一種D‑二聚體免疫螢光定量試紙條及其製備方法與流程
2023-12-05 22:43:11 1
本發明涉及免疫學檢測領域，更具體地涉及一種D-二聚體免疫螢光定量試紙條及其製備方法。
背景技術：
D-二聚體是血液中的纖維蛋白原受凝血酶等作用而凝固形成的聚合物，是交聯纖維蛋白的特異性降解產物。在正常生理狀態下，機體保持著凝血與纖溶動態平衡，以保證纖維蛋白及時形成和清除。當這一平衡遭到破壞，血管內凝血傾向增強，纖維蛋白聚集，纖維蛋白降解產物增加，D-二聚體含量增加。因此，D-二聚體水平的升高反映體內凝血和纖溶系統的雙重激活，可作為體內高凝狀態和纖溶亢進的分子標誌物之一，用於多種疾病的病程檢測，如深靜脈血栓、瀰漫性血管內凝血、心肌梗死、重症肝炎、肺栓塞等。
目前，D-二聚體檢測方法主要有：乳膠凝集法、酶聯免疫法、螢光抗體檢測法、金標法和膠乳免疫比濁法。乳膠凝集法只能定性檢測，不能測定血漿中D-二聚體含量的變化；酶聯免疫法操作容易受到酶活性變化的影響，結果不太準確；金標法容易受類風溼因子、肝素及血脂的影響，結果準確性差；膠乳比濁法反應特異性不好，所需試劑比較複雜。
螢光抗體檢測技術能夠實現樣品中D-二聚體的定量檢測，且具有檢測儀器精巧輕便、操作簡單迅速、結果精準等優點，因此，製備和生產D-二聚體免疫螢光定量試紙條非常有市場價值。然而，要實現D-二聚體免疫螢光定量試紙條的製備和長期保存，儲存液是關鍵之一。儲存液的好壞關乎試紙條的準確度和保存期，因此，通過改進儲存液，開發高準確度的D-二聚體免疫螢光定量試紙條非常有現實意義。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種D-二聚體免疫螢光定量試紙條及其製備方法。
本發明所採取的技術方案是：
一種D-二聚體免疫螢光定量試紙條，包括吸水墊、硝酸纖維素膜、質控線、檢測線、結合墊、樣品墊、PVC底板(7)；其中，結合墊上噴有D-二聚體一抗-螢光微球偶聯物；所述的檢測線為D-二聚體一抗，質控線為D-二聚體二抗，且檢測線和質控線依次固定於硝酸纖維素膜上；樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次搭接並承載於PVC底板；D-二聚體一抗-螢光微球偶聯物使用儲存液進行浸漬處理、保存和稀釋；所述的儲存液配方為：PB的質量濃度為15～25mM、BSA的百分濃度為1.6％～2％、Tween-80的百分濃度為0.4％～0.6％、葡萄糖的百分濃度為0.4％～0.6％、甘氨酸的百分濃度為1.5％～2.5％、PEG4000的百分濃度為0.8％～1.2％、PEG20000的百分濃度為1％～2％、Proclin300或疊氮鈉的百分濃度為0.01％～0.1％。
作為優選的儲存液配方，PB的質量濃度為20mM、BSA的百分濃度為1.8％、Tween-80的百分濃度為0.5％、葡萄糖的百分濃度為0.5％、甘氨酸的百分濃度為2％、PEG4000的百分濃度為1％、PEG20000的百分濃度為1.5％、Proclin300或疊氮鈉的百分濃度為0.03％。
試紙條加樣層析後，檢測質控線和檢測線的螢光信號強度，並以質控線螢光信號強度校正檢測線的螢光信號強度，實現D-二聚體的定量檢測。
一種D-二聚體免疫螢光定量試紙條的製備方法，包括如下步驟：
(1)將螢光微球活化後與D-二聚體一抗偶聯，偶聯完畢後加入封閉劑，保存於儲存液中；
(2)將D-二聚體一抗-螢光微球偶聯物用儲存液稀釋後，噴於結合墊上，乾燥保存；
(3)將D-二聚體一抗固定於硝酸纖維素膜上作為檢測線，將D-二聚體二抗固定於硝酸纖維素膜上作為質控線；
(4)在PVC底板上依次搭接地粘貼：樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，並剪切成適當寬度即成為D-二聚體免疫螢光定量試紙條，其中，樣品墊材質為玻璃纖維素膜或濾血膜，結合墊材質為玻璃纖維素膜；
上述的儲存液配方為：PB的質量濃度為15～25mM、BSA的百分濃度為1.6％～2％、Tween-80的百分濃度為0.4％～0.6％、葡萄糖的百分濃度為0.4％～0.6％、甘氨酸的百分濃度為1.5％～2.5％、PEG4000的百分濃度為0.8％～1.2％、PEG20000的百分濃度為1％～2％、Proclin300或疊氮鈉的百分濃度為0.01％～0.1％。
作為優選的儲存液配方，PB的質量濃度為20mM、BSA的百分濃度為1.8％、Tween-80的百分濃度為0.5％、葡萄糖的百分濃度為0.5％、甘氨酸的百分濃度為2％、PEG4000的百分濃度為1％、PEG20000的百分濃度為1.5％、Proclin300或疊氮鈉的百分濃度為0.03％。
D-二聚體一抗-螢光微球偶聯物在儲存液中的保存濃度為0.1～10mg/mL。
本發明的有益效果是：
相對於普通儲存液製備的試紙條，本發明所製備的D-二聚體免疫螢光定量試紙條存儲穩定性更佳，精密度更好，檢測樣品的出峰具有更高的信號和較平整的基線，準確度較高。
附圖說明
圖1：優選的儲存液製備的D-二聚體免疫螢光定量試紙條檢測希森美康D-二聚體標準曲線；
圖2：優選的儲存液製備的D-二聚體免疫螢光定量試紙條檢測D-二聚體重組抗原的檢測值與理論值散點圖；
圖3：不同儲存液製備的試紙條檢測含不同濃度D-二聚體的病人血清樣本的螢光檢測折線圖；
圖4：不同儲存液製備的試紙條檢測含D-二聚體的病人血清樣本檢測值與希森美康-CA7000檢測值的相關圖；
具體實施方式
實施例1
D-二聚體免疫螢光定量試紙條的製備過程如下：
(1)優選儲存液的製備：PB的質量濃度為20mM、BSA的百分濃度為1.8％、Tween-80的百分濃度為0.5％、葡萄糖的百分濃度為0.5％、甘氨酸的百分濃度為2％、PEG4000的百分濃度為1％、PEG20000的百分濃度為1.5％、Proclin300百分濃度為0.03％，按上述配方配製混勻後過濾除菌，製得儲存液；
(2)樣品墊的製備：用樣品墊處理液浸泡玻璃纖維膜10min，置於乾燥間37℃溼度30％，烘乾3h，製得樣品墊，備用；
(3)結合墊的製備：用結合墊處理液浸泡玻璃纖維素膜10min，浸泡處理後，置於乾燥間37℃溼度30％，烘乾3h，製得結合墊，備用；
(4)將1mg的200nm聚苯乙烯螢光微球先後加入20μL的0.5mg/mL的EDC和0.5mg/mL的NHS，在活化緩衝液37℃活化1h；
(5)加入0.1mgD-二聚體一抗(鼠源D-二聚體單克隆抗體)，在200μL偶聯緩衝液中與螢光微球偶聯，完畢後加入封閉液20μL，製得D-二聚體一抗-螢光微球偶聯物，18000rpm離心15min後，加入200μL儲存液，製得D-二聚體一抗-螢光微球偶聯物濃度為5mg/mL，2～8℃保存；
(6)用儲存液將D-二聚體一抗-螢光微球偶聯物稀釋到0.5mg/mL，用噴金劃膜儀噴於經結合墊處理液處理後的結合墊上，用鼓風乾燥箱乾燥7h。鋁箔袋密封置於20-25℃、溼度約30％的條件下存放備用；
(7)將1mg/mLD-二聚體二抗(羊抗鼠IgG多克隆抗體)和1mg/mLD-二聚體一抗分別用包被液包被，以條帶狀1.0mm用噴金劃膜儀分別固定於硝酸纖維素膜上分別作為質控線和檢測線；
(8)在PVC底板上依次搭接地粘貼：樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙，並剪切成寬度4.1mm即成為D-二聚體免疫螢光定量試紙條；
(9)將切好的試紙條裝卡，過壓殼機，準備檢測；
(10)樣品墊處理液：100mMPBS、1％Triton、0.75％BSA、0.5％PVA、0.9％NaCl、0.3％葡聚糖、0.05％Proclin300，pH7.8；
(11)結合墊處理液：2％Tween-80、1.5％PVA、0.5％BSA、1％海藻糖，PH7.05-7.10；
(12)活化緩衝液為75mM MES，pH5.5；
(13)偶聯緩衝液：20mM PB，pH7.5；
(14)封閉液：20％BSA；
(15)包被液：20mMPBS，1.2％異丙醇、0.4％葡聚糖20000、1.5％BSA、0.5％Tween-80、0.03％Proclin300，pH7.0。
實施例2
將實施例1製備的D-二聚體免疫螢光定量試紙條建立標準曲線並進行檢測，實施方法如下：
(1)建立標準曲線：用希森美康D二聚體濃度為高低值校準品混合稀釋至200ng/mL、500ng/mL、900ng/mL、1800ng/mL、3600ng/mL、6000ng/mL、8000ng/mL七個濃度。用製備好的試紙條加樣80μL上免疫螢光分析以檢測，每個濃度重複3次取平均值。以檢測線所出的T峰面積和質控線所出的C峰面積的比值為縱坐標，標準品理論值為橫坐標。
標準曲線如圖1所示；y＝0.0023x-0.2779，R2＝0.9966，用該方程可計算樣品中的D二聚體含量，實現定量，且相關性好。
(2)樣品檢測：用抗原稀釋液對D二聚體重組抗原倍比稀釋至250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL、8000ng/mL六個濃度。抗原稀釋液：20mMPBS，0.5％BSA，0.5％Tween-20，PH7.2；將求得T/C峰面代入y＝0.0023x-0.2779中Y，求得X為所測抗原值，
如圖2所示，可以看出實施例2製備的試紙條檢測值與理論值偏差小(R2＝0.9988)，檢測的準確率高。
實施例3
配製對照儲存液，具體配方為：PB的質量濃度為50mM、BSA的百分濃度為1％、Tween-80的百分濃度為1％、葡萄糖的百分濃度為1％、甘氨酸的百分濃度為0.5％、PEG4000的百分濃度為2％、Proclin300百分濃度為0.3％。
採用實施例1製備的優選儲存液(以下簡稱儲存液2)與對照儲存液(以下簡稱儲存液1)進行助穩性能和精密度對比，實施方法和結果如下：
用儲存液1和儲存液2，對相同工藝標記的D二聚體(D-Dimer)一抗-螢光微球進行噴膜乾燥，分別組裝成40個試紙條，放鋁箔袋、乾燥劑封口。一袋放置冰箱4℃保存7天(對照組)，另外一袋放置溫箱37℃加速7天。完整7天後，取出卡條，分別加入濃度為50ng/mL和500ng/mL的D-Dimer重組抗原檢測。根據理論37℃加速7天相當於4℃保存1年，模擬1年後的抗原檢測情況，結果如下表1、表2所示。
表1、2種儲存液製得的試紙條測試1.9ng/mL D-Dimer重組抗原的效果對比
表2、2種儲存液製得的試紙條測試500ng/mL D-Dimer重組抗原的效果對比
從表1、2得出，優選的儲存液2製備的試紙條在37℃加速七天後，檢測值僅下降7％左右，且精密度較好；而對照儲存液1製備的試紙條在37℃加速七天後，檢測值下降35％左右，精密度相對較差。
實施例4
用儲存液1和儲存液2(同實施例3)，對相同工藝標記的D-二聚體一抗-螢光微球進行噴膜乾燥，組裝好試紙條，分別用濃度為120ng/mL、270ng/mL、310ng/mL、430ng/mL、460ng/mL、1920ng/mL的含D-二聚體的希森美康CA7000賦值的病人血清樣本對兩種試紙條加樣檢測，隨後用配套檢測儀器對試紙條窗口信息進行讀取。通過儀器雷射對窗口的螢光微球進行激發，再採集窗口300個位置(作橫坐標)的發射螢光強度(作縱坐標)，利用螢光分析軟體將300個點按順序連在一起形成折線圖。
如圖3所示，折線圖可反映螢光微球在NC膜上的跑膜情況，圖中有兩個峰，左邊為T峰(對應肉眼視卡條為檢測線)，右邊為C峰(對應肉眼視卡條為質控線)。使用儲存液2的整體出峰效果較好，說明儲存液2對抗體-螢光微球偶聯物從結合墊釋放到NC膜效果較好。使用儲存液1的則出峰信號不高，基線不平整，前段抬起較明顯，影響軟體對峰面積的計算，進而影響讀值的準確度。
實施例5
用儲存液1和儲存液2(同實施例3)，對相同工藝標記的D-二聚體一抗-螢光微球進行噴膜乾燥，分別組裝15個試紙條，用15個不同濃度的含D-二聚體抗原的病人血清樣本同時對兩種試紙條加樣檢測。用配套檢測儀器對試紙條窗口信息進行讀取，用螢光分析軟體計算T峰面積與C峰面積，同時用血凝方面權威公司希森美康旗下的CA7000全自動血凝儀檢測的結果值。
以希森美康CA7000評價2種儲存液製備的試紙條檢測結果的臨床診斷準確性。如圖4所示，縱坐標為T峰面積/C峰面積，橫坐標希森美康CA7000結果值，儲存液2製備的試紙條檢測結果與希森美康公司的CA7000儀器檢測結果較吻合(R2＝0.991)，而儲存液1的血清線性相關較差(R2＝0.965)，重複性也不好。這與前述儲存液2讓抗體-螢光微球偶聯物釋放效果更好，軟體計算面積更加準確有關。