一種利用單片段置換系聚合改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法與流程
2023-12-05 15:01:21 2
本發明屬於分子育種領域，涉及一種利用單片段置換系聚合改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法，具體涉及一種利用野生稻單片段置換系聚合同步改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法。
背景技術：
高溫熱害是影響全球水稻產量和品質的主要因子之一，也是中國稻作的主要自然災害，主要發生在長江流域以南(熊振民，蔡洪法主編.中國水稻.北京:中國農業科技出版社，1992)。水稻高溫障礙具有發生突然、成災面積大、常造成嚴重減產等特點(王志剛,王磊,林海,龐乾林,鄂志國,張玉屏,朱德峰.水稻高溫熱害及耐熱性研究進展[j].中國稻米,2013,19(1):27–31)。全球熱帶地區水稻受到高溫潛在威脅的面積約有4.0×106hm2,我國長江流域也是水稻花期高溫危害的重災區,湖南、湖北、江西、江蘇、四川等地均有水稻高溫災害的報導,受災嚴重時不少品種大面積結實率降低到50％以下,損失慘重(汪壽康,汪更文,汪又佳.2003年水稻高溫熱害情況的調查[j].安徽農學通報,2004,10(1):27–35)。在水稻灌漿成熟期,因高溫縮短了灌漿成熟過程,秕粒增多,千粒重下降,形成高溫逼熟。因此,水稻耐高溫指標應包括兩個方面:一方面以花粉在培養基上的萌發率、柱頭上的萌發率、結實率的下降為指標篩選孕穗期耐熱品種。國外從20世紀70年代開始就以高溫脅迫後結實率與常溫下結實率的比值為指標進行耐熱品種的篩選以及耐熱性的數量遺傳分析。另一方面以千粒重的下降為指標,篩選灌漿期耐熱材料。水稻不同生長期對高溫耐性不一樣,有的耐熱性狀qtl/基因在抽穗揚花期對高溫有較強的耐性,這一時期對結實率影響不大；有的耐熱性狀qtl/基因在灌漿期較耐高溫,這一時期對千粒重影響不大。因此,將這兩類耐熱性狀qtl/基因聚合到一個材料中是耐熱性水稻新種質創造的目標之一。
應用傳統育種方法和分子標記輔助育種技術培育水稻耐熱品種是目前最有效和可行的控制高溫脅迫危害的方法。秈稻是栽培稻的一個亞種，主產區為長江中下遊平原、四川盆地，江南各省，所以是遺傳研究和育種的主要對象，但是這些地區的雙季稻區的早稻抽穗揚花期經常遇到連續高溫熱害，影響雜交早稻高產組合的產量和品質。元江野生稻是長期生長在雲南元江乾熱河谷地區的普通野生稻，具備了適應高溫乾旱等惡劣自然環境的特性。因此元江野生稻是重要的耐熱及耐旱資源的重要來源。育種家們一直想通過種間雜交的方式把元江野生稻中耐熱的基因導入到栽培稻中去，但是由於連鎖累贅和雜交後代不容易穩定等原因限制了耐熱品種的培育。分子標記技術在提高水稻耐熱性育種中的應用大大減少了育種過程中選擇的盲目性，快速實現外源優良種質向栽培品種滲透，拓寬了品種的遺傳基礎。國內外研究人員對耐熱性進行了大量的qtl定位研究，有的已經用於標記輔助選擇育種實踐。
單片段置換系(singlesegmentsubstitutionlines,sssl)是利用雜交，回交和分子標記輔助選擇(marker-assistedselection,mas)構建的覆蓋作物整個基因組的一系列近等基因系。它的基因組內只有來自供體親本的一個純合的染色體片段，而基因組的其餘部分與輪迴親本相同。它是進行基因組研究，特別是qtl定位和分子設計育種的理想材料。peleman等(pelemanj.d.andvandervoortj.r.，breedingbydesign[j].trendsplantsci，2003，8(7):330-334)提出了分子設計育種的新概念，包括定位相關性狀的qtl、評價這些位點的等位性變異和開展設計育種，有望突破水稻精確高效育種等方面的障礙。目前廣東省植物分子育種重點實驗室培育了1600多份水稻單片段置換系(xiz.y.,hef.h.,zengr.z.etal.developmentofawidepopulationofchromosomesinglesegmentsubstitutionlines(sssls)inthegeneticbackgroundofanelitecultivarinrice(oryzasatival)[j].genome,2006,49:476-484)，用這些材料鑑定了許多重要農藝性狀的qtls及其等位基因(楊自鳳，朱海濤，劉自強，等.基於單片段置換系的水稻抽穗期qtl上位性研究[j].華南農業大學學報,2014，35(6):24-28.)，並廣泛開展了分子設計育種(梁海福.基於單片段置換系的高產優質水稻設計育種[d].廣州:華南農業大學，2011.)。
技術實現要素：
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種利用元江野生稻單片段置換系聚合同步改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法。
本發明的目的可通過如下技術方案實現：
一種利用元江普通野生稻單片段置換系聚合改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法，包含如下步驟：
(1)以保藏號為cgmccno.12532的中秈兩系骨幹恢復系9311為母本，保藏號為cgmccno.12534和cgmccno.12535的元江普通野生稻(荷花塘3號)單片段置換系yj07‐04‐06和yj01‐05‐03雜交得到的f1為親本，聚合雜交1代，回交3代，再自交3代獲得穩定純合株系bc3f4，每代都是單穗收穫；
(2)分子標記輔助第一次選擇：種植bc1f1，應用ctab法提取dna，採用所述的元江野生稻單片段置換系yj07‐04‐06對應的分子標記引物對rm3394和rm6223(表1)進行pcr擴增，單片段置換系yj01‐05‐03對應的分子標記引物對rm6515和rm8069(表1)進行pcr擴增，選擇同時含有上述4個來源於元江普通野生稻的分子標記條帶，分子量分別是404bp，184bp，224bp和392bp的單株與輪迴親本9311回交，種子按單株收穫；其中分子標記引物對rm3394正/反向序列為seqidno.1/seqidno.2，rm6223正/反向序列為seqidno.3/seqidno.4；rm6515正/反向序列為seqidno.5/seqidno.6；rm8069正/反向序列為seqidno.7/seqidno.8。
(3)分子標記輔助第二次選擇：種植bc2f1，每株提取dna後，再利用所述的分子標記引物對確定bc2f1單株的基因型，同時具有4個來源於上述野生稻的分子標記條帶，分子量分別是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的單株繼續與輪迴親本9311回交。
(4)分子標記輔助第三次選擇：種植bc3f1，每株提取dna後，繼續利用所述的分子標記引物對確定bc3f1單株的基因型，同時具有4個來源於上述野生稻的分子標記條帶，分子量分別是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的單株自交，按單株收穫種子。
(5)分子標記輔助第四次選擇：種植bc3f2，每株提取dna後，繼續利用所述的分子標記引物對確定bc3f2單株的基因型，同時具有4個來源於上述野生稻的分子標記條帶，分子量分別是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的單株自交獲得bc3f3，按單株收穫種子。
所述的分子育種方法還包括步驟(6)：將步驟(5)篩選到的含純合基因型的bc3f3株系種在盆缽中，分別在抽穗後第0天移進人工氣候室處理5天結束後一直自然條件下正常生長，然後在抽穗後第10天繼續移進人工氣候室處理5天，結束後一直置於自然條件下正常生長，以結實率及千粒重下降分別評價抽穗揚花期及灌漿期耐熱性，篩選獲得抽穗揚花期及灌漿期耐熱性顯著改良的育成新品系。
有益效果：
本發明所提供的一種利用元江野生稻單片段置換系改良中秈兩系骨幹恢復系抽穗揚花期耐熱性的分子育種方法，與傳統的回交聚合育種技術相比具有如下優點：傳統的回交聚合育種技術存在雜交工作量大、選擇可靠性差、育種周期長的缺陷。通過分子標記輔助選擇目標性狀，可在3～4年內快速高效培育出抽穗揚花期及灌漿期耐熱性顯著增強的中秈兩系骨幹恢復系。本發明以元江野生稻單片段導入系yj07‐04‐06、yj01‐05‐03和中秈兩系骨幹恢復系9311為材料，通過分子標記輔助選擇獲得了抽穗揚花期及灌漿期耐熱性顯著提高的新品系「元野3號」，「元野3號」在抽穗揚花期模擬高溫脅迫下結實率比對照9311提高18.4％，單株產量為25.02g，比輪迴親本增加8.72g。在灌漿期模擬高溫脅迫下千粒重比對照9311提高1.2g，單株產量為36.2g，比輪迴親本增加3.1g。
附圖說明
圖1分子標記輔助選擇抽穗揚花期及灌漿期耐熱性顯著優於輪迴親本的新品系。
圖29311背景中目標區間不同基因型高溫脅迫下結實率表現(2014‐2015)。
圖39311背景中目標區間不同基因型高溫脅迫下千粒重表現(2014‐2015)。
生物材料保藏證明
yj07‐04‐06為秈稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為cgmccno.12534；
yj01-05-03為秈稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為cgmccno.12535；
9311為秈稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為cgmccno.12532。
具體實施方式
實施例1選擇親本
江西省農業科學院水稻國家工程實驗室(南昌)超級水稻研究發展中心以蜀恢527為輪迴親本，以元江野生稻(荷花塘3號)為供體親本，在回交5代自交3代結合覆蓋全基因組的ssr分子標記輔助選擇，培育了一套蜀恢527為背景的元江普通野生稻單片段置換系112個，其基因組的覆蓋率達73.5％。2010年，於水稻抽穗後第1天,選取生長一致的植株裝入盆缽,移入人工氣候室。每盆栽3株,每份材料設3個重複,常規水肥管理。設定相對溼度為85％,光照12h/d,恆溫38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。處理5d,處理後,將試驗材料移到常溫下,直至成熟。調查結實率,各個處理均設對照(對照為田間正常生長條件下各試驗材料),以結實率下降為指標評價抽穗揚花期耐熱性。篩選出抽穗揚花期耐熱性顯著提高的導入系11個，其中包括導入系yj07‐04‐06，在模擬高溫脅迫情況下，結實率比對照提高13.4％。2010年，於水稻抽穗後第10天,選取生長一致的植株裝入盆缽,移入人工氣候室。每盆栽3株,每份材料設3個重複,常規水肥管理。設定相對溼度為85％,光照12h/d,恆溫38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。處理5d,處理後,將試驗材料移到常溫下,直至成熟。調查千粒重,各個處理均設對照(對照為田間正常生長條件下各試驗材料),以千粒重下降為指標評價灌漿期耐熱性。篩選出灌漿期耐熱性顯著提高的導入系13個，其中包括導入系yj01-05-03，在模擬高溫脅迫情況下，千粒重比對照提高13.4％。
導入系yj07‐04‐06和yj01-05-03為栽培秈稻(oryzasativaindica)，2016年5月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號分別為cgmccno.12534和cgmccno.12535；9311為栽培秈稻(oryzasativaindica)，2016年5月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號分別為cgmccno12532。
實施例2
(1)2011年夏季在江西省農業科學院南昌試驗站分別種植yj07‐04‐06和9311各一行，9311(cgmccno.12532)為母本，yj07‐04‐06(cgmccno.12534)和yj01-05-03(cgmccno.12535)雜交得到的f1為父本配製雜交組合產生f1，成熟後全部混收。2011年冬季在海南三亞種植3行f1，回交獲得bc1f1，成熟後全部混收。田間管理按常規方法進行。
(2)分子標記輔助選擇：2012年夏季在江西省農業科學院南昌試驗站種植50行bc2f1，每行8株，每株採集葉片放入2ml的eppendorf管中，裝人小鋼珠，利用高通量組織研磨儀高速震蕩研磨之後加入1.25％的sds提取液600μl，應用sds法提取dna，採用yj07‐04‐06(cgmccno.12534)和9311(cgmccno.12532)導入片段上的分子標記(表1)進行pcr擴增，擴增體系10μl，dna模板1μl，94℃預變性5min，94℃變性0.5min，57℃復性0.5min，72℃延伸1min，32個循環後，72℃再延伸10min，擴增產物經非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳：凝膠濃度為8％，電泳緩衝液為0.5倍tbe，175v恆壓電泳1.5小時。選擇含有4個分子標記的10個單株繼續回交獲得bc3f1種子。
(3)2012年冬季在海南三亞將bc3f1種植10行，每行8株，每株採集葉片，提取dna後，利用表1提供的分子標記確定bc3f1單株的基因型，選擇4個標記都含有的單株繼續自交得到bc3f2(同時具有表1中來源於上述野生稻的4個分子標記條帶)。
表1yj07‐04‐06和yj01-05-03導入片段的ssr分子標記
(4)2013年冬季在海南三亞將bc3f2種植40行，每行8株，每株採集葉片，提取dna後，利用表1提供的分子標記確定bc3f2單株的基因型，選擇4個標記純合的單株自交得到bc3f3(同時具有表1中來源於上述野生稻的4個分子標記條帶)。
(5)人工氣候室模擬高溫脅迫鑑定：2014‐2015年，將純合的bc3f4及bc3f5株繫於抽穗後第1天,選取生長一致的植株裝入盆缽,移入人工氣候室。每盆栽3株,每份材料設3個重複,常規水肥管理。設定相對溼度為80％,光照11h/d,恆溫38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。處理5d,處理後,將試驗材料移到常溫下進行正常生長。然後於抽穗後10天繼續移入人工氣候室進行高溫脅迫處理5天。處理後,將試驗材料移到常溫下,直至成熟。每盆栽3株,每份材料設3個重複,常規水肥管理。設定相對溼度為80％,光照11h/d,恆溫38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。處理後,將試驗材料移到常溫下,直至成熟。調查結實率及千粒重,及其他重要農藝性狀，各個處理均設對照(對照為田間正常生長條件下各試驗材料),分別以結實率和千粒重下降為指標評價抽穗揚花期和灌漿期的耐熱性。
通過方差分析，經過兩個世代以上鑑定的純系中選擇在人工氣候室中揚花期及灌漿期人工模擬高溫脅迫情況下結實率及千粒重顯著高於輪迴親本的株系，即為育成品系「元野3號」。
由於本發明選擇的耐熱株系背景親本為9311，其為中秈兩系骨幹恢復系代表性品系，因此通過該分子育種方法選育的「元野3號」品系顯著特點是配合力高，具有抽穗揚花期及灌漿期耐熱顯著提高的特點。
注:rm編號的引物來自利用temnykh等(2000)和mccouch等(2002)公布的ssr引物序列合成的ssr標記(temnykhs,parkwd,ayresn,etal.mappingandgenomeorganizationofmicrosatellitesequencesinrice(oryzasatival.).theoreticalandappliedgenetics,2000,100(5):697-712；mccouchsr,teytelmanl,xuy,etal.developmentandmappingof2240newssrmarkersforrice(oryzasatival.).dnaresearch,2002,9(6):199-207.)。