定性檢測細胞色素氧化酶cyp2c19基因分型的測序引物對及其試劑盒的製作方法

2024-01-26 04:24:15

專利名稱：定性檢測細胞色素氧化酶cyp2c19基因分型的測序引物對及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及體外核酸檢測領域，尤其涉及一種在臨床樣本中檢測常用藥物代謝的細胞色素氧化酶CYP2C19基因的兩個位點的基因分型的測序引物對及其試劑盒，即CYP2C19*2 (681G/A)與 CYP2C19*3 (636G/A)兩個位點的基因分型。
背景技術：
細胞色素P450(CytochromeP450，CYP450)是由一組結構和功能相關的超家族基因(Superfamily gene)編碼的同工酶，在人類身體中，其主要存在於肝細胞微粒中。在CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15個亞家族，它們代謝約20%目前臨床使用的藥物。其中CYP2C19 (S-美芬妥英羥化酶)是CYP450的主要成分之一，CYP2C19基因cDNA全長1940，含有9個外顯子，編碼區為1473bp。其編碼的蛋白S-美芬妥英羥化酶代謝一系列臨床藥·物，如氯吡格雷、美芬妥英、奧美拉唑、普萘洛爾、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等。研究表明很多藥物代謝表型的差異源於CYP2C19基因突變，中國人常見的兩種單核苷酸突變為CYP2C19*2型和CYP2C19*3型，分別為CYP2C19基因的第5外顯子G681A和第4外顯子G636A的突變。其中CYP2C19*2型G681A點突變產生了一個異常的拼接位點，使外顯子5 '端的前40bp核苷酸發生缺失，改變了隨後mRNA的閱讀框，從而使蛋白的合成過早終止，使其合成的S-美芬妥英羥化酶缺乏血紅素結合位點，使其失去活性。CYP2C19*3型G636A點突變使編碼色氨酸密碼子變為終止子，也導致蛋白合成提前終止，使合成的酶缺乏血紅素及底物結合區而失去活性。這些點突變引起了 S-美芬妥英羥化酶的活性和下降，代謝底物的能力減弱，使血藥濃度增高，從而引起與血藥濃度相關的藥品不良反應。根據CYP2C19基因型改變而引起酶代謝活性的改變，可將人群根據對藥物代謝能力分為三大類藥物強代謝型(EM，extensive metabolisers)CYP2C19野生型，CYP2C19雜合型代表的是中間代謝型(頂)，弱代謝型(PM)為突變型純合子。CYP2C19*2在中國人中發生率是30%，CYP2C19*3是5%，而這兩種突變幾乎涵蓋了中國人所有的弱代謝型(PM)。CYP2C19基因型與腫瘤發病危險性CYP2C19基因的遺傳多態性與多種腫瘤癌症的發生有關。研究結果表明，CYP2C19可能參與食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鱗狀細胞肺癌、肝癌等前致癌物的活化，即CYP2C19基因的突變將增加患食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鱗狀細胞肺癌、肝癌的危險性。因此，對人群中CYP2C19基因進行分型檢測，能為臨床上對某些腫瘤的易感性預測以及早期癌變預警提供重要的理論依據，有助於腫瘤癌症的前期預防。CYP2C19基因主要影響的幾種藥物代謝有氯吡格雷氯吡格雷為噻吩並吡啶衍生物，是一類新型的抗血小板藥物，氯吡格雷本身無治療效應，它由細胞色素P450氧化生成活性代謝產物(一種硫醇衍生物)而發揮作用。CYP2C19的變異是目前發現的氯吡格雷療效個體差異的主要原因。CYP2C19基因的突變降低了氯吡格雷抗血小板聚集的療效，並呈現出基因劑量效應。
美芬妥英美芬妥英是臨床常用廣譜抗癲癇藥，其血藥濃度、療效和不良反應存在顯著個體差異，主要與藥物代謝及反應的遺傳多態性有密切關係。其中CYP2C19基因多態性可引起不同個體服用美芬妥英後出現特異性的藥理及毒理作用，造成藥物治療效果的差
巳
升。 奧美拉唑奧美拉唑是目前應用最為廣泛的質子泵抑制劑(PPI)之一,能抑制胃酸分泌，但長期大劑量使用將增加患者骨折的危險。在CYP2C19強代謝型人群中，奧美拉唑80%都是由CYP2C19代謝。故此，CYP2C19基因突變型人群使用奧美拉唑的療效顯著低於CYP2C19基因野生型人群。CYP2C19基因參與的藥物代謝還包括普萘洛爾、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等，患者對這些藥物的敏感性、耐藥性以及不良反應狀況都與患者本身CYP2C19基因多態性相關。因此根據檢測CYP2C19基因型的多態性來選擇用藥或者選擇最小有效劑量治療方案有重要的臨床意義。目前醫院用於CYP2C19基因分型檢測的「金標準」是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對於含〈10%突變細胞的腫瘤組織以及外周血，常規PCR+直接測序法幾乎無能為力。相比於直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基於聚合原理的DNA測序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術。它是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中並釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，並由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然後加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達到測定DNA序列的目的目前市場上還沒有利用焦磷酸技術進行CYP2C19的基因多態性檢測的產品。

發明內容
本發明的目的是提供一種特異性高、準確性好、能夠定性檢測細胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的測序引物對及其試劑盒。為了達到上述目的，本發明採用如下技術方案一種檢測CYP2C19基因分型的焦磷酸測序引物對，所述引物對為如下引物CYP2C19*2 正向擴增引物5' -CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA-3' (SEQ ID NO. I)；CYP2C19*2 反向擴增引物5' -CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC-3' (SEQ ID NO. 2)CYP2C19*2 測序引物5' -AAGTAATTTGTTATGGGTTC-3' (SEQ IDN0. 3)CYP2C19*3 正向擴增引物5' -GCAATGTGATCTGCTCCATTATTT-3' (SEQ ID NO. 4)CYP2C19*3 反向擴增引物5' -GCAAAAAACTTGGCCTTACCTG-3' (SEQID NO. 5)CYP2C19*3 測序引物5' -TTGTAAGCACCCCCT-3' (SEQ ID NO. 6)其中，CYP2C19*2正向擴增引物(SEQ ID NO. I)和 CYP2C19*3 (SEQ IDNO. 5)反向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。一種定性檢測細胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的測序試劑盒，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向擴增引物的PCR反應液2，SEQ ID NO. I所示的正向擴增引物，SEQ IDNO. 5所示的反向擴增引物，SEQID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5』端進行生物素標記。進一步地，所述試劑盒中還包括質控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對照品的超純水；質控序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用於檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。進一步地，所述試劑盒還包括CYP2C19*2陽性對照品1，CYP2C19*2陽性對照品2，CYP2C19*2陽性對照品3 ;CYP2C19*3陽性對照品1，CYP2C19*3陽性對照品2，CYP2C19*3陽性對照品3 ；所述CYP2C19*2陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的CYP2C19*2野生純合子質粒；所述CYP2C19*2陽性對照品2為插有SEQ IDN0. 9所示核苷酸序列的·CYP2C19*2突變純合子質粒；CYP2C19*2陽性對照品3為由所述CYP2C19*2突變純合子質粒和所述CYP2C19*2野生純合子質粒組成的CYP2C19*2質粒混合物；所述CYP2C19*3陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的CYP2C19*3野生純合子質粒；CYP2C19*3陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的CYP2C19*3突變純合子質粒；CYP2C19*3陽性對照品3為由所述CYP2C19*3突變純合子質粒和所述CYP2C19*3野生純合子質粒組成的CYP2C19*3質粒混合物；其中，質粒載體為pMD18-T質粒；所述CYP2C19*2質粒混合物中CYP2C19*2突變純合子質粒和所述CYP2C19*2野生純合子質粒的數量比為I: I ;所述CYP2C19*3質粒混合物中CYP2C19*3突變純合子質粒和所述CYP2C19*3野生純合子質粒的數量比為1:1。所述的PCR反應液I和PCR反應液2中其他組分為常規的10 x PCR Buffer、dNTP和1120，各組分按常規體積比配置(10 X PCR Buffer、dNTP、H20和反應液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑，如尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本發明的優點及有益效果I)本發明提供的定量檢測CYP2C19基因分型的焦磷酸測序試劑盒定性準確，具有靈敏性高、特異性強的優點，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機反應，直接給出檢測位點頻率分析，結果直觀。2)本發明提供的定量檢測CYP2C19基因分型的焦磷酸測序試劑盒靈敏度和特異性高；3)本發明提供的定量檢測CYP2C19基因分型的焦磷酸測序試劑盒檢測速度快；4)本發明提供的定量檢測CYP2C19基因分型的焦磷酸測序試劑盒步驟簡單；5)本發明提供的定量檢測CYP2C19基因分型的焦磷酸測序試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。6)本發明的試劑盒中設置了空白對照和陽性對照，能更好的確保檢測結果的準確性。由於設計了靈敏度高，特異性好的引物，並且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒能夠對CYP2C19基因分型進行快速檢測。本發明的試劑盒可實時監測反應進程，反應時間短，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，高通量，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用於突變分析。


圖I為臨床樣本CYP2C19*2突變型純合子的焦磷酸測序圖；圖2為臨床樣本CYP2C19*2突變雜合型的焦磷酸測序圖；圖3為臨床樣本CYP2C19*2野生型的焦磷酸測序圖。圖4為臨床樣本CYP2C19*3野生型的焦磷酸測序圖。
圖5為臨床樣本CYP2C19*3突變雜合型的焦磷酸測序圖。圖6為臨床質控品control oligo的焦磷酸測序結果圖；圖7為臨床空白對照的焦磷酸測序結果圖；圖8為多組設計引物的凝膠電泳圖；圖中①、②表明非特異性條帶，③表明特異性和片段大小均比較合適，④表明目的帶片段大小不對。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例I :試劑盒的製備I.引物的設計與合成研究表明目前針對CYP2C19基因多態性主要是CYP2C19*2和CYP2C19*3兩種基因多態性，CYP2C19*2基因突變主要發生在第5號外顯子第681核苷酸上G突變成A，CYP2C19*3型基因突變主要發生在第4號外顯子第636核苷酸上G突變成A，。使用PyroMarkAssay Design2. O軟體，根據這兩個突變位點(表I)設計並確定了 PCR擴增引物和焦磷酸測序引物(表2)，試劑盒中最主要的影響試劑盒的準確性的就是引物，包括擴增引物和測序引物，在設計的初期，我們設計了多組引物進行比較(見圖7);其中擴增引物和測序引物先經過PAGE純化，再經HPLC純化，其中CYP2C19*2正向擴增引物(SEQ ID NO. I)和CYP2C19*3(SEQ ID N0:5)反向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。表I.突變位點與類型
權利要求
1.一種定性檢測細胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的測序引物對，其特徵在於，所述引物對為SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物;其中，SEQID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5』端進行生物素標記。
2.一種定性檢測細胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的測序試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向擴增引物的PCR反應液2，SEQ ID NO. I所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 5所示引物的5』端進行生物素標記。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括SEQID NO. 7所示的質控品和空白對照品。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述空白對照品為水。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括CYP2C19*2陽性對照品1，CYP2C19*2陽性對照品2，CYP2C19*2陽性對照品3 ;CYP2C19*3陽性對照品1，CYP2C19*3陽性對照品2，CYP2C19*3陽性對照品3 ； 所述CYP2C19*2陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的CYP2C19*2野生純合子質粒；所述CYP2C19*2陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的CYP2C19*2突變純合子質粒；CYP2C19*2陽性對照品3為由所述CYP2C19*2突變純合子質粒和所述CYP2C19*2野生純合子質粒組成的CYP2C19*2質粒混合物； 所述CYP2C19*3陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的CYP2C19*3野生純合子質粒；CYP2C19*3陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的CYP2C19*3突變純合子質粒；CYP2C19*3陽性對照品3為由所述CYP2C19*3突變純合子質粒和所述CYP2C19*3野生純合子質粒組成的CYP2C19*3質粒混合物； 其中，質粒載體為PMD18-T質粒。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述CYP2C19*2質粒混合物中CYP2C19*2突變純合子質粒和所述CYP2C19*2野生純合子質粒的數量比為1:1。
7.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述CYP2C19*3質粒混合物中CYP2C19*3突變純合子質粒和所述CYP2C19*3野生純合子質粒的數量比為1:1。
全文摘要
本發明提供一種定性檢測細胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的測序引物對及其試劑盒，屬於體外核酸檢測領域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反應液、PCR擴增引物、焦磷酸測序引物、以及陽性對照品；本發明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用於突變分析。
文檔編號C12N15/11GK102912013SQ201210348050
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者周姍 申請人:長沙三濟生物科技有限公司