超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷及其提取和測定方法
2023-12-03 18:33:06 3
超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷及其提取和測定方法
【專利摘要】本發明超聲-微波協同提取山茱萸環烯醚萜苷的方法包括如下步驟，1)得到山茱萸粗粉；2)將山茱萸粗粉按料液比為1:5～1:25的比例加入體積分數為80％的甲醇溶液並密封，稱定重量，連接好冷凝裝置，在微波功率300～700W，超聲功率120～600W的條件下提取3～15min得到提取液；3)將提取液抽濾後得到濾液，經定容過濾濃縮乾燥純化後得到本發明提供的山茱萸環烯醚萜苷。山茱萸環烯醚萜苷測定方法包括如下步驟，a.混合對照品溶液的製備；b.供試品溶液的製備，c.採用HPLC-UV法測定混合對照品及供試品中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量；d.根據液相色譜分析結果計算分別得到4種苷的含量。
【專利說明】超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷及其提取和測定 方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於山茱萸環烯醚萜苷的提取和測定領域，具體為超聲-微波協同提取的 山茱萸環烯醚萜苷及其提取和測定方法。
【背景技術】
[0002] 山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)為山茱萸科植物山茱萸的乾燥成熟 果肉，其味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經，具有補益肝腎、澀精固脫之功效，主治眩暈耳鳴、腰膝 酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內熱消渴。主產於我國陝西、浙江和河南等 省，四川、安徽、山東、山西等地亦有栽培。山茱萸是常用中成藥"六、八味地黃丸"、"杞菊地 黃丸"等的原料，為我國傳統名貴中藥材，是國家40種用量較大的重點藥材之一。近年來， 國內外學者對山茱萸的多種有效成分進行了研究，從中分離得到環烯醚萜苷類、總多糖、鞣 質和皂苷等多種活性成分，莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷為環烯醚萜苷類物質中 的主要成分，具有抗腫瘤、降血糖、保肝和調節免疫等藥理作用。因此，山茱萸環烯醚萜苷的 開發及利用對人體的功能保健具有重要意義。
[0003] 山茱萸環烯醚萜苷的提取方法主要為索式提取、加熱回流提取、超聲輔助提取、微 波輔助提取、索式提取和加熱回流提取這兩種傳統方法均具有提取時間長，提取率低，提取 物結構易被破壞等缺點。而環烯醚萜苷類成分性質大多不穩定，遇酸、高溫等易分解，而索 式提取和加熱回流提取法正是利用高溫冷凝回流使原料成分析出，而單純的超聲輔助提取 可以利用超聲波產生強烈的振動、空化和攪拌等作用，加速物質的溶解度和運動速度，但是 提取時間相對較長；微波輔助提取法具有選擇性高、提取時間短等優點，但其受熱不均勻。
[0004] 現有技術中，不僅對山茱萸環烯醚萜苷的提取方法不能滿足要求，而且不能對提 取後得到產物中的有效物質的含量進行快速有效的同時分離和測定，測定山茱萸多種有效 成分的HPLC色譜方法具有色譜峰分離度低，且各色譜峰沒有完全達到基線分離。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種操作簡單，耗時短，提取效率高，檢 測準確，重現性好的超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷及其提取和測定方法。
[0006] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0007] 本發明超聲-微波協同提取山茱萸環烯醚萜苷的方法，包括如下步驟，
[0008] (1)將新鮮成熟的山茱萸果實在開水中浸泡數分鐘後，流水衝洗冷卻，剝除果核； 將剩餘的果肉乾燥後粉碎，過40目篩，得到山茱萸粗粉；
[0009] (2)稱取一定量的山茱萸粗粉，置於反應容器中，按料液比為1:5?1:25的比例 加入體積分數為80%的甲醇溶液並密封，稱定重量，連接好冷凝裝置，在微波功率300? 700W，超聲功率120?600W的條件下提取3?15min得到提取液；
[0010] (3)將提取液抽濾後得到濾液，將濾液用80%的甲醇溶液補充至稱定的重量，搖 勻過0. 22 μ m微孔濾膜，濃縮乾燥，再經純化後得到山茱萸環烯醚萜苷。
[0011] 優選的，步驟2)中，1:15?1:25的比例加入體積分數為80%的甲醇溶液並密封， 稱定重量，連接好冷凝裝置，在微波功率500?700W，超聲功率240?480W的條件下提取 6?12min得到提取液。
[0012] 優選的，步驟2)中，1:21的比例加入體積分數為80%的甲醇溶液並密封，稱定重 量，連接好冷凝裝置，在微波功率641W，超聲功率360W的條件下提取9min得到提取液。
[0013] 進一步的，料液比1:21，微波功率為641W，超聲功率為360W和時間9min的提取條 件由響應面法優化得到，步驟如下；
[0014] 1)製備山茱萸環烯醚萜苷樣品液；精密稱取山茱萸粗粉l.OOg，置於反應瓶中， 加入80%甲醇溶液密封，稱定重量，連接好回流裝置，超聲微波組合反應系統中提取，抽 濾，所得濾液再用80%甲醇溶液補至原重量，搖勻，過0.22 μ m微孔濾膜，得到山茱萸環 烯醚萜苷樣品液備用；分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷對照品1.00、 0. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，用色譜甲醇溶解並定容，0. 22 μ m微孔濾膜過濾即得 1. 00mg/mL莫諾苷、0· 50mg/mL馬錢苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱萸新苷混合對 照品溶液；繪製標準曲線得線性回歸方程，並根據線性回歸方程計算出山茱萸樣品液中環 烯醚萜苷的含量；
[0015] 2)單因素實驗；根據步驟1)中山茱萸環烯醚萜苷樣品液的製備方法，分別按料液 t匕、超聲功率、微波功率和提取時間四個單因素設計若干組單因素實驗；
[0016] 3)響應面法優化；以山茱萸環烯醚廠苷提取率為響應因子，採用Design-Expert 軟體中的Box-Behnken原理在步驟2)中單因素實驗的基礎上進行響應面實驗，模擬得到二 次多元回歸方程如下：
[0017] R1 = 26. 25+0. 49A-0. 098B+1. 42C-0. 080D+0. 21AB+0. 65AC+0. 88AD-0. 29BC+0. 54 BD-0. 22CD-0. 91A2-1. 02B2-2. 89C2
[0018] 其中，R1為相應因子，A為微波功率的影響量，B為超聲功率的影響量，C為料液比 的影響量，D為時間的影響量；
[0019] 4)通過Design-Expert軟體對回歸方程的求解，得到山茱萸環烯醚廠苷提取的最 佳條件為：料液比1:21. 45、微波功率640. 57W、超聲功率356. 59W、時間9. 22min ;再以實際 操作為約束條件，將修正得到最佳提取工藝參數為：料液比1:21、微波功率641W、超聲功率 360W、時間 9min。
[0020] 本發明超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷，由所述的任意一種所述的提 取方法製得。
[0021] 再進一步，山茱萸環烯醚萜苷至少包括莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四 種物質。
[0022] 本發明超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷的測定方法，對再進一步中所述 的山茱萸環烯醚萜苷進行測定，包括如下步驟，
[0023] a.混合對照品溶液的製備；分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷 對照品1. 〇〇、〇. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，加色譜甲醇溶解並定容，0. 22μπι微孔濾 膜過濾即得1. 〇〇mg/mL莫諾苷、0· 50mg/mL馬錢苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱 萸新苷混合對照品溶液；
[0024] b.供試品溶液的製備，精密稱取過40目篩的山茱萸粉末1. 00g，置於X0-200型專 用玻璃反應瓶中，加入80%甲醇溶液2lmL密封，稱定重量，連接好回流裝置，於X0-200超 聲微波組合反應系統中提取9min，取出，抽濾，所得濾液再用80%甲醇溶液補至原重量，搖 勻，過0. 22 μ m微孔濾膜作供試液；
[0025] c.測定法；採用HPLC-UV法測定混合對照品及供試品中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷 和山茱萸新苷的含量；具體如下，
[0026] 色譜條件：色譜柱：採用JADE-PAK 0DS-AQ色譜柱為C18柱；柱溫：35°C ;檢測波 長：240nm ;梯度洗脫條件：乙腈-0. 2%乙酸水溶液梯度洗脫，A為0. 2%乙酸水，B為乙腈； 流速：L 〇mL/min ;進樣量：10 μ L ;
[0027] 以體積百分比計算，梯度洗脫階段如下，
[0028] 0?15min，A從90%線性下降至80%，Β從10%線性增加至20% ;
[0029] 15?19min，Α從80%線性下降至78%，Β從20%線性增加至22% ;
[0030] 19?25min，A從78%線性下降至75%，B從22%線性增加至25% ;
[0031] 25?35min，A從75%線性下降至73%，B從25%線性增加至27% ;
[0032] 35?50min，A從73%線性下降至0%，B從27%線性增加至100%，
[0033] 50 ?55min，為 100% B 等度洗脫；
[0034] d.根據液相色譜分析結果計算分別得到山茱萸藥材中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷 和山茱萸新苷的含量。
[0035] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0036] 本發明所述提取方法通過將超聲振動與脈衝式微波兩種作用方式結合，利用微波 的高能作用與超聲波的空化作用，實現對樣品快速、高效、可靠地處理，是一種新型的提取 技術；其微波快速加熱和超聲波空化作用使樣品獲得足夠的熱轉移和乳化特性，進而加速 了分子的熱運動速度和相互碰撞作用，具有提取時間短、提取率高、提取物結構未被破壞等 優點；能夠提高樣品的提取率，縮短樣品的製備時間，從而達到降低生產成本的目的。
[0037] 進一步的，由於中藥提取過程中常常受到諸多因素的影響，響應面法和超聲-微 波協同提取方法的有機結合不僅可以精確地找出整個區域上因素的最佳組合，而且可以確 定在試驗範圍內的任何試驗點的預測值，通過將響應面分析法用於工藝條件的優化，精確 的表達因素和響應值之間的關係，同時可根據數學模型控制響應值，選擇不同的操作參數， 得到最佳工藝參數。相比現有的正交設計、索式提取、回流提取和單獨的超聲波輔助提取或 微波輔助提取法，採用響應面法優化的超聲-微波提取工藝更為精準，能夠更好的將山茱 萸環烯醚萜苷的提取用於工業化生產；比索式提取法提高了 36. 13%，超聲輔助提取法提 高了 28.00%，比微波輔助提取法提高了 10. 22%。
[0038] 本發明所述測定方法，採用高效液相紫外檢測法，結合0. 2%乙酸水溶液-乙腈流 動相梯度洗脫，實現同時測定山茱萸中4種環烯醚萜苷的含量。本發明所建立的色譜方法 能夠較好地分離和測定山茱萸中4種環烯醚萜苷的含量，其色譜峰峰形好，分離度高，能夠 準確地測定山茱萸藥材中4種環烯醚萜苷的含量。本方法操作簡單，精密度、重現性和穩定 性良好，可為山茱萸環烯醚萜苷的分離純化和質量標準控制提供科學依據，並且能夠通過 HPLC法同時對山茱萸中4種環烯醚萜苷含量的測定，更好的優化最佳的超聲-微波協同提 取工藝，從而為山茱萸環烯醚萜苷的藥理作用及生產實踐方面的應用提供基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039] 圖1 :料液比對山茱萸環烯醚萜苷含量的影響示意圖。
[0040] 圖2 :提取時間對山茱萸環烯醚萜苷含量的影響示意圖。
[0041] 圖3 :超聲功率對山茱萸環烯醚萜苷含量的影響示意圖。
[0042] 圖4 :微波功率對山茱萸環烯醚萜苷含量的影響示意圖。
[0043] 圖5 :超聲功率和微波功率對山茱萸環烯醚萜苷含量影響示意圖，5a為響應面圖， 5b為等高線圖。
[0044] 圖6 :料液比和微波功率對山茱萸環烯醚萜苷含量影響示意圖，6a為響應面圖，6b 為等1?線圖。
[0045] 圖7 :提取時間和微波功率對山茱萸環烯醚萜苷含量影響示意圖，7a為響應面圖， 7b為等高線圖。
[0046] 圖8 :料液比和超聲功率對山茱萸環烯醚萜苷含量影響示意圖，8a為響應面圖，8b 為等1?線圖。
[0047] 圖9 :提取時間和超聲功率對山茱萸環烯醚萜苷含量影響示意圖，9a為響應面圖， 9b為等1?線圖。
[0048] 圖10 :提取時間和料液比對山茱萸環烯醚萜苷含量影響示意圖，10a為響應面圖， l〇b為等高線圖。
[0049] 圖11 :對照品圖色譜圖，其中：1_莫諾苷，2-馬錢苷，3-獐芽菜苷，4-山茱萸新苷。
【具體實施方式】 [0050]
[0051] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。
[0052] 本發明超聲-微波協同提取山茱萸環烯醚萜苷的方法，包括如下步驟，1)將新鮮 成熟的山茱萸果實在開水中浸泡數分鐘後，流水衝洗冷卻，剝除果核；將剩餘的果肉乾燥後 粉碎，過40目篩，得到山茱萸粗粉；
[0053] 2)稱取一定量的山茱萸粗粉，置於反應容器中，按料液比為1:5?1:25的比例 加入體積分數為80%的甲醇溶液並密封，稱定重量，連接好冷凝裝置，在微波功率300? 700W，超聲功率120?600W的條件下提取3?15min得到提取液；3)將提取液抽濾後得到 濾液，將濾液用80 %的甲醇溶液補充至稱定的重量，搖勻過0. 22 μ m微孔濾膜，濃縮乾燥， 再經純化後得到山茱萸環烯醚萜苷。
[0054] 本優選實施例中還能夠在步驟2)中，以1:15?1:25的比例加入體積分數為80% 的甲醇溶液並密封，稱定重量，連接好冷凝裝置，在微波功率500?700W，超聲功率240? 480W的條件下提取6?12min得到提取液。除了以上所述的兩個範圍的端點值外，具體的 以，1:21的比例加入體積分數為80 %的甲醇溶液並密封，稱定重量，連接好冷凝裝置，在微 波功率641W，超聲功率360W的條件下提取9min得到提取液為例，以其中的點值進行說明， 同時還能夠取到限定範圍內的其他值。
[0055] 其中，料液比1:21，微波功率為641W，超聲功率為360W和時間9min的提取條件由 響應面法優化得到，步驟如下；
[0056] 1)製備山茱萸環烯醚萜苷樣品液；精密稱取山茱萸粗粉l.OOg，置於反應瓶中， 加入80%甲醇溶液密封，稱定重量，連接好回流裝置，超聲微波組合反應系統中提取，抽 濾，所得濾液再用80 %甲醇溶液補至原重量，搖勻，過0. 22 μ m微孔濾膜，得到山茱萸環 烯醚萜苷樣品液備用；分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷對照品1.00、 0. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，用色譜甲醇溶解並定容，0. 22μπι微孔濾膜過濾即得 1. 00mg/mL莫諾苷、0· 50mg/mL馬錢苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱萸新苷混合對 照品溶液；繪製標準曲線得線性回歸方程，並根據線性回歸方程計算出山茱萸樣品液中環 烯醚萜苷的含量；
[0057] 2)單因素實驗；根據步驟1)中山茱萸環烯醚萜苷樣品液的製備方法，分別按料液 t匕、超聲功率、微波功率和提取時間四個單因素設計若干組單因素實驗；
[0058] 3)響應面法優化；以山茱萸環烯醚廠苷提取率為響應因子，採用Design-Expert 軟體中的Box-Behnken原理在步驟2)中單因素實驗的基礎上進行響應面實驗，模擬得到二 次多元回歸方程如下：
[0059] R1 = 26. 25+0. 49A-0. 098B+1. 42C-0. 080D+0. 21AB+0. 65AC+0. 88AD-0. 29BC+0. 54 BD-0. 22CD-0. 91A2-1. 02B2-2. 89C2
[0060] 其中，R1為相應因子，A為微波功率的影響量，B為超聲功率的影響量，C為料液比 的影響量，D為時間的影響量；
[0061] 4)通過Design-Expert軟體對回歸方程的求解，得到山茱萸環烯醚廠苷提取的最 佳條件為：料液比1:21. 45、微波功率640. 57W、超聲功率356. 59W、時間9. 22min ;再以實際 操作為約束條件，將修正得到最佳提取工藝參數為：料液比1:21、微波功率641W、超聲功率 360W、時間 9min。
[0062] 本發明中所述的超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷，由以上所述的提取方 法製得。優選的山茱萸環烯醚萜苷至少包括莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四種物 質。
[0063] 本發明超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷的測定方法，對至少包括莫諾 苷、馬錢苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四種物質的山茱萸環烯醚萜苷進行測定，包括如下步 驟，
[0064] a.混合對照品溶液的製備；分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、山茱萸新 苷對照品1. 〇〇、〇. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，加色譜甲醇溶解並定容，0. 22μπι微孔 濾膜過濾即得1. 00mg/mL莫諾苷、0. 50mg/mL馬錢苷、0. 10mg/mL猜芽菜苷和0. 20mg/mL山 茱萸新苷混合對照品溶液；
[0065] b.供試品溶液的製備，精密稱取過40目篩的山茱萸粉末1. 00g，置於X0-200型專 用玻璃反應瓶中，加入80 %甲醇溶液2lmL密封，稱定重量，連接好回流裝置，於X0-200超 聲微波組合反應系統中提取9min，取出，抽濾，所得濾液再用80%甲醇溶液補至原重量，搖 勻，過0. 22 μ m微孔濾膜作供試液；
[0066] c.測定法；採用HPLC-UV法測定混合對照品及供試品中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷 和山茱萸新苷的含量；具體如下，
[0067] 色譜條件：色譜柱：採用JADE-PAK 0DS-AQ色譜柱為C18柱；柱溫：35°C ;檢測波 長：240nm ;梯度洗脫條件：乙腈-0. 2%乙酸水溶液梯度洗脫，A為0. 2%乙酸水，B為乙腈； 流速：L 〇mL/min ;進樣量：10 μ L ;
[0068] 以體積百分比計算，梯度洗脫階段如下，
[0069] 0?15min，A從90%線性下降至80%，B從10%線性增加至20% ;
[0070] 15?19min，A從80%線性下降至78%，B從20%線性增加至22% ;
[0071] 19?25min，A從78%線性下降至75%，B從22%線性增加至25% ;
[0072] 25?35min，A從75%線性下降至73%，B從25%線性增加至27% ;
[0073] 35?50min，A從73%線性下降至0%，B從27%線性增加至100%，
[0074] 50 ?55min，為 100% B 等度洗脫；
[0075] d.根據液相色譜分析結果計算分別得到山茱萸藥材中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷 和山茱萸新苷的含量。
[0076] 為了確定本發明的最佳原料配比和最佳工藝步驟，發明人進行了大量的實驗室研 究試驗，具體的試驗情況如下。
[0077] 儀器與試藥
[0078] 儀器：LC-2010A HT型高效液相色譜儀（日本SHIMADZU)，超純水儀（美國 Millipore公司），精密微量移液器（德國Eppendorf公司），Centrifuge5804R冷凍臺式離 心機（德國Eppendorf公司），FA2004N型電子分析天平（上海天平儀器總廠），X0-200微 波超聲波組合反應系統（南京先歐儀器製造有限公司），DFT-50手提式粉碎機（溫嶺市林 大機械有限公司），RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），SHB-HIA型循環水式多 用真空泵（陝西太康生物科技有限公司）。
[0079] 試劑：馬錢苷（成都曼斯特生物，批號：MUST-12052813,純度：> 98% );猜牙菜苷 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號：130311 :純度：彡98% );莫諾苷（天津一方生物 科技有限公司，批號：MUST-13070102,純度：彡98% );山茱萸新苷（成都普菲德生物技術 有限公司，批號：121015,純度：彡98% )甲醇為分析純（河北天力試劑有限公司）；乙腈， 冰乙酸均為色譜醇（美國Fisher公司）；水為超純水。
[0080] 藥材：山茱萸於2011年10月至11月採集於河南西峽，經陝西師範大學肖婭萍教 授鑑定為山茱萸科山茱萸（Cornus officinalis Sieb.Et Zucc.)的乾燥成熟果肉，50°C烘 幹，粉碎後過40目篩，備用。
[0081] 方法與結果
[0082] 混合對照品溶液的製備：分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷對 照品1. 00、0. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，加色譜甲醇溶解並定容，0. 22μπι微孔濾膜 過濾即得1. 〇〇mg/mL莫諾苷、0· 50mg/mL馬錢苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱萸 新苷混合對照品溶液。
[0083] 供試品溶液的製備：精密稱取過40目篩的山茱萸粉末1. 00g，置於X0-200型專用 玻璃反應瓶中，加入80 %甲醇溶液2lmL密封，稱定重量，連接好回流裝置，於X0-200超聲微 波組合反應系統中提取9min，取出，抽濾，所得濾液再用80%甲醇溶液補至原重量，搖勻， 過0. 22 μ m微孔濾膜作供試液。
[0084] 色譜條件
[0085] 色譜柱：JADE-PAK 0DS-AQ C18 極性色譜柱（250mmX 4. 6mm，5 μ m)，柱溫：35°C，流 速：1. OmL/min，檢測波長：240nm，進樣量：10 μ L。流動相：A為0. 2%乙酸水，B為乙腈；梯度 洗脫條件：〇 ?15min，10%?20% B ;15 ?19min，20%?22% B ;19 ?25min，22%?25% B ;25 ?35min，25%?27% B ;35 ?50min，27%?100% B ;50 ?55min，100% B 等度洗脫。 山茱萸對照品色譜圖見圖11。
[0086] 方法學考察
[0087] 線性關係考察
[0088] 依次進已配製的莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷和莫諾苷混合對照品溶液1、4、10、 14、18 μ L，於240nm波長下檢測各物質的峰面積，以峰面積值為縱坐標，各對照品含量為橫 坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果詳見表1。
[0089] 表1線性關係試驗結果（η = 3)
[0090] Table 1 Linear relation between peak area and concentration, n = 3
[0091]
【權利要求】
1. 超聲-微波協同提取山茱萸環烯醚萜苷的方法，其特徵在於，包括如下步驟， (1) 將新鮮成熟的山茱萸果實在開水中浸泡數分鐘後，流水衝洗冷卻，剝除果核；將剩 餘的果肉乾燥後粉碎，過40目篩，得到山茱萸粗粉； (2) 稱取一定量的山茱萸粗粉，置於反應容器中，按料液比為1:5?1:25的比例加入體 積分數為80 %的甲醇溶液並密封，稱定重量，連接好冷凝裝置，在微波功率300?700W，超 聲功率120?600W的條件下提取3?15min得到提取液； (3) 將提取液抽濾後得到濾液，將濾液用80%的甲醇溶液補充至稱定的重量，搖勻過 0. 22 μ m微孔濾膜，濃縮乾燥，再經純化後得到山茱萸環烯醚萜苷。
2. 根據權利要求1所述的超聲-微波協同提取山茱萸環烯醚萜苷的方法，其特徵在 於：所述的步驟（2)中，1:15?1:25的比例加入體積分數為80%的甲醇溶液並密封，稱定 重量，連接好冷凝裝置，在微波功率500?700W，超聲功率240?480W的條件下提取6? 12min得到提取液。
3. 根據權利要求1所述的超聲-微波協同提取山茱萸環烯醚萜苷的方法，其特徵在於： 所述的步驟（2)中，1:21的比例加入體積分數為80%的甲醇溶液並密封，稱定重量，連接好 冷凝裝置，在微波功率641W，超聲功率360W的條件下提取9min得到提取液。
4. 根據權利要求3所述的超聲-微波協同提取山茱萸環烯醚萜苷的方法，其特徵在於： 所述的料液比1:21，微波功率為641W，超聲功率為360W和時間9min的提取條件由響應面 法優化得到，步驟如下； 1) 製備山茱萸環烯醚萜苷樣品液； 精密稱取山茱萸粗粉1. 〇〇g，置於反應瓶中，加入80%甲醇溶液密封，稱定重量，連接 好回流裝置，在超聲-微波協同作用下中提取，抽濾，所得濾液再用80%甲醇溶液補至原重 量，搖勻，過0. 22 μ m微孔濾膜，得到山茱萸環烯醚萜苷樣品液備用；分別精密稱取莫諾苷、 馬錢苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷對照品l.〇〇、〇. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，用色譜甲 醇溶解並定容，〇. 22 μ m微孔濾膜過濾即得1. 00mg/mL莫諾苷、0. 50mg/mL馬錢苷、0. 10mg/ mL獐芽菜苷和0. 20mg/mL山茱萸新苷混合對照品溶液；繪製標準曲線得線性回歸方程，並 根據線性回歸方程計算出山茱萸樣品液中環烯醚萜苷的含量； 2) 單因素實驗；根據步驟1)中山茱萸環烯醚萜苷樣品液的製備方法，分別按料液比、 超聲功率、微波功率和提取時間四個單因素設計若干組單因素實驗； 3) 響應面法優化；以山茱萸環烯醚廠苷提取率為響應因子，採用Design-Expert軟體 中的Box-Behnken原理在步驟2)中單因素實驗的基礎上進行響應面實驗，模擬得到二次多 元回歸方程如下： R1 = 26. 25+0. 49A-0. 098B+1. 42C-0. 080D+0. 21AB+0. 65AC+0. 88AD-0. 29BC+0. 54BD-0 .22CD-0. 91A2-1. 02B2-2. 89C2 其中，R1為相應因子，A為微波功率的影響量，B為超聲功率的影響量，C為料液比的影 響量，D為時間的影響量； 4) 通過Design-Expert軟體對回歸方程的求解，得到山茱萸環烯醚廠苷提取的最佳 條件為：料液比1:21.45、微波功率640.571、超聲功率356.591、時間9.2211^11 ;再以實際 操作為約束條件，將修正得到最佳提取工藝參數為：料液比1:21、微波功率641W、超聲功率 360W、時間 9min。
5. 超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷，其特徵在於，所述的山茱萸環烯醚萜苷 由權利要求1-4中任意一項所述的提取方法製得。
6. 根據權利要求5所述的超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷，其特徵在於，至少 包括莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四種物質。
7. 超聲-微波協同提取的山茱萸環烯醚萜苷的測定方法，其特徵在於，對權利要求6所 述的山茱萸環烯醚萜苷進行測定，包括如下步驟， a. 混合對照品溶液的製備；分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷對照 品1. 00、0. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，加色譜甲醇溶解並定容，0. 22μπι微孔濾膜過 濾即得1. 〇〇mg/mL莫諾苷、0· 50mg/mL馬錢苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱萸新 苷混合對照品溶液； b. 供試品溶液的製備，精密稱取過40目篩的山茱萸粗粉l.OOg，置於X0-200型專用玻 璃反應瓶中，加入80 %甲醇溶液2lmL密封，稱定重量，連接好回流裝置，於X0-200超聲微波 組合反應系統中提取9min，取出，抽濾，所得濾液再用80%甲醇溶液補至原重量，搖勻，過 0. 22 μ m微孔濾膜作供試液； c. 測定法；採用HPLC-UV法測定混合對照品及供試品中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷和山 茱萸新苷的含量；具體如下， 色譜條件：色譜柱：採用JADE-PAK 0DS-AQ色譜柱為C18柱；柱溫：35°C ; 檢測波長：240nm ; 梯度洗脫條件：乙腈-〇. 2%乙酸水溶液梯度洗脫，A為0. 2%乙酸水，B為乙腈；流速： 1. OmL/min ;進樣量：10 μ L ; 以體積百分比計算，梯度洗脫階段如下， 0?15min，Α從90%線性下降至80%，Β從10%線性增加至20% ; 15?19min，A從80%線性下降至78%，B從20%線性增加至22% ; 19?25min，A從78%線性下降至75%，B從22%線性增加至25% ; 25?35min，A從75%線性下降至73%，B從25%線性增加至27% ; 35?50min，A從73%線性下降至0%，B從27%線性增加至100%， 50?55min，為100% B等度洗脫； d. 根據液相色譜分析結果計算分別得到山茱萸藥材中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷和山 茱萸新苷的含量。
【文檔編號】G01N30/36GK104147079SQ201410325551
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月9日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】康傑芳, 楊寧, 王紅菊, 王韶君, 白嫄, 王喆之 申請人:陝西師範大學