微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法
2023-12-02 11:00:01
專利名稱：微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法
技術領域：
本發明是一種藥物分析技術，特別是用於豆製品黃水下腳料中提取的經酶法水解的微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法。
背景技術：
豆製品黃水下腳料中提取的經酶法水解的大豆異黃酮，其含大豆異黃酮苷元有效成分高，但色澤深黃、氣味濃烈，有強烈的異臭味，嚴重影響了其在保健食品和食品中作為功能型成分添加劑的應用。目前對大豆及其產品的國家標準中關於氣味鑑定項目均採用感官鑑定，如大豆的國標中，「色澤、氣味、口味」項按GB 5492-85相關解釋執行，其中氣味項為「1、取少量試樣，嘴對試樣呵氣，立即嗅辨氣味是否正常；2、將試樣放入密閉器皿內，在60-70℃的溫水杯中保溫數分鐘，取出，開蓋嗅辨氣味是否正常。」人為因素極大。文獻對大豆及其產品報導的異味研究多為對豆漿等副食品進行，尚未見對大豆異黃酮類產品的類似報導。在大量文獻調研的基礎上，對頻繁提及的揮發性異味物質如正己醛、苯甲醛和正己醇等，由豆製品廢水中提取得到的大豆異黃酮原料及其微膠囊製品進行了色譜保留時間比對法定性，結果均否定。
發明內容
本發明目的是把豆製品黃水下腳料中提取的經酶法水解的大豆異黃酮，採用現代技術，對包接前後異味物質進行定性定量方法研究及建立，並以此法檢測比較包接工藝的有效性，以評價工藝以及控制產品質量。對微囊化製備工藝進行有效的質量控制，使經微囊化製備後的產品有效地掩蓋異臭，除製成膠囊劑外，還可廣泛應用於片劑、顆粒劑及作為功能性添加劑，在食品、飲料、營養保健食品等方面起到很好的作用，將大大提高應用範圍和銷量。
科學評價包接的效果及嚴格控制產品質量，必須建立有代表性的異味物質定量質量控制方法，首先找到定性指標性成分，經氣相色譜頂空法對原料中的揮發性成分進行分離，發現於12min至17min之間3個峰適合作指標性成分。見圖1。
進一步查找合適的指標性物質，對原料進行了氣相色譜-質譜聯用分析，確定12min至17min之間的15min峰為戊酸，16min峰為己酸，其他揮發性成分尚有乙酸乙酯、1-辛烯-3-甲醇、苯甲醛、2，4-二氯-1-甲基-酚、庚酸等。根據戊酸和己酸兩者的豐度，選擇己酸作指標性成分，固體樣品頂空進樣難以定量，重現性差，進樣方式改為用乙醚作溶劑，將樣品中己酸成分充分溶解後，直接進樣，並進行系列研究和方法驗證。
本發明要解決的技術問題是解決微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定。從豆製品廢水中提取的經酶法水解的大豆異黃酮，對產品中的揮發性成分進行了氣相色譜分離，並用氣相色譜-質譜聯用技術，選擇己酸作為異味物質的指標性成分加以含量測定，對具有濃烈異味大豆異黃酮分子包接的工藝研究進行有效的質量控制。
本發明測定方法包括如下步驟1)測定樣品微膠囊大豆異黃酮及其原料2)材料A.對照品己酸B.氣相色譜儀C.色譜柱固定相為氰丙基苯基-甲基聚矽氧烷的毛細管柱3)測定方法A.對照品溶液的製備取對照品用乙醚配製成每1mL含5-50ug的溶液。
B.供試品溶液的製備(1)樣品供試品溶液的製備取樣品0.8～1.2g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，定量配製成每1mL含供試品80～120mg的溶液。
(2)原料供試品溶液的製備取原料0.8～1.2g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，定量配製成每1mL含供試品80～120mg的溶液。
C.柱溫採用程序升溫，初始溫度30-35℃，保持2-5min，以3-6℃·min-1升至55-65℃，以8-12℃·min-1升至95-105℃，以15-20℃·min-1升至220-250℃。
D.氫火焰離子化檢測器(FID)檢測器溫度220-260℃E.進樣器溫度220-250℃F.理論塔板數按己酸峰計算≥400004).方法考察A.專屬性試驗溶劑對己酸測定無影響；B.標準曲線及線形關係己酸濃度為1～50ug·mL-1範圍內線性關係良好，研究結果1.0～50.0ug·mL-1，A＝-0.46+2197.28C r＝0.9999；C.重複性試驗相對標準偏差RSD≤3％，研究結果RSD為1.6％，n＝6；D.回收率試驗回收率為80％-120％，研究結果本法回收率為99.2％，RSD為1.6％；E.靈敏度試驗最低檢測濃度≤1ug·mL-1，研究結果0.14ug·mL-1，方法靈敏。
為控制原料和體現微膠囊大豆異黃酮[製法]的合理性，本發明將氣相色譜法測定己酸含量作為微膠囊大豆異黃酮的[檢查]項目之一，並對其方法學進行考察，方法如下一. 試驗材料(一)己酸對照品含量大於98％(二)氣相色譜儀Agilent 6890N氣相色譜儀；Agilent7683自動進樣器，Agilent氣相色譜工作站。
(三)色譜柱Agilent DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚矽氧烷)毛細管柱(30m×0.32mm×0.25μm)。
(四)溶劑乙醚為分析純二. 試驗方法(一)對照品溶液製備1.對照品貯備液 精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
2.對照品溶液 精密量取對照品貯備液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為25ug·mL-1溶液，搖勻，即得。
(二)供試品溶液的製備1.樣品供試品溶液的製備取樣品約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
2.原料供試品溶液的製備取原料約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
(三) 色譜條件的選擇柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮氣，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。進樣1μL。理論板數按己酸峰計算為400000。
三.方法學考察試驗(一)專屬性試驗取空白溶劑1μL，依法操作。由圖中可見乙醚在待測溶劑出峰處不幹擾檢測。見附圖2。
(二)靈敏度試驗以信噪比為3計，本法中己酸的最低檢測濃度為0.14ug·mL-1，方法靈敏。見附圖3。
(三)標準曲線及線形關係配置5種濃度的對照品溶液精密量取對照品貯備液各1.0mL分置於10、20、50、100mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度分別為50.0，25.0，10.0，5.00ug·mL-1；精密量取10.0ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度為1.0ug·mL-1，依次進樣1uL，按上述色譜條件測定峰面積。以己酸峰面積A對己酸濃度C(ug·mL-1)作一回歸處理，得回歸方程及相關係數A＝-0.4565+2197.28Cr＝0.9999n＝5結果表明己酸濃度為1.0～50.0ug·mL-1範圍內線性關係良好。見附圖4-附圖8。
(四)重複性試驗取同一批號的樣品6份，按樣品含量測定項方法連續測定，計算樣品中己酸的平均含量為194ug·g-1，RSD為1.6％。見附圖9-附圖14。
(五)回收率試驗取已知含量的同一批號樣品約0.5g，精密稱定，加入對照品貯備液0.25ml，加入乙醚依法處理，並稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，測定，6份測得的平均回收率為99.2％，RSD為1.6％。
四.樣品中己酸含量測定取供試品溶液，進樣1μl，測定。按所擬定的方法測定了3批樣品，結果分別為194、198、201ug·g-1。
產品含己酸含量限度不得大於250ug·g-1。
原料的己酸含量亦作了測定，結果為5472ug·g-1。
以己酸作為考察指標，微膠囊的遮蔽率高於95％，進一步說明了工藝的有效性。
圖1原料頂空進樣GC2空白溶劑圖譜圖3靈敏度試驗圖譜圖4線性與回歸圖譜A分析結果表
圖5線性與回歸圖譜B分析結果表
圖6線性與回歸圖譜C分析結果表
圖7線性與回歸圖D分析結果表
圖8線性與回歸圖譜E分析結果表
圖9重複性試驗A分析結果表
圖10重複性試驗B分析結果表
圖11重複性試驗C分析結果表
圖12重複性試驗D分析結果表
圖13重複性試驗E分析結果表
圖14重複性試驗F分析結果表
微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法，對微囊化製備工藝進行了有效的質量控制，經微囊化製備後的產品有效地掩蓋了異臭，除製成膠囊劑外，還可廣泛應用在片劑、顆粒劑及作為功能性添加劑，在食品、飲料、營養保健品等方面起到很好的作用，大大提高了應用範圍和銷量，具有較大的社會效益和經濟效益。該指標的建立，將有利於大豆異黃酮製劑的研究、生產、使用全過程的質量控制，包括原料投料、中間體及最終的成品，因此具有深遠的實際意義。
具體實施例方式
實施例1標準曲線及線形關係毛細管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚矽氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮氣，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數按己酸峰計算應不低於40000。
對照品貯備液製備 精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
配置5種濃度的對照品溶液精密量取對照品貯備液各1.0mL分置於10、20、50、100mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度分別為50.0，25.0，10.0，5.00ug·mL-1；精密量取10.0 ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度為1.0ug·mL-1，依次進樣1uL，按上述色譜條件測定峰面積。以己酸峰面積A對己酸濃度C(ug·mL-1)作一回歸處理，得回歸方程及相關係數A＝-0.4565+2197.28Cr＝0.9999n＝5結果表明己酸濃度為1.0～50.0ug·mL-1範圍內線性關係良好。
實施例2專屬性試驗毛細管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚矽氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮氣，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數按己酸峰計算應不低於40000。
供試品溶液製備取微膠囊大豆異黃酮樣品約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
測定法取乙醚溶劑和供試品溶液分別進樣1μL，注入氣相色譜儀，測定比較，乙醚在己酸出峰處不幹擾檢測。
實施例3靈敏度試驗毛細管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚矽氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮氣，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數按己酸峰計算應不低於40000。
對照品貯備液製備過且過精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
對照品溶液製備精密量取對照品貯備液各1.0mL分置於50mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度分別為10.0ug·mL-1；精密量取10.0ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度為1.0ug·mL-1，進樣1uL，按上述色譜條件測定，以信噪比為3計，算得己酸的最低檢測濃度為0.14ug·mL-1，方法靈敏。
實施例4微膠囊大豆異黃酮原料中己酸含量的測定毛細管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚矽氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮氣，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數按己酸峰計算應不低於40000。
對照品貯備液製備精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
對照品溶液製備取對照品貯備液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為25ug·mL-1溶液，搖勻，即得。
供試品溶液製備取微膠囊大豆異黃酮原料約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
測定法對照品溶液和供試品溶液分別進樣1μL，注入氣相色譜儀，測定，即得。
實施例5微膠囊大豆異黃酮中己酸含量的測定毛細管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚矽氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮氣，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數按己酸峰計算應不低於40000。
對照品貯備液製備精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
對照品溶液製備取對照品貯備液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為25ug·mL-1溶液，搖勻，即得。
供試品溶液製備取微膠囊大豆異黃酮樣品約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
測定法對照品溶液和供試品溶液分別進樣1μL，注入氣相色譜儀，測定，即得。
實施例6回收率試驗毛細管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚矽氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮氣，流速1.5 mL·min-1，分流比5∶1。理論板數按己酸峰計算應不低於40000。
對照品貯備液製備精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
對照品溶液製備取對照品貯備液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解並稀釋至刻度，配製成濃度約為25ug·mL-1溶液，搖勻，即得。
供試品溶液製備取已知含量的同一批號樣品約0.5g，精密稱定，加入對照品貯備液0.25ml，加入乙醚依法處理，並稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。共製備6份。
測定法對照品溶液和供試品溶液分別進樣1μL，注入氣相色譜儀，測定，計算即得。
權利要求
1.一種微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法，其特徵在於從豆製品廢水中提取的經酶法水解的大豆異黃酮，對產品中的揮發性成分進行氣相色譜分離，用氣相色譜—質譜聯用技術，選擇己酸作為異味物質的指標性成分加以含量測定，對具有濃烈異味大豆異黃酮分子包接的工藝研究進行有效的質量控制。
2.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於該方法包括如下步驟1)測定樣品微膠囊大豆異黃酮及其原料2)材料A.對照品己酸B.氣相色譜儀C.色譜柱固定相為氰丙基苯基-甲基聚矽氧烷的毛細管柱3)測定方法A.對照品溶液的製備取對照品用乙醚配製成每1mL含5-50ug的溶液。B.供試品溶液的製備(1)樣品供試品溶液的製備取樣品0.8～1.2g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，定量配製成每1mL含供試品80～120mg的溶液。(2)原料供試品溶液的製備取原料0.8～1.2g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，並稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，定量配製成每1mL含供試品80～120mg的溶液。C.柱溫採用程序升溫，初始溫度30-35℃，保持2-5min，以3-6℃·min-1升至55-65℃，以8-12℃·min-1升至95-105℃，以15-20℃·min-1升至220-250℃。D.氫火焰離子化檢測器(FID)檢測器溫度220-260℃E.進樣器溫度220-250℃F.理論塔板數按己酸峰計算≥400004).方法考察A.專屬性試驗溶劑對己酸測定無影響；B.標準曲線及線形關係己酸濃度為1～50ug·mL-1範圍內線性關係良好，研究結果1.0～50.0ug·mL-1，A＝-0.46+2197.28 C r＝0.9999；C.重複性試驗相對標準偏差RSD≤3％，研究結果RSD為1.6％，n＝6；D.回收率試驗回收率為80％-120％，研究結果本法回收率為99.2％，RSD為1.6％；E.靈敏度試驗最低檢測濃度≤1ug·mL-1，研究結果0.14ug·mL-1，方法靈敏。
全文摘要
本發明是一種藥物分析技術，特別是用於微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法。本發明從豆製品廢水中提取的經酶法水解的大豆異黃酮，對產品中的揮發性成分進行了氣相色譜分離，並採用氣相色譜—質譜聯用技術，選擇了己酸作為異味物質的指標性成分加以含量測定，經對具有濃烈異味大豆異黃酮微囊化製備工藝進行了有效的質量控制，而微囊化製備後的產品有效地掩蓋了異臭，除製成膠囊劑外，還可廣泛應用在片劑、顆粒劑及作為功能性添加劑，在食品、飲料、營養保健品等方面起到很好的作用，大大提高了應用範圍和銷量，具有較大的社會效益和經濟效益。
文檔編號G01N30/54GK1928546SQ20061005308
公開日2007年3月14日 申請日期2006年8月23日 優先權日2006年8月23日
發明者姜麗霞, 徐世芳, 陳愛瑛 申請人:浙江省醫學科學院