人抗凝血酶Ⅲ基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法
2024-02-25 04:44:15
專利名稱：人抗凝血酶Ⅲ基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種利用基因打靶技術，使人抗凝血酶III 基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法。
背景技術：
隨著轉基因動物的問世，基因工程製藥愈來愈受到人們的認可和關注，轉基因技術不但可以加快畜種改良力度，提高畜產品產量和質量，而且可以生產珍貴藥用蛋白，為人類造福。轉基因動物最誘人的前景是作為生物反應器，利用它生產人類所需的生物活性產品或藥物。而乳腺生物反應器是目前生產外源蛋白最有效的生物反應器，也是目前國際上惟一證明可以達到商業化生產水平的生物反應器(朱小甫，2007)。1987年，Gordon等將組織纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的啟動子構成重組基因，成功培育出能在乳汁中表達tPA的轉基因小鼠，開啟了利用動物乳腺生物反應器生產藥用蛋白的時代(Gordon K,1987)。外源基因在動物乳腺中高效表達的關鍵是整合到動物染色體組中的表達載體 (調控序列和外源基因)要處於一個開放和活躍轉錄的狀態。常用的乳腺生物反應器的表達載體分為普通質粒的表達載體、人工染色體的表達載體和基因打靶表達載體。其中，基於普通質粒的外源基因隨機整合到宿主基因組中，往往產生位置效應，影響外源基因的高效表達；而人工染色體尚存在克隆片段不穩定、易發生缺失等難以避免的缺陷。基因打靶載體由基因打靶技術衍生而來，基因打靶技術(Gene targeting technology)是20世紀80年代後半期興起的，按預期方式精細改造生物遺傳信息的研究技術手段。是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因為目的的一項技術。它克服了隨機整合的盲目性和危險性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法(孫振紅，2010)。PPL公司的McCrearh等在Nature上報導了 C0L1A1 (原膠原)基因在胎兒成纖維細胞內進行基因打靶，在C0L1A1基因內插入了 IRES和無啟動子的neo和 α I-Antitrypsin(AAT)基因，生產出轉基因克隆綿羊，羊乳中AAT蛋白含量高達650mg/L， 這是第一例通過核移植生產的體細胞基因打靶克隆綿羊(MCCreath，2000)。2006年Lai等 (Lai, 2006)製備出能夠合成多不飽和脂肪酸的豬。2008年Baldassarre等(Baldassarre， 2008)報導，重組人丁醯膽鹼酯酶(rBChE)在哺乳期山羊乳中的表達量可達到1 5g/L，這充分些證實了利用基因打靶技術製備動物乳腺生物反應器廣闊的產業化前景。理論上，各種重組蛋白都可以通過乳腺生物反應器途徑獲得，其中包括一些相當複雜的蛋白分子，但可能由於轉基因動物研究理論不足，轉基因技術支撐體系不夠完善，致使目前轉基因動物成功率和成活率極低，這是限制轉基因動物發展的主要因素。世界範圍內，目前利用乳腺生物反應器可進行商業生產的藥用蛋白僅有十餘種，仍有大量的轉基因藥用蛋白處在研究階段(劉靜，2009)。人抗凝血酶III是存在於血漿中的一類重要的抗凝血因子，是抗凝血酶活性的主要承擔者，在臨床上，可預防和治療急、慢性血栓、血塞形成，對治療抗凝血酶缺失症有顯著療效。目前市場上有從人體血漿中直接提取的人抗凝血酶III的蛋白注射針劑，也有用細胞和酵母作為表達載體，在體外合成的重組人抗凝血酶III蛋白，但成本高，表達量低，生產費用昂貴。2006年6月，美國GTC公司研製成功世界上第一個利用轉基因乳腺生物反應器生產的基因工程蛋白藥物——重組人抗凝血酶III (商品名為Atryn，治療先天性抗凝血酶缺乏症)，其上市許可申請獲得了歐洲醫藥評價署人用醫藥產品委員會肯定的批准意見， 充分證明利用哺乳動物乳腺生物反應器生產重組人抗凝血酶III具有理想的市場價值(王慶忠，2005)，但是GTC公司採用原核注射法獲得轉基因動物乳腺生物反應器，投入高、效率低；2008年，青島森淼實業有限公司成功構建了分泌人抗凝血酶III的轉基因山羊(鄒賢剛等，2008)，並申請了專利(CN1840187A)，但鮮見利用基因打靶技術來獲得攜帶抗凝血酶 III基因的奶山羊乳腺生物反應器。乳腺生物反應器的研究始於模型動物小鼠，許多學者將研究集中在轉基因鼠、兔、 豬等動物上，但是從生物維持成本和產奶量的角度來看，用以食草為主的乳用型家畜進行轉基因乳腺生物反應器研究比較理想，且具備產奶量高，藥用蛋白活性高且易提純、開發周期短、生產成本低等優點(吳應積，2009)。山羊的研究周期短、飼養管理費用低，是乳腺生物反應器的主要研究對象之一，我國已開展了一些山羊乳腺生物反應器方面的研究工作 (Zhang et al,2004 ；Shen et al，2007)，並獲得了含有人組織纖溶酶原激活劑基因的基因打靶山羊細胞株(Shen et al，2007)。嶗山奶山羊(Capra hircus L.)是我國的高產奶羊之一，產奶量高、產奶期長，相當於1/3頭奶牛的產奶量，本研究利用基因打靶技術，獲得了表達人抗凝血酶III基因的嶗山奶山羊，為進一步從羊奶中獲得人抗凝血酶III蛋白向前邁進重要一步。
發明內容
本研究的發明目的，是針對上述現有技術存在的缺陷和不足，構建含有Iox序列的基因打靶載體，提供一種利用基因打靶技術和核移植技術，使人抗凝血酶III基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法。為實現上述任務，本發明採用如下的技術解決方案研究一種使人抗凝血酶III基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法，該方法包括以下步驟，功能基因的獲得，基因打靶載體的構建和標記基因的連接，轉化受體細胞經篩選獲得陽性細胞株，陽性細胞株DNA製備，陽性細胞株經核移植，獲得含有人抗凝血酶III基因的克隆嶗山奶山羊，嶗山奶山羊中抗凝血酶III基因的PCR和Southern blot鑑定。其特徵是(1)功能基因的獲得從人肝臟組織中獲得人抗凝血酶III基因的mRNA，逆轉錄成cDNA ；通過PCR方法建立兩端的連接酶切位點；PCR產物連接在pUC19質粒上，再進行DNA序列分析；(2)基因打靶載體的構建和目的基因的連接以嶗山奶山羊β-酪蛋白基因為表達框架，分別將人抗凝血酶III基因(具體DNA 序列見序列表4)，Iox序列(具體DNA序列見序列表5)，poly (A)信號(具體 DNA序列見序列表7)，新黴素抗性篩選基因(具體DNA序列見序列表9)和Iox序列(具體結構見序列表10)依次構建到β-酪蛋白基因為表達框架中(具體DNA 序列見序列表1和12)；(3)轉化受體細胞經篩選獲得陽性細胞株轉化受體細胞後，經篩選獲得基因打靶陽性細胞株；(4)陽性細胞株DNA製備培養的細胞轉入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，用I3St I酶消化，在0. 8%的凝膠上進行電泳，然後將DNA轉入纖維膜中，分別用P32標記探針雜交；(5)陽性細胞株核移植經供核細胞的培養，核移植，和胚胎移植，獲得含有人抗凝血酶III基因的克隆嶗山奶山羊。(6)判斷所述轉基因羊的方法提取提取轉基因奶山羊所生羊羔的總DNA，用PCR和Southern檢測是否為陽性。上述的方法，其特徵是所述功能基因的獲得的方法是，根據人抗凝血酶III的 DNA序列，設計PCR引物，並在引物前加入一個唯一的Bio I酶切位點(具體DNA序列見 4)，進行PCR反應，PCR產物克隆到pUC19載體上，進行序列分析，再將DNA序列分析正確的ATIII的DNA片段，加上一個Iox序列，Poly (A)序列，新黴素基因和Iox序列，使兩個Iox序列的方向相同。上述的方法，其特徵是所述基因打靶載體的構建和標記基因連接的方法是，用綿羊的酪蛋白基因片斷為探針，從嶗山奶山羊基因組文庫中分離出一段完整的酪蛋白基因，並用PCR方法去除β -酪蛋白基因的部分第二外顯子與第七外顯子及其之間的 DNA序列，建立一個Not I位點，然後將抗凝血酶III和含有兩個同一方向的Iox序列的 Poly(A)信號和新黴素基因(neo)，連接在嶗山奶山羊酪蛋白基因的表達框架上。上述的方法，其特徵是所述轉化受體細胞經篩選獲得陽性細胞株的方法是，從40d 胎齡的嶗山奶山羊胎兒中分離出胎兒成纖維細胞，分離的細胞培養在DMEM-F12的培養基中，並在培養基中添加10%胎牛血清和抗菌素，用脂質體介導的方法，將基因打靶載體轉入山羊胎兒成纖維細胞中，然後在含有G418 600μ g/mL的培養基中篩選培養18d ；細胞株再進行擴繁，一部分細胞株冷凍保存，一部分用於製備DNA。上述的方法，其特徵是所述陽性細胞株DNA製備的方法是，將培養的細胞轉入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，在55°C水浴鍋中過夜，然後加入兩倍量的純酒精，混勻，離心；用70%酒精洗DNA —次，自然乾燥，然後加入適量的Tris-EDTA溶液，待DNA全部溶解後，放入_20°C冰箱中；用I^st I酶消化過夜，在0. 8 %的凝膠上進行電泳，然後將DNA轉入纖維膜中，分別用P32標記探針雜交。上述的方法，其特徵是所述陽性細胞的細胞核移植的方法是，供核細胞的培養作為供核細胞的基因打靶細胞株從液氮中復甦後，在DMEM-F12 培養基體外培養3d，然後在含有0. 5%胎牛血清的培養基中飢餓2d，備用；核移植經同期發情和超排處理，獲得體內成熟的卵母細胞和繼母羊，用體內成熟的313個卵母細胞製備去核細胞，取飢餓3d的陽性細胞，將其移入去核卵母細胞的卵周隙中，用電刺激的方法將陽性細胞與去核卵母細胞融合，體外培養4h後，用離子黴素激活5min，再在含有6-二甲基苯胺嘌呤的培養基中培養證，將克隆胚胎移入DMEM-F12培養基中培養Id。胚胎移植克隆胚胎在培養基中培養Id後，將胚胎移植到繼母羊輸卵管內，正常懷孕，產羔；Southern blot和PCR分析表明，如結果為陽性，則證克隆羊羔含有抗凝血酶 III基因，獲得的是含有人抗凝血酶III基因的克隆嶗山奶山羊。上述的人抗凝血酶III基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法，其特徵在於所述抗凝血酶III基因是否在轉基因奶山羊體內的鑑定判斷的方法是，提取所述轉基因奶山羊羊羔耳部組織的總DNA，用PCR和Southern檢測是否為陽性；如結果為陽性，則證明克隆羊羔含有抗凝血酶III基因，獲得的是含有人抗凝血酶III基因的克隆嶗山奶山羊。本發明的優點本方法選擇嶗山奶山羊β-酪蛋白基因為表達框架，構建基因打靶載體，通過同源重組將人源性抗凝血酶III基因定點整合入嶗山奶山羊胎兒成纖維細胞株基因組上某一確定的位點，克服了隨機整合的盲目性和危險性，並且基因打靶載體的表達量高於轉基因的表達量(大約高2 10倍)；與森淼實業有限公司之前申請的專利(一種利用基因打靶技術製備哺乳動物乳腺生物反應器的方法，CN1730659A ；利用乳腺生物反應器製備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法，CN1944645A)相比，本專利公開了一種通過基因打靶技術使人抗凝血酶III基因在嶗山奶山羊乳腺細胞內表達的方法，並且所採用的基因打靶載體攜帶有人完整的抗凝血酶III基因表達序列，在人源性抗凝血III基因的後面加上牛生長激素基因的Poly(A)信號，有助於基因打靶載體在第一代克隆嶗山奶山羊的乳腺中表達人抗凝血酶III基因；本專利基因打靶載體中有兩個相同方向的Iox序列，便於將來工作中除去篩選基因，以最終獲得高效表達人抗凝血酶III基因的嶗山奶山羊乳腺生物反應器。
圖1 本發明嶗山奶山羊β -酪蛋白基因結構和基因打靶技術路線示意圖；圖2 實施例1中基因打靶細胞株及實施例2中克隆羊的PCR分析；圖3 實施例1中基因打靶細胞株及實施例2中克隆羊的Southern分析；圖4 實施例3中基因打靶克隆公羊和後代的PCR分析；圖5 實施例3中基因打靶克隆公羊和後代的Southern分析。圖1中，1，2，3，4，5，6，7，8，9是奶山羊β-酪蛋白基因的外顯子；Kpn I，Pst I,Not I是基因克隆和Southern雜交中用主要酶切位點；PA是Poly A終止信號；ATIII是抗凝血酶III基因；Lox是一段34bp DNA序列；Neo是新黴素基因；弓丨物A或B是用於長片段PCR反應(產物5.7KB)的引物；弓丨物C或D是用於短片段PCR反應(產物0.851Λ)的引物；Southern雜交探針用I3St I和Kpn I之間的DNA序列。圖2中，1是實施例2中基因打靶克隆羊PCR條帶；2、4是實施例1中基因打靶的胎兒成纖維細胞株PCR條帶；3是對照組羊DNA條帶；W是空白對照；MW是分子量標記。DNA 用Pst I酶切，Pst I和Kpn I之間的DNA為探針。PCR條件94°C 2min ；94°C 25s ；65°C 15s ；72°C 8min，共 31 循環；最後在 68°C下 IOmin0
圖3中，1是實施例2中基因打靶克隆羊的Southern條帶，2是實施例1中基因打靶胎兒成纖維細胞株的Southern分析條帶；3是對照組羊DNA的Southern分析條帶。圖4 中，其中，a，b，c，d，e，f，g，h，i，j，k，1，m，n，o，p，q，r, s 是基因打靶克隆羊的後代的DNA樣品，t是基因打靶克隆公羊本身的DNA樣品；麗是DNA分子量；5. Okb片段是山羊的基因組片段，6. Okb是基因靶片段。圖5中，a，e，f，g, h，j，m，o，q，r，t是PCR檢測陽性的奶山羊基因Southern分析；5. Okb片段是山羊的基因組片段，6. Okb是基因打靶片段。
具體實施例方式以下結合附圖和實施例對本發明作進一步闡述。實施例1 人抗凝血酶III基因轉入嶗山奶山羊體內的方法1材料及試劑本試驗所用化學試劑購自Sigma-Aldrich公司；所用內切酶、載體、分子量標記等分子生物學方面的試劑購自hvitrogen公司；培養基購自Gibco公司。2具體步驟(1)功能基因的獲得從人肝臟組織中獲得抗凝血酶III (ATIII)基因的mRNA，逆轉錄成cDNA ；然後通過 PCR方法建立兩端的連接酶切位點。PCR產物連接在pUC19質粒上，再進行DNA序列分析； 克隆的ATIII基因的DNA序列與已公開的DNA序列相同。具體方法抗凝血酶III基因的製備是根據已公開的ATIII的DNA順序(Gene Bank, D29832)，設計PCR引物(並在引物前加入一個唯一的Β ο I酶酶切位點)進行PCR 反應，PCR產物克隆到pUC19載體上，進行序列分析，再將DNA序列分析正確的ATIII的DNA 片段，加上一個Iox序列，Poly (A)序列，新黴素基因(neo)和Iox序列，使兩個Iox序列的方向相同，最後連接到嶗山奶山羊酪蛋白DNA載體的表達框架上。(2)基因打靶載體的構建用綿羊的酪蛋白基因片斷為探針，從嶗山奶山羊基因組文庫中分離出一段完整的酪蛋白基因，並用PCR方法去除酪蛋白基因的第二外顯子與第七外顯子及其之間的部分DNA序列，建立一個Not I位點，然後將抗凝血酶III和含有兩個同一方向的 Iox序列的Poly(A)信號和新黴素基因，連接在酪蛋白基因的表達框架上。(3)轉化受體細胞從40d胎齡的嶗山奶山羊胎兒中分離出胎兒成纖維細胞，分離的細胞培養在 DMEM-F12(1 1)培養基中，並在培養基中添加10%胎牛血清(FCS)和抗菌素，用脂質體介導的方法將基因打靶載體轉入山羊胎兒成纖維細胞中，然後在含有G418(600yg/mL)的培養基中篩選培養18d ；本實施例共獲得6個陽性細胞，建立6個原始細胞系，從中篩選了 4 個細胞系用於細胞轉染；對陽性細胞株進行擴繁，一部分細胞株冷凍保存，一部分用於製備 DNA。(4)受體細胞株DNA製備，Southern分析將培養的細胞轉入DNA裂解液(含有蛋白酶K)中，在55°C水浴鍋中過夜，然後加入兩倍的純酒精，混勻，離心；用70%酒精洗DNA—次，自然乾燥，然後加入適量的 Tris-EDTA溶液，待DNA全部溶解後，放入_20°C冰箱中。用I^st I酶消化過夜，在0. 8%的凝膠上進行電泳，然後將DNA轉入纖維膜中，用P32標記探針進行雜交。獲得DNA的Southern 圖片(細胞株的基因打靶分析)，相關結果見表一，共分離6個嶗山奶山羊的胎兒細胞，建立 6個原始細胞系。從中篩選了4個細胞系用於細胞轉染。表一細胞的生長與轉基因和基因打靶效率
權利要求
1.人抗凝血酶III基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法，該方法包括以下步驟功能基因的獲得；基因打靶載體的構建和標記基因的接入；轉化受體細胞經篩選獲得陽性細胞株；陽性細胞株DNA製備；陽性細胞株經核移植，獲得含有人抗凝血酶III基因的克隆嶗山奶山羊和轉基因奶山羊的鑑定；其特徵是(1)功能基因的獲得從人肝臟組織中獲得人抗凝血酶III基因的mRNA，逆轉錄成cDNA ；通過PCR方法建立兩端的連接酶切位點；PCR產物連接在pUC19質粒上，再進行DNA序列分析；(2)基因打靶載體的構建和標記基因的接入以嶗山奶山羊β-酪蛋白基因為基因打靶載體，分別將人抗凝血酶III基因，Iox序列， poly(A)信號，新黴素抗性篩選基因(neo)和Iox序列依次構建到β-酪蛋白基因為表達框架中；(3)轉化受體細胞經篩選獲得陽性細胞株轉化受體細胞後，經篩選獲得基因打靶陽性細胞株；(4)陽性細胞株DNA製備培養的細胞轉入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，用I3St I酶消化，在0. 8%的凝膠上進行電泳，然後將DNA轉入纖維膜中，分別用P」標記探針雜交；(5)陽性細胞株核移植經供核細胞的培養，核移植和胚胎移植，獲得含有人抗凝血酶III基因的轉基因嶗山奶山羊；(6)轉基因奶山羊的鑑定提取奶山羊組織DNA，通過PCR或Southern分析，進行轉基因奶山羊的鑑定。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵是所述功能基因的獲得方法是，根據人抗凝血酶III的DNA順序，設計PCR引物，並在引物前加入一個唯一的Β ο I酶酶切位點，進行PCR 反應，PCR產物克隆到pUC19載體上，進行序列分析，再將DNA序列分析正確的ATIII的DNA 片段，加上一個Iox序列，Poly (A)序列，新黴素基因和Iox序列，使兩個Iox序列的方向相同。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵是所述基因打靶載體的構建和標記基因接入的方法是，用綿羊的酪蛋白基因片斷為探針，從嶗山奶山羊基因組文庫中分離出一段完整的酪蛋白基因，並用PCR方法去除β-酪蛋白基因的第二外顯子與第七外顯子及其之間的部分DNA序列，建立一個Not I位點，然後將抗凝血酶III和含有兩個同一方向的 Iox序列的Poly(A)信號和新黴素基因，連接在嶗山奶山羊酪蛋白基因的表達框架上。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵是所述轉化受體細胞經篩選獲得陽性細胞株的方法是，從40d胎齡的嶗山奶山羊胎兒中分離出胎兒成纖維細胞，分離的細胞培養在 DMEM-F12的培養基中，並在培養基中添加10%胎牛血清和抗菌素，用脂質體介導的方法， 將基因打靶載體轉入山羊胎兒成纖維細胞中，然後在含有G418 600yg/mL的培養基中篩選培養18d ；細胞株再進行擴繁，一部分細胞株冷凍保存，一部分用於製備DNA。
5.按照權利要求1所述的方法，其特徵是所述陽性細胞株DNA製備的方法是，將培養的細胞轉入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，在55°C水浴鍋中過夜，然後加入兩倍量的純酒精，混勻，離心；用70%酒精洗DNA —次，自然乾燥，然後加入適量的Tris-EDTA溶液，待DNA全部溶解後，放入-20°C冰箱中；用Pst I酶消化過夜，在0. 8%的凝膠上進行電泳，然後將DNA轉入纖維膜中，分別用 P32標記探針雜交。
6.按照權利要求1所述的方法，其特徵是所述陽性細胞的細胞核移植的方法是，供核細胞的培養作為供核細胞的基因打靶細胞株從液氮中復甦後，在DMEM-F12培養基體外培養3d，然後在含有0. 5%胎牛血清的培養基中飢餓3d，備用；核移植經同期發情和超排處理，獲得體內成熟的卵母細胞和繼母羊，用體內成熟的 313個卵母細胞製備去核細胞，取飢餓3d的陽性細胞，將其移入去核卵母細胞的卵周隙中， 用電刺激的方法將陽性細胞與去核卵母細胞融合，體外培養4h後，用離子黴素激活5min， 再在含有6- 二甲基苯胺嘌呤的培養基中培養證，將克隆胚胎移入DMEM-F12培養基中培養 Id。胚胎移植克隆胚胎在培養基中培養Id後，將胚胎移植到繼母羊輸卵管內，正常懷孕， 產羔；Southern blot和PCR分析表明，克隆羊羔含有抗凝血酶III基因，獲得的是含有人抗凝血酶III基因的克隆嶗山奶山羊。
7.按照權利要求1所述的人抗凝血酶III基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法，其特徵在於所述抗凝血酶III基因是否在轉基因奶山羊體內的鑑定判斷的方法是，提取所述轉基因奶山羊羊羔耳部組織的總DNA，用PCR和Southern檢測是否為陽性；如結果為陽性，則證明克隆羊羔含有抗凝血酶III基因，獲得的是含有人抗凝血酶III基因的克隆嶗山奶山羊。
全文摘要
本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種利用基因打靶技術，使人抗凝血酶III基因在嶗山奶山羊乳腺中表達的方法。本法構建的基因打靶載體，通過同源重組將人源性抗凝血酶III基因定點整合入嶗山奶山羊胎兒成纖維細胞株基因組上某一確定的位點，克服了隨機整合的盲目性和危險性，並且基因打靶載體的表達量高於轉基因的表達量(大約高2～10倍)；在人源性抗凝血III基因的後面加上牛生長激素基因的poly(A)信號，有助於基因打靶載體在第一代克隆嶗山奶山羊的乳腺中表達人抗凝血酶III基因；本基因打靶載體中有兩個相同方向的lox序列，便於將來工作中除去篩選基因，以最終使人抗凝血酶III基因在嶗山奶山羊體內高效表達。
文檔編號A01K67/027GK102296088SQ20111025219
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月30日 優先權日2010年9月7日
發明者袁三平, 鄒賢剛 申請人:青島森淼實業有限公司