一種轉基因作物花粉競爭劑及其用於棉花制種的方法
2024-01-19 10:11:15
專利名稱：一種轉基因作物花粉競爭劑及其用於棉花制種的方法
技術領域：
本發明涉及轉基因作物雜交制種的轉基因花粉競爭劑及用該競爭劑對轉基因作物進行雜交制種的方法。特別是一種用於雜交制種的轉基因花粉競爭劑和種、苗純度選擇劑，以及用該花粉競爭劑和種、苗純度選擇劑對轉基因棉花進行雜交制種的方法。屬於農業雜交制種技術領域。
背景技術：
我國目前轉基因作物(如棉花)雜交種子生產方法主要靠人工去雄、人工授粉。該生產方法的不足之處是用工多，種子雜，價格高，限制了雜交一代種子大面積利用。在高產、優質優勢組合確定以後，生產雜交種子既要制種產量高，又要減少用工時間和勞動強度，還要保證雜交種純度，這是簡化制種的重點和難點，也是科技工作者亟待解決的重大技術難題。
如，在棉花制種中，如果採用不去雄直接授粉就可以減輕70％以上制種的工作量。但，因同時自花授粉產生的假雜種比例高達50％以上，不能保證雜交種純度，所以，此方法一直不能在制種生產中應用。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能不去雄授粉的轉基因作物花粉競爭劑和種苗純度選擇劑。
本發明進一步的目的在於提供一種採用轉基因花粉競爭劑和種苗純度選擇劑對抗蟲、抗除草劑棉花雜交組合進行棉花雜交制種的方法。
本發明雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑由卡那黴素或者新黴素、蔗糖為溶質、以蒸餾水為溶劑配製而成。
本發明雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑所述的卡那黴素或者新黴素、蔗糖在競爭劑溶液中含有卡那黴素或者新黴素0.02--1g·L-1、蔗糖50-480g·L-1。
本發明所述的雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑中可以含有草甘膦。
本發明所述的雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑中草甘膦在競爭劑溶液中含有草甘膦0.01-0.1g·L-1。
本發明所述的雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑中還可以含有促進父本花粉萌發、花粉管生長營養劑及殺蟲劑。
本發明所述的雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑中的促進父本花粉萌發、花粉管生長營養劑、殺蟲劑可以為赤黴素、硼酸、硝酸鈣、硫酸鎂、敵殺死之一種或多種。
本發明所述的赤黴素、硼酸、硝酸鈣、硫酸鎂、敵殺死可以在競爭劑溶液中含有GA30.01-0.2g·L-1、H3BO30.01-0.2g·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 0.1-3g·L-1、MgSO4·7H2O 0.1---3g·L-1、敵殺死0.01---0.05％，其中之一種或多種。
本發明的花粉競爭劑在使用中可以加入少量土溫80做展布劑，增加對柱頭的覆蓋效果。
本發明的種子純度選擇劑包括抗病蟲種衣劑，在該抗病蟲種衣劑中含有草甘膦；草甘膦、抗病蟲種衣劑在選擇劑中按重量百分比計含有草甘膦30-40％；抗病蟲種衣劑60-70％。
本發明轉基因棉花雜交制種的方法有(一)、對抗除草劑雜交組合的步驟如下(1)、以非抗除草劑棉花B作為母本，以抗除草劑的轉基因棉花A作為父本，配成雜交組合；(2)、棉花開花期的每天上午，用裝有上述技術方案含草甘膦的花粉競爭劑的液體C的微型噴霧器，對棉花B的花朵柱頭、花葯噴霧後，即用轉基因棉花A的花粉對B柱頭雜交授粉；或者，(3)、搜集父本轉基因棉花A的抗性花粉於上述技術方案中含草甘膦的花粉競爭劑的液體C中配成花粉液，將花粉液點塗或噴霧到母本棉花B柱頭上雜交授粉；(4)、用上述技術方案中的種子純度選擇劑，對該收穫的種子進行包衣處理選擇，完成雜交種子生產。
(二)、對抗蟲雜交組合的步驟如下(1)、以非轉基因棉花B作為母本，轉基因抗蟲棉花A作為父本，配成雜交組合；(2)、棉花開花期的每天上午，用裝有上述技術方案中不含草甘膦的花粉競爭劑的液體C的微型噴霧器，對非轉基因棉花B的花朵柱頭、花葯噴霧後，即用轉基因棉花A的花粉對B柱頭雜交授粉；或者，(3)、搜集父本轉基因棉花A的花粉於上述技術方案中不含草甘膦的花粉競爭劑的液體C中配成花粉液，將花粉液點塗或噴霧到母本非轉基因棉花B柱頭上雜交授粉；(4)、雜交種子在苗床播種出苗後，用5g·L-1的卡那黴素液噴苗，7天後選擇拔除有黃斑的假雜種苗。
本發明的關鍵技術設計是對轉基因作物(如棉花，下同)雜交組合制種時對花粉和種、苗進行「兩次選擇」的制種理論及方法，即以保證非抗性植物母本柱頭正常生活能力，提高制種產量為前提；以植物抗性基因(抗除草劑草甘膦，抗卡那黴素等)為選擇基礎；以「花粉競爭」提高真雜種比例為手段；以「種子選擇」去除假雜種為種子純度保證。在不具抗性的母本花器柱頭體細胞、母本花粉配子體細胞和具有抗性的父本花粉配子體細胞之間，利用三者對某些化學藥劑在生理、生化反應上的抗性差異，在母本柱頭上創造出一種能促進父本花粉、抑制母本花粉萌發和花粉管生長的競爭微環境，形成並加大父、母本花粉競爭差異。在花粉萌發和花粉管生長的約20個小時內，通過提高具有抗性的父本花粉在柱頭上萌發率和花粉管的生長速度，使其精細胞比受抑制的母本花粉精細胞能夠更早、更快地到達子房，更多地佔據有限的胚囊卵細胞位置，完成受精過程，達到父、母本花粉競爭和選擇、提高雜種率的目的。再對其生產的種子進行抗性藥劑包衣處理選擇，去掉可能產生的假雜種，以確保雜交種子純度，從而實現不去雄直接授粉簡化制種。
通過在棉花柱頭上創造競爭的微環境，對父、母本進行「花粉競爭選擇」提高雜種率，並對所產種子採用『種子包衣選擇』保證種子純度的「兩次選擇」的制種理論及其方法設計，可以用於棉花、小麥、水稻、油菜、蔬菜等轉基因作物的簡化雜交制種。
本發明提出使用花粉競爭劑授粉，改變常規的授粉方法。
本發明的轉基因作物花粉競爭藥劑是利用轉基因抗蟲植物常具有的編碼氨基糖苷3』--磷酸轉移酶II〔APH(3』)-II〕抗卡那黴素、新黴素標記基因，以及抗除草劑草甘膦等轉基因特性，與非抗性株系配成雜交組合；根據父、母本花粉的物理、生化特性，保持和增加花粉活性，擴大父母本花粉的競爭差異，使其達到能夠競爭選擇的目的。本人在棉花花粉離體萌發試驗中，加入0.05g·L-1的卡那黴素後，非抗性花粉比對照萌發率下降84.5％，花粉管長度短45.6％，差異極顯著；而抗性花粉與對照比差異不顯著；採用花粉競爭劑授粉制種的真雜種比例，比不用競爭劑但同樣採取不去雄授粉制種增加27％，達到76％。同時，加入抗蟲劑可以保花、保鈴；且花粉萌發、保鈴又與激素、硼、鈣等物質關係密切；不同植物花粉的等滲濃度差異很大，必須加入不同濃度的蔗糖等。故，花粉競爭劑配方由花粉等滲劑、父本花粉促進劑、母本花粉抑制劑、花粉生長營養劑、殺蟲劑等組成。
本發明的花粉競爭劑，適用於具有抗除草劑草甘膦、抗卡那黴素與抗蟲連鎖等顯性標記性狀的轉基因植物作父本，與非抗植物作母本的雜交組合。顯性性狀包括抗卡那黴素、草甘膦、等除草劑、抗生素中一種或一種以上化學藥劑的作物雜交組合。
本發明的制種方法與現有制種技術相比具有如下優點(以抗草甘膦兼抗蟲棉花雜交組合為例)①、本發明實現了棉花簡化、省工制種，解決了不去雄直接授粉難題。省去目前大面積採用的手工去雄程序，在與原人工授粉用工相同或減少的情況下，一次性完成了授粉、花粉競爭選擇等兩道工序；且花朵的可視性遠比去雄後的柱頭要好，又省去標記程序，加快授粉速度。可節約70％以上的人工制種成本。因此，減輕了勞動強度，可以大幅度降低制種成本。
②、本發明保證了雜交種子的純度。由於採用了抗除草劑等顯性標記棉花做父本，經過『花粉競爭』，在保證了父本抗性基因純度，抑制了母本中非抗性花粉萌發後，又通過『種子選擇』機械包衣處理，直觀、安全、自動清除並杜絕了假雜種，確保雜交一代種子純度。這是包括人工去雄等現有各種制種方法所不可能達到的純度比例。而且此工藝便於工廠化生產，把田間農民人工去雜前移到工廠化自動處理。也減輕制種者、管理者的市場風險。
③、本發明保證了制種產量。由於採用花粉競爭雜交法授粉，提高了真雜交種子產量，不用人工去雄，避免了人工去雄對子房的手工損傷，而且授粉量大，所以單株成鈴率高，因此，保證了制種田產量。
④、本發明提出的液體花粉授粉法，與目前採用的乾粉授粉相比較，用液體花粉授粉具有可以加入激素、殺蟲劑、促進劑等藥劑，便於合併多項作業的優點，且花粉授粉均勻、利用率高，花粉萌發率高，棉鈴脫落少，還可以實現小型機械噴霧授粉。
⑤、本發明提出用加有除草劑的包衣劑處理種子，具有保證了種子質量和純度、可以工廠化生產、在出苗期早識別、安全自動清除假雜種、杜絕假冒、偽劣種子等多種優點，使種苗具有可識別性，使農民用上放心種子。
⑥、本發明在棉花柱頭上塗抹或噴霧花粉競爭藥劑，只針對最關鍵部位施藥，採用『外科手術』的辦法處理柱頭；只在柱頭上創造一種微競爭環境，抑制而不殺死花粉。比化學殺雄方法的整株噴霧殺死花粉，更直接、安全和有效，解決了多年來棉花化學殺雄不能成功的難題，減少用藥量和藥害，減少環境汙染，降低藥劑成本和工時。
⑦、此種方法生產的抗草甘膦雜交種子，可以在田間使用滅生性除草劑，比較徹底地解決棉田草害，減輕鋤草勞動強度，降低生產成本，提高棉花產量，實現規模化生產。
⑧、本發明有利於高產組合的自由選配。因為不需要不育系，只要求父、母本一方是轉基因品系即可。因此，容易篩選到大批高產優質組合，特別是對於棉花、小麥等在三系制種應用上尚存在問題的作物，更有應用價值；對雜交種子的育種方向提出一條途徑。
⑨、使用轉基因花粉競爭劑的不去雄授粉制種方法的雜交種子比例，要比對照提高25％，達到75％以上。提高了制種效率，減少假雜種數量。
具體實施例方式
實施例1對抗草甘膦、抗蟲的棉花雜交組合，用卡那黴素、草甘膦和蔗糖在蒸餾水中(以下各實施例同)配成花粉競爭劑，其中卡那黴素0.08g·L-1，蔗糖460g·L-1，草甘膦0.042g·L-1。
用卡那黴素0.08克，蔗糖460克，草甘膦0.042克，加入到1000毫升蒸餾水中，再加入0.1克土溫80做展布劑。
以非轉基因棉花鄂抗病棉B為母本，以抗草甘瞵棉花A為父本，配成雜交組合。開花期每天上午，制種人員一手持裝有花粉競爭劑的小噴霧器，對準母本B的柱頭和花葯噴霧後，另一手隨即拿一父本A的開放花朵，在父本B柱頭上授粉雜交；一朵父本花可為5朵母本花授粉。
花粉選擇的效果檢查方法用1g·L-1的草甘膦溶液浸泡棉種直到種子分層，在30℃條件下保溼萌發，72小時後檢查，有氣生根毛、頸葉綠者為真雜種，黑根斑、無氣生根毛為假雜種。統計比例後，真雜交種高於65％為有效。
棉花收穫後，對生產的雜交種子用硫酸脫絨，用雜交種子純度選擇劑進行種子包衣處理。播種後，只有抗草甘瞵的雜交種可以出苗正常生長，假雜種不能出苗或出苗後很快死亡.達到種子選擇的目的。雜交種子純度達到97％。
也可以不用除草劑包衣，棉苗出齊後，結合苗床化除，用1g·L-1草甘膦噴霧，殺死假雜種。
實施例2，對抗卡那黴素的抗蟲棉花雜交組合，卡那黴素和蔗糖用蒸餾水配成花粉競爭劑，其中卡那黴素0、1g·L-1，蔗糖420g·L-1。
噴霧時加入0.01％土溫80作展布劑。
以非轉基因棉花鄂抗病棉B為母本，以轉基因抗蟲棉花A為父本，配成高產組合。早上取30克父本花粉放入100毫升花粉競爭液中，用毛筆蘸取花粉液，塗在母本花的柱頭上，或用噴霧器對柱頭噴霧，完成了一朵花的雜交授粉工作。
雜交種子播種出苗後，用5g·L-1卡那黴素液噴苗，10天後選擇拔除黃斑不抗的假雜種苗，完成種苗選擇。雜交種子的純度達到95％以上。
實施例3
對抗蟲且有雞腳葉、無腺體等顯性標記性狀抗蟲棉花組合，新黴素、蔗糖、赤黴素、硼酸、硝酸鈣和硫酸鎂在花粉競爭劑溶液中含有新黴素0、07g·L-1，蔗糖450g·L-1，赤黴素0、1g·L-1，硼酸0、1g·L-1，硝酸鈣0、3g·L-1，硫酸鎂0、2g·L-1。
花粉競爭劑的使用方法同實施例2。其真假雜種選擇方法與實施例2相同，只是還可以進一步拔除非雞腳葉、無腺體標記的假雜種。雜交種子的純度達到98％。
實施例4對父本抗除草劑草甘膦兼抗蟲的棉花雜交組合，卡那黴素、草甘膦、蔗糖、赤黴素和硼酸在花粉競爭劑溶液中含有卡那黴素0.05g·L-1，蔗糖380g·L-1，草甘膦0.042g·L-1，赤黴素0、08g·L-1，硼酸0、15g·L-1。
花粉選擇及種子包衣選擇方法同實施例1。雜交種子的純度達到97％。
實施例5對蟲害重的棉田，在上述實施例1、2、3、4的花粉競爭劑中，加入殺蟲劑敵殺死0.03％，其他組分和方法相同。
實施例6對母本抗蟲的轉基因棉花，需父本抗除草劑。在花粉競爭劑溶液中含有草甘膦0、04g·L-1，蔗糖400g·L-1。
其制種和種子選擇方法同實施例1。雜交種子的純度達到98％。
實施例7對於雜交小麥制種，用抗草甘膦小麥作父本；在花粉競爭劑溶液中含有草甘膦0.03g·L-1，蔗糖100g·L-1。
開花期，每天對母本開穎麥穗噴霧後，用抗草甘膦小麥授粉，其種子用含草甘膦的種衣劑處理。
對於棉花雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑，蔗糖在溶液中含有350-480g·L-1，而其它的農作物花粉等滲濃度一般需蔗糖50-480g·L-1。
權利要求
1.一種雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑，其特徵是該花粉競爭劑由以卡那黴素或者新黴素、蔗糖為溶質、以蒸餾水為溶劑配製而成，專用於轉基因作物抗性花粉和非抗性花粉的競爭選擇，結合種、苗選擇劑，實現不去雄授粉雜交制種。
2.根據權利要求1所述的一種雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑，其特徵是所述的卡那黴素或者新黴素、蔗糖，在競爭劑溶液中含有卡那黴素或者新黴素0.02--1g·L-1，蔗糖50-480g·L-1。
3.根據權利要求1或2所述的一種雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑，其特徵是所述的花粉競爭劑中含有草甘膦。
4.根據權利要求3所述的一種雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑，其特徵是所述的草甘膦在競爭劑溶液中含有草甘膦0.010.1g·L-1。
5.根據權利要求1或2所述的一種雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑，其特徵是所述的花粉競爭劑中含有促進父本花粉萌發、花粉管生長營養劑、殺蟲劑。
6.根據權利要求5所述的一種雜交制種的轉基因作物花粉競爭劑，其特徵是所述的促進父本花粉萌發、花粉管生長的營養劑、殺蟲劑在競爭劑溶液中含有GA30.010.2g·L-1、H3BO30.01-0.2g·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 0.1-3g·L-1、MgSO4·7H2O 0.1---3g·L-1、敵殺死0.01---0.05％，其中之一種或多種。
7.一種雜交制種的種苗純度選擇劑，包括抗病蟲種衣劑，其特徵是在該抗病蟲種衣劑中含有草甘膦；草甘膦、抗病蟲種衣劑在選擇劑中按重量百分比計含有草甘膦30-40％；抗病蟲種衣劑60-70％。
8.一種雜交制種的種苗純度選擇劑的快速檢驗方法，其特徵是把權利要求7所述的種苗純度選擇劑與水按1∶300比例配製成液體，將種子浸泡在該液體中至種子分層，在保溼、照光、30℃條件下發芽，72小時後，有氣生根毛、頸葉綠色、根無黑斑者為抗草甘膦種子。
9.一種轉基因抗除草劑棉花雜交制種的方法，其特徵是該制種的步驟如下(1)、以非抗除草劑棉花B作為母本，以抗除草劑草甘膦的轉基因棉花A作為父本，配成雜交組合；(2)、棉花開花期的每天上午，用裝有上述權利要求中含草甘膦的花粉競爭劑C的微型噴霧器，對B花朵的柱頭、花葯噴霧後，即用A的花粉對B柱頭雜交授粉；或者，(3)、搜集父本A的花粉於上述權利要求中含草甘膦的花粉競爭劑的液體C中配成花粉液，將花粉液點塗或噴霧到母本棉花B柱頭上雜交授粉；(4)、用上述權利要求7中的種子純度選擇劑，對該收穫的種子進行包衣處理，完成雜交種子生產。
10.一種轉基因抗蟲棉花雜交制種的方法，其特徵是該制種的步驟如下(1)、以非轉基因棉花B作為母本，轉基因抗蟲棉花A作為父本，配成雜交組合；(2)、棉花開花期的每天上午，用裝有上述權利要求中不含草甘膦的花粉競爭劑微型噴霧器對棉花B的花朵柱頭、花葯噴霧後，即用棉花A的花粉對B柱頭雜交授粉；或者，(3)、搜集父本棉花A的花粉於上述權利要求中不含草甘膦的花粉競爭劑中配成花粉液，將花粉液點塗或噴霧到母本棉花B柱頭上雜交授粉；(4)、雜交種子在苗床播種出苗後，用0、5--1g·L-1的卡那黴素液噴苗，7天後選擇拔除有黃斑的假雜種苗，完成雜交種子生產。
全文摘要
一種轉基因作物花粉競爭劑及其用於棉花制種的方法。屬於農業雜交制種技術領域。主要解決現行棉花制種方法中存在的工序繁雜、種子混雜、田間去雜問題。其步驟為(1)以非抗棉花作為母本，以轉基因棉花作為父本，配成雜交組合；(2)棉花開花期，用花粉競爭劑對非抗母本花朵的柱頭、花葯噴霧後，用抗性父本花粉授粉；或者，(3)搜集父本的花粉於花粉競爭劑的液體中配成花粉液，將其點塗或噴霧到母本棉花柱頭上雜交授粉；(4)用種、苗純度選擇劑，對所產種子包衣或噴霧選擇，完成雜交種子生產。此發明的花粉競爭劑、種苗純度選擇劑及制種方法主要適用於父本轉基因抗蟲、抗除草劑作物雜交組合(如棉花)制種、種子加工。
文檔編號A01H1/02GK1823579SQ200510018298
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月23日 優先權日2005年2月23日
發明者朱安燦, 朱昊 申請人:朱安燦