切向流過濾方法及其裝置的製作方法

2023-09-27 08:37:45

專利名稱：切向流過濾方法及其裝置的製作方法
技術領域：
本發明提供了改善的方法和系統，用於從汙染物中分離特異的目標分子。更特別地，本發明涉及通過改進的切向流過濾(tangentialflow filtration)方法處理樣品溶液，該改進的切向流過濾方法提高了從給定的料液中對所需分子的澄清、濃縮和分級分離。
背景技術：
本發明涉及的是從給定的料液(feedstream)中過濾目標分子的改進方法。應當注意的是，生產大量較純的、具有生物活性的分子對於節約有效地生產人和動物的藥用配方、蛋白質、酶、抗體和其他特殊化學物質是非常重要的。重組DNA技術已經成為可選擇的方法用於生產多種多肽、抗體和蛋白質，因為大量的外源蛋白質或者抗體可以在細菌、酵母、昆蟲或者哺乳動物細胞培養物中表達。最近以來，已經通過工程操作或者其他方式的改變使轉基因動物(主要是哺乳動物，但是也包括禽類)或者甚至是轉基因植物大量產生外源的蛋白質、抗體或者它們的片段或融合物。通過重組DNA技術表達蛋白質用於生產作為生物催化劑起作用的細胞或者細胞部分，也是一項重要的應用。
重組蛋白的生產包括用編碼該蛋白質的DNA轉染宿主細胞以及在有利於重組蛋白質或者其他目標分子表達的條件下培養宿主細胞、轉基因動物或者植物。原核生物大腸桿菌已經成為一個受偏愛的宿主系統，因為可以將其改造，從而生產大量重組蛋白。但是，已經開發出從大腸桿菌到牛的多種不同的表達平臺，因此有眾多的關於一般表達蛋白編碼DNA的美國專利。
隨著從生物體系中生產外源蛋白質或者其他目標分子的工作的改善，工業上面臨著更大的壓力，要求開發出新的技術，以提高用於這樣生產出的生物製品和藥物的純化和回收工藝，並使其更為有效。那就是，隨著新產品的供應增加，隨之出現了對於設計出使這些治療藥劑(以商業量)迅速上市的方法的巨大興趣。同時工業上還面臨著新的挑戰，即開發從各種機體流體(包括乳汁和尿)中回收轉基因蛋白質和抗體的新型工藝。生產的規模越大，這些問題經常變得更為複雜。此外，工業上還面臨著其他的挑戰，涉及產品的純度和安全性達標方面，主要涉及的方面是病毒安全性和殘留汙染物例如DNA和宿主細胞蛋白質，標準，這樣的標準是許多監管生物用途藥物生產的政府機構都可能要求達到的。
目前有多種可用於從混合物中分離生物學目標分子例如蛋白質的方法。這些技術中重要的一項是親和層析，它對分子的分離是基於所需的分子與親和介質或者凝膠的特異性、選擇性結合，而不需要的分子不能結合因此可以從體系中去掉。親和凝膠通常由固定在凝膠支持物上的配基結合部分組成。例如GB2,178,742使用了親和層析方法將血紅蛋白及其化學修飾衍生物純化出來，其依據的原理是天然血紅蛋白可與一個特殊的多聚陰離子部分家族特異結合。將這些部分固定在凝膠上，以捕獲目標分子。在這一過程中，未修飾的血紅蛋白被親和凝膠保留，而被修飾的血紅蛋白由於其多聚陰離子結合位點被修飾劑所共價佔據而不能與凝膠結合，所以從體系中被除去。親和層析柱是高度特異的，所以會產生非常純的產物，但是親和層析是一個相對較昂貴的工藝，因此很難在商用操作中運用。
通常情況下，經遺傳工程操作的生物藥物是從含有多種不同的宿主細胞汙染物的上清中純化出來的。可以使用反相高效液相層析(RP-HPLC)純化蛋白質，因為它可以有效地將結構或者重量都極其相似的分子分開。使用RP-HPLC分離多種分子的技術操作已經發表。McDonald and Bidlingmeyer，″Strategies for SuccessfulPreparative Liquid Chromatograplay″，PREPARATIVE LIQUIDCHROMATOGRAPHY，Brian A.Bidlingmeyer(New YorkElsevierScience Publishing，1987)，vol.38，pp.1-104；Lee et al.，Preparative HPLC.8th Biotechnology Symposium，Pt.1，593-610(1988).
膜類在產業規模的分子產物回收工藝中的使用以及多種類型的膜和膜技術的相關使用也是為人所知的。這些方法中的基本特點是懸浮於液體料液中的顆粒根據其大小進行分離。在這一工藝的最簡單形式中，用壓力迫使溶液通過具有固定大小孔的過濾膜。大於過濾膜孔徑大小的顆粒被截留，而較小的溶質與溶劑被一同帶到膜的另一側。根據膜的孔徑大小，這種膜過濾工藝一般屬於反滲透、超濾和微過濾類型。
重要的還應該提及作為分離技術的膜過濾在生物技術領域內被廣泛應用。根據膜的類型，膜過濾可以分為微濾或者超濾。微濾膜的孔徑大小在0.1到10微米之間，通常用于澄清、除菌和微小顆粒物的去除，或者用於細胞收穫。超濾膜的孔徑大小要小得多，在0.001到0.1微米之間，用於將溶解的分子(蛋白質、多肽、核酸、糖和其他生物分子)分開和濃縮，或者交換緩衝液，以及粗分級。
目前有兩種主要的膜過濾方法單向通過或者直接流過濾(DirectFlow Filtration，DFF)以及交叉流或者切向流過濾(TangentialFlow Filtration，TFF)。TFF是一種超濾系統，其被設計成控制料液的流體流動型式，以提高被截留的溶質從膜表面向料液中的回輸。在這個過程中，料液高速地重複循環，方向與膜的平面相切。這樣進行的效果是可以提高傳質係數(mass-transfer coefficient)，允許反向擴散。流體流動的方向與濾膜的方向平行，這也使濾膜表面不斷被清潔，從而防止了堵塞。
但是對於超濾中可以達到的蛋白質純化程度存在限制。這些限制主要是由於濃度極化、淤積以及大多數膜的孔徑大小分布過寬造成的。因此溶質分開的情況經常很差。參見例如Porter，ed.，HANDBOOK OFINDUSTRIAL MEMBRANE TECHNOLOGY(Noyes Publications，Park Ridge，N.J.，1990)，pp.164-173.
溶質的極化層成為額外的一層濾膜，基本上與原來的超濾膜串聯作用。這一作用在過濾給定溶劑時導致了明顯的阻力。隨著料液中被截留溶質濃度的提高，極化程度將提高，並且在真實系統中會導致許多看起來反常的或者不可預知的情況的發生。例如，在高度極化的條件下，過濾速率隨著壓力的增加而只有小幅增加，這與未極化條件下的過濾速度通常與壓力呈線性的關係相反。使用更加開放、更高通量的膜可能不會提高過濾速度，因為極化層仍然對過濾提供著限制性的阻力。由於截留的和洗脫的溶質之間的相互作用，這一情形將更為惡化。
濃度極化和汙染過程的一個結果是不能有效利用超濾膜對大分子分級的能力用於大分子混合物例如血漿蛋白的大規模拆分中。參見Michaels，″Fifteen Years of UltrafiltrationProblems andFuture Promises of an Adolescent Technology″，inULTRAFILTRATION MEMBRANES AND APPLICATIONS，POLYMER SCIENCEAND TECHNOLOGY，13(Plenum Press，N.Y.，1979，Anthony R.Cooper，ed.，)，pp.1-19.
因此，用其他和額外的技術分離更多種類的生物分子是很困難的。也就是說，通過凝膠滲透、吸附或者離子交換層析、選擇性沉澱或者電泳這類技術進行的複雜大分子混合物大規模分離中使用膜超濾是異常困難的，且不適於商業的應用。TFF通過將混合物重複循環而解決這個堵塞的問題。
用切向流過濾分離物質的技術是已知的。Marinaccio et al.，美國專利編號4,888,115中公開了將該過程(稱為「交叉流」)用於分離生物性液體(例如分離血液組分用於血漿除去法)。在該過程中，血液切向通過(即跨過)有機多聚微孔濾膜，並除去顆粒狀物質。在現有技術的另一個實施例中，切向流過濾被用於啤酒溶液的過濾(Shackleton，EP 0,208,450，1987年1月14日發表)，它特別用於除去例如酵母細胞和其他懸浮固體等顆粒狀物質。Kothe et al.(美國專利4,644,056，1987年2月17日頒布)公開了這一工藝用於從乳汁或者初乳中純化免疫球蛋白，Castino(美國專利4,420,398，1983年12月13日頒布)描述了切向流過濾用於從包含抗病毒物質以及病毒顆粒和抗病毒物質所來源的細胞培養物殘渣的肉湯中分離抗病毒物質，例如幹擾素。
已經在從細胞殘渣中分離細菌酶時使用過切向流過濾裝置(Quirk et al.，1984，Enzyme Microb.Technol.，6(5)201)。與使用傳統的離心技術相比，使用這一技術，Quirk et al.能夠在較短的時間內分離出更大量的酶。在製藥領域中切向流過濾的多種應用在Genovesi(1983，J.Parent er.Aci.Technol.，37(3)81)中有綜述，應用包括注射用無菌水的過濾、溶劑系統的澄清以及從肉湯和細菌培養物中過濾酶。
但是對於該技術用於商業應用所需的顆粒大小的精確控制還很困難並且還未普遍獲得成功。在本發明中對切向流過濾的使用進行了改良，用於在商用的高效且重要的工藝中根據大小分離顆粒。本發明公開了使用具有所選尺寸的濾膜以及依次使用或者串聯疊加不同孔徑大小的濾膜(即過濾系統)，以分離顆粒狀物質，獲得具有所需的特定大小範圍的顆粒。
在本領域內還需要有高效的實驗方案，用於使用一種提高產量、較為便宜以及減少變性的工藝而從其他分子中選擇性地分離例如肽、多肽和非肽類物質等分子。特別地，需要有純化技術，以便從細胞培養使用的發酵培養液中或者從轉基因哺乳動物產生的乳汁料液中分離出目標分子。
可以從細胞培養液或者轉基因乳汁料液中純化出的這樣一種目標分子是人白蛋白。人白蛋白是臨床用作血容量擴充劑的第一種天然膠體組合物，並且它是與其他膠體分子進行比較的標準膠體試劑。其他目標分子包括，但不限於，人甲胎蛋白、抗體、抗體的Fc片段以及人白蛋白或者甲胎蛋白片段作為載體分子的融合分子。
本發明的方法還提供了濾器和過濾條件的精確組合，以便優化從給定料液中獲得目標分子的產量。在這些方法中重要的過程參數包括pH和溫度被精確地調控。
本發明的一個目的是提供切向流過濾工藝，用於根據大小分離物質，例如顆粒和分子，其中所述工藝對於目標物是選擇性的，從而能夠更高倍地純化。
另外一個目的是提供改進的過濾工藝，包括超濾工藝，用於分離生物大分子如蛋白質，該工藝使濃度極化最小化，並且不增加通量。
另外一個目的是提供一種過濾工藝，它可以根據大小分離大小相差不到10倍的物質，並且在過濾之前不需要對混合物進行稀釋。
這些以及其他目的對於本領域內的技術人員將會變得明確。本發明的其他特點和優勢將會在以下本發明優選實施方案的詳細描述並參考相伴隨的附圖而變得明確。
生物製劑產業正在越來越關注產品的安全性、純度以及成本。根據本發明使用切向流過濾(TFF)是一種迅速且更高效的生物分子分離方法。它可以用於廣泛的生物學領域，例如免疫學、蛋白質化學、分子生物學、生物化學和微生物學。
附圖的簡要描述

圖1顯示了物質從料液通過TFF到灌裝和結束的流程的工藝流程圖。
圖2A顯示了微濾的工藝和設備安裝。
圖2B顯示了TFF的工藝和設備安裝。
圖3顯示了在高溫和低溫下酪蛋白產品去除的比較。
圖4顯示了過濾工藝的流程。
圖5顯示了從DNA構建體到含有重組目標蛋白質的澄清乳汁產生的轉基因動物構建過程。
圖6顯示了本發明的方法的工藝設備圖示。
圖7顯示了不同TMP下人單抗#A通過微濾膜的流體動力學性質與交叉流速度的關係。當TMP從12psi上升到20psi時出現了顯著的發展。
圖8顯示了人單抗#A通過微濾膜的溫度依賴性。提供了細胞培養物抗體和轉基因抗體。
圖9顯示了來自GTC微濾工藝中的不同級分的SDS-PAGE分析結果。其中顯示，與全乳汁(#3泳道)相比，4倍澄清化的乳汁(#7泳道)中酪蛋白的含量降低。
圖10顯示了根據本發明的TFF工藝，質量平衡以及該工藝的整體產量。
發明概述簡而言之，本發明提供了一種用於加速處理來自多種不同料液、優選來自轉基因哺乳動物乳汁的人類治療性蛋白、蛋白質片段或者抗體的方法。因此，在本發明的一項優選實施方案中，這裡開發和提供的過濾技術提供了一種工藝，用於從乳汁的天然組合物或者乳汁的汙染物中對所需的重組蛋白或者其他目標分子進行澄清、濃縮和分級。產生的大量澄清中間產物是用於傳統的純化技術例如層析的適宜料液，這些傳統純化技術用於TFF工藝的下遊，使產品達到其最終的配方和純度。
本發明的一項優選實驗方案使用了三種過濾單元操作，從給定的含有目標分子的轉基因乳汁中對產物進行澄清、濃縮和分級。澄清步驟從產物中除去了較大的顆粒狀物質例如脂肪球和酪蛋白微球。之後的濃縮和分級步驟除去了大多數小分子，包括乳糖、礦物質和水，提高了純度且降低了所得產物組合物的體積。將TFF過程的產物適當的濃縮至能使下遊純化最適地進行並且使整體產物具有最佳穩定性的水平。然後將該濃縮的產物無菌過濾以保證最低的生物負荷並且提高產物在延長時間段內的穩定性。半成品的純度在65％到85％之間，可能含有的組分包括山羊抗體、乳清蛋白(α乳球蛋白、β乳白蛋白以及BSA)、低水平的殘留脂肪和酪蛋白。這種部分純化的產物是常規下遊層析技術的理想起始料液。
通常可以使用本發明處理的產物是免疫球蛋白分子，包括但是不限於IgG1(例如針對關節炎的抗體-「Remicade抗體」)，IgG4、IgM、IgA、Fc部分、含有與免疫球蛋白片段相連的肽或多肽的融合分子。其他可以使用本發明處理的蛋白質包括重組蛋白質、內源蛋白質、融合蛋白或者沒有生物學活性、但可以進行後續加工而恢復生物活性的蛋白。其中包括、但是不限於抗凝血酶III蛋白、人血清白蛋白、核心蛋白聚糖、人甲胎蛋白、尿激酶和催乳素。
優選實施方案的描述在說明中以下縮略語具有指定的含義縮略語表BSA 牛血清白蛋白CHO 中國倉鼠卵巢細胞CV交叉流速率DFF 直接流過濾DV透濾體積IEF 等電聚焦GMH 質量通量(克/平方米/小時)-也稱為JMLMH 液體通量(升/平方米/小時)-也稱為JL1pm 升/分鐘M 摩爾濃度MF微濾NMWCO 額定分子量截留NWP 標準化的透水性PES 多聚(醚)碸pH根據眾所周知的科學參數，用於描述化學物質或者化合物中氫離子活性的術語PPM 每一百萬份中所佔的份數SDS-PAGE SDS(十二烷基硫酸鈉)-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)SEC 大小排阻層析TEF 切向流過濾PEG 聚乙二醇TMP 跨膜壓力UF超濾術語的解釋澄清從溶液中去除顆粒狀物質，使溶液能夠通過0.2微米的膜。
膠體指的是不能容易地跨過毛細管壁的大分子。這些化合物施加腫脹壓力(即它們吸引液體)，給服的目的通常是恢復血管內容量，改善組織灌注。
濃縮用膜將水和小分子除去，使截留的分子對小分子的比例提高。
濃度極化在膜表面上截留分子的累積(凝膠層)，它是由於多個因素組合而造成的跨膜壓力、交叉流速度、樣品黏度和溶質濃度。
交叉流速度跨膜上層的流體的速度。CF＝Pi-Po，其中Pi是進口的壓力，而Po是出口的壓力，CF與截留物的流速有關。
透濾通過膜洗掉較小分子的分級分離過程，使目標大分子留在截留物中。這是一種方便有效的技術，可除去或者交換鹽類、除去去汙劑、將自由分子與結合分子分開、除去小分子量物質或者迅速改變離子或者pH環境。該過程通常使用微濾膜，將目標產物從漿液中分離，而同時保持漿液濃度恆定。
料液為工藝或者方法所提供的原材料或者原料液，它含有目標蛋白，還可能含有多種不同的汙染物，包括微生物、病毒和細胞碎片。
濾出液通量(J)樣品的一部分通過膜的速率。
流速(V)流體通過膜表面的速度被認為是流體的流速。由於流速的改變，需要測量產物通量。兩個變量之間的關係使我們可以確定流動的最佳操作窗口。
分級分離根據物理或者化學部分而對分子進行優先分離。
凝膠層顯微鏡下觀察到的分子薄層，它可以在膜的上面形成。它會通過堵塞膜表面而影響分子的截留，因而減緩濾出液的流動。
額定截留分子量(Nominal Molecular Weight Cut Off，NMWCO)超濾膜的大小(千道爾頓)指示。截留分子量的定義是被該膜截留90％的球蛋白的分子量。
標準化的透水性(NWP)TFF裝置起始清潔時在特定的重複循環速率下建立的水濾出液流速。該數值用於計算膜回收率。
目標分子能夠從溶液或者流體(如液體)中的懸液中分離出來的顆粒或者其他種類的分子。顆粒或者目標分子從流體中分離出來，多數情況下與流體中的其他顆粒或者分子分開。將要分離的目標分子的大小將決定要使用的膜的孔徑大小。優選地，目標分子是生物或者生化來源的，或者通過轉基因或體外過程產生的，包括蛋白質、肽、多肽、抗體或者抗體片段。優選的料液來源實例包括哺乳動物乳汁、哺乳動物細胞培養物以及微生物細胞培養物如細菌、真菌和酵母。還應當注意的是要被濾出的物質包括不合意的多肽、蛋白質、細胞組分、DNA、膠體、支原體、內毒素、病毒、糖和其他生物學分子，不論其是否被糖基化。
切向流過濾是指這樣一個過程，其中含有將要被過濾分離的組分的流體混合物沿著膜平面切線地高速重複循環以提高反向擴散的傳質係數。在這種過濾中，沿膜的長度施加壓力差，使流體和可濾過的溶質流過濾器。這種過濾最適宜以分批過程和連續流過程進行。例如，可以將溶液反覆通過膜，同時通過該濾器的流體被不斷回收到分開的裝置中，或者使溶液一次通過膜，通過濾器的流體被不間斷地進行下遊的處理。
跨膜壓力沿著濾膜的長度施加的不同壓力梯度，使得流體和可濾過的溶質流過濾器。在切向流系統中，最高的TMP是在入口處(流動管道的開始)，最低的TMP是在出口處(流動管道的終止)。取入口、出口和濾出液出口的平均壓力計算TMP。
回收率在處理後能夠回收的目標分子的量。經常表示為起始物質的百分比或者產率。
截留物不能通過膜的樣品部分，也被稱為濃縮物。在TFF過程中截留物被不斷地重複循環。
切向流過濾的原理所有的切向流裝置涉及了兩個重要的變量跨膜壓力(transmembrane pressure，TMP)和交叉流速度(crossflowvelocity，CF)。跨膜壓力是實際上推動分子通過濾器小孔的力量。交叉流速度是溶液跨膜的流速。它提供的力將能夠堵塞膜而降低該過程的效率的大分子一掃而光。在實際操作中，將流體料液從樣品補料容器中泵出，在濾器中跨過膜表面(交叉流)，再作為截留物回到樣品補料容器中。通過夾具施加在截留物管上的返回壓力建立了跨膜壓力，可驅動比膜孔徑小的分子通過濾器進入濾出液(或者透過物(permeate))級分中。交叉流清除了在膜表面上截留的較大分子，使其作為截留物返回到料液中。成功實施TFF實驗方案的基本目標是對TMP和CF進行優化，使在不產生膜阻塞性凝膠的情況下可以過濾最大體積的樣品。如果TMP沿著膜的長度發生的增加或者減少的程度一般不超過平均TMP正負約10psi，優選為不超過約5psi，則認為TMP是「基本恆定的」。就整個過濾過程中的TMP水平而言，在濃縮步驟中使TMP保持恆定或者降低，以在高濃度下保持選擇性。因此「基本恆定的TMP」是指TMP沿著膜的長度而保持恆定，並不是隨著過濾時間而保持恆定。
乳汁作為料液根據本發明的一個優選實施方案，TFF過程使用了三種過濾裝置操作，對來自乳汁料液的產物進行澄清、濃縮和分級分離。該乳汁可以是含有生物藥物或者其他目標分子的轉基因哺乳動物的產物。在一個優選的實施方案中，該系統被設計成對目標分子具有高度選擇性。澄清步驟從乳汁料液中去除了較大的顆粒狀物質，例如脂肪球和酪蛋白微球。濃縮/分級步驟去除了多數小分子，包括乳糖、礦物質和水，提高純度並降低了產物的體積。此後將TFF過程的產物濃縮至適於最佳下遊純化和整體產物穩定性的水平。然後將這一含有目標分子的濃縮產物無菌過濾，以確保最低的生物負荷，提高目標分子在延長時間段內的穩定性。根據本發明的優選實施方案，半成品的純度在65％到85％之間，可以含有的組分例如有山羊抗體、乳清蛋白(β乳球蛋白、α乳白蛋白以及BSA)以及低水平的殘留脂肪和酪蛋白。這一部分純化的產物是常規下遊層析技術的理想起始料液，可以進一步選擇和分離目標分子，所述目標分子可能包括、但是不限於乳汁中產生的重組蛋白、乳汁中產生的免疫球蛋白或者融合蛋白。
步驟1(澄清)參考圖1，使用分批微濾對轉基因哺乳動物的乳汁、優選地來自山羊或者牛的乳汁進行澄清。將乳汁置於補料罐內，沿環路泵出，使乳汁的截留物濃縮兩倍(參見圖1中的流程圖)。濃縮之後，對乳汁截留物進行透濾，使產物和小分子量的蛋白質、糖和礦物質通過適當大小的膜。根據本發明，目前將該操作設計為耗時2-3小時，日處理乳汁量1000升。本發明的技術和方法可以進行放大，可以生產出的產品的總體積取決於對於某種特定目標分子的商業和/或治療需要。
步驟2(濃縮/分級)同樣參考圖1，使用超濾(UF)對第一步得到的澄清後的透過物進行濃縮和分級。澄清的透過物流入超濾補料罐內，沿環路泵出，使產物濃縮兩倍。一旦濃縮過程啟動，就將UF的透過物置於第一步中的澄清補料罐中的乳汁截留物中。調整第一步和第二步的時間和規模，使它們同時進行。UF的透過物含有通過膜的小分子量蛋白質、糖和礦物質。一旦在UF的截留物中累積了95％的產物，則停止澄清，開始對UF物質進行濃縮/透濾。將產物濃縮為起始乳汁體積的五分之一到十分之一，向UF補料罐中加入緩衝液。這洗掉了大部分的小分子量蛋白質、糖和礦物質。本操作目前設計為耗時2.5到3.5小時，每天可以處理多達500升的澄清透過物。同上，本發明的技術和方法可以被放大，可以通過本濃縮/分級過程生產出的產品的總體積取決於對於某種特定目標分子的商業和/或治療需要。
步驟3(無菌過濾)根據圖1，以及根據本發明，對澄清的半成品濃縮物進行無菌微濾。將得到的50-100升超濾截留物放到補料罐中，在那裡通過一個盲端絕對0.2微米MF過濾系統將UF截留物泵出，目的是除去大部分的生物負荷、提高產物在延長時間段內的穩定性。將產物通過本發明的過濾系統泵出，然後可以直接灌注到最終的包裝裝置中。在加工目標分子的條件下，在達到清潔房間標準(例如100級條件)的GMP設施中，本操作目前被設計成耗時0.5到1小時，每天可以處理多達100升的澄清化半成品中間產物。同上，本發明的技術和方法可以被擴大規模，可以通過本濃縮/分級過程生產出的產品的總體積取決於對於某種特定目標分子的商業和/或治療需要。
實施例1乳汁作為料液用於生產目標分子以下的數據提供了本發明的一項應用，它提供了基於膜的工藝，可用於對來源於乳汁粗料液中的轉基因生產的IgG1抗體進行澄清、濃縮和分級。根據本發明的該實施例，提供乳汁用於處理的轉基因哺乳動物是山羊，但是也可以使用其他哺乳動物，包括牛、家兔、小鼠以及綿羊和豬。使用CHO細胞產生的IgG1抗體摻入到非轉基因山羊乳汁中，對工藝的起始操作參數範圍進行優化。當能夠產生該目標分子的轉基因山羊到了哺乳期，並且開始在其乳汁中產生重組IgG1，則使用摻入到非轉基因乳汁中的CHO細胞產生的重組IgG1抗體進行多次實驗，然後使用轉基因乳汁重複這些實驗。
根據本發明，實驗性策略是確定可以在大規模下控制的過濾工藝變量(CM，V，TMP，T)之間的關係，其中V是流速，產物通過、截留和質量也同樣可以被控制。通過單獨小規模實驗矩陣確定關係，並找到操作的最佳窗口。將這些最佳參數組合成「雙TFF」實驗系列，對整體產率和質量平衡進行研究。根據產品的產率、澄清度和通量效率確定性能。在單獨小規模實驗矩陣中研究以下的過程變量。
濃縮(Cm)使用經驗產物通過數據，確定最佳的乳汁濃縮因子。在固定時間內每平方米內產物通過的速率被稱為產物通量(Jp)。在澄清步驟中根據濃縮因子測定產物通量(操作裝置#1)。
同樣參考圖1，以下提供了對本發明元件的解釋圖1元件工藝流描述液流編號描述1a 轉基因乳汁原料1b 微濾的CIP溶液2a 將微濾產生的截留物在透濾後排到排水道中2b 使用後的CIP溶液排到排水道中
3 在位的微濾截留物(環)4 微濾CIP重複循環(環)5 微濾濾出液6 超濾的CIP溶液7 使用後的CIP溶液排到排水道中8 超濾料液(微濾濾出液)9 在位的超濾截留物(環)10 超濾透過物(為了透濾MF截留物)11 濃縮的澄清化乳汁12 超濾CIP重複循環(環)13 AF CIP溶液14 無菌過濾料液15 生物負荷降低後的濃縮澄清半成品16 使用後的CIP溶液排到排水道中以其最寬泛的方式，這裡提供的本發明涵蓋的高效切向流過濾過程涉及使將要被分離的物質的混合物通過一個或者更多的位於裝置或者組件中的濾膜，該裝置或者組件被設計成在某些特定的TMP和通量條件下進行的某種切向流過濾類型。TMP保持在通量對TMP曲線中的壓力依賴區域的範圍內，即不超過臨界點TMP數值的壓力範圍。因此，過濾是在通量範圍為臨界點通量約5％到高達100％的通量下進行操作的。參見以下的圖A和B，其中描繪出了通量對TMP曲線以及臨界點。結果是膜將目標物質作為截留物選擇性地截留下來，而更小的物質通過膜作為透過物流出，或者是目標物質作為透過物流過膜，而混合物中的汙染物被膜截留。應當注意的是，用於超濾的目標物質優選為分子量至少為大約1000道爾頓的生物大分子，最為優選的是多肽和蛋白質。另外優選的是，目標物質的大小比將要同它分開的物質(即汙染物)更大倍數小於20-300倍，或者比將要同它分開的物質更小，不到其十分之一。
正如這裡所使用的，短語「在過濾室內使濾出液按與流體方向平行的方向通過濾出液室重複循環的方式」指的是一種機制或者裝置，它引導來自濾出液室的流體的一部分沿著與通過相鄰過濾室的流體流動的方向平行或者大體相同的方向(允許在流動中出現一些旋渦)，從過濾室的入口流到出口。優選地，該方式是泵抽吸方式。
應注意的是，隨著過濾時間的增加，TMP並不增加，而且在整個過濾過程中也不一定保持恆定。TMP可以隨時間保持大致恆定，或者隨過濾的進行有所降低。如果所截留的物質正在進行濃縮，則最好隨著濃縮步驟的進程而降低TMP。
每一個膜優選具有的孔徑大小能夠截留尺寸大至10微米、更優選1kDa到10微米的物質。可以通過超濾分離的物質的實例包括蛋白質、多肽、膠體、免疫球蛋白、融合蛋白、免疫球蛋白片段、支原體、內毒素、病毒、胺基酸、DNA、RNA和糖類。可以通過微濾分離的物質的實例包括哺乳動物細胞和微生物，例如細菌。
由於膜過濾器並不完美，可能存在破洞或者不規則處，它們可能比較大而能使得一些要被截留的分子通過膜溜走了，所以本文的一個優選方面是使用一個以上具有相同孔徑大小的膜，使膜的放置方式互相平行，優選為一個膜置於另一個膜的上方。用於本目的的膜的優選數目為2個。
儘管在以上的過程中維持壓力的適宜通量範圍是大約5％到100％，但是通量越低，則所需的膜的表面積就越大。因此，為了使膜上的花費最小，操作時優選在通量處於該範圍高端的壓力下進行操作。通量的優選範圍是臨界點通量的大約50％到100％，更為優選的範圍是臨界點通量的大約75％到100％。
儘管TMP不需要沿著膜表面維持大體恆定，但是優選地仍使TMP維持大體恆定。一般通過在膜的濾出液一側製造壓力梯度來實現這種情況。這樣，濾出液通過過濾裝置的濾出液室重新循環，循環的方向與過濾裝置中截留物室中混合物的流動方向相同和平行。對重新循環的物質的入口和出口壓力進行調節，使跨濾出液室的壓力降低值與跨截留物室的壓力降低值相等。
可以使用多種實際方式獲得這種濾出液壓力梯度。優選實施方案的一些實施例是圖2A和2B種所示的構件。根據這些構件，將要分離的溶質通過入口導管36導入到裝置中，如果將要分離的產物是在發酵培養液中，則入口導管與發酵罐(未顯示)連接。入口導管還可以連接容器(未顯示)，該導管承載著轉基因(Tg)乳汁或者細胞裂解物來源或者細胞培養系統中細胞收穫之後的上清中。泵是本領域內技術人員所知的任何泵，流速可以根據本領域內技術人員所知的過濾性質進行調整。
在本發明的微濾單元30中，可選地使用壓力計45測量來自抽吸裝置(pumping means)40的液流的入口壓力。在入口導管36內的流體進入到過濾裝置50中。過濾裝置50在其入口上方部分含有過濾室51，在其出口部分含有濾出液室52。這兩個室由過濾膜55分開。入口的流體流向與過濾室51內的過濾膜平行。上方的過濾室51接收含有溶質的混合物(溶質中含有目標分子)。比目標分子小的分子能夠通過膜55進入到濾出液中或者離開濾出液室52。濃縮的截留物經出口導管60通過過濾裝置50，在那裡可以收集截留物，如果需要的話用微濾膜65進一步處理，以獲得所需的目標物質，包括使截留物再通過另一個膜。在這一整個過程中，以及為了質量控制的目的，本發明預計可以有一系列的樣品點99，使得可以監測分子濃度、pH和汙染-「B路徑」。或者，截留物流回流至混合物來源的罐或者發酵罐35內「路徑A」，通過入口導管36對截留物重新利用以進一步純化。
含有經過膜55進入到濾出液室52的目標分子的溶液還可以通過出口導管70離開過濾裝置，出口導管70和截留物流體離開的出口導管60位於過濾單元50的同一末端。但是，通過出口導管70流出的溶液和目標分子被送回到罐35中，由壓力計測量，用於進一步的處理。
相似地，以及由圖2B所描繪的，還涉及了根據本發明的雙TFF系統80。
在圖2A中所示的構件中，需要根據室51和52放置膜，以提供所示的流速和跨膜壓力差。在本發明的工藝中有用的膜的形狀一般有平板狀、摺疊式平板狀、圓筒、同心圓筒、各種橫斷面的管道以及其他的構型，可以單獨使用或者成組組裝在一起，串聯在一起或者在過濾裝置內平行排列。裝置的構建一般使得過濾和濾出液室的走向沿著膜的長度。
適宜的膜是可以從混合物中將所需的物質與不合意的物質分開而基本上不產生堵塞問題、並且速度足以支持系統的連續運轉的那些。膜的實例包括微孔膜，其孔徑大小通常是0.1到10微米，可以將其製作為截留所有大於額定大小的顆粒。優選地，它們的材質是陶瓷的，用於本發明的微濾和TFF。超濾膜具有較小孔徑，並根據被截留的蛋白質的大小來表徵。可以獲得額定截留分子量從1000到1000000道爾頓的超濾膜。
超濾膜最適合用於本發明的工藝中。超濾膜通常是不對稱的，在上遊表面有一薄層或者皮層，該薄層是分離動力所需的。它們通常是從再生纖維素或者聚碸製備的。
用於切向流系統80的膜濾器根據將要處理的液體的量而可以以不同構造單元出現，孔徑大小也有多種。特別適宜用於本發明的、用於相對大規模的是那些已知的市售切向流過濾裝置。
在變通的優選裝置中，並且由於以上列出的原因，圖2A的微濾裝置30包含多個(優選為2個)過濾膜，分別為膜56和57。這些膜以互相平行的構型放置。
本發明還涉及多階段級聯過程，其中來自上一個過程的濾出液在第二個切向流過濾裝置中通過比第一個裝置中的膜孔徑小的過濾膜，來自這第二個過濾的濾出液被回收回第一裝置中，然後該過程重複進行。
適宜本發明的工藝或者與微濾單元30聯合使用的一種切向流系統80圖示於圖2B中。這裡，第一容器85通過入口導管90與設置在過濾單元95內的過濾室96相連。第一輸入抽吸裝置100設置在第一容器85和過濾室96之間。過濾室96通過出口導管110與第一容器85相連。過濾室96被第一過濾膜115與在過濾裝置95中位於其正下方的第一濾出液室97隔開。第一濾出液室97具有出口導管98，其與室97的入口相連，在導管98處設置了濾出液抽吸裝置120。與出口導管98相連的導管45還與另一容器120相連。
該容器120通過入口導管125與另一過濾室127相連，過濾室127設置於第二過濾裝置130中。第二輸入抽吸裝置133被設置於第二容器120與過濾室127之間。過濾室127被第二過濾膜128與在過濾單元130中位於其正下方的第二濾出液室129隔開。第二濾出液室129具有出口導管135與室129的入口相連，在導管135內設置了濾出液抽吸裝置140。與出口導管135相連的導管125還與第三容器150相連。
該容器150通過入口導管155與第三過濾室157相連，室157被設置於第三過濾裝置160中。第三輸入抽吸裝置165設置於第三容器150和過濾室157之間。過濾室157被第三過濾膜165與在過濾裝置160中位於其正下方的第三個濾出液室159隔開。第三濾出液室159具有出口導管170與導管155相連，導管155與第一容器150相連，使濾出液重複循環到原來的罐內。還提供了樣品點99以及壓力計175用於監控該過程。
本發明的工藝可很好地調試成用於商業規模。該工藝可以按照分批運行或者連續運行，或者以半連續的方式運行，即在連續流的基礎上，將含有所需物質的溶液通過切向流濾器，直至整個大批被過濾，在不同的過濾階段之間插入有清洗步驟。然後就可以處理新鮮的分批溶液。這樣，可以進行連續的循環過程而在相對短的時間內獲得大量的純度可以接受的所需產物。
由這裡描述的切向流過濾的獨特性質以及其對含有固體的溶液提供連續過濾而不會出現濾器堵塞的能力得到了一種有高度優勢的工藝，它可以連續地並在商用規模上分離和純化生物反應產物。而且，該過程可以用於大範圍內的生物分子，例如轉基因來源的蛋白質產物、抗體、細胞碎片和細胞培養物裂解物。
以下的實施例進一步詳細舉例說明了本發明，但是這些實施例的目的並不是限制性的。在這些實施例中，所有參考文獻中公開的內容均明確引入作為參考。
材料和方法對於所有使用微濾系統進行的實驗(除了供給與排放實驗以外)，使用以下的設備經過校準與泵相關的601pm泵(泵曲線)1″OD不鏽鋼清潔管道系統
0.2微米孔徑陶瓷膜，面積為0.2平方英寸或者1.5平方英寸具有一個1/2″物料出口的不鏽鋼清潔膜支架1/4″ID彈性透過物管線截留物管線上的隔膜閥兩個壓力計鋼製的1.2升補料貯罐3/4″ID彈性截留物管線對於所有的雙TFF實驗，將前面的設備與以下的設備聯合使用最大輸出量為800mlpm的隔膜泵所有管線上都有1/4″彈性抗壓力管材一個壓力計，用於測定補料液的壓力在截留物和透過物管線上的兩個隔膜閥30kDa額定截留分子量的PES Pall Filtron Centramate膜，面積為0.2平方英寸或者1平方英寸不鏽鋼的Pall Filtron Centramate膜支架1個不鏽鋼U型管與透過物出口相連膜的選擇用於雙TFF系統的膜選自一組具有不同幾何形狀和額定截留分子量的膜。以前的研究對多聚物材質的高截留分子量UF膜以及陶瓷材質的膜用于澄清步驟進行了考察。將乳汁濃縮兩倍、然後進行雙TFF對於所有的膜來講都是挑戰。然後對膜進行多次運行和清潔以分析膜的重複使用性。當膜的標準化水通量維持在未使用過的膜的80％以上，則認為該膜已經再生而可以用於下一步的過程。沒有一種平板型的多聚物膜盒在三次使用後仍然能夠保持目標水通量回收率，而陶瓷材質的膜可以再生利用60次以上。這是由於可以用更為苛刻的條件即更高濃度的化學物質和更高的溫度來清潔陶瓷之故。30kDa超濾膜在20次循環後保持了高的水通量回收率。
用0.2微米額定截留分子量的陶瓷管狀膜測試用于澄清乳汁並且使IgG1抗體通過的第一個單元。使用30kDa截留分子量的平板狀超濾膜測試用於捕獲IgG1抗體的第二個系統。
分析方法對每個實驗中的樣品進行分析用蛋白A HPLC分析IgG含量，用SDS-PAGE檢查降解，用等電聚焦(IEF)檢查修飾，用大小排阻層析(SEC)檢查聚集情況。
步驟使用0.2微米截留分子量的陶瓷微濾膜進行一系列的對照實驗，期望理解工藝操作關係。測量產物通量(Jp)，其與流速(u)、跨膜壓力(TMP)、溫度(t)和乳汁濃度(c)有關。一旦關係建立，則確定操作的最佳窗口，並且測試集成性工藝。取樣並且收集質量平衡數據，分析最初產物產率和處理量。(請參見圖2A和2B)溫度實驗此目的是確定以最小的體積通過0.2微米、3毫米管道的陶瓷微濾膜、得到最佳IgG1抗體通量時的操作溫度範圍。為了在處理過程中用SDS-PAGE和Western印跡分析IgG1抗體的降解，在乳汁混和之前測定每個乳汁部分的pH。將乳汁混入微濾補料罐中，記錄總體積。這時微濾泵控制器的頻率從20赫茲升高到45赫茲(大約5L/min升高到20L)。記錄每一個後繼時間點的所有參數，例如溫度、壓力、交叉流速率、透過物流速和體積。重複循環運行該微濾環(路徑A)5分鐘。將跨膜壓力調整為12psig，再重複循環5分鐘(路徑A，維持溫度為20攝氏度)。使透過物管線通向排水道中，直至乳汁濃縮為原來的兩倍(收集透過物)。溫度維持在20攝氏度。從補料罐和透過物管線中取樣品2和3。然後將透過物管線返迴路徑A，並重複循環10分鐘。取樣品4和5。使溫度上升至25攝氏度。重複循環系統10分鐘，然後取樣品6和7。使溫度上升至30攝氏度。然後重複循環系統10分鐘，取樣品8和9。使溫度上升至35攝氏度。然後重複循環系統10分鐘，取樣品10和11。使溫度上升至40攝氏度。然後重複循環系統10分鐘，取樣品12和13。關閉泵並在2-8攝氏度下儲存樣品，用於IgG的定量(樣品1，3，5，7，9，11，13，15，17進行SDS-PAGE，檢查降解和聚集；樣品1和16用I EF分析；樣品1，3，16，17用SEC分析)。
微濾乳汁濃縮實驗根據本發明的優選實施方案，本實驗的目的是確定用最小的體積通過0.2微米、3毫米管道的陶瓷微濾膜、得到最佳IgG1抗體通量時的起始乳汁濃度的範圍。
在操作中，在乳汁混和之前，測量每個乳汁部分的pH。將乳汁混入微濾補料罐中，記錄總體積。這時將微濾泵控制器的頻率從20赫茲升高到45赫茲(大約5L/min升高到20L)。記錄每一個後續時間點的所有參數，例如溫度、壓力、交叉流速率、透過物流速和體積。重複循環運行該微濾環(路徑A)5分鐘。將跨膜壓力調整為12psig，再重複循環5分鐘(路徑A，維持溫度為20攝氏度)。將跨膜壓力調整為15psig，重複循環運行(路徑A)5分鐘。使透過物的管線通向排水道中，直至乳汁濃縮，收集550毫升的透過物，然後將透過物管線返迴路徑A(重複循環10分鐘)。分別從補料罐和透過物管線中取樣品2和3。
將透過物管線通向路徑B，並向補料罐中加600毫升乳汁。將透過物的管線通向排水道中，直至乳汁濃縮，收集500毫升的透過物，然後將透過物管線返迴路徑A(重複循環10分鐘)。分別從補料罐和透過物管線中取樣品4和5。然後將透過物管線通向路徑B，並向補料罐中加入500毫升乳汁。將透過物的管線通向排水道中，直至乳汁濃縮，收集500毫升的透過物，然後將透過物管線返迴路徑A(重複循環10分鐘)。分別從補料罐和透過物管線中取樣品6和7。然後將透過物管線通向路徑B，並向補料罐中加入380毫升乳汁。將透過物的管線通向排水道中，直至乳汁濃縮，收集400毫升的透過物，然後將透過物管線返迴路徑A(重複循環10分鐘)。分別從補料罐和透過物管線中取樣品8和9。關閉泵並在2-8攝氏度下儲存樣品，用蛋白質A分析進行IgG定量；用SDS-PAGE和Western檢查降解和聚集；用SEC檢查聚集；經IEF檢查等電點的改變。
流速和TMP實驗為了確定跨膜壓力(TMP)、交叉流速度、濾出液澄清度、膜液體通量和IgG1抗體通過0.2微米、3毫米管道的陶瓷微濾膜之間的關係，在1升非轉基因乳汁中摻入3.7克IgG1抗體(2.5g/L)，將摻入後的乳汁置於1.5升的補料罐內。摻入後的乳汁在室溫下一邊連續攪拌一邊通過微濾環被以30L/min的速率泵出，使用以下的起始參數膜面積0.164平方英寸膜孔徑大小0.20微米起始乳汁體積1.0升料液壓力10psig透過物壓力0psig料液速率20L/min乳汁溫度30攝氏度樣品#1該樣品取自摻入後的乳汁。微濾的透過物管線返回補料罐內。在10分鐘時，將透過物通向「路徑B」(透過物通向排水道)。這將使乳汁濃縮至500毫升。當乳汁的濃度是起始濃度的兩倍時，將透過物返迴路徑A(重複循環至補料罐內)。10分鐘的重複循環後，取樣品2和3，然後調整返回壓力閥，使靠近泵的補料壓力示數為10psi。通過調整泵速度為55赫茲，使補料流速保持在13.351/min。10分鐘重複循環後，取樣品4和5，然後調整返回壓力閥，使靠近泵的補料壓力示數為14psi。通過調整泵速度為60.66赫茲，使補料流速保持在13.351/min。10分鐘重複循環後，取樣品6和7，然後調整返回壓力閥，使靠近泵的補料壓力示數為12psi。通過調整泵速度為40赫茲，使補料流速調整至7.751/min。10分鐘重複循環後，取樣品8和9，然後調整返回壓力閥，使靠近泵的補料壓力示數為14psi。
通過調整泵速度為43.45赫茲，使補料流速保持在7.751/min。10分鐘重複循環後，取樣品10和11，然後調整返回壓力閥使靠近泵的補料壓力示數為10psi。通過調整泵速度為48赫茲，使補料流速調整至12.361/min。10分鐘重複循環後，取樣品12和13，然後調整返回壓力閥使靠近泵的補料壓力示數為14psi。通過調整泵速度為55.44赫茲，使補料流速保持在12.361/min。10分鐘重複循環後，取樣品14和15，然後調整返回壓力閥使靠近泵的補料壓力示數為20psi。通過調整泵速度為61.69赫茲，使補料流速調整至12.361/min。10分鐘重複循環後，取樣品16和17，然後通過調整泵速度為64.64赫茲，調整補料流速為13.351/min，調整返回壓力閥使靠近泵的補料壓力示數為20psi。10分鐘重複循環後，取樣品18和19，然後通過調整泵速度為52.65赫茲，調整補料流速為7.751/min，調整返回壓力閥使靠近泵的補料壓力示數為20psi。10分鐘重複循環後，取樣品20和21，然後關閉泵。所有的樣品冷藏保存，用蛋白質A測定法確定總IgG含量。對透過物樣品(3，5，7，9，11，13，15，17，19，21)目測檢查澄清度。
雙處理實驗為了在雙TFF系統中測試在前面的實驗中確定的工藝參數從非轉基因乳汁中回收細胞培養物IgG1抗體的情況，用2.4克的細胞培養物IgG1抗體摻入非轉基因乳汁中，總體積為1000毫升，取1號樣品。將摻入後的乳汁置於微濾系統的補料罐內，以13.41/min的速度泵出並跨過膜。在每個後續時間點記錄溫度、壓力、透過物流速和體積。調整系統至以下的起始參數膜面積0.2sqft膜孔徑大小0.20um起始乳汁體積.1000mL跨膜壓力14psig透過物壓力0psig濃縮1x使微濾的透過物管線返回至補料罐。在10分鐘時，將透過物導入「路徑B」(引流透過物)。當乳汁濃縮至500毫升或當乳汁的濃度是起始濃度的兩倍時，將透過物返迴路徑A(重複循環回補料罐內)。按照以下的條件啟動超濾泵膜面積0.2sqft膜孔徑大小30kDa起始體積.500mL跨膜壓力7.3psig透過物壓力1.4psig濃縮1x10分鐘重複循環後，調整超濾截留物和透過物的壓力，使超濾的透過物流速與微濾的透過物流速相等。然後將超濾的透過物管線通向微濾的補料罐內，將微濾的透過物管線通向超濾的補料罐內，開始透濾。運行該系統共326分鐘，對每一透濾體積都取樣。所有的樣品冷藏保存，用蛋白質A測定法確定總IgG含量，用SEC檢查聚集。
使用CHO細胞產生的IgG抗體的實驗顯示跨膜壓力為14psig時的最佳流速為大約23cm/s(圖表C和D)。但是含有目標蛋白質或者免疫球蛋白的料液可能來自任何能夠產生這種分子的來源，包括但是不止限於產生外源重組蛋白的轉基因動物。根據本發明的最適溫度是30-35攝氏度之間(圖表A)。非轉基因乳汁顯示液體通量在1.5-2X時最高(圖表B)。當在雙TFF系統中測試這些參數時，得到了82.3％的產率(圖表H)。使用來自山羊C1017的天然轉基因乳汁重複流速和跨膜壓力實驗，顯示跨膜壓力為16psig時最適流速為40-45cm/s(圖表E和F)。在所發現的參數下對天然轉基因乳汁使用CHO細胞表達的IgG1抗體進行的雙TFF過程測試得到的產率為64％(圖表G)。轉基因山羊可以來自任何的哺乳動物，優選來自有蹄類動物，最優選來自山羊或者牛。
摻入研究圖表A 圖表B 圖表C圖表D
轉基因乳汁圖表E 圖表F 工藝測試圖表G 圖表H
儘管向非轉基因乳汁中摻入CHO細胞IgG1抗體對於IgG1抗體在乳汁中的行為有了初步的觀察，含有IgG1抗體的天然分泌的乳汁在使用根據本發明優選使用的0.2微米的陶瓷材質膜時，需要對參數進行不同的優化。與轉基因乳汁的研究相比，摻入研究顯示了較低的最適流速和非常高的產物通量。而且，使用對轉基因乳汁優化的參數運行雙TFF，對摻入IgG1抗體的天然非轉基因乳汁得到的產物回收率更低。
切向流過濾(TFF)作為一種工藝而實施，它通過去除原料乳汁中的顆粒狀物質如脂肪、酪蛋白微球和細菌而使乳汁基質中的IgG1抗體澄清和穩定。TFF廣泛用於生物技術和乳製品工業中，用於除去雜質和濃縮產物。為了根據本發明有效地使用TFF，重要的是要選擇適當的膜，對工藝參數(溫度、跨膜壓力、交叉流速度和乳汁濃度)進行優化以得到高產物通量，並開發出清潔和矩陣儲存的步驟以保證膜具有較長的壽命。這裡根據本發明描述了實驗性矩陣，並且將其用於轉基因山羊乳汁以確證前面的操作參數。對膜的清潔和儲存條件也進行了研究。還開發出了一個無菌過濾步驟以除去在TFF過程完成之後仍然存在於含有目標蛋白的澄清化乳汁產物中的任何細菌。然後將工藝信息傳送到中試規模的設備中，進行最初的工程運轉。一些工藝設計標準包括不使用添加劑以防止對注射用水的需求、長的濾膜壽命、高產率以及短的處理時間。本發明的工藝優選地被設計為可以針對中試和生產操作而被放大。
工藝描述為了使用0.2微米的陶瓷材質微濾膜和30kDa超濾膜進行雙TFF，對來自山羊D035的轉基因乳汁進行澄清和濃縮，用0.1M氫氧化鈉對系統進行清潔。然後必須將乳汁混和並提高溫度至15-20攝氏度。必須通過收集陶瓷膜的透過物而將乳汁在微濾系統上濃縮至其原有體積的一半。微濾必須在141pm的交叉流速率和15psi的跨膜壓力下運行。溫度必須保持在27攝氏度或者左右。然後必須在1.6-21pm的交叉流速率下啟動超濾系統。必須調整超濾的截留物和透過物的壓力，使超濾的透過物流速與微濾的透過物流速相匹配。一旦超濾的透過物流速與微濾的透過物流速相匹配，必須將兩個系統相偶聯以使微濾的透過物管線通向超濾的補料罐中，而超濾的透過物管線通向微濾的補料罐中。兩個系統必須偶聯運行5-6個透濾體積。一旦透濾完成，將兩個系統分開，關閉微濾系統，排空並且清潔，將超濾的透過物通向排水道直至超濾補料罐內的半成品澄清濃縮液的體積降低一半，使總濃度提高4倍。然後排空超濾系統，對半成品澄清化濃縮物進行無菌過濾，並清潔超濾系統。兩個系統都保存在0.1M氫氧化鈉中。工藝示意圖在圖1中提供。
膜的選擇根據以前的研究，使用0.2微米標稱的陶瓷管狀膜，對用于澄清乳汁和通過IgG1抗體的第一個裝置進行測試。使用30kDa截留分子量的平板狀超濾膜對用於捕獲IgG1抗體的第二個系統進行測試。對於使用D035乳汁的每個實驗中的樣品進行分析，分析項目包括用蛋白質AHPLC分析IgG含量，用SDS-PAGE檢查降解，用等電聚焦檢查修飾，用大小排阻層析(SEC)檢查聚集。確定用最小的體積通過0.2微米、3毫米管道陶瓷微濾膜、得到最佳IgG1抗體通量時的起始乳汁濃度範圍。在處理過程中用SDS-PAGE和Western印跡檢查IgG1抗體的降解，以測定濃縮步驟對於IgG抗體產生的影響(如果有的話)。完成兩個實驗以研究乳汁濃度，包括一次用非轉基因乳汁運行的實驗和一次用轉基因乳汁運行的實驗。
非轉基因補料與排放實驗由於可以獲得非轉基因乳汁的充足供應，所以使用非轉基因乳汁分析在使用0.2微米陶瓷微濾膜濃縮時液體通量的衰減。用於該實驗的設備與微濾實驗中描述的設備相同，但是添加了第二個補料罐以及料液泵，以便將乳汁運送到微濾系統的補料罐中，運送速率與透過物從膜流出的速率相同。設備的示意圖如下圖表1 如在圖表I中看到的，用1500毫升的乳汁填充補料罐，泵開始的速率是45赫茲。在沒有截留物壓力的情況下重複循環系統10分鐘。記錄所有的參數。然後將截留物的壓力提高到10psig，跨膜壓力為11psig。通過調整截留物閥門而在整個實驗中維持該跨膜壓力恆定。將透過物導入到排水道中，啟動第二個泵，將新鮮的乳汁泵入到補料罐內，泵入的速率與透過物流出的速率相同，使得補料罐內的體積保持恆定。每隔5-10分鐘記錄所有的參數，調整第二個泵的速度使補料罐內的乳汁水平保持恆定。實驗一直進行到乳汁被濃縮5.37倍或者82％。
轉基因乳汁濃度與產物通量測量D035每一次產奶的pH和體積，並且記錄於pH表格中。合併D035的RM01-001PD到RM-004PD部分的乳汁，總體積為3升。從其中取樣F1，將1500升倒入補料罐內。啟動泵，將速度從20赫茲增加到45赫茲(大約5LPM到大約20L)。記錄溫度、壓力、交叉流速率、透過物流速和體積。在每個後繼時間點記錄所有的參數。重複循環運行該系統(路徑A)5分鐘。調整跨膜壓力到12pisg，重複循環(路徑A)5分鐘。將透過物管線通向排水道直至乳汁濃縮1.5倍，收集550毫升的透過物。分別從補料罐和收集的透過物中取樣F2和P1。將透過物管線返迴路徑A，重複循環10分鐘。分別從補料罐和透過物管線中取樣F3和P2。之後向補料罐內加入500毫升新鮮乳汁，將透過物通向路徑B以將乳汁濃縮至2倍，收集500毫升的透過物。將透過物管線返迴路徑A，重複循環10分鐘。分別取樣F4和P3。重複上述過程，將乳汁濃縮至2.5倍和3倍，繼續取樣。關閉泵。將樣品儲存於2-8攝氏度，用於IgG定量和SDS-PAGE分析。
確定以最小的體積通過0.2微米、3毫米管道陶瓷微濾膜、得到最佳IgG1抗體通量時的操作溫度範圍。由於處理造成的IgG抗體的降解由SDS-PAGE分析。由IEF追蹤同I型的修飾。測量山羊D035每一次產奶的pH和體積，並且記錄於pH表格中。合併D035的RM01-005PD到RM01-008PD部分的乳汁，總體積為3000毫升。從混合物中取樣F1。將2升倒入補料罐內。啟動泵，將速度從20赫茲增加到45赫茲(大約5LPM到大約20L)。記錄溫度、壓力、交叉流速率、透過物流速和體積。在每個後繼時間點記錄所有的參數。重複循環運行該系統(路徑A)5分鐘。調整跨膜壓力到12pisg，重複循環(路徑A)5分鐘。保持溫度為20攝氏度。將透過物管線通向排水道直至乳汁濃縮2.5倍，收集800毫升的透過物。分別從補料罐和收集的透過物中取樣F2和P1。將透過物管線返迴路徑A，繼續重複循環，降低TMP至2psi，泵的速度降低至28赫茲(17LPM)運行17分鐘，使溫度降低到23攝氏度。將泵的速度和TMP分別提高至45赫茲和15psi，在24攝氏度下重複循環5分鐘。取樣F3和P2。將溫度提高至27攝氏度，乳汁重複循環5分鐘，取樣F4和P3。在29攝氏度和36攝氏度重複上述步驟。剩餘的新鮮乳汁通過微濾膜澄清。關閉泵。樣品儲存於2-8攝氏度，用於IgG定量、IEF和SDS-PAGE分析。
流速和TMP與產物通量確定通過0.2微米、3毫米管道陶瓷微濾膜、得到最佳IgG1抗體通量的跨膜壓力(TMP)範圍和交叉流速度範圍。測量D035每一次產奶的pH和體積，並且記錄於pH表格中。合併D035的RM01-009PD到RM01-0012PD部分的乳汁，總體積為3700毫升。從混合物中取樣F1。將1升倒入補料罐內。啟動泵，將速度從20赫茲增加到45赫茲(大約5LPM到大約20L)。記錄溫度、壓力、交叉流速率、透過物流速和體積。在每個後繼時間點記錄所有的參數。重複循環運行該系統(路徑A)5分鐘。調整跨膜壓力到12pisg，重複循環(路徑A)5分鐘。將透過物通向排水道直至乳汁濃縮2倍，收集500毫升的透過物。分別從補料罐和收集的透過物中取樣F2和P1。將透過物管線返迴路徑A，繼續重複循環10分鐘。取樣4和5。調整跨膜壓力為10psig，通過提高泵速至38.81赫茲(大約14LPM)來維持補料流速。乳汁通過微濾系統重複循環10分鐘，然後取樣P3。根據以下的表格重複該步驟
關閉泵。將樣品儲存於2-8攝氏度，用於通過蛋白A定量而進行IgG定量、IEF和SDS-PAGE分析。
工藝測試為了澄清D035乳汁，使用雙TFF系統，使用面積為1.5平方英寸的0.2微米陶瓷微濾膜，將微濾透過物補料30kDa、1.0平方英寸的30kDa超濾膜，在每一個透濾體積時對IgG抗體的回收進行分析。測量山羊D035每一次產奶的pH和體積，並且記錄於pH表格中。合併山羊D035的1776-032601-01-B RM01-029PD-RM01-032PD部分和RM01-033PD-RM01-036PD部分的乳汁，總體積為大約4升，用於每一次實驗。從混合物中取樣F1。將1500毫升倒入補料罐內。啟動泵，將速度從20赫茲增加到45赫茲(大約5LPM到大約20L)。記錄溫度、壓力、交叉流速率、透過物流速和體積。在每個後續時間點記錄所有的參數。重複循環運行該系統(路徑A)5分鐘。調整跨膜壓力到15pisg，重複循環(路徑A)5分鐘。將透過物管線通到量筒中。隨著補料罐內體積的下降，加入新鮮乳汁。收集透過物，直至乳汁濃縮3倍，收集到2700毫升。分別從微濾補料罐和收集的透過物中取樣F2和P1。再次將透過物管線返迴路徑A。將交叉流速率和跨膜壓力分別提高到14LPM和15psig。啟動超濾系統，交叉流速率為0.8LPM，料液壓力為11psi。每一個系統同時重複循環10分鐘。將超濾透過物引到排水道中，收集800毫升的透過物。測量微濾的透過物流速。調整超濾系統上的截留物和透過物壓力，使透過物流速與微濾系統的透過物流速相等。將微濾系統的透過物通向超濾系統的補料罐中，而將超濾系統的透過物通向微濾系統的補料罐中。計算透濾時間(參考計算部分)。在每一次透濾結束時取樣。測量透過物流速並重新計算透濾時間。進行7個透濾體積。分開兩個系統，關閉微濾系統。將超濾的透過物引入排水道中，使澄清化的乳汁濃縮到總濃縮倍數為4倍。然後關閉超濾系統。樣品儲存於2-8攝氏度下，用於IgG定量、IEF、SEC和SDS-PAGE分析。從系統中取出澄清過的濃縮超濾截留物，無菌過濾，2-8攝氏度儲存。
膜的清潔使用嚴格的清潔程序以保證每次循環都有高的水通量回收。將清潔步驟設計成模擬乳製品工業中標準的膜清潔步驟，也考慮到了生物製藥實踐的一些方面。對水衝洗步驟進行優化，以使用水量最小，同時將殘留的化學物質衝走，達到適當的pH和電導值。在每次工藝步驟之後進行以下的清潔步驟，如以下的表1和2所示表1陶瓷膜清潔步驟
表230kDa PEs膜清潔步驟
在第一次使用膜以前，針對跨膜壓力、溫度和水通量製作標準化的透水性曲線。在實驗中使用膜之前，要檢查標準化的水滲透性使其保持最少80％的水通量回收率。在開發中，陶瓷膜保持了95-105％的回收率，而30kDa PES膜保持了80-90％的回收率。
無菌過濾如下面的圖J所示，PallGe lman Inc.製備了除菌濾器，由Supor膜製成，其中有0.8微米的前濾膜與0.2微米的濾膜組合在套盒中。這些套盒的面積為200平方釐米，這是小盒型式的用於除菌過濾的最小膜面積。進行實驗以確定每個小盒的過濾容量。用雙TFF澄清非轉基因乳汁，製備大量的澄清化乳汁，它可以模擬無菌處理過程中的料液。將37毫米的盤狀Supor膜裝在不鏽鋼的正常流支架上，並裝配數字壓力傳感器和蠕動泵。用USP水衝洗整個系統使膜潤溼並且檢查是否有滲漏。然後將澄清的非轉基因乳汁以恆定的流速泵入該系統中，定時記錄壓力。將數據擬合成直線，在下面的圖表中該直線將處理量與壓力聯繫起來。由於在30psig壓力時膜會被堵住，所以用外推法計算30psig時的處理量，以確定容量。對於37毫米的膜推算出的處理量為7343毫升，所以200平方毫米的盒，處理量估計為131升。
圖表J 膜的儲存當膜的清潔方案確定以後，就可以測定儲存條件。在清潔48小時後將膜儲存於水中或者0.1N氫氧化鈉中。將儲存溶液漂洗掉，檢查NWP，並與清潔後的NWP相比較。儲存之後兩個NWP的變化都在儲存之前NWP的10％以內。由於0.1N氫氧化鈉可以抗細菌和真菌，NWP在儲存中沒有下降，所以選擇0.1N氫氧化鈉作為儲存劑。
濃縮與產物通量幾乎在濃縮剛一開始時液體的通量就開始下降，在整個實驗中通量持續平緩下降。最後幾個點顯示出由於膜汙染而通量出現急劇下降。為了在處理過程中保持最適的液體通量，同時使用足夠低的體積進行操作以便有合理的透濾時間，所以推薦1.5到3倍的乳汁濃縮。
圖表K 通過蛋白質A HPLC對IgG進行定量，顯示IgG1抗體和液體通量隨乳汁的濃縮而穩步降低。從下面的圖表L可見，在運行雙TFF時，1.5到2.5倍濃縮是合理的。SDS-PAGE顯示沒有由於乳汁濃縮而出現聚集或者降解。
圖表L
溫度與產物通量通過微濾膜的IgG1抗體質量通量在27攝氏度時達到最大，為20.3克/平方米/小時，如下面圖表所示。最適的操作範圍是26-29攝氏度。參考下面的圖M，IEF顯示未出現由於處理而造成的IgG1抗體同I型的修飾。對於乳汁樣品，SDS-PAGE不能提供信息；而澄清過的乳汁樣品則顯示有降解條帶出現。這些降解條帶在D035的初始乳汁樣品中存在，在經TFF的澄清後半成品材料中條帶變淺。
圖表M通量與溫度的關係 流速、溫度與產物通量對於每一個TMP有一個最適的流速，但是在TMP為15psi、流速為42cm/s(141pm)時，IgG1抗體通量是整體最高的。下面的圖顯示了在每個跨膜壓力下流速的影響曲線。IEF檢查未發現由於處理造成的同I型的改變，SDS-PAGE顯示了與前一實驗相似的結果。
圖表N 如圖N所示，第一個工藝測試顯示了從乳汁混合物中總的IgG1抗體回收率為81％。但是其中有20％是聚集的。在澄清結束時的IEF條帶與初始乳汁混合物的IEF條帶看起來相同。而且取自中間透濾體積的樣品顯示了非常低的IgG1抗體濃度，表明樣品取自超濾補料罐內未混和的區域。重複該實驗。
第二個工藝測試顯示IgG1抗體的回收率為90％，只有5％±0.5％的IgG1抗體發生聚集。IEF凝膠顯示未出現由於處理造成的同I型修飾。SDS-PAGE顯示了輕微的聚集和降解條帶，但是這些條帶並不意味著聚集或者降解的蛋白佔據明顯的百分比，因為在最終的樣品中通過大小排阻層祈測定有96.2％為單體。由於低的IgG1抗體起始濃度，用於IgG定量的蛋白質A測定使得確定回收IgG1抗體所需的透濾次數變得很困難。六次透濾後的回收率為90％，但是五次透濾後通過蛋白質A測定的回收率為170％。因此五到六次的透濾很可能對於回收IgG1抗體來講已經足夠了。
在中試廠房中使用的設備上進行了幾次工程運行以澄清乳汁之後，確定需要對設備和步驟進行修改以穩定地生產澄清的乳汁。將設備從中試廠房的GMP環境中移到開發實驗室中，進行大量的測試。對於系統的改變包括減少透過物的運輸以及改變系統中閥門的位置，使得在清潔和消毒步驟中的漂洗更加便利。對清潔方案作少量改動，以改進清潔效率並降低耗水量。確定了工藝溫度範圍。最後在GMP記錄中更加明確工藝的參數。
中試設備的原始設計完全使用的是不鏽鋼。該設計清潔起來非常麻煩，因為有許多很長的管道需要進行拆卸，從工藝處理的組裝方式變為清潔階段的組裝方式。由於超濾透過物管道的長度和內徑，在清潔方案中，這些管道不能被有效地清潔或漂洗。在微濾系統中加入一些部件以有助於清潔，但是這些部件的搭建會導致殘渣累積的死空間。通過用1/4″內徑的管道代替長的超濾透過物管道，消除了這些問題。改變清潔設置，使微濾膜上面的出口可以用於清潔膜的透過物一端，這樣就不需要其他的部件了。超濾的透過物管道在清潔過程中仍然保留在超濾系統上。而且在系統的微濾部分上安裝有大型的熱交換器，使微濾的溫度可以被更精細地控制，但是這樣就不能將超濾部分的溫度控制在工藝要求的正確範圍內。將熱交換器從系統中移走，調整冷卻器的設置，以便將兩個系統都冷卻到正確的溫度範圍內。最終的設計如下。用於儲存、消毒和處理而裝配的設備。在本發明的一個優選實施方案中的設備配置如下面的圖0和P所示。
用於清潔裝配的設備上圖為圖0，下圖為圖P
對設備還有其他簡單的改動。在使用水對超濾系統進行測試以確定妨礙足夠的跨超濾膜交叉流的高壓產生的原因之後，發現膜向下的扭矩過大，適宜的扭矩是60英寸.磅。泵的轉子和密封墊也有脫落。向超濾膜上遊的管線中插入80目濾網墊片，截獲大的脫落物，防止流動限制和超濾膜上壓力的積聚。移動超濾截留物閥，使其與超濾補料罐相鄰。在處理過程中連接微濾透過物閥門和超濾補料罐的捲筒(spool piece)被去掉，使閥門與補料罐直接相連。這些改動使設備在清潔步驟時更易清潔和漂洗，並使得整個系統在消毒和接下來的漂洗以及潔淨水透水性測試中保持為工藝處理模式的連接狀態。
工藝過程改變對TFF操作SOP和處理含IgG1抗體的乳汁的批記錄進行修改，使其包括交叉流速率、跨膜壓力以及微濾和超濾系統溫度的範圍。通過一系列實驗確定溫度範圍。研究的參數以及產生的澄清乳汁的質量在下面的表3中予以概述。HEX指的是在微濾系統上使用熱交換器。比較最後三次運行(5-7)時溫度範圍的圖表在附錄B.1中。
表3工藝過程改變
在中試設備上進行的所有工程操作產生的都是模糊或者混濁的澄清化乳汁。在過高的溫度下操作會使澄清化的乳汁看起來模糊並且顏色幾乎為綠色，而不是看起來清澈且呈黃色。高溫處理可能導致乳汁中一般情況下被截留的多種分子通過微濾膜，並且可能會影響IgG1抗體的穩定性。當工藝過程在合適的交叉流速率以及跨膜壓力下運行時，泵並不會導致溫度升高到在工程運行中所見到的無法控制的情況。澄清化乳汁中的模糊物質還可能是由於在一些運行的清潔中不正確的衝洗留下的化學物質殘留，樣品的pH經測定為9(正常為6.7)。通過調整設備和清潔步驟，充分地將化學物質從系統中衝走，這可以通過測定所有液流中漂洗水的pH和電導率而看出。
在過低的溫度下操作會使澄清化的乳汁看起來混濁，且有白色的絮狀物質均勻分布在乳汁中。在微濾系統中安裝熱交換器時，溫度很容易控制，但是澄清化的乳汁仍然混濁。根據P.F.Fox and P.L.H.McSweeny(1998)的Dairy and Biochemistry，酪蛋白在其等電點時是不溶的，而且不溶性的範圍隨著溫度的升高而增大。這提示在較高的溫度下進行微濾比在較低的溫度下進行微濾能夠除去更多的酪蛋白，而且微濾操作的溫度比超濾操作低會使得通過微濾的處於溶解狀態的酪蛋白在更為溫暖的超濾過程中變得不溶。SDS-PAGE確證了這個現象，顯示與在實驗規模運行(bench scale run)和成功的中試運行中製備的澄清化乳汁相比，在低溫下進行的運行產生了過量的酪蛋白(下圖)。因此需要在維持高度酪蛋白不溶性和最低的可能溫度之間找到一個平衡。根據所進行的運行，在22攝氏度下進行微濾則溫度太低，在30攝氏度下進行運行則溫度又太高。在運行的大部分過程中保持微濾的運行溫度在25攝氏度附近可以重複產生出清澈的澄清化乳汁。圖3中提供了SDS-PAGE凝膠比較。請參考圖3。泳道1是分子量標準。泳道2是細胞培養物IgG1抗體。泳道3是2001年4月17日進行的工程運行的最終澄清半成品。泳道4是中試運行6(合適溫度)的最終澄清半成品，泳道5是實驗性TFF得到的澄清化半成品物質。與中試運行6和實驗性澄清化物質的樣品相比較，工程運行樣品顯示出多得多的酪蛋白。
清潔和消毒的改變進行的設備改變使清潔和消毒方案也必須改變。在上表中，每次運行之後都運行清潔方案。需要使微濾上的截留閥保持半開放，以便於每一漂洗步驟中能夠恰當地漂洗，原因是在閥和補料罐之間有一段長的死端。在第4次運行之後，運行清潔方案，跟蹤水的消耗(筆記本10586)。在該實驗中使用的水在第5、6和7次運行後得以證實，並且推薦在GMP工藝過程中使用。正如前面所陳述的，設備的改變可以使整個系統以工藝處理模式進行消毒。對此進行了檢測。也測定了將消毒劑潤從漂洗系統中洗掉所需的USP水。
操作使用雙TFF進行乳汁處理所採取的實際步驟在下面的部分中予以描述。這些包括從系統消毒到工藝處理、清潔以及儲存的整個過程。在開發實驗室中第5-7次運行過程中在設備上使用了這些步驟，產生了清澈的澄清化乳汁。
消毒為了使用0.2微米陶瓷微濾膜和30kDa超濾膜進行雙TFF，以便對來自D035的轉基因山羊乳汁進行澄清和濃縮，必須使用0.1M氫氧化鈉對系統進行消毒。設備如上組裝用於消毒和工藝處理。用USP水製備2升的0.1M氫氧化鈉，將其泵入每個系統中，在微濾上的交叉流速率是151pm，在超濾上的交叉流速率是11pm。對於微濾不施加任何的截留物壓力，而對於超濾的截留物施加5psi的壓力。透過物閥門完全打開，使氫氧化鈉在整個系統中反覆循環。反覆循環進行15分鐘，然後通過罐和泵之間的排放閥使氫氧化鈉溶液完全排出系統。在需要時，用USP水完全充滿補料罐，漂洗整個系統。從每一個排放閥中排出1升水。微濾上的截留物閥門半關閉，將透過物閥門完全通向排廢管。超濾上的截留物和透過物閥門也完全通向排廢管。用12升超純水通過微濾截留物管道進行衝洗，交叉流速率為201pm。用4升超純水通過微濾透過物管道進行衝洗，交叉流速率為15-201pm，TMP為6-8psi。用7升超純水通過超濾的截留物和透過物管道進行衝洗，交叉流速率為11pm，然後再用3升水衝洗透過物管道。
使用超純水(如果需要的話加入更多)，抽吸微濾，速率為201pm，提高截留物壓力直至TMP達到15psi，而不施加透過物壓力，然後通過改變抽吸速度調整交叉流速率至151pm。記錄溫度(必須在25-28攝氏度之間)、壓力和交叉流速率。測量透過物通過透過物排空閥門的流速。在超濾上使用11pm的交叉流速率和5psig的截留物壓力，不施加透過物壓力(TMP大約為10psig)，重複上面的過程。比較透過物速率與膜在使用前的透水性。如果流出速率小於起始值的80％，則或者重新清潔膜或者將它們換掉。
乳汁處理乳汁必須合併並提高溫度至15-20攝氏度。在微濾罐內合併乳汁，然後關閉微濾的透過物閥門，打開截留物閥門，打開泵，使交叉流速率為201pm。5分鐘後取起始乳汁樣品。然後提高壓力至TMP達到15psig，交叉流速率為151pm。重複循環一直進行至乳汁溫度達到20攝氏度。然後打開冷卻器，調至10攝氏度，打開微濾的透過物閥門，通過收集陶瓷膜的透過物，在微濾系統上使乳汁濃縮至其起始體積的一半。在151pm交叉流速率和15psi跨膜壓力下運行微濾。微濾的溫度應該提高並且保持在26±2.0攝氏度。然後必須啟動超濾系統，交叉流速率為0.8-11pm/sqft。通過透過物閥門測量每個膜的透過物流速。必須調整超濾的截留物和透過物的壓力，使透過物的流速與微濾的透過物流速相匹配。當超濾的透過物流速與微濾的透過物流速相匹配時，應該在偶聯狀態下運行系統5-6個透濾體積。一旦透濾完成，即將系統分離，關閉微濾，排空並且清潔，將超濾的透過物排入排水管道內，直至超濾補料管內的半成品澄清化濃縮物的體積降低了一半，總的濃縮倍數為4倍。然後排空超濾，無菌過濾半成品澄清化濃縮物，並清潔超濾。
清潔和儲存方案根據本報告第14頁上的圖拆卸系統。用20升的熱的(45-65攝氏度)軟水漂洗MF，同時截留物閥門半開，將透過物管道通向排水管道。使閥門通向重複循環溶液返回補料罐內，用2升熱的0.5M氫氧化鈉+400ppm次氯酸鈉重複循環5分鐘。將溶液從系統中排空，替換為2升相同的化學物質。用新鮮的溶液重複循環30分鐘，然後通過排放閥排空。用20升熱的軟水通過半開的截留物閥門衝洗整個系統。用4升水衝洗通過透過物管道，只是將水在膜的截留物一側重複循環，交叉流速率為201pm，TMP為6-8psi。剩餘的水通過排放閥排空。用2升熱的0.5M檸檬酸溶液在整個系統中重複循環30分鐘，交叉流速率為201pm，TMP為6-8psi。然後通過排放閥排空檸檬酸溶液。使用15升軟水漂洗微濾的截留物一側，用4升漂洗透過物一側(同腐蝕性氫氧化鈉之後的漂洗一樣)。2升熱的0.05M氫氧化鈉+400ppm漂白劑在MF中重複循環15分鐘，然後排空，用10升水漂洗截留物一側，用4升水漂洗透過物一側(同腐蝕性氫氧化鈉之後的漂洗一樣)。在開始的水衝洗中，通過使截留物閥門排空以及使整個透過物管道排空(不通過閥門)，將超濾的截留物和透過物管道直接通向排水管道。泵總是在11pm下運行，即如果截留物壓力升高，泵的速度也必須提高以維持11pm。用4升超純水漂洗兩條管道。用超純水配置的2升0.5M氫氧化鈉+250ppm次氯酸鈉衝洗兩條管道。在整個系統中重複循環2升新鮮的溶液，使透過物管線與補料罐連接，使截留物閥門向補料罐打開60分鐘。通過排放閥排空溶液。同初次衝洗一樣，將兩個管線通向排水管道。用超純水填滿補料罐，通過排放閥排空1升水。通過兩個管線衝洗8升水，再用4升水通過透過物管道，截留物的壓力為5psi。然後將2升0.4M檸檬酸溶液在系統中重複循環60分鐘。通過排放閥排空酸性溶液，然後用超純水填滿補料罐，通過排放閥排空1升水。通過截留物和透過物兩條管線衝洗8升水，再用8升水衝洗透過物管線，跨膜的交叉流速率為11pm，截留物壓力為5psi。當兩個系統都被清潔和漂洗後，將它們裝配起來用於保存(上面的圖)。將2升的0.1M氫氧化鈉溶液灌入每一個料液導管，泵到整個系統中，使截留物和透過物閥門打開，進行重複循環，通向廢物的閥門關閉，保持兩分鐘。然後覆蓋管道導管並且作出狀態標籤，表明其是清潔的並且儲存於0.1M的氫氧化鈉溶液中。
已經顯示工藝參數對於生產一致性的物質是重要的。用于澄清的膜是CerCor陶瓷材質的0.2微米孔徑大小的膜，1.5平方英寸，30kDaNMWCO Pall Filtron PES盒式膜，2平方英寸(2個盒子)。對於最佳的IgG1抗體澄清度和通量，微濾的溫度應該保持在26-29攝氏度。微濾系統應該在截留物流速為141pm(42cm/s)和跨膜壓力為15psig下運行。乳汁應該濃縮至原始混合物體積的40-70％(1.5-2.5倍)。系統的超濾部分應該在截留物流速為1.6-21pm、補料壓力為20-30psig下運行。應該通過調整透過物壓力使透過物流速與微濾系統的透過物流速相匹配。最終的半成品澄清化濃縮物應該是原始乳汁混合物體積的四分之一(4倍濃縮)。
重組生產目前正在開發出越來越多的重組蛋白質，用於治療和診斷的用途。但是，這些蛋白質中有很多難於以功能形式和/或所需量經常規方法生產或者這樣的生產方法比較昂貴。通常的方法包括將負責產生某種具體蛋白質的基因插入宿主細胞中，例如細菌、酵母或者哺乳動物細胞如COS或CHO細胞，然後在培養基中培養這些細胞。然後培養的細胞將合成所需的蛋白質。傳統的細菌或者酵母系統可能不能以有功能的形式產生許多複雜的蛋白質。儘管哺乳動物細胞可以生產複雜的蛋白質，但是它們的培養一般比較困難和昂貴，而且蛋白質的產量通常只是毫克/升數量級。此外，由於非分泌型蛋白質不被分泌到培養基中，所以從原核或者哺乳動物細胞中純化它們相對困難。
一般而言，轉基因技術的特色是，它是一種製造和分泌一般情況下不被分泌出來的蛋白質(非分泌型蛋白質)的方法。該方法包括用核酸構建體表達蛋白質，該核酸構建體包括(a)啟動子，例如乳腺上皮細胞特異性啟動子，例如乳汁蛋白啟動子；(b)信號序列，它指導蛋白質的分泌，如來自乳汁特異性蛋白質的信號序列；(c)可選地編碼分泌型蛋白質(例如分泌到乳汁中的蛋白質)的氨基末端編碼區域足夠長的部分的序列，使非分泌型蛋白分泌(例如分泌到轉基因哺乳動物的乳汁中)；以及(d)編碼非分泌型蛋白質的序列，其中元件(a)、(b)、(c)(可選性的)和(d)優選地以上述連接順序可操作性連接。
在優選的實施方案中元件a、b、c(如果有的話)和d來自同一基因；元件a、b、c(如果有的話)和d來自兩個或者更多基因。
在優選的實施方案中分泌是分泌到轉基因哺乳動物的乳汁中。
在優選的實施方案中信號序列是β-酪蛋白的信號序列；啟動子是β-酪蛋白的啟動子序列。
在優選的實施方案中，非分泌型蛋白質編碼序列是人源的；編碼截短的細胞核或者細胞質多肽；編碼人血清白蛋白或者其他所需的目標蛋白。
除非特別指明，本發明在實施中會使用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，這些技術是在本領域技術範圍內的。這些技術在文獻中都有描述。參見，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory Press1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；專題論述集Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mamma lian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；MethodsIn Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
乳汁特異性啟動子在實施本發明時有用的轉錄啟動子是那些優先在乳腺上皮細胞中被激活的啟動子，包括控制編碼乳汁蛋白〔例如酪蛋白、β乳球蛋白(Clark et al.，(1989)Bio/Technology 7487-492)、乳清酸蛋白(Gorton et al.(1987)Bio/Technology 51183-1187)和乳白蛋白(Soulier et al.，(1992)FEBS Letts.29713)〕的基因的啟動子。酪蛋白啟動子可以來自任何哺乳動物種中的α，β，γ或者κ酪蛋白基因；優選的啟動子來自山羊β酪蛋白基因(DiTullio，(1992)Bio/Technology1074-77)。乳汁特異性蛋白質啟動子或在乳腺組織中被特異激活的啟動子可以來自cDNA或者基因組序列。優選地，它們來自基因組序列。
關於所有上面列舉的乳腺特異性基因，已經可以獲得至少一個、通常是多個生物體的DNA序列信息，參見例如Richards et al.，J.Biol.Chem.256，526-532(1981)(大鼠α乳白蛋白)；Campbell etal.，Nucleic Acids Res.12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Joneset al.，J.Biol.Chem.260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee Rosen，J.Biol.Chem.258，10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，Biochem.J.242，735-742(1987)(人α乳白蛋白)；Stewart，Nucleic Acids Res.12，389(1984)(牛αs1和κ酪蛋白cDNAs)；Gorodetsky et al.，Gene 66，87-96(1988)(牛β-酪蛋白)；Alexander et al.，Eur.J.Biochem.178，395-401(1988)(牛κ-酪蛋白)；Brignon et al.，FEBS Lett.188，48-55(1977)(牛αs2酪蛋白)；Jamieson et al.，Gene 61，85-90(1987)，Ivanov etal.，Biol.Chenet.Hoppe-Seyler 369，425-429(1988)，Alexanderet al.，Nucleic Acids Res.17，6739(1989)(牛β-乳球蛋白)；Vilotte et al.，Biochimie 69，609-620(1987)(牛α-乳白蛋白)。有關多種不同的乳汁蛋白質基因的結構和功能的綜述參見Mercier Vilotte，J.Dairy Sci.76，3079-3098(1993)(這裡引用其全部內容作為參考，用於所有的目的)。如果還需要額外的序列數據，可以利用已有的序列作為探針，很容易地克隆出已經可以獲得的區域的側翼序列。來自不同生物體中的乳腺特異性調控序列也可以使用已知的同源核苷酸序列或者針對同源蛋白質的抗體作為探針，通過篩選這些生物體的文庫而類似地獲得。
儘管通過舉例說明和實施例對上述的發明進行了描述，以便於理解，顯然對於那些本領域的技術人員，可以實施一些改變和調整。因此，上述描述和實施例不應該理解為是對所附權利要求書所確定的本還應當注意到，儘管白蛋白與多種不同的化合物如乙醇和包括磷酸鹽在內的礦物質鹽類共同結晶，在文獻中沒有發現有使用磷酸鹽結晶的工業方法。通過本發明的優選實施方案，現在已經發現，通過充分使用本發明的關鍵工藝參數和/或條件，使用磷酸鹽可以便利地結晶人白蛋白。已在上文列出和描述了本發明的參數和一些變動。
因此，應當理解的是，本發明中有關提供改進的切向流過濾方法以便從給定的料液中以高產率生產出目標分子的實施方案只是對本發明原理的應用進行舉例說明。從前面的描述中顯然可見，在不偏離本發明精神或者所附權利要求的範圍的情況下，可以對本發明公開內容的各要件的形式、使用方法和應用進行改變。
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權利要求
1.從料液中分離目標分子物質的方法，該方法包含(a)用切向流過濾工藝通過濾膜將所述的料液過濾，所述濾膜具有的孔徑大小可以將所述的目標分子物質從所述的料液中分開，同時保持通量水平在「通量-TMP曲線」的壓力依賴性區域內臨界點通量的大約5-100％，其中所述跨膜壓力沿著膜大體保持恆定，其水平不高於過濾臨界點處的跨膜壓力，從而將所述的目標分子物質從所述的料液中選擇性地分離出來，並使所述的目標分子物質保持其生物活性；(b)通過微濾工藝過濾所述的料液；其中所述的目標分子物質是蛋白質。
2.權利要求1的方法，還包含將所述的料液分級分離。
3.權利要求1的方法，還包含使所述的料液澄清。
4.權利要求1的方法，還包含對所述的料液進行透濾。
5.權利要求1的方法，還包含將所述的料液濃縮。
6.權利要求1的方法，其中所述目標分子物質分子量為大約1到1000kDa。
7.權利要求1的方法，其中所有的過濾階段都是超濾。
8.權利要求1的方法，其中所述的料液是乳汁。
9.權利要求1的方法，其中所述的料液是細胞裂解物溶液。
10.權利要求1的方法，其中所述的蛋白質是生物藥劑。
11.權利要求8的方法，其中所述乳汁的狀態選自以下狀態中的一種a)未經處理的；b)稀釋的；c)使用緩衝溶液處理過的；d)經化學處理過的；以及e)部分蒸發的。
12.權利要求2的方法，其中所述的分級分離步驟使用陶瓷材質的濾膜。
13.權利要求3的方法，其中所述的澄清步驟使用陶瓷材質的濾膜。
14.權利要求2的方法，其中所述的分級分離步驟使用聚合物濾膜。
15.權利要求3的方法，其中所述的澄清步驟使用聚合物濾膜。
16.權利要求2的方法，其中所述的分級分離步驟使用纖維素濾膜。
17.權利要求3的方法，其中所述的澄清步驟使用纖維素濾膜。
18.權利要求2的方法，還包含優化系統參數。
19.權利要求18的方法，其中所述的系統參數包括溫度、料液流速、跨膜壓力、料液濃度和透濾體積。
20.權利要求3的方法，還包含優化系統參數。
21.權利要求20的方法，其中所述的系統參數包括溫度、料液流速、跨膜壓力、料液濃度和透濾體積。
22.權利要求1的方法，其中所述的目標分子物質是選自下組中的生物實體蛋白質、免疫球蛋白、多肽、肽、糖蛋白、RNA和DNA。
23.權利要求19的方法，其中最適溫度範圍是15到50攝氏度。
24.權利要求19的方法，其中最適溫度範圍是20到35攝氏度。
25.權利要求19的方法，其中最適溫度範圍是25到29攝氏度。
26.權利要求21的方法，其中最適溫度範圍是15到50攝氏度。
27.權利要求21的方法，其中最適溫度範圍是20到35攝氏度。
28.權利要求21的方法，其中最適溫度範圍是25到29攝氏度。
29.權利要求19的方法，其中料液流速是從10cm/sec到100cm/sec。
30.權利要求19的方法，其中料液流速是從20cm/sec到60cm/sec。
31.權利要求19的方法，其中料液流速是從25cm/sec到45cm/sec。
32.權利要求21的方法，其中料液流速是從10cm/sec到100cm/sec。
33.權利要求21的方法，其中料液流速是從20cm/sec到60cm/sec。
34.權利要求21的方法，其中料液流速是從25cm/sec到45cm/sec。
35.權利要求19的方法，其中跨膜壓力範圍是從2psi到40psi。
36.權利要求19的方法，其中跨膜壓力範圍是從5psi到30psi。
37.權利要求19的方法，其中跨膜壓力範圍是從10psi到20psi。
38.權利要求21的方法，其中跨膜壓力範圍是從2psi到40psi。
39.權利要求21的方法，其中跨膜壓力範圍是從5psi到30psi。
40.權利要求21的方法，其中跨膜壓力範圍是從10psi到20psi。
41.權利要求19的方法，其中料液濃度是天然乳汁的0.25到4倍。
42.權利要求19的方法，其中料液濃度是天然乳汁的0.5到3倍。
43.權利要求19的方法，其中料液濃是是天然乳汁的1.0到2倍。
44.權利要求21的方法，其中料液濃是是天然乳汁的0.25到4倍。
45.權利要求21的方法，其中料液濃度是天然乳汁的0.5到3倍。
46.權利要求21的方法，其中料液濃度是天然乳汁的1.0到2倍。
47.權利要求19的方法，其中透濾體積範圍是濃縮的微濾截留物體積的1到20倍。
48.權利要求19的方法，其中透濾體積範圍是濃縮的微濾截留物體積的3到15倍。
49.權利要求19的方法，其中透濾體積範圍是濃縮的微濾截留物體積的5到10倍。
50.權利要求21的方法，其中透濾體積範圍是濃縮的微濾截留物體積的1到20倍。
51.權利要求21的方法，其中透濾體積範圍是濃縮的微濾截留物體積的3到15倍。
52.權利要求21的方法，其中透濾體積範圍是濃縮的微濾截留物體積的5到10倍。
53.權利要求2的方法，其中超濾膜用於所有的過濾步驟。
54.權利要求5的方法，其中超濾膜用於所有的過濾步驟。
55.權利要求8的方法，其中所述的乳汁用選自下組中的溶液進行處理a)水；b)緩衝鹽水溶液；c)螯合劑；d)酸溶液；以及e)鹼溶液。
56.權利要求4的方法，其中所述的透濾使用超濾透過物。
57.權利要求4的方法，其中所述的透濾使用水。
58.權利要求4的方法，其中所述的透濾使用緩衝鹽溶液。
59.權利要求1的方法，其中使用的膜用溫度高於20攝氏度的溶液進行清潔。
60.權利要求1的方法，其中使用的膜用溫度範圍在20到70攝氏度的溶液進行清潔。
61.權利要求1的方法，其中使用的膜用溫度範圍在40到60攝氏度的溶液進行清潔。
62.權利要求1的方法，其中使用的膜用酸溶液進行清潔。
63.權利要求1的方法，其中使用的膜用鹼溶液進行清潔。
64.權利要求1的方法，其中使用的膜用次氯酸鹽溶液進行清潔。
65.權利要求62、63或64的方法，還包括在使用所選的溶液之後用水漂洗。
66.權利要求1的方法，其中使用的膜在使用之前用氫氧化物溶液進行消毒。
67.權利要求1的方法，其中使用的膜在使用之前用醇溶液進行消毒。
68.權利要求1的方法，其中使用的膜在使用之前用次氯酸鹽溶液進行消毒。
69.權利要求1的方法，其中使用的膜的清潔時間為20分鐘到45分鐘。
70.權利要求1的方法，其中還包括將第二個切向流過濾階段的濾出液通過孔徑比在第一個過濾階段中使用的膜的孔徑更小的膜進行過濾，並且將第二個過濾階段的濾出液返回到第一個過濾階段，如此重複該過程。
全文摘要
本發明提供了用於將目標分子從包含它們的混合物中分離出來的工藝過程和設備，包含用改進的切向流過濾(TFF)方法對混合物進行處理。使用該改進的TFF可澄清、處理多種料液，以取出目標分子。根據一項優選的實施方案，使轉基因乳液流穩定並且除去顆粒狀物理例如脂肪和酪蛋白微球以及細菌。在本發明中使用的TFF方法利用了優化的工藝參數，包括溫度、跨膜壓力、交叉流速度和乳汁的濃度。還開發出了清潔和儲存操作流程，以保證膜具有長的使用壽命。還開發出了無菌過濾步驟，以從澄清過的轉基因乳汁料液中除去殘留的任何細菌。
文檔編號C07K1/34GK1759189SQ03826243
公開日2006年4月12日 申請日期2003年8月6日 優先權日2003年2月24日
發明者D·E·克託, A·拉沃蒂爾 申請人:Gtc生物治療學公司