)；IR(膜)νmax3445(br)，2936，1732，1682，1454，1383，1259，756cm-1；MALDI-FTMS m/z 500.3369(MH+)，C30H46NO5的計算值為500.3376。
埃坡黴素10通用方法不能將MOM保護基團完全裂解。因此，該基團首先使用溴三甲基甲矽烷如下除去向被保護的埃坡黴素43d(11mg，14μmol)於無水CH2Cl2(0.4mL)中的溶液中加入粉末化的4MS(5mg)，並將所得混合物冷卻至-30℃。滴加溴三甲基甲矽烷(18.4μL，140μmol)，將混合物於-30℃攪拌1小時，之後用NaHCO3(飽和)終止反應，並用EtOAc萃取五次。合併萃取液、乾燥並蒸發，對殘餘物進行常規的脫甲矽烷基操作，得到無色玻璃狀的10(56％)；TLC Rf＝0.42(矽膠，己烷∶EtOAc 1∶4)；[α]D22-52(c 0.12，CH2Cl2)；IR(膜)νmax3401(br)，2931，1731，1684，1596，1561，1461，1378，1331，1290，1255，1173，1149，1044，1008，979，879，732cm-1；MALDI-FTMS m/z 516.3330(MH+)，C30H46NO6的計算值為516.3319。
埃坡黴素12粘稠油(17％，由41e得到)；TLC Rf＝0.38(矽膠，己烷∶EtOAc 2∶1)；[α]D22-52(c 0.50，CHCl3)；IR(膜)νmax3490(br)，2933，1732，1686，1255，1038，756cm-1；MALDI-FTMS m/z 538.2666(MH+)，C28H44NO5S2的計算值為538.2655。
埃坡黴素13無色玻璃狀(68％)；TLC Rf＝0.57(矽膠，己烷∶EtOAc1∶1)；[α]D22-46(c 0.34，CH2Cl2)；IR(膜)νmax3484(br)，2932，1731，1684，1469，1367，1255，1150，1044，1009，973，879，826，732cm-1；MALDI-FTMSm/z 554.2915(MNa+)，C30H45NO5Sna的計算值為554.2910。
埃坡黴素14無色玻璃狀(48％)；TLC Rf＝0.42(矽膠，己烷∶EtOAc2∶1)；[α]D22-38(c 0.34，CH2Cl2)；IR(膜)νmax3478(br)，2930，1732，1682，1556，1434，1378，1257，1149，1137，1067，1044，1012，979，785，732cm-1；MALDI-FTMS m/z 532.3078(MH+)，C30H45NO5S的計算值為532.3091。
埃坡黴素9無色玻璃狀(54％)；TLC Rf＝0.13(矽膠，己烷∶EtOAc1∶2)；[α]D22-24(c 0.14，CH2Cl2)；IR(膜)νmax3379，2920，2857，1725，1688，1600，1459，1370，1255，1151，1047，1010，979，880，734cm-1；MALDI-FTMSm/z 524.3004(MNa+)，C29H43NO6Na的計算值為524.2982。
埃坡黴素11無色玻璃狀(68％)；TLC Rf＝0.28(矽膠，己烷∶EtOAc2∶1)；[α]D22-26(c 0.30，CHCl3)；IR(膜)νmax3444(br)，2925，1731，1693，1454，1258，1037，756cm-1；MALDI-FTMS m/z 546.2330(MNa+)，C27H41NO5S2Na的計算值為546.2318。
化合物48Rf＝0.19(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝3/7)；[α]D20-19.3(c 0.14，CH2Cl2)；IR(膜)νmax3484(br)，2932，1729，1459，1375，1249，1043，982，733cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝6.97(s，1H)，6.47(s，1H)，5.25(dd，J＝5.7，7.1Hz，1H)，4.04(dd，J＝3.0，8.1Hz，1H)，3.91(dd，J＝4.1，4.1Hz，1H)，3.23(m，1H)，2.69(s，3H)，2.52(dd，J＝8.4，14.9Hz，1H)，2.46(dd，J＝2.6，14.9Hz，1H)，2.11(s，3H)，2.04(dd，J＝4.0，14.5Hz，1H)，1.66-1.72(m，1H)，1.44-1.62(m，4H)，1.36(s，3H)，1.22-1.35(m，2H)，1.17(d，J＝7.5Hz，3H)，1.16(s，3H)，1.04-1.15(m，1H)，0.99(d，J＝7.0Hz，3H)，0.97(s，3H)，0.48(m，1H)，0.40(dd，J＝3.9，8.8Hz，1H)，-0.11ppm(br t，J＝4.6Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝221.5，171.1，165.7，152.9，138.6，120.1，116.2，82.0，73.8，73.2，52.0，42.9，39.4，36.5，35.0，33.2，31.6，24.6，23.5，22.54，22.49，21.1，20.8，19.4，17.4，16.8，15.0，13.2ppm；MALDI-FTMSm/z538.2632(MH+)，C28H44NO5S2的計算值為538.2655。
化合物50Rf＝0.27(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-61(c 0.12，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 500.3376(MH+)，C30H46NO5的計算值為500.3370。
化合物51Rf＝0.37(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-44(c 0.14，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 554.2604(MH+)，C28H44NO6S2的計算值為554.2604。
化合物52Rf＝0.31(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-32(c 0.33，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 608.2334(MH+)，C28H41F3NO6S2的計算值為608.2322。
化合物53Rf＝0.38(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-43(c 0.12，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 568.2777(MH+)，C29H46NO6S2的計算值為568.2761。
化合物54Rf＝0.27(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-28(c 0.26，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 628.2376(MH+)，C31H43NO7S2Na的計算值為628.2373。
化合物55Rf＝0.24(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-49(c 0.45，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 566.2116(MH+)，C28H41BrNO6的計算值為566.2112。
化合物56Rf＝0.36(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-27(c 0.15，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 544.24 19(MH+)，C28H40ClNO6Na的計算值為544.2436。
化合物57Rf＝0.28(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-49(c 0.45，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 534.2907(MH+)，C29H44NO6S的計算值為534.2884。
化合物58Rf＝0.35(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-50(c 0.62，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 556.2724(MH+)，C29H43NO6SNa的計算值為556.2703。
化合物59Rf＝0.37(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-34(c 0.24，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 556.2891(MH+)，C29H41F3NO6的計算值為556.2880。
化合物60Rf＝0.34(矽膠，乙酸乙酯/己烷＝1/1)；[α]D20-33(c 0.80，CH2Cl2)；MALDI-FTMSm/z 535.2820(MH+)，C28H43N2O6S的計算值為535.2836。
實施例軟膠囊如下製備5000粒軟明膠膠囊，每粒膠囊含0.05g前述實施例中定義的式I化合物、例如實施例1、2、3或4的化合物之一作為活性成分組成活性成分 250gLauroglycol 2升製備方法將研細的活性成分懸浮於Lauroglycol(丙二醇月桂酸酯，GattefosséS.A.，Saint Priest，法國)中，並在溼粉碎器中研磨成粒徑為約1至3μm。然後通過膠囊填充機將每份含0.419g該混合物的部分填充入軟明膠膠囊中。
實施例輸液將實施例1、2、3或4的化合物以1mg/ml的濃度溶解於聚乙二醇300(PEG 300)中並填充入2ml小瓶。用於輸注時，將該溶液用50至100ml根據美國藥典的0.9％鹽水稀釋。
附圖詳述圖1顯示了所選擇的天然和設計的埃坡黴素的結構。灰色部分指本研究中合成的化合物。
圖2的圖表說明了於37℃時在微管結合位點(50nM)競爭性配體對螢光紫杉烷Flutax-2(50nM)的替換。圓點表示所獲得的數據點，描繪曲線以給出每種競爭性配體的結合平衡常數的最適值，假定對同一位點一對一結合。所測定的配體為紫杉醇(Taxol)(深藍色)、埃坡黴素A(1)(紅色)、埃坡黴素B(2)(紫色)、化合物3(黃色)、化合物4(淺棕色)和化合物8(綠色)。所選擇的埃坡黴素類似物(3、4和8)的代表性曲線在該圖中給出，用於舉例說明如何測定表3中每種化合物的親合性。
圖3顯示了通過Stille偶合來合成2-(甲硫基)噻唑埃坡黴素B(3)。試劑和條件Pd2(dba)3CHCl3(0.2當量)、CuI(2.0當量)、AsPh3(0.8當量)，DMF，25℃，80％。dba＝二苯亞甲基丙酮。
圖4顯示了反式-環丙基埃坡黴素B類似物(1-6、8、10和12-14)的反向合成分析。
圖5顯示了醛32的構建。試劑和條件(a)參見Nicolaou，K.C.等人，ChemBioChem 2001，2，69-75；Charette，A.B.等人，J.Am.Chem.Soc.1998，120，11943-11952；(b)NaH(1.5當量)、BnBr(1.5當量)，DMF，0→25℃，12小時；(c)O3，CH2Cl2∶MeOH 4∶1，-78℃，21分鐘；然後NaBH4(3.0當量)，-78℃→25℃，1小時，兩步，89％；(d)MsCl(1.3當量)，Et3N(1.5當量)，CH2Cl2，25℃，1小時；(e)NaI(3.0當量)，丙酮，回流，40分鐘，兩步，95％；(f)LDA(1.4當量)、25(1.3當量)，THF，0℃，6小時；然後24，-98℃→-10℃，14小時，84％；(g)MeI，60℃，3小時；(h)3N HCl∶戊烷1∶1，25℃，3小時，兩步，88％；(i)LDA(2.4當量)、19(2.3當量)，THF，-78℃，1小時；然後-40℃，0.5小時；然後17，於-78℃，5分鐘，81％；(j)TBSOTf(2.0當量)，2，6-二甲基吡啶(3.0當量)，CH2Cl2，-20℃，1小時；(k)HF·py，吡啶，THF，25℃，4小時，兩步，89％；(l)DMP(2.5當量)、NaHCO3(2.5當量)、H2O、CH2Cl2，25℃，1小時；(m)NaClO2(3.1當量)，NaH2PO4(2.1當量)，2-甲基-2-丁烯(74當量)，t-BuOH，THF，H2O，25℃，1小時；(n)2-(三甲基甲矽烷基)乙醇(4.0當量)、EDC(1.5當量)、4-DMAP(0.1當量)，DMF，25℃，14小時，3步，74％；(o)20％Pd(OH)2/C、H2(1atm)、EtOH∶EtOAc 1∶1，25℃，1小時；(p)DMP(2.5當量)、NaHCO3(2.5當量)、H2O、CH2Cl2，25℃，1小時，2步，84％；(q)MeOCH2PPh3Cl(3.0當量)、NaHMDS(2.8當量)，THF，-40℃→-10℃，2小時，84％；(r)PPTS(8.0當量)、二噁烷∶H2O 9∶1，70℃，6小時，82％。4-DMAP＝4-(二甲氨基)吡啶；DME＝1，2-二甲氧基-乙烷；DMP＝Dess-Martin periodinane；EDC＝1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；HF·py＝氟化氫吡啶配合物；NaHMDS＝六甲基二矽烷鈉；PPTS＝對-甲苯磺酸吡啶鎓；TMSE＝2-三甲基甲矽烷基乙基。
圖6顯示了乙烯基碘化合物20c-g的構建。試劑和條件(a)TrCl(1.4當量)、4-DMAP(1.7當量)，DMF，80℃，48小時，100％；(b)Pd(PPh3)2Cl2(0.01當量)、CuI(0.02當量)、HCéCCH3(1atm)，DMF，i-Pr2NEt，25℃，3小時，35∶96％；(c)(i)n-BuLi(4.0當量)、(n-Bu3Sn)2(4.0當量)、CuCN(2.0當量)、MeOH，THF，-10℃，12小時；(ii)I2(1.05當量)，CH2Cl2，0℃，5分鐘，20c∶80％，由35得到；20d∶67％，由36得到；20e∶37％，由37得到；20f∶97％，由38得到；20g∶58％，由39得到；(d)(i)HCl(g)，CHCl3，0℃，1小時，69％；(ii)MOMCl(1.2當量)、NaH(1.2當量)，THF，0℃，1小時，50％。TrCl＝三苯基甲基氯；4-DMAP＝4-(二甲氨基)吡啶；MOMCl＝氯甲基甲基醚。
圖7是埃坡黴素類似物8-14的合成。試劑和條件(a)CrCl2(10當量)、NiCl2(0.2當量)、4-叔丁基吡啶(30當量)、20(3.0當量)，DMSO，25℃，過夜；(b)TBAF(4.0當量)，THF，0℃，1小時，然後25℃，1小時；(c)Et3N(6.0當量)、2，4，6-三氯苯甲醯氯(2.4當量)、41或42，THF，0℃，1小時，然後4-DMAP(2.2當量)，甲苯，75℃，3小時；(d)20 v/v％TFA/CH2Cl2，25℃，3小時(除43d外)；(e)通過1H NMR測定；(f)43d的脫保護TMSBr(10當量)、4MS，CH2Cl2，-30℃，1小時，然後20v/v％TFA/CH2Cl2，25℃，3小時。TBAF＝四丁基氟化銨；4-DMAP＝4-(二甲氨基)吡啶；TFA＝三氟乙酸；TMSBr＝三甲基甲矽烷基溴；MS＝分子篩。
圖8所顯示的表公開了埃坡黴素1至14以及紫杉醇對抗用紫杉醇或埃坡黴素A所選擇的1A9人卵巢癌細胞和β-微管蛋白突變細胞系的細胞毒性。使用SRB(磺基羅丹明-B)分析法(Skehan，P.等人，J.Natl.Cancer Inst.1990，82，1107-1112)在72小時生長抑制分析中評價了測試化合物對親代1A9以及紫杉醇-和埃坡黴素-所選擇的耐藥克隆(分別為PTX10、PTX22和A8)的抗增殖效果。每種化合物的IC50值以nM給出，表示3-9次獨立實驗的平均值±平均值的標準誤差。相對抵抗力(RR)以每種耐藥亞系的IC50值除以親代細胞系(1A9)的IC50值計算。CP＝環丙基；py＝5-甲基吡啶側鏈；pyOH＝5-羥甲基吡啶側鏈；5tmpy＝5-甲硫基吡啶側鏈；6tmpy＝6-甲硫基吡啶側鏈；tmt＝2-甲硫基噻唑側鏈。
圖9所顯示的表公開了埃坡黴素1-8、10-14以及紫杉醇對人表皮樣癌細胞系的微管蛋白聚合效力和細胞毒性。(a)將4μm化合物產生的豬微管蛋白聚合(TP)程度相對於25μm埃坡黴素B的作用(定義為100％)如(Nicolaou，K.C.等人，Chem.Biol.2000，7，593-599)所述進行定量。(b)在暴露於藥物96小時後，通過使用所述的蛋白質染色法(Meyer，T.等人，Int.J.Cancer 1989，43，851-856)對細胞群定量以評價細胞生長最大抑制所需的藥物濃度(IC50值以nM給出)。KB-31表皮樣Taxol-敏感性細胞，KB-8511表皮樣耐Taxol-細胞(由於Pgp過表達所致)。相對抵抗力(RR)通過將耐藥細胞系的IC50值除以敏感性細胞系的IC50值計算。(c)來自於ref.3的數據(Taxol、Epo A和Epo B的％TP值分別為49、69和90)。CP＝環丙基；py＝5-甲基吡啶側鏈；pyOH＝5-羥甲基吡啶側鏈；5tmpy＝5-甲硫基吡啶側鏈；6tmpy＝6-甲硫基吡啶側鏈；tmt＝2-甲硫基噻唑側鏈。
圖10所顯示的表公開了埃坡黴素類似物對微管的紫杉烷結合位點的親和性。(a)通過從其結合位點替換螢光Taxol衍生物(Flutax-2)測定不同配體與微管的紫杉烷位點的結合(圖2)(Díaz，J.F.等人，J.Biol.Chem.2000，275，26265-26276)。按照前述報告中修改的方法(Andreu，J.M.；Barasoain，I.Biochemistry 2001，4，11975-11984)，使用螢光偏振微板讀數儀測定每種配體的Flutax-2替換等溫線，至少測定兩次。使用已經儲存在液氮中的交聯穩定化的微管。在每個溫度下，通過離心和螢光各向異性測定參比配體Flutax-2的結合常數(Díaz，J.F.等人，J.Biol.Chem.2000，275，26265-26276)。所得參比值於37℃時為2.2×107M-1。(b)解離平衡常數(Kd)以nM給出。(c)標準結合自由能變化(DG0app)以kJ mol-1給出。
圖11顯示了各個所設計的埃坡黴素A和B類似物的一系列結構以及埃坡黴素A和B的結構。該埃坡黴素庫的設計基於現有的構效關係(SAR)的知識，特別是基於下述事實埃坡黴素B(2)的效力比埃坡黴素A(1)強得多；在噻唑部分用甲硫基替換甲基可增強效力；以及用於替換噻唑側鏈的雜環如吡啶或嘧啶為了生物學活性需要維持氮的正確位置。
圖12的流程圖顯示了由乙烯基碘化合物15以及相應的芳族錫烷合成多種類似物的最後步驟。15與適宜錫烷的Stille-型偶合於環境溫度下、在DMP中的PdCl2(MeCN)2、CuI和AsPh3存在下進行，直接生成指定產率的類似物。試劑和條件a.PdCl2(MeCN)2(0.5當量)、CuI(2.0當量)、AsPh3(1.0當量)、64a-64d、66a-66d、67-68(2.5當量)，DMF，25℃，1-3小時，41-80％。
圖13的流程圖顯示了合成用於圖12的流程圖的錫烷所需的步驟。噻唑化合物(64a-64d)由商業購得的2，4-二溴噻唑(62)、通過將相應的硫醇與NaH在二溴噻唑存在下反應而合成。產物與Me3SnSnMe3在Pd(PPh3)4存在下、於100℃在甲苯中偶合，生成預期的產物64a-64d。試劑和條件a)NaH(3當量)、RSH(3當量)，i-PrOH，24小時，70-81％；b)(Me3Sn)2(5-10當量)、Pd(PPh3)4(5mol％)，甲苯，100℃，1-3小時，71-88％；c)n-BuLi(1.1當量)，乙醚，-78℃，1小時，然後n-Bu3SnCl(1.2當量)，-78℃至25℃，1小時，49-62％。
圖14的流程圖顯示了用於構建埃坡黴素B的環丙基類似物的骨架的合成路線。試劑和條件(a)Nicolaou，K.C.等人J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313和Jessie，S；Kjell，U.Tetrahedron 1994，50，275；(b)NaH(1.5當量)、BnBr(1.2當量)，DMF，0℃至室溫，12小時，100％；(c)O3，CH2Cl2∶MeOH(4∶1)，-78℃，然後NaBH4(3當量)，-78℃至室溫，1小時，83％；(d)MsCl(1.3當量)、Et3N(1.5當量)、DCM，室溫，1小時；(e)NaI(3當量)，丙酮，室溫，12小時，91％(兩步)；(f)LDA(1.4當量)、25(1.3當量)，THF，0℃，6小時，然後73，-98至-10℃，14小時，87％；(g)MeI，回流，3小時；(h)3N HCl∶戊烷(1∶1)，室溫，3小時，91％(兩步)；(i)LDA(2.4當量)、19(2.3當量)，THF∶乙醚(1∶1)，-78℃，1小時，然後-40℃，30分鐘，然後76，-78℃，5分鐘，80％；(j)TBSOTf(1.5當量)、2，6-二甲基吡啶(2當量)，DCM，-20℃，1小時；(k)HF·py、吡啶，THF，0℃，8小時，86％(兩步)；(l)(COCl)2(1.2當量)、DMSO(2.0當量)，DCM，-78℃，5分鐘，然後79(1當量)，20分鐘，然後Et3N(3當量)，-78℃至0℃；(m)NaClO2(5當量)，NaH2PO4(3當量)、2-甲基-2-丁烯(75當量)、t-BuOH，THF，H2O，室溫，1小時；(n)2-(三甲基甲矽烷基)乙醇(4當量)、EDC(1.5當量)、DMAP(0.1當量)，DMF，室溫，12小時，73％(三步)；(o)20％Pd(OH)2/C、H2、EtOH∶EtOAc(1∶1)，室溫，2小時，89％；(p)(COCl)2(1.2當量)、DMSO(2.0當量)、DCM，-78℃，5分鐘，然後81(1當量)，20分鐘，然後Et3N(3當量)，-78至0℃，99％；(q)MeOCH2PPh3Cl(3當量)、n-BuLi(2.8當量)，THF，0℃，1小時，然後82，-78至0℃，2小時，79％；(r)PPTS(10當量)，二噁烷∶水(9∶1)，70℃，12小時，81％。
圖15的流程圖顯示了用於合成環丙基類似物48和50的最終步驟。試劑和條件(a)CrCl2(10當量)、NiCl2(0.2當量)、4-t-BuPy(30當量)、84a或84b(3當量)，DMSO，25℃，24小時；(b)TBAF(2當量)，THF，室溫，2小時；(c)Et3N(6當量)、2，4，6-三氯苯甲醯氯(2.4當量)、85或88，THF，0℃，1小時，然後DMAP(2.2當量)，甲苯，75℃，3小時；(d)20％v/v TFA/CH2Cl2，室溫，3小時。
圖16的表顯示埃坡黴素48、50和51-60對用紫杉醇或埃坡黴素A所選擇的人癌細胞和β-微管蛋白突變細胞系的細胞毒性。使用SRB(磺基羅丹明-B)分析法(Skehan，P.等人，J.Natl.Cancer Inst.1990，82，1107-1112)在72小時生長抑制分析中評價了測試化合物對親代1A9以及紫杉醇-和埃坡黴素-所選擇的耐藥克隆(分別為PTX10、PTX22和A8)的抗增殖作用。每種化合物的IC50值以nM給出，表示3次獨立實驗的平均值±平均值的標準誤差。相對抵抗力(RR)以每種耐藥亞系的IC50值除以親代細胞系(1A9)的IC50值來計算。化合物3的結果取自Nicolaou，K.C.等人，Tetrahedron2002，58，6413-6432。
圖17的表顯示所選擇的埃坡黴素對人表皮樣細胞系KB-3和KB-8511的細胞毒性(IC50，nM)。測試化合物的抗增殖作用在兩種人表皮樣癌細胞系中進行了評價，包括親代細胞系(KB-31)和耐TaxolTM的(由於Pgp-過表達)細胞系(KB-8511)。Epo B和3的結果取自Nicolaou，K.C.等人，Tetrahedron 2002，58，6413-6432。
權利要求
1.式(I)化合物，或者當有成鹽基團存在時式I化合物的鹽 其中當式I化合物為順式-異構體時，X為氧或CH2，當式I化合物為反式-異構體時，X為CH2；當式I化合物為順式-異構體且X為氧時，則R1為甲基且R為選自下組的基團 其中R2為選自-Me、-Cl、-Br、-SMe和-CF3的基團；當式I化合物為順式異構體且X為CH2時，則R1為甲基且R為選自下組的基團 其中R2為選自-Me、-Cl、-Br、-SMe和-CF3的基團；當式I化合物為反式異構體且X為CH2時，則R1為甲基或氫；其中，當R1為甲基時，R為選自下組的基團 且當R1為氫時，R為選自下組的基團
2.根據權利要求1的化合物，其由式II表示 其中，R為選自下述結構的基團
3.根據權利要求2的化合物，其由下式表示
4.根據權利要求2的化合物，其由下式表示
5.根據權利要求2的化合物，其由下式表示
6.根據權利要求2的化合物，其由下式表示
7.根據權利要求2的化合物，其由下式表示
8.根據權利要求2的化合物，其由下式表示
9.由下式表示的化合物 其中R為選自下述結構的基團
10.根據權利要求9的化合物，其由下式表示
11.根據權利要求9的化合物，其由下式表示
12.根據權利要求1的化合物，其由下式表示
13.根據權利要求1的化合物，其由下式表示
14.根據權利要求1的化合物，其由式IV表示 其中R為選自下述結構所表示基團的基團
15.根據權利要求14的化合物，其由以下結構表示
16.根據權利要求14的化合物，其由以下結構表示
17.根據權利要求14的化合物，其由以下結構表示
18.根據權利要求14的化合物，其由以下結構表示
19.根據權利要求14的化合物，其由以下結構表示
20.根據權利要求1的化合物，其由以式V表示 其中R為選自-Me、-Cl、-Br、-SMe和-CF3的基團。
21.根據權利要求20的化合物，其由以下結構表示
22.根據權利要求20的化合物，其由以下結構表示
23.根據權利要求20的化合物，其由以下結構表示
24.根據權利要求20的化合物，其由以下結構表示
25.根據權利要求20的化合物，其由以下結構表示
26.根據權利要求1的化合物，其由以下結構表示
27.根據權利要求1的化合物，其由以下結構表示
28.用於治療哺乳動物中增殖性疾病、含有治療劑量的任意一種或多種權利要求1-27的化合物以及可藥用載體的藥物組合物。
29.根據權利要求28的藥物組合物，其中所述哺乳動物為人。
30.藥物組合物，該組合物含有可藥用載體或稀釋劑以及根據權利要求1-27中任一項的化合物或者如果可能的話其可藥用酸或鹼加成鹽。
31.根據權利要求1至27中任一項的化合物在製備用於治療增殖性疾病的藥物中的用途。
32.用於治療人或動物體的方法中使用的根據權利要求1至27中任一項的化合物。
33.治療增殖性疾病的方法，該方法包括向需要該治療的哺乳動物施用治療有效量的根據權利要求1至27中任一項的化合物或者如果可能的話其可藥用酸或鹼加成鹽。
34.製備根據權利要求1至27中任一項的化合物的方法，其中，在第一步中將式IV化合物在任選存在催化劑的條件下通過酯化反應而縮合， 其中X和R具有權利要求1至27中所定義的任一含義且PG為羥基官能團的保護基，和在第二步中脫去保護基，由此得到式I的內酯。
全文摘要
本發明涉及其中符號和取代基如說明書中定義的式(I)的埃坡黴素衍生物，還涉及其製備方法、含有該衍生物的藥物組合物以及該衍生物在製備尤其用於治療增殖性疾病如腫瘤的藥物組合物中的用途。
文檔編號A61K31/4433GK1675220SQ03818644
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月1日 優先權日2002年8月2日
發明者名原健二, K·C·尼科拉烏, A·裡森 申請人:諾瓦提斯公司, 斯克裡普斯研究所