用於分析蛋白的方法和組合物的製作方法

2023-10-19 22:06:27 1

專利名稱：用於分析蛋白的方法和組合物的製作方法
背景技術：
本發明涉及用於檢測和可定量多肽的可分離組合物、方法和試劑盒。發明發現了在多肽多重檢測領域的特殊應用，多肽包括參與翻譯後活動的蛋白。
在許多醫學學科中，在血液或其它生物學液體中檢測許多被分析物的需要已變得日益明顯，包括多肽和核酸序列。大多數多分析物檢測，如在基因組範圍內檢測多個核酸序列的測定，涉及多個步驟，具有很少的靈敏性，有限的動力學範圍(通常相當於2至100倍差異)，有些需要複雜的儀器。多分析物檢測的一些已知的經典方法包括如下a.應用兩個不同的放射性同位素標記來區分兩個不同的被分析物。
b.應用兩個或以上不同的螢光標記來區分兩個或以上被分析物。
c.應用無機螯合物，其壽命和波長都被用於區分兩個或以上被分析物。
d.應用螢光和化學發光標記來區分兩個或以上被分析物。
e.應用兩個不同的酶來區分兩個或以上被分析物。
f.應用酶和吖啶酯類來區分兩個或以上被分析物。
g.不同被分析物的空間解析度，例如排列，來鑑定和量化多個被分析物。
h.應用吖啶酯類標記，其壽命或dioxetanone的形成被用來量化兩個不同的病毒靶。
蛋白組在過去的幾年已經引起人們的興趣。由於蛋白組比基因組更複雜，蛋白研究比mRNA研究提供了更精確的細胞生物學圖譜。蛋白組領域是非常廣的，涉及的領域如，例如，通過應用二維凝膠電泳和質譜分析的蛋白構型來研究蛋白在細胞中的表達，用酵母雙雜交方法研究蛋白-蛋白相互作用，通路分析以了解信號傳導和其它複雜的細胞過程，大規模蛋白摺疊和3-D結構研究以及蛋白的高通量表達和純化，在代謝、有絲分裂、減數分裂過程中應答外部刺激的細胞表達，如藥物、病毒、物理或化學條件的改變，包括營養素和輔因子的過剩或不足，應激，衰老，存在特殊的生物體菌株並鑑定生物體和菌株，多藥耐藥，蛋白-DNA相互作用，蛋白-肽相互作用，等。有必要有一種方法在單一標本中鑑定多數蛋白以及對被檢測的不同蛋白提供一些定量分析。
隨著人類基因組被闡明，會有大量的機會進行涉及基因編碼序列的診斷程序。基因的一個主要功能是產生蛋白，它在細胞中完成的工作中起重要的作用。由於細胞中的蛋白功能是動態的，特定蛋白在特定時間點的結構、濃度、位置等等是不斷變化的。蛋白表達方式的分析是正在進行的基因組計劃的目的。對蛋白生理學活性形式及其在細胞中空間和時間相互作用的研究是整體研究的重要方面。
蛋白的一個翻譯後修飾是添加或去除磷酸鹽基團。蛋白磷酸化作用和去磷酸化作用反應已被確定是代謝調節和信號傳導通路的主要組成部分。蛋白磷酸化作用的變化提供了目前已知的生物學系統中主要的酶調節方法，特別是在細胞表面受體的信號傳導的調節中。可逆的磷酸化作用對於傳導調節信號是重要的，包括所有活細胞中的增殖調節信號。為理解這些調節機制的分子基礎，有必要鑑定被磷酸化的特異胺基酸殘基。通過鑑定磷酸化作用的底物和位點，可開發對某些腫瘤的診斷工具，且磷酸化過程本身的修飾可能成為治療幹預的靶標。
多肽如生長因子、分化因子和激素對協調多細胞生物體發育的調節系統是至關重要的成分。許多這些因子通過結合到並活化具有內在蛋白酪氨酸激酶活性的細胞表面受體來介導其多效性作用。由細胞外信號傳導分子如生長因子和細胞因子引起的細胞行為改變需要完成轉錄活動的複雜程序。為激活或抑制轉錄，轉錄因子必須位於核內，與DNA結合，並與基本轉錄結構相互作用。因此，調節轉錄因子活性的細胞外信號可影響這些過程的一種或多種。最普通地，通過可逆的磷酸化作用獲得調節。由幾種不同激酶(或通過與一個以上通路相聯繫的激酶)引起的轉錄因子的磷酸化作用是簡單的機制，使不同的信號集中於相同的因子。
文獻中有許多方法關注於磷酸化作用的分析。一個這種方法是32P-標記蛋白的二維磷酸肽圖譜。另一個方法依賴於分析非放射標記磷酸蛋白的質譜分析。在另一個方法中(Cao，等人，Rapid Commun.Mass Spectrom.(2000)5141600-1606)，用即時的固定金屬親合層析(IMAC)/毛細管電泳(CE)/電噴離子化多相序貫質譜分析(MS)繪製蛋白的磷酸化作用位點圖譜。IMAC樹脂保留和預濃縮磷酸化的蛋白和肽，CE從IMAC樹脂上洗脫出來的混合物中分離磷酸肽，MS提供了包括每個成分磷酸化作用位點的信息。
磷酸化肽微量純化的步驟，作為質譜分析的餾分前端，由Posewitz，等人公開，Anal.Chem.(1999)712883-2892。使用微量吸頭形式的固定金屬親合層析，更特別地與鎵III離子聯合使用。磷酸肽以接近定量和高度選擇性的方式被回收，以產生濃縮的標本，直接通過矩陣輔助雷射解吸附/飛行電離時間和毫微電噴電離質譜分析而分析。
但是，仍然需要鑑定和/或檢測多肽的活性和/或檢測多肽存在和/或量的方法，多肽參與了翻譯後修飾過程。該方法應當能夠識別已經發生的修飾，修飾的單個或多個位點以及修飾位點的位置。該方法應當應用類別特異的試劑，可能並能夠在單一測定中檢測多個多肽，即，具有高度的多重技術能力。該方法應當能夠實時地提供要檢測的信息，並能夠確定某種多肽在生物學通路中的重要性。此外，無論特定通路是否被激活，為了檢測，該方法使用多重技術是很重要的。
發明概述在一個方面，本發明關注於在懷疑含有靶多肽的標本中檢測一種或多種靶多肽的存在和/或量的方法。形成的混合物含有(i)標本；(ii)包括致裂解部分的第一個試劑(這裡也指″類別特異的試劑″)和對一種或多種靶多肽上的翻譯後修飾特異的第一個結合劑；和(iii)一種或多種電泳探針和一種或多種電泳標記，每個探針具有對靶多肽特異的結合部分，每個標記上附有可裂解的連接。混合物被置於每個結合劑與每個部分發生結合的條件下。第一個結合劑和翻譯後修飾間的相互作用將致裂解部分帶到可裂解連接的近旁(這裡也稱作″有效近端″)，可裂解連接在與多肽相連的探針上，且僅當與致裂解部分接近時才容易被裂解。以此方式，只有當結合發生時，每個多肽的獨特電泳標記可從電泳探針上釋放。然後釋放的電泳標記被分離，並根據相應標記的特性和量檢測靶多肽的存在和/或量。優選地，每個電泳標記具有獨特的光學和/或電荷-質量特徵。
本發明的另一個實施例是在一個標本中進行多重測定以檢測多數靶多肽的方法，其中的靶多肽已經接受了磷酸化作用。標本與包含致裂解部分的第一個試劑、含有親合性支持物的第一個結合劑和多數電泳探針結合。每個電泳探針含有各自靶多肽的結合部分和可裂解或可釋放的電泳標記。結合體接受使第一個結合劑與靶多肽結合的條件。每個電泳探針中的電泳標記包括i)只有當與致裂解部分接近時才容易被裂解的可裂解連接，和ii)具有獨特的電泳和/或光學特性的可檢測部分。第一個結合劑和靶多肽間的相互作用將致裂解部分帶到可裂解連接的近旁。通過裂解可裂解連接，電泳標記從與靶多肽連接的電泳探針上釋放。釋放的標記通過每個標記特有的分離和光學特徵而被鑑定，並檢測標本中靶多肽的存在。優選地，電泳標記具有獨特的電泳遷移率和/或螢光特徵。
本發明的另一個實施例是用於檢測多數靶多肽的每一個和任一個的存在和/或量和/或活性的組合物，靶多肽屬於預先確定的一類翻譯後物質如磷酸化的蛋白、糖蛋白、脂質衍生的蛋白，等。組合物包括含有致裂解部分的第一個試劑和結合部位的第一個結合劑，結合部位含有靶多肽的翻譯後修飾。檢測可以是對靶多肽本身或對參與靶多肽翻譯後修飾的成分。組合物可以是試劑盒的一部分，試劑盒還包含封裝的多種電泳探針的組合，其中每個電泳探針含有針對各自靶多肽的第二個結合劑和可裂解電泳標記。每個電泳探針中的可裂解標記包括只有當與致裂解部分接近時才容易被裂解的可裂解部分，和至少一個具有獨特的電泳和/或光學特徵的可檢測部分。
附圖描述

圖1圖解了一個始於可商業獲得的6-羧基螢光素的示例合成方法，其中的酚羥基用酸酐保護。通過標準的提取檢查，獲得產物的95％產量。此材料被亞磷酸化以產生氨基磷酸酯單體。
圖2圖解了應用對稱的雙-氨基醇連接劑作為具有仲胺的氨基醇，然後加上多數的羧酸衍生物。
圖3顯示了可以作為遷移率調節物的幾種苯甲酸衍生物的結構。
圖4圖解了可選擇策略的應用，即使用5-氨基螢光素作為起始物質，用相同系列的步驟將其轉變成保護的氨基磷酸酯單體。
圖5圖解了可以用來將氨基染料轉化成e-標記氨基磷酸酯單體的幾種遷移率調節物。
圖6A-B圖解可用於構建本發明電泳標記的螢光素衍生物。
圖7圖解了用本發明進行蛋白組研究。
圖8是細胞周期主要階段及各階段活性分子和過程的卡通圖解。
圖9A-C是卡通電泳圖譜，圖解採用e-標記試劑和天然產物通過細胞為基礎的檢測來發現和確認靶標。圖9A顯示來自非同步化細胞群的假設結果；圖9B顯示在G1早期俘獲的細胞的結果；圖9C顯示在G1晚期俘獲的細胞的結果。
圖10A-F圖解氧化不穩定的連接及其各自由單態氧介導的裂解反應。
圖11是描述應用本發明的試劑檢測配體-細胞表面受體相互作用影響的卡通畫。
圖12是進一步描述應用本發明的試劑檢測配體-細胞表面受體相互作用影響的卡通畫。
圖13A是描述分析細胞通路中蛋白-蛋白相互作用的卡通畫。圖13B顯示了藥物處理對6個指定的蛋白相互作用的影響的假設結果。
圖14A-B圖解e-標記部分與抗體結合以形成e-標記探針的一般方法學，以及得到的探針與單態氧的反應以產生作為釋放的e-標記報告子的亞磺酸部分。
圖15A-J顯示已經被設計和合成的e-標記部分的結構(Pro1可從MolecularProbes，Inc.商業渠道獲得)。
圖16A-I圖解圖15中圖解的e-標記部分的合成化學。
圖17A-C是本方法中使用的CE2LabCardTM裝置的示意圖。圖17A圖解了該裝置；圖17B和17C圖解裝置中分別用來注射和分離的高壓構造的範例。
圖18顯示了兩個電泳圖譜說明用CE2LabCard的e-標記報告子分析。
圖19顯示了多個電泳圖譜說明用CE2LabCard的e-標記報告子分析。
圖20描述了e-標記報告子釋放作為光敏劑微珠濃度函數的線性標準曲線。
圖21顯示標記的氨基葡聚糖的濃度對e-標記報告子釋放影響的數據曲線。
圖22顯示8個e-標記報告子在ABI310上的電泳分離。
圖23是描述定量細胞因子IL-4和IL-5的夾心試驗的卡通畫。
圖24顯示了一系列電泳圖譜說明在IL-4滴定研究中的e-標記報告子(Pro1)分析。
圖25顯示了一系列電泳圖譜說明在IL-6滴定研究中的e-標記報告子(Pro10)分析。
圖26顯示了一系列電泳圖譜說明在IFNγ滴定研究中的e-標記報告子(Pro8)分析。
圖27顯示了一系列電泳圖譜說明在TFNα滴定研究中的e-標記報告子(Pro7)分析。
圖28顯示了一系列電泳圖譜說明在IL-10滴定研究中的e-標記報告子(Pro4)分析。
圖29顯示了一系列電泳圖譜說明在IL-8滴定研究中的e-標記報告子(Pro2)分析。
圖30描述了電泳圖譜說明在單路和雙重細胞因子研究中的e-標記報告子分析。
圖31描述了電泳圖譜說明在5個細胞因子的多重研究中的e-標記報告子分析。
圖32描述了電泳圖譜說明在多個細胞因子研究中的e-標記報告子分析。
圖33是描述直接定量人IgG的均一性測定的卡通畫。
圖34描述了電泳圖譜說明在人IgG滴定研究中的e-標記報告子分析。
圖35描述了量化圖34結果的標準曲線。
定義如這裡所用的，″alkyldiyl(烴二基)″是指飽和的或不飽和的，分支、直鏈或環狀的二價碳氫化合物游離基，通過從母烷烴、烯烴或炔烴的兩個不同碳原子的每一個上去除一個氫原子，或通過從母烷烴、烯烴或炔烴的單一碳原子上去除兩個氫原子而衍生。兩個單價游離基中心或二價游離基中心的每個化合價可以與相同或不同的原子形成鍵。典型的烴二基包括但不限於，甲二基；乙二基如乙烷-1，1-二基，乙烷-1，2-二基，亞乙基-1，1-二基，亞乙基-1，2-二基；丙二基如丙烷-1，1-二基，丙烷-1，2-二基，丙烷-2，2-二基，丙烷-1，3-二基，環丙烷-1，1-二基，環丙烷-1，2-二基，丙-1-烯-1，1-二基，丙-1-烯-1，2-二基，丙烯-1，2-二基，丙-1-烯-1，3-二基，環丙-1-烯-1，2-二基，環丙烯-1，2-二基，環丙烯-1，1-二基，丙炔-1，3-二基，等；丁二基如，丁-1，1-二基，丁1，2-二基，丁-1，3-二基，丁-1，4-二基，丁-2，2-二基，2-甲基-丙烷-1，1-二基，2-甲基丙烷-1，2-二基，環丁-1，1-二基；環丁-1，2-二基，環丁-1，3-二基，丁-1-烯1，1-二基，丁-1-烯-1，2-二基，丁-1-烯-1，3-二基，丁-1-烯-1，4-二基，2-甲基-丙-1-烯-1，17二基，2-methanylidene-丙烷-1，1-二基，丁-1，3-二烯-1，1-二基，丁-1，3-二烯-1，2-二基，丁1，3-二烯-1，3-二基，丁-1，3-二烯-1，4-二基，環丁-1-烯-1，2-二基，環丁-1-烯-1，3-二基，環丁烯-1.2-二基，環丁-1，3-二烯-1，2-二基，環丁-1，3-二烯-1，3-二基，丁炔1，3-二基，丁炔-1，4-二基，丁-1，3-二炔-1，4-二基；等。
″抗體″是指與另一個分子的特定空間和極性結構特異地結合併因此定義為與之互補的免疫球蛋白。抗體可以是單克隆或多克隆，並可以通過本領域熟知的技術製備，如免疫接種宿主並收集血清(多克隆)或通過製備連續的雜交細胞系並收集分泌的蛋白(單克隆)，或通過克隆和表達核苷酸序列或其誘變處理的變體，核苷酸序列至少編碼與天然抗體特異的結合所需要的胺基酸序列。抗體可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各種類型和同種型如IgA，IgD，IgE，IgGI，IgG2a，IgG2b和IgG3，IgM，等。其片段可包括Fab，Fv和F(ab′)2，Fab′，等。此外，在合適時可以使用免疫球蛋白的聚合體、多聚體和合成體或其片段，只要保持對特定多肽的結合親合力。
″抗體結合組合物″是指含有一種或多種抗體的分子或分子複合體，從抗體中獲得其結合特異性。抗體結合組合物包括但不限於抗體對，其中第一個抗體特異地結合靶分子，第二個抗體特異地結合第一個抗體的恆定區；與靶分子特異結合的生物素化抗體，以及與如電泳標記或光敏劑部分衍化的抗生蛋白鏈菌素；對靶分子特異並與多聚體如右旋糖苷結合的抗體，它反過來與如電泳標記或光敏劑部分衍化；對靶分子特異並與珠、或微珠、或其它固相支持物結合的抗體，它反過來與如電泳標記或光敏劑或含有後者的多聚體部分衍化。
″毛細電泳″是指在毛細管或毛細板中的電泳，其中分離柱的直徑或分離盤的厚度大約在25-500微米之間，使貫穿分離介質有足夠的熱分散，從而在介質中有很低的熱對流。
″篩選基質″或″篩選介質″是指含有交聯或非交聯多聚體的電泳介質，它有效地阻止帶電荷種類穿過基質的電泳遷移。
關於兩個分子或分子和分子複合體的結合″特異性″，是指同基本上不識別其它分子且不與這種其它分子形成穩定複合體的結合相比，一個對另一個特異的識別並形成穩定的複合體。優選地，關於結合的″特異性″是指就分子與其它分子或複合體形成複合體來說，它與具有特異性的分子或複合體形成至少50％的複合體。一般地，分子或複合體在產生兩個分子間特異識別的表面或空腔中具有一定區域。特異結合的範例是抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、聚核苷酸相互作用、細胞的受體-配體相互作用，等等。
如這裡所用的，關於多數螢光標記的術語″光譜可分辨的″，是指標記的螢光發射帶是十分明顯不同的；即充分地不重疊，使與各自標記物附著的電泳標記可以根據各自標記物產生的螢光信號通過標準的光電檢測系統被區分，如採用通頻帶過濾器和光電倍增管系統，等等，如以美國專利第4,230,558，4,811,218中描述的系統為例等，或在Wheeless等人，21-76頁，流式細胞儀儀器使用和數據分析(Academic Press，New York，1985)中。
具體實施例方式
在一個方面，本發明關注於在懷疑含有多肽的標本中檢測靶多肽族成員的存在和/或量的方法。作為本發明目標的蛋白種類包括具有一般物理、功能或化學特徵的蛋白，它提供了物理或化學鑑定的方法。優選的蛋白種類包括膜結合蛋白、具有普通結合特徵的蛋白如DNA結合蛋白、和具有特殊類型翻譯後修飾如磷酸化作用、糖基化、核糖基化，等的蛋白。優選的靶多肽種類是已經接受了翻譯後修飾的多肽。
在發明的另一個方面，可以希望檢測多肽上已經被修飾的位點，在修飾的多肽上存在多少修飾，修飾在多肽上的位置，和多肽的位置，等等。另一方面，靶多肽的存在和/或量可被用來測定引起靶多肽翻譯後修飾的物質的存在和/或量和/或活性。在此實施例中，希望知道存在該物質和/或該物質是有活性的。該物質可以是例如，多肽如酶、受體，複合體如多聚體蛋白或多亞單位的全酶、蛋白-核酸，等。
多肽是一類由胺基酸殘基組成的化合物，胺基酸殘基通過去除了一個胺基酸的羧基和另一個胺基酸的氨基之間的水的醯胺鍵而化學鍵合在一起。多肽是胺基酸殘基的多聚體，它可包含多數的這種殘基。通常，除了由較少數量的胺基酸組成以外，肽與多肽是相似的。肽有時指寡肽。在多肽和肽之間沒有明確的截然不同。為了方便，在此公開物和權利要求書中，術語″多肽″一般用於指肽和多肽。胺基酸殘基可以是天然的或合成的。
蛋白是摺疊成指定的三維結構的多肽鏈。他們是含有碳、氫、氮和硫的複雜高度多聚體，並由通過肽鍵連接的胺基酸線性鏈組成。蛋白的分子量一般從大約5,000至大約5,000,000，更通常地從大約5,000至大約1,000,000。可以考慮各種蛋白如，具有相似結構特徵的蛋白家族、具有特殊生物學功能的蛋白、涉及特殊微生物的蛋白，特別是致病微生物，等。這種蛋白包括，作為例子並不限於，細胞因子或白介素，酶如激酶、蛋白酶、半乳糖苷酶等等，精蛋白，組蛋白，白蛋白，免疫球蛋白，硬蛋白，磷酸蛋白，粘蛋白，色蛋白，脂蛋白，核蛋白，糖蛋白，T-細胞受體，蛋白多糖，未分類蛋白如生長激素、催乳激素、胰島素，胃蛋白酶，在人血漿中發現的蛋白，凝血因子，血型因子，蛋白激素，癌抗原，組織特異抗原，肽激素，營養標記物、組織特異的抗原，和合成肽。
本發明優選的中心是多肽，包括經過天然加工如翻譯後加工修飾的胺基酸序列。這種修飾在基礎教材、更詳細的專論和大量的研究文獻中有很詳細的描述。修飾可發生在多肽的如何位置，包括肽主鏈、胺基酸側鏈和氨基或羧基末端。可以理解，相同類型的修飾可能以相同和各種不同的程度出現在指定多肽的數個位點上。此外，指定多肽上可含有許多類型的修飾。多肽可以因泛素化作用而是分支的，它們也可以是環狀的，有或沒有分支。環狀的、分支的和分支環狀的多肽可能來自於翻譯後的天然加工。因非天然活動如化學修飾引起的修飾也在本發明的範圍內。
修飾包括乙醯化作用、醯化作用、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素的共價附著、亞鐵血紅素部分的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質或脂質衍生物的共價附著、磷酸tidylinositol的共價附著、共軛連接、環化作用、二硫鍵形成、去甲基化作用、形成共價共軛連接、形成胱氨酸、形成焦穀氨酸、甲醯化、γ-羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻醯化作用、氧化、蛋白水解加工、磷酸化作用、異戊二烯化、外消旋作用、硒化作用、硫酸化作用、轉移-RNA介導的胺基酸添加到蛋白上如精氨醯化作用，和泛素化作用(見，例如，蛋白—結構和分子特性，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York，1993；Wold，F.，翻譯後蛋白修飾；觀察和前景1-12頁，蛋白的翻譯後共價修飾，B.C.Johnson，主編，Academic Press，New York，1983；Seifter等人.，″蛋白修飾和非蛋白輔因子的分析″，Meth Enzymol(1990)182626-646和Rattan等人.，″蛋白質合成翻譯後修飾和衰老″，Ann NY Acad Sci(1992)66348-62)。
檢測翻譯後修飾活性的標本通常是來自細胞的材料。標本可以通過溶解細胞，從血清、血漿、唾液、血液或其它體液中獲取。生物學通路可以在緩衝液中分析，如檢測受體通過酶或另一個受體的翻譯後修飾。
種類特異的試劑進行按照本發明方法的一個試劑是種類特異的試劑，或普通試劑，由致裂解部分和結合劑組成，結合劑針對一類靶多肽的全部或實質上全部成員上的結合部位。此試劑就其結合劑與特定類型蛋白的所有或幾乎所有成員結合來說是普通的。優選地，該種類特異試劑結合劑的選擇使得在需要時可以容易地從結合的材料中分離出未結合的材料。
在一個實施例中，固定的金屬親合層析(IMAC)被用來在固相如微珠上俘獲標本如細胞溶解物中含有的所有磷酸化蛋白，如下面公開的，Holmes，J.LiquidChromatography and Rel.Technol.，20123-142(1997)；Posewitz等人，Anal.Chem.，712883-2892(1999)；等。結合後，通過過濾作用衝洗微珠。俘獲和衝洗步驟用來濃縮磷酸蛋白和從檢測中去除汙染的非磷酸化蛋白和其它細胞碎片。結合在微珠上的蛋白被重懸浮在含有候選目的蛋白抗體的溶液中。抗體可以對一種或多種指定的目的蛋白靶特異，或者可以是針對全細胞溶解物製備的多克隆抗體試劑。優選地，使用單克隆抗體集合，其中的一種或多種不同的單克隆抗體對預先確定的一組蛋白中的每一個磷酸化蛋白特異。抗體試劑上可裂解地連接著一種或多種e-標記部分，其中的連接易於被IMAC樹脂如IMAC-24 DNP上含有的致裂解部分裂解。多抗體試劑可與多重的、靶特異的檢測聯合，每一個對不同的指定蛋白特異，且每一個與單獨分派給指定蛋白的指定e-標記部分連接。抗體結合後，與e-標記部分的連接會被裂解以釋放相應的e-標記報告子，表明IMAC-24 DNP微珠俘獲了指定的靶。蛋白特異的或抗原決定簇特異的單克隆抗體可具有直接附著的e-標記部分，或者e-標記可以附著在第二個抗體上，後者對結合在選定蛋白上的單克隆抗體恆定區特異。
多肽上的結合部位通常是多肽翻譯後修飾的結果。因此，結合部位可以是上面提到的任何一種修飾。因此，多肽上結合部位的結合劑依賴於結合部位或修飾的特性。通常，結合劑是能夠特異識別修飾的親合性試劑。下表(表1a)列出了各種翻譯後修飾和相應的結合劑表1a修飾結合劑

金屬親合劑在本發明的一個實施例中，金屬親合劑與合適的金屬聯合可用作結合劑。金屬親合劑是指定螯合某種金屬離子的物質，該金屬離子對特別基團具有選擇性。因此，可以使用對金屬離子具有親合力的任何配體，金屬離子與翻譯後修飾產生的結合部位結合。於是，螯合配體的特性依賴金屬離子，又依賴翻譯後修飾。術語″金屬離子″是指來自以下物質的離子，例如，簡單鹽類(如，AlCl3，NiCl2，等)，包括有機和無機配體及金屬複合體的複雜或混合鹽類。用於實踐本發明的金屬離子包括例如，主族金屬離子，過渡金屬離子，鑭系元素離子，等。零價金屬前體包括在此定義中。這種金屬離子的實例包括，作為例子並不限於鎵、鋁、鐵、鉛、汞、鎳、鎘、鉈、銻、銀、鉻、錳、鉑、金、鉍、鐵、銅、鋅、鈷、鉬、硒、釩、鈣、銪、釓、鋱、釤的離子，等等。
對於含磷酸鹽部分，如來自多肽磷酸化作用者，適合的金屬離子包括2或3價離子。特別優選的金屬離子是鎵III、鋁III、鐵III、鈷+3、銪+3、釓+3、釤+3、鋱+3。
螯合配體通常是二齒螯合物、三齒螯合物或四齒螯合物，因為螯合配體含有大約2至4個金屬配價部位。配價部位可含有氮如亞氨基、次氮基、嘧啶基、吡唑基、咪唑基、異腈基，等等；氧如羧基、羥基、醚、酮類，等等；磷如磷化氫，等等；砷如三氫化砷，等等；銻如stilbines，等等；硫如硫醚、硫酮類，等等；硒如硒醚，等等；碲如碲醚，等等；等。還包括上述的聯合如硫羧基、亞膦酸亞氨基、唑類、唑啉、硫苯類、噻唑、異唑、isothrazoles，等。還包括有機部分如芳烴類、乙炔、烯烴，等。含有上述基團的螯合配體特殊實例包括，作為例子並不限於，亞氨基雙乙酸鹽、三(羧基甲基)乙烯二胺、通常在α位置上被烷基(1-30個碳原子)取代的次氮基三乙酸、羧甲基化的天冬氨酸、2-羥基-3[N-(2-吡啶基甲基)氨基乙酸]丙烷基，等。
螯合配體可以是金屬結合肽，例如，(GHHPH)nG其中n是1(SEQ ID NO1)、2(SEQ ID NO2)、3(SEQ ID NO3)或5(SEQ ID NO4))(見，例如，Hutchens，等人.，J.Chromatogr.(1992)604125-132和133-141)，等等。
許多上述的金屬螯合配體可以從商業渠道獲得，其它已經被合成且合成是文獻的一部分。其它的金屬螯合配體可以通過本領域熟知的步驟合成。
含硼酸劑在本發明的一個實施例中，結合劑是硼酸部分，它包括至少一個硼原子被一些部分取代，可以與多肽上結合部位的交互功能基形成複合體。通常，硼酸部分來自被有機部分取代的硼酸，有機部分具有至少大約2個如下的原子碳、氧、氮、硫和磷酸鹽。通常，有機部分具有至少大約2個被取代或未取代的碳原子。有機部分可以是脂肪族的或芳香族的。關於硼酸部分的重要考慮是其酸度。一般的，硼酸部分的酸度越高，其與結合部位的交互功能基形成複合體的能力越強。期望地，硼酸部分的pKa低於大約11，優選地低於大約9，更優選地低於大約8.75。硼酸部分的pKa值越低，其與多肽結合部位結合的能力越強。因此，優選增加硼酸酸度的硼取代。在硼上的芳香族取代是優選的，例如，苯基和取代的苯基(用一種或多種功能基取代如氨基、硝基，等。為增加硼酸部分的酸度，芳香族取代物優選地含有一種或多種吸電子基，例如，硝基等。硼酸部分的有機部分的特殊實例包括苯基、氨基苯基，等等。特殊的硼酸部分包括，作為例子並不限於，苯基硼酸和(3-氨基苯基)硼酸。其它實例可以在美國專利第5,623,055，5,876,938，6,013,783，5,831,045中發現，相應的公開物在此合併為參考文獻。
許多上述的含硼酸劑可以從商業渠道獲得，其它已經被合成且合成是文獻的一部分。其它的金屬含硼酸劑可以通過本領域熟知的步驟合成。
植物血凝素在本發明的另一個實施例中，植物血凝素可被用作結合劑。植物血凝素是對特殊的糖或糖類而非其它糖具有受體位點特異性的蛋白或糖蛋白。因此，植物血凝素可被用作檢測糖基化的結合劑。例如，刀豆素A(Con A)對α-D-葡萄糖和α-D-甘露糖具有特異性。當多肽上存在如葡萄糖的配體時，Con A與葡糖基化的多肽結合。植物血凝素可來自任何適合的來源，例如，植物、哺乳動物、微生物，等等。已知的植物血凝素的數量太多以致不能在此列出。如上面指出的，植物血凝素對特殊的糖或糖類特異。因此，根據預期的多肽糖基化部分選擇植物凝集素。植物血凝素的實例，作為例子並不限於，包括刀豆素A，凝集素如麥芽凝集素、接骨木花黑素凝集素(SNA)、落花生油凝集素、Bauhinia紫花凝集素、Galanthus nivalis凝集素(GNA)、曼陀羅stramionium凝集素(DSA)、Maackia amurensis凝集素(MAA)、花生凝集素等、接骨木皮植物血凝素、Ulex Europeus(UEA I)、Ulex Europaeus(UEAII)、鱟Polyhemus(LPA)、百脈根四戈諾裂藤(Lotus A)，等等。
抗體在一個實施例中，結合劑可以是針對多肽上修飾的抗體。例如，識別磷酸鹽基團的抗體可被用於磷酸化的多肽，或識別糖部分的抗體可被用於糖基化的多肽，或識別乙醯化作用的抗體可被用於乙醯化的多肽，等等。抗體可以是單克隆或多克隆。許多適合的抗體是本領域已知的和/或可以通過本領域熟知的技術製備。這些技術包括免疫接種宿主並收集血清(多克隆)，或通過製備連續的雜交細胞系並收集分泌的蛋白(單克隆)，或通過克隆和表達核苷酸序列或其誘變處理的變體，核苷酸序列至少編碼與天然抗體特異的結合所需要的胺基酸序列。抗體包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各種類型和同種型如IgA，IgD，IgE，IgGI，IgG2a，IgG2b和IgG3，IgM，等。其片段可包括Fab，Fv和F(ab′)2，Gab′，等。此外，在合適時可以使用免疫球蛋白的聚合體、多聚體和合成體或其片段，只要保持對特定分子的結合親合力。
在一個方法中，為製備適合的抗體，通過完全確定的技術獲得含抗體(多克隆)的抗血清，該技術涉及用合適的免疫原免疫接種動物如兔、豚鼠或山羊，並在合適的等待期後從被免疫動物的血液中獲得抗血清。目前的發展水平被綜述如下Parker，生物學活性化合物的放射免疫檢測，Prentice-Hall(Englewood Cliffs，N.J.，U.S.，1976)，丁ler，J.Immunol.Meth.71-24(1975)；Broughton和Strong，Clin.Chem.22726-732(1976)；和Playfair，等人.，Br.Med.Bull.30；24-31(1974)。抗體也可以通過體細胞雜交技術獲得，這種抗體一般被稱作單克隆抗體。單克隆抗體可按照Kohler和Milstein，Nature265495-497，1975的標準技術產生。單克隆抗體技術的綜述見於Melchers等人主編的淋巴細胞雜交瘤，Springer-Verlag(New York 1978)，Nature 266495(1977)，Science 208692(1980)，和Methods of Enzymology 73(PartB)3-46(1981)。為增加單克隆抗體產量有各種技術，如將雜交瘤細胞注射進接受細胞的哺乳動物宿主的腹腔，並收穫腹水。當腹水中的單克隆抗體收集量不足時，從宿主血液中獲取抗體。可選擇地，產生所需抗體的細胞可以在中空纖維細胞培養裝置或旋轉瓶裝置中培養，兩者都為本領域熟知。從其它蛋白和其它汙染物中分離和純化單克隆抗體有各種常規的方法(見Kohler和Milstein，見上)。在另一個製備抗體的方法中，可以從染色體DNA上切取編碼抗體結合部位的序列並插入能夠在細菌中表達的克隆載體中，以產生具有相應抗體結合部位的重組蛋白。一般的，抗體可以通過已知的技術被純化，如層析如DEAE層析、ABx層析等，過濾，等等。
生物素在一個實施例中，磷酸蛋白的磷酸基可以是生物素化的並通過抗生蛋白鏈菌素分離蛋白，Goshe等人，Anal.Chem.，732578(2001)。
致裂解部分致裂解部分是產生活性核素的基團，後者能夠裂解可裂解的連接，優選地通過氧化。優選地，活性核素是具有短暫活性的化學核素，使得其致裂解作用僅在其產生部位附近存在。或者活性核素本來就壽命很短，使得因遠離其產生的附近而不會產生顯著的背景，或者使用足以清除活性核素的清除劑，使得在其產生部位的短距離之外不能被用來與可裂解連接起反應。作為例證的活性核素包括單態氧、過氧化氫、NADH和羥基游離基、含苯氧基的游離基、過氧化物，等。作為例證的致氧化活性核素的淬滅劑包括多烯、類胡蘿蔔素、維生素E、維生素C、酪氨酸的胺基酸-吡咯N-合成體、組氨酸和穀胱甘肽，等，如Beutner等人，Meth.Enzymol.，319226-241(2000)。
對於致裂解部分和可裂解連接重點考慮的是，它們在與靶蛋白結合時不要彼此遠離，否則由感光劑產生的活性核素在與可裂解連接結合之前擴散並喪失其活性。因此，可裂解連接優選地在連接的致裂解部分的1000nm內，優選地20-100nm。此致裂解部分的有效範圍在此稱作其″有效近程″。
活性核素的發生器包括酶類，如產生過氧化氫的氧化酶如葡萄糖氧化酶、氧雜蒽氧化酶、D-胺基酸氧化酶、NADH-FMN氧化還原酶、半乳糖氧化酶、甘油基磷酸鹽氧化酶、肌氨酸氧化酶、膽鹼氧化酶和乙醇氧化酶，產生羥基游離基的辣根過氧化酶，產生NADH或NADPH的各種脫氫酶，產生氨的尿素酶以形成局部高pH。一個可裂解連接可以硫或硒的氧化為基礎，其中的硫醚、亞碸或其硒類似物存在於活化基團的α-或β-位，它使氫α成為酸性活化基團並能夠被鹼去除，以便釋放附著有可釋放e-標記部分的氧化功能基或接受氧化並釋放e-標記。可選擇地，可使用在一個氧化狀態下穩定而在另一個氧化狀態下不穩定的金屬螯合物。其它化合物包括α-取代的甲基醌，它具有經離去基團如磺醯基、羥基、氨基等結合的試劑的可釋放部分。
感光劑是一個分子，通常是化合物，可以導致產生反應中間體或核素，通常是單態氧。優選地，按照本發明使用的感光劑是光敏劑。但是，其它感光劑可以用在本發明中，例如，化學激活的(如，酶類和金屬鹽類)包括，作為舉例並不限於，其它物質和組合物，可以通過外部光源產生具有活化作用或很少優選地沒有活化作用的單態氧。因此，例如，鉬酸鹽(MoO4-)類和氯過氧物酶和髓過氧物酶加溴化物或氯化物離子已顯示催化過氧化氫轉化成單態氧和水。對於上面的感光劑實例，過氧化氫可分別作為輔助試劑而被包含在內，氯過氧物酶可結合在表面上，鉬酸鹽可摻入脂質體的水相中。其它包括在本發明範圍內的感光劑並非真正的感光劑，但在熱、光、電離輻射或化學活化作用激發下會釋放單態氧分子的化合物。此類化合物中最熟知的成員包括內過氧化物如1，4-二羧基乙基-1.4-萘內過氧化物、9，10-二苯基蒽-9，10-內過氧化物和5，6，11，12-四苯基萘5，12-內過氧化物。被加熱或直接吸收光的這些化合物釋放單態氧。更多的感光劑在如下文獻中公開Di Mascio等人，FEBS Lett.，355287(1994)(過氧化酶和氧化酶)；Kanofsky，J.Biol.Chem.2585991-5993(1983)(乳過氧物酶)；Pierlot等人，Meth.EnzymoL，3193-20(2000)(內過氧化物的熱裂解)；等。
結合劑附著到致裂解部分上可以是直接的或間接的，共價的或非共價的，並可以通過熟知的技術完成，一般可在文獻中得到。見，例如，「固定酶」，IchiroChibata，Halsted Press，New York(1978)；Cuatrecasas，J.Biol.Chem.，2453059(1970)。各種廣泛的功能基團是可以獲得的或可被加入的。功能基團包括羧酸、醛類、氨基、氰基、乙烯基、羥基、巰基，等。各種廣泛化合物的連接方式是熟知的並在文獻中被詳細地圖解(見上)。結合劑上連接基團的長度可以很大地不同，依賴於要連接的化合物的特性，距離對特異結合特性的影響，等。
植物血凝素可以通過已知的共價連接技術附著到致裂解部分上。這種連接通過植物血凝素與致裂解部分或主鏈分子經雙功能交聯劑的共軛連接而恰當地進行。適合的雙功能化合物在Peters，K.和Richards，F.M.的綜述(Ann.Rev.Biochim.46(1977)523)中見到。在蛋白遞呈給它們的功能基中，烷基imidates顯示高度的特異性。反應對伯氨基是特異的。特異的耦合試劑包括氨基酯如二甲基malonimidate，疊氮化物如tartryl二疊氮化物的丙烯疊氮化物，它容易地與氨基起反應以產生醯胺連接，芳基二滷化物(如，1，5-二氟-2，4-二硝基苯或4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基碸)，戊二醛，雙馬來醯亞胺，混合的酸酐，混合的芳香族或脂肪族二羧基，N-羥基琥珀醯亞胺酯，和其它已知的共軛連接劑。催化劑如1-乙基-3(3-二甲基氨基丙烷基)碳化二亞胺氫氯化物可被用來在一個分子的氨基和另一個分子的羧基間形成共價鍵。
種類特異的試劑可在原地進行或形成。在前一個情況中，所有種類特異試劑的成分在用於本方法之前結合在一起。在後一情形下，至少某些種類特異試劑分別地加入進行本方法的介質中。在一個方法中，結合劑含有附著致裂解部分的部分。通常，這涉及存在於致裂解部分上的第二個部分，在此第二個部分與結合劑部分相互作用為致裂解部分附著到結合劑上作準備並在原地形成種類特異的試劑。典型地，各部分通過非共價附著相互作用。此情形的例證為，兩個部分之一含有小分子(大約100至大約1500的分子量)，其它的部分含有小分子的結合伴侶。例如，小分子可以是生物素、地高辛、螢光素、二硝基苯酚，等等，小分子的結合伴侶分別是抗生物素蛋白、地高辛抗體、螢光素抗體、二硝基苯酚抗體，等等。
期望結合劑上附著有多個致裂解部分以增加例如活性核素產生的數量。在一個方法中，結合劑具有多個位點以附著例如抗體、植物血凝素，等等。為進一步增加致裂解部分的數量，使用了主鏈分子或核。主鏈的核心是多功能材料，一般是多聚體，具有許多功能基團作為連接位點如羥基、氨基、巰基、羧基、烯基、乙醛，等。主鏈上的功能基應該是與要附著的致裂解部分或結合劑上的功能基起反應者。就其它試劑，主鏈核心的討論列於下面，且下面討論的原理也可以用在此情況中。
在某些實施例中，種類特異的試劑包括支持物，它與種類特異試劑的成分之一連接在一起。支持物可以由有機或無機、固體或液體的水不溶性材料組成，它可以是透明的或部分透明的。支持物可以有許多形狀中的任何一種如，顆粒包括微珠、膠片、膜、管、孔、條、棒，等。對於摻入了光敏劑的支持物，支持物的表面優選地是親水的或能夠變為親水的，支持物主體優選地是疏水的。支持物在其被使用的介質中可以是可懸浮的。可懸浮支持物的實例作為例子並不限於，多聚體材料如乳膠、脂質雙層、油滴、細胞和水凝膠。其它支持物組合物包括玻璃，金屬，多聚體如硝化纖維、醋酸纖維素、聚(氯乙烯)、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(乙烯對苯二酸鹽)、尼龍、聚(乙烯丁酸鹽)，等；它們或者單獨使用或者與其它材料聯合使用。結合劑附著到支持物上可以是直接的或間接的、共價或非共價的，並可以通過熟知的技術完成，如上討論一般可以在文獻中獲得。見，例如，″固定酶″Ichiro Chibata，見上。支持物的表面通常是多功能的，或能夠被多功能化的，或能夠經共價或特異或非特異的非共價相互作用結合到靶結合部分上的，等。
致裂解部分可以通過被共價或非共價地附著到支持物表面或摻入支持物主體而與支持物相連。連接到表面可以如上面所述完成。致裂解部分可以在支持物製備期間或之後摻入支持物主體。一般的，與支持物連接的致裂解部分的量必須能達到活性核素所必需的量。通常，致裂解部分的量是憑經驗確定的。
光敏劑作為致裂解部分如上面提到的，按照本發明優選的致裂解部分是產生單態氧的光敏劑。如這裡所用的，″光敏劑″是指光吸附分子，當被光激活時將分子氧轉變成單態氧。光敏劑可以經共價或非共價連接直接或間接地附著到種類特異試劑的結合劑上。構建這種組合物的指導，特別是抗體作為結合劑，可在文獻中獲得，如在光動力學治療領域，免疫診斷，等。下面是示例的文獻Ullman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5426-5430(1994)；Strong等人，Ann.New York Acad.Sci.，745297-320(1994)；Yarmush等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst，10197-252(1993)；Pease等人，美國專利5,709,994；Ullman等人，美國專利5,340.716；Ullman等人，美國專利6,251,581；McCapra，美國專利5,516,636；等。
同樣地，在文獻中有關於適合用在本發明中的光敏劑的特性和選擇的指導。下面是示例的文獻Wasserman和R.W.Murray.單態氧(Academic Press，New York，1979)；Baumstark，單態氧，Vol.2(CRC Press Inc.，Boca Raton，FL 1983)；和Turro，現代分子光化學(University Science Books，1991)。
光敏劑是通過光激發產生單態氧的感光劑。光敏劑包括染料和芳香族化合物，通常是由共價連接的原子組成的化合物，通常具有複合共軛的雙或三鍵。該化合物典型地吸收大約200至大約1,100nm波長範圍的光，通常在大約300至大約1,000nm間，優選地在大約450至大約950nm間，在激發波長下，其最大吸光率的消光係數超過大約500M-1cm-1，優選地大約5,000M-1cm-1，更優選地大約50,000M-1cm-1。在無氧情況下，吸收光以後產生的激發態的壽命通常至少大約100毫微秒，優選地至少大約1毫秒。一般的，此壽命必須足夠長以能夠將根據本發明的試劑中的連接裂解。這種試劑通常以下面所述的濃度存在。光敏劑激發態通常具有與其基礎狀態不同的自旋量子數(S)，當在通常情況下基礎狀態是單體時(S＝0)，激發態通常是三聯體(S＝1)。優選地，光敏劑具有較高的系統間交聯產量。即，光敏劑的光激發通常產生至少大約具有10％功效的三聯體，理想地至少大約40％，優選地超過大約80％。
選擇的光敏劑是相對光穩定的，且優選地不與單態氧有效地反應。在大多數有用的光敏劑中存在幾個結構特徵。大多數光敏劑在剛性的、往往是芳香族的結構中具有至少一個並經常是三個或以上共軛的雙鍵或三鍵。它們往往含有至少一個促進系統間交聯的基團如羰基或亞氨基或選自周期表3-6排的重原子，特別是碘或溴，或它們可具有延伸的芳香族結構。
大量的各種光源可用來光激活光敏劑以產生單態氧。多色和單色源均可以使用，只要光源足夠強以在使用時間內產生充足的單態氧。照射的長度依賴光敏劑的特性、可裂解連接的特性、照射源的能量和其距離標本的遠近，等等。一般的，照射期間可少於大約1微秒至大約10分鐘長，通常在大約1毫秒至大約60秒的範圍內。照射的強度和長度應當充分以激發至少大約0.1％的光敏劑分子，通常至少大約30％的光敏劑分子，優選地實質上全部的光敏劑分子。實例的光源包括，作為例子並不限於，雷射如氦-氖雷射、氬雷射、YAG雷射、He/Cd雷射和紅寶石雷射；光電二極體；汞、鈉和氙蒸氣燈；白熾燈如鎢和鎢/滷素；閃光燈；等。
可用在本發明中的光敏劑實例是具有上面的特性者，並列舉在如下文獻中Turro，現代分子光化學(上面引用的)；Singh和Ullman，美國專利5,536,834；Li等人，美國專利5,763,602；Ullman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5426-5430(1994)；Strong等人，Ann.New York Acad.Sci.，745297-320(1994)；Martin等人，MethodsEnzymoL，186635-645(1990)；Yarmush等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst，10197-252(1993)；Pease等人，美國專利5,709,994；Ullman等人，美國專利5,340,716；Ullman等人，美國專利6,251,581；McCapra，美國專利5,516,636；Wohrle，Chimia，45307-310(1991)；Thetford，歐洲專利publ.0484027；Sessler等人，SPIE，1426318-329(1991)；Madison等人.Brain Research，52290-98(1990)；Polo等人，Inorganica Chimica Acta，1921-3(1992)；Demas等人，J.Macromol.Sci.，A251189-1214(1988)；等。示例的光敏劑列於表1b中。
表1b示例的光敏劑

如上面就致裂解部分的討論，在某些實施例中，光敏劑部分包括支持物。如上所述，光敏劑可以通過被共價或非共價地附著到支持物表面或摻入支持物主體而與支持物相連。一般的，與光敏劑相連的量必須達到單態氧的必需量。通常，光敏劑的量是憑經驗確定的。用作光敏劑的光敏劑優選地相對無極性，當光敏劑被摻入例如乳膠顆粒以形成光敏劑微珠時保證其溶解進親脂性成分中，如Pease等人公開的美國專利5,709,994。例如，光敏劑孟加拉玫瑰紅通過乳膠上的氯甲基共價地附著到0.5微米乳膠微珠上，以提供酯連接基，如J.Amer.Chem.Soc.，973741(1975)中描述的。
在本發明的一個方面，種類特異的試劑含有是抗體的第一個結合劑和是光敏劑的致裂解部分，使得光敏劑共價地連接到抗體上，如採用熟知的技術，如Strong等人(上面引用的)、Yarmush等人(上面引用的)公開的；或類似技術。可選擇地，種類特異的試劑包含固相支持物如微珠，光敏劑共價或非共價地附著其上，抗體優選共價地、或直接地、或作為功能化多聚體如氨基葡聚糖的方式附著，或類似方式。
電泳探針組合物按照本發明的重要特徵，提供了一組電泳探針，其中每一個具有獨特的多肽結合部分和相連的具有獨特電荷/質量比和/或光學特徵的″e-標記部分″。為方便起見，e-標記部分獨特的電荷/質量比是由遷移率調節劑的化學結構引起的，因為檢測基和連接基殘基(如果有的話)對於任何系列電泳探針是共同的。但是，已認識到e-標記報告子產生的獨特電荷和/或質量也可以是檢測基造成的。例如，一組電泳探針可由兩個亞組組成，第一個亞組具有遷移率調節劑基團，它與具有規定的電荷和/或質量的檢測基團一起賦予亞組獨特的電泳遷移率，第二個亞組具有相同的遷移率調節劑基團並與電荷和/或質量不同的第二個檢測基團結合，從而賦予兩個亞組間都獨特的電泳遷移率。
在一個方面，本發明包括由多個電泳探針組成的組合物。電泳探針包括對靶多肽特異的結合部分和一種或多種電泳標記。電泳標記可以通過與結合部分特異結合的第二個結合分子直接或間接地附著到結合部分上，如對一抗恆定區特異的第二個抗體。優選地，電泳探針的結合部分是抗體。一般地，電泳探針被定義為如下結構式T-(L-E)k其中T是結合部分，或更特別地，是結合多肽的部分；L是可裂解的連接；E是電泳標記，或″e-標記″。優選地，可裂解連接L是易氧化的連接，更優選地，是可以被單態氧裂解的連接。″-(L-E)k″部分表示單個結合部分可以有一種或多種經可裂解連接附著的電泳標記，k是大於或等於1的整數；優選地，k是1至500範圍內的整數；更優選地，k是1至100或1至50範圍內的整數；還更優選地，k是1至10範圍內的整數。優選地，電泳探針的數量至少是5，更優選地至少是10。還更優選地，數量範圍是5至200，更優選地5至100或5至50或10至30。優選地，在數量範圍內，每個不同的結合部分T具有不同的電泳標記E。易氧化的連接和標記E通過常規的連接化學附著到T上。優選地，只要T是多肽，就可以通過常見的反應功能基如氨基、硫醚、羧基等附著。
優選地，結合部分T是對靶蛋白或多肽特異的抗體，或含有抗體。在後者情況下，T可以包括多個一起起作用的結合組分，以在靶蛋白附近保持有一個電泳標記。例如，T可以是一個抗體和附著有e-標記的第二個抗體，半抗原化的抗體和附著有e-標記的第二個抗半抗原抗體，生物素化的抗體和附著有e-標記的抗生蛋白鏈菌素，依次具有e-標記附著的功能化多聚體衍化的抗體，或類似物。多數電泳探針優選地用於本發明的方法中，其中每一個探針具有不同的結合部分T。
優選地，L是硫醚或其硒類似物；或含有碳-碳雙鍵的烯烴，其中的雙鍵裂解成含氧基團，並釋放e-標記E。舉例的烯烴包括乙烯硫醚、乙烯醚、烯胺、在碳原子上用α-次甲基(CH，碳原子具有至少一個氫原子)取代的亞胺，其中乙烯基可以是環狀的，雜原子可以是環狀的，或在環狀的烯烴碳原子上取代，且至少有一個直至4個雜原子結合在烯烴的碳原子上。得到的二唑可自發地分解，通過在環境溫度以上的溫度加熱分解，通常低於大約75℃，通過與酸或鹼反應分解，或在有或無光敏劑的條件下通過光活化作用分解。這種反應被描述在下面示例的文獻中Adam和Liu，J.Amer.Chem.Soc.94，1206-1209，1972，Ando等人，J.C.S.Chem.Comm.1972，477-8，Ando等人，Tetrahedron 29，1507-13，1973，Ando等人，J.Amer.Chem.Soc.96，6766-8，1974，Ando and Migita，ibid.97，5028-9，1975，Wasserman和Terao，Tetra.Lett.21，1735-38，1975，Ando和Watanabe，ibid.47，4127-30，1975，Zaklika等人.Photochemistry and Photobiology 30，35-44，1979，和Adam等人，Tetra.Let.36，7853-4，1995.又見，美國專利第5,756,726。
二唑的形成是通過單態氧與激活烯烴的反應而獲得的，烯烴的一個碳原子被e-標記部分取代，其它碳原子被結合部分取代。見，例如，美國專利第5,807,675。這些可裂解的連接可描述為如下的結構式-W-(X)nCα＝Cβ(Y)(Z)-其中W可以是一個鍵，一個雜原子如O、S、N、P、M(是指形成穩定共價鍵的金屬)，或功能基如羰基、亞氨基等，可以結合到X或Cα上；至少一個X應是脂肪族的、芳香族的、脂環族的或雜環的並經雜原子如N、O或S鍵合到Cα上，其它X可以相同或不同，可另外是氫、脂肪族的、芳香族的、脂環族的或雜環的，通常是芳香族的或芳香雜環的，其中一個X可與Y一起形成環，通常是雜環，它們所附著的碳原子一般地除氫以外是從大約1至20，通常1至12，更通常1至8碳原子，一個X將有0至6，通常0至4個雜原子，而其它X將有至少一個雜原子和直至6個雜原子，通常1至4個雜原子；Y在X的定義範圍內，通常經雜原子與Cβ結合，並如所說明的可與X一起形成雜環；Z通常是芳香族的，包括芳香雜環的，如上所述從大約4至12，通常4至10個碳原子和0至4個雜原子，如上所述直接地或經雜原子結合到Cβ上；n是1或2，依賴於e-標記部分是否結合到Cα上或X上；其中，Y和Z之一具有與結合部分結合的功能基，或被結合到結合部分上，如通過作為、或包括連接基團而結合到結合部分T上。
優選地，選擇W、X、Y和Z使得裂解後的電泳標記E在下面的大小範圍內。
雖然沒有在結構式中描述，通過一種或多種e-標記部分結合一個或兩個Xs，在單個分子中可有多個e-標記部分。
舉例的可裂解連接包括S-3-硫醇丙烯酸、-N，N-甲基4-氨基-4-丁烯酸、-O，3-羥基丙烯醛、N-(4-羧基苯基)2-咪唑，唑和噻唑。
同樣的目的是N-烷基吖啶衍生物，在第9位置被下面結構式的二價基團取代-(CO)X1(A)-其中X1是選自O、S、N和Se的雜原子，通常是前三個之一；和A是被e-標記報告子取代的至少2個碳原子的鏈，通常不超過6個碳原子，其中A的其它價優選地由氫補償，儘管此鏈可被其它基團取代如烷基、芳基、雜環基等，但A一般不超過10個碳原子。
同樣的目的是雜環化合物，如二雜茂，舉例為取代的咪唑、噻唑、唑類等，其中的環通常被至少一個芳香基團取代，且在某些情況下為釋放e-標記報告子必須水解。
同樣的目的是碲(Te)衍生物，Te與含有β氫原子至Te原子的乙烯基結合，其中所述的乙烯基是脂環族或雜環的一部分，可具有含氧基團，優選地結合在芳香環狀上，其它價的Te與e-標記報告子鍵合。環可以是香豆素、苯並惡嗪、四氫化萘等。
數個優選的可裂解連接及其裂解產物圖解於圖10A-F中。噻唑的可裂解連接″-CH2-噻唑-(CH2)n-C(＝O)-NH-蛋白″顯示在圖10A中，得到具有″-CH2-C(＝O)-NH-CHO″部分的電泳標記。優選地，n在1至12範圍內，更優選地從1至6。唑的可裂解連接″-CH2-唑-(CH2)n-C(＝O)-NH-蛋白″顯示在圖10B中，得到具有″-CH2-C(＝O)O-CHO″部分的電泳標記。烯烴的可裂解連接(圖10C)與上面描述的電泳探針實施例″T-L-M-D″一起顯示，其中的D是螢光素染料。可裂解的烯烴連接也可用於其它實施例。圖解的烯烴連接的裂解得到了″R-(C＝O)-M-D″形式的電泳標記，其中″R″可以是上面提供的電泳標記E的一般描述中的任何取代物。優選地，R是供電子基團，如Ullman等人，美國專利6,251,581；Smith和March，March′s高級有機化學反應，機理，和結構，第五版(Wiley-Interscience，New York，2001)；等。更優選地，R是具有1-8個碳原子和0-4個雜原子的供電子基團，雜原子選自O、S和N。更好的，R是-N(Q)2、-OQ、p-[C6H4N(Q)2]、呋喃基、n-烷基吡咯基、2-吲哚基，或類似物，其中D是烷基或芳基。在圖10C的烯烴可裂解連接的進一步說明中，取代基″X″和″R″等同於上面描述可裂解連接L的結構式中的取代基″X″和″Y″。特別地，圖10C中的X優選嗎啉代-OR′或-SR″，其中的R′和R″是具有1至8個碳原子和0至4個雜原子的脂肪族、芳香族、脂環族或雜環，雜原子選自O、S和N。圖10D圖解了″-(CH2)2-S-CH(C6H5)C(＝O)NH-(CH2)n-NH-″形式的優選硫醚可裂解連接，其中n在2至12範圍內，更優選地在2至6範圍內。圖10D中顯示的硫醚可裂解連接類型可以經由圖10E和10F中顯示的前體化合物附著在結合部分T和電泳標記E上。為附著結合部分T的氨基，採用常規的化學將末端羥基轉變為NHS酯。在與氨基反應並附著後，Fmoc保護基團被去除以產生隨後與e-標記的NHS酯起反應的游離胺，像由圖1、2和4的亞鐵血紅素產生的化合物那樣，除了最後的反應步驟是添加NHS酯而不是氨基磷酸酯基團。
電泳標記E是對活性核素特別是單態氧穩定的水溶性有機化合物，並包含檢測或報告子基團。另外，E的大小和結構可很大地變化。優選地，E攜帶一個中性pH電荷，分子量範圍從大約150至大約10,000道爾頓，更優選地，從大約150至大約5000道爾頓，更優選地，從大約150至2500道爾頓。E的優選結構更充分地描述於下。優選地，檢測基團產生一個電化學、螢光或發色的信號。最優選地，檢測基團產生螢光信號。本發明的組合物包括多個電泳標記，可一起使用來實現本發明的多重檢測。優選地，一個組合物中的多個電泳標記至少是5個，更優選地至少10個。還更優選地，數量範圍從5至200，更優選地，從5至100，或5至75，或從5至50，或從10至30。優選地，在多元組合物的電泳標記中，就同一多元體中的其它成員而言，每一個具有或者獨特的電荷/質量比和/或獨特的光學特性。優選地，光學特性是螢光特性如放射譜、螢光壽命，或類似特性。更優選地，螢光特性是放射譜。例如，多元體的每一個電泳標記可具有相同的螢光發射特性，但每一個由於獨特的電荷/質量比而彼此不同。另一方面，多元體的兩個或以上的電泳標記可具有相同的電荷/質量比，但它們具有獨特的螢光特性如光譜可辨發射光譜，使得多元體的所有成員可以聯合電泳分離和螢光檢測而區分。
優選地，多元體中的電泳標記通過電泳分離和螢光進行檢測。優選地，具有實質上相同螢光特性的電泳標記具有不同的電泳遷移率，使得分離條件下在一個電泳圖譜中形成截然不同的峰。鄰近峰的差異或缺少重疊的測量標準是電泳解析度，它是鄰近峰最高值之間的距離除以兩個峰標準差的較大者的4倍。優選地，鄰近峰的解析度至少為1.0，更優選地至少1.5，最優選地至少2.0。在特定的分離和檢測系統中，所需的解析度可以通過選擇多個電泳標記而獲得，電泳標記的成員具有的電泳遷移率至少有一個峰分辨值的差異，其量依賴於普通技術人員熟知的幾個因素，包括信號檢測系統、螢光部分的特性、標記的散射係數、有或沒有篩選基質、電泳設備的種類如有或無泳道、分離泳道的長度，等。優選地，本發明的多個電泳標記通過常規的毛細電泳設備分離，或者有或者沒有常規的篩選基質。實例的毛細電泳設備包括Applied Biosystems(Foster City，CA)310，3100和3700型；Beckman(Fullerton，CA)P/ACE MDQ型；Amersham Biosciences(Sunnyvale，CA)MegaBACE1000或4000；SpectmMedix基因分析系統；等。優選地，在這種常規設備中，多個電泳標記的電泳遷移率至少有一個百分比的差異，更優選地，至少百分之1至10範圍內的百分比。
電泳遷移率與q/M2/3成比例，其中q是分子上的電荷，M是分子的質量。期望在測定條件下最近電泳標記間的遷移率差異至少是大約0.001，通常是0.002，更通常地至少大約0.01，並可以是0.02或以上。
優選的電泳標記E的結構是(M，D)，其中M是遷移率修飾部分，D是檢測部分。符號″(M，D)″用來表示M和D部分的順序可以是任一部分都能鄰近可裂解的連接L。即，″T-L-(M，D)″指定任何兩種形式的電泳探針″T-L-M-D″或″T-L-D-M″。
檢測部分D可以是螢光標記或染料，發色的標記或染料，電化學標記，或類似物。優選地，D是螢光染料。實例的用於本發明的螢光染料包括水溶性的若丹明染料，螢光素，4，7-二氯螢光素，苯並氧蒽染料，和能量傳遞染料，公開在以下文獻中分子探針和研究試劑手冊，第8版，(Molecular Probes，Eugene，2002)；Lee等人，美國專利6,191,278；Lee等人，美國專利6,372,907；Menchen等人，美國專利6,096,723；Lee等人，美國專利5,945,526；Lee等人.Nucleic Acids Research，252816-2822(1997)；Hobb，Jr.，美國專利4,997,928；Khanna等人，美國專利4,318,846；Reynolds，美國專利3,932,415；Eckert等人，美國專利2,153,059；Eckert等人，美國專利2,242,572；Taing等人，國際專利公開物WO 02/30944；等。進一步特殊的實例螢光染料包括5-和6-羧基若丹明6G；5-和6-羧基-X-若丹明，5-和6-羧基四甲基若丹明，5-和6-羧基螢光素，5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二甲氧基-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基螢光素，2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，1′，2′，7′，8′-二苯並-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，1′，2′，7′，8′-二苯並-4′，5′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，和2′，4′，5′，7′-四氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素。最優選地，D是螢光素或螢光素衍生物。實例的本發明使用的最優選的染料顯示在圖6A和6B中。
M一般是具有或被設計有特殊電荷/質量比的化學基團或部分，因而在規定的電泳系統中有特殊的電泳遷移率。遷移率修飾部分的實例類型在下面討論。在一組電泳探針中，每個獨特的遷移率修飾劑被指定為Mj，其中j＝1至n，n的值如上所述。遷移率修飾部分可考慮包括質量修飾區和/或電荷修飾區或作為質量和電荷修飾區的單個區。在本發明中使用的探針組中，遷移率修飾部分可有以下一種或多種特徵(i)由於質量而非電荷的變化具有獨特的電荷/質量比；(ii)由於質量和電荷的改變具有獨特的電荷/質量比；和(iii)獨特的電荷/質量比在大約-0.0001和大約0.5之間，通常大約-0.001和大約0.1之間。如上提到的，D典型地在一組或多個不同的電泳探針間是共同的，但在探針組之間也可以不同，產生釋放e-標記的獨特電泳遷移率。
遷移率修飾部分M的大小和組合物在一個鏈中的變化可以從一個鍵到大約100個原子，通常不超過大約60個原子，更通常地不超過大約30個原子，其中的原子是碳、氧、氮、磷、硼和硫。一般地，當除外一個鍵時，遷移率修飾部分具有從大約0至大約40個雜原子，更通常地從大約0至大約30個，除上面說明的雜原子外可包括滷素或其它雜原子。除氫以外總的原子數一般少於大約200個原子，通常少於大約100個原子。在存在酸基的地方，依賴於遷移率修飾部分所在介質的pH，各種陽離子可與酸基相連。該酸可以是有機或無機的包括羧酸、硫逐羧酸、硫羧酸、羥氨酸、磷酸、亞磷酸、膦酸、亞膦酸、磺酸、亞磺酸鹽、硼酸、硝酸、亞硝酸，等。對於正電荷，取代基包括氨基(包括銨)、膦、鋶、鍚，等，其中取代通常是1-6個碳原子的脂肪族，每個雜原子的總碳原子數目通常少於大約12，通常少於大約9。側鏈包括胺類、銨鹽類、包括酚基的羥基、羧基、酯類、醯胺類、磷酸鹽類、雜環類。M可以是具有相同或不同化學特徵的不同單體的同型寡聚體或異型寡聚體，如核苷酸和胺基酸。
儘管可以有電荷的組合，但帶電荷的遷移率修飾部分通常僅有負或正電荷，特別是在遷移率修飾部分附著區域是帶電荷的且遷移率修飾部分具有相反電荷時。遷移率修飾部分含有可為寡聚作用提供不同功能基的單獨單體並攜帶一個電荷，或可以使用兩個單體，一般地是兩個單體。可以使用取代的二醇，其中的取代物是帶電荷的和二元酸。舉例說明的這種寡聚體是二醇或二氨基的聯合如2，3-二羥基丙酸、2，3-二羥基琥珀酸、2，3-二氨基琥珀酸、2，4-二羥基戊二酸，等。二醇或二氨基化合物可以通過二元酸連接，其二元酸包括上面說明的無機二元酸，以及如草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、碳酸等的二元酸。不使用酯類，可以使用醯胺類，其中可以使用胺基酸或二胺和二酸。可選擇地，可用亞烴基或芳香烴基團連接羥基或胺。
通過使用含有取代基的單體來提供電荷，或它可被修飾來提供電荷，可以提供具有所需電荷/質量比的遷移率修飾部分。例如，通過使用絲氨酸或蘇氨酸，可以用磷酸鹽修飾羥基以提供負電荷的遷移率修飾部分。對於精氨酸、賴氨酸和組氨酸，提供了正電荷的遷移率修飾部分。用常規的方式可完成寡聚作用以提供適當大小的遷移率修飾部分。不同的遷移率修飾部分具有不同的寡聚體序列，通常具有1至20個單體單位，更通常地大約1至12個，其中一個單位是指可有1-2個不同單體的重複性單位。對大部分來說，寡聚體可與其他的核酸靶結合區一起使用。單體單位的多功能基在可用於結合其它部分的末端提供了功能基，使得可以用可獲得的反應功能基來提供不同的功能基。例如，可以用氨基乙基硫醇與羧基起反應，以用同激活烯烴反應的硫醇功能基替換羧基。
就使用大約1至大約3個電荷的單體來說，可以應用低數目的單體並用來根據分子量的變化而改變遷移率。特別感興趣的是有大約2至4個功能基的聚羧酸多元醇，每個功能基如酒石酸、2，3-二羥基對苯二酸、3，4-二羥基鄰苯二甲酸、Δ5-四氫-3，4-二羥基鄰苯二甲酸，等。為提供另外的負電荷，這些單體可用二元酸寡聚化，如用磷酸衍生物以形成磷酸二酯。可選擇地，羧酸能與二胺一起使用以形成聚醯胺，同時羥基可被用來形成酯類如磷酸酯，或醚類如羥基乙酸醚，等。為改變遷移率，可以使用各種分子量不同的脂肪族基團，如聚亞甲基、聚乙二醇、聚滷脂肪族或芳香族基團、多羥基化合物如糖類，其中遷移率將改變至少大約0.01，更通常地至少大約0.02，更通常地至少大約0.5。
在另一個方面，(M，D)部分是從產生組合文庫所用的化學骨架中構建的。例如，以下文獻描述用於產生不同遷移率修飾部分的骨架化合物類肽(PCT公開物WO91/19735，1991年12月26日)，編碼的肽(PCT公開物WO 93/20242，1993年10月14日)，隨機生物寡聚體(PCT公開物WO 92/00091，1992年1月9日)，苯並二氮雜(美國專利第5,288,514)，diversomeres如乙內醯脲、苯並二氮雜和二肽(HobbsDeWitt，S.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.906909-6913(1993)，vinylogous多肽(Hagihara等人.J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))，具有β-D-葡萄糖骨架的非肽擬態肽(Hirschmann，R.等人，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))，小化合物文庫的類似有機合成(Chen，C.等人.J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))，寡氨基甲酸鹽(Cho，C.Y.等人.Science 2611303(1993))，肽醯膦酸酯類(Campbell，D.A.等人，J.Org.Chem.59658(1994))；Cheng等人，美國專利6,245,937；Heizmann等人，″黃嘌呤作為分子多樣性的基礎″Mol.Divers.2171-174(1997)；Pavia等人，Bioorg.Med.Chem.，4659-666(1996)；Ostresh等人，美國專利5,856,107；Gordon，E.M.等人，J.Med.Chem.371385(1994)；等。優選地，在此方面，D是骨架上的取代物，M是骨架的其餘部分。
仍在另一個方面，(M，D)部分構建自一種或多種相同或不同的常見或商業獲得的連接、共軛連接和標記試劑，使之易於組裝，特別是使用商業化的DNA或肽合成儀全部或部分的合成。在此方面，(M，D)部分由通常經磷酸二酯和醯胺鍵連接的亞單位組成。作為舉例，前體包括但不限於，二甲氧基三苯甲基(DMT)保護的己乙烯乙二醇氨基磷酸酯，6-(4-單甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，12-(4-單甲氧基三苯甲基氨基)十二烷基-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，2-[2-(4-單甲氧基三苯甲基)氨基乙氧基]乙基-(2-氰基乙基)，N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，(S-三苯甲基-6-巰己基)-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，5′-螢光素氨基磷酸酯，5′-六氯-螢光素氨基磷酸酯，5′-四氯-螢光素氨基磷酸酯，9-O-二甲氧基三苯甲基-三乙烯乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，3(4，4′二甲氧基三苯甲氧基)丙烷基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′，2′-二脫氧核糖-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，18-O二甲氧基三苯甲基己乙烯乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，12-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，1.3-雙-[5-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)戊氨基]丙烷基-2-[(2-氰基乙基)-(N.N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，1-[5-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)戊氨基]-3-[5-芴醇甲氧基羰基氧戊氨基]-丙烷基-2-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，三-2，2，2-[3-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙烷氧甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，琥珀醯亞胺反-4-(馬來醯亞胺甲基)環己胺-1-羧基酯(SMCC)，琥珀醯亞胺3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)，琥珀醯亞胺乙醯硫代乙酸酯，德克薩斯紅-X-琥珀醯亞胺酯，5-和6-羧基四甲基若丹明琥珀醯亞胺酯，雙-(4-羧基哌啶基)磺酸基若丹明二(琥珀醯亞胺酯)，5-和6-((N-(5-氨基戊基)氨基羰基)四甲基若丹明，琥珀醯亞胺4-(p-馬來醯亞氨苯基)丁酸鹽(SMPB)；N-γ-馬來醯亞胺丁醯-氧化琥珀醯亞胺酯(GMBS)；p-硝基苯基碘代醋酸酯(NPIA)；4-(4-N-馬來醯亞氨苯基)丁酸醯肼(MPBH)；和類似試劑。上述試劑可從商業渠道獲得，如從Glen Research(Sterling，VA)，Molecular Probes(Eugene，OR)，Pierce Chemical，和類似的試劑供應者。在常規合成方案中使用上述試劑是本領域熟知的，如Hermanson，生物共軛技術(Academic Press，New York，1996)。特別是，M可從以下試劑構建二甲氧基三苯甲基(DMT)保護的己乙烯乙二醇氨基磷酸酯，6-(4-單甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，12-(4-單甲氧基三苯甲基氨基)十二烷基-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，2-[2-(4-單甲氧基三苯甲基)氨基乙氧基]乙基-(2-氰基乙基)，N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，(S-三苯甲基-6-巰己基)-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，9-O-二甲氧基三苯甲基-三乙烯乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，3(4，4′二甲氧基三苯甲氧基)丙烷基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′，2′-二脫氧核糖-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，18-O二甲氧基三苯甲基己乙烯乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，12-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，1.3-雙-[5-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)戊醯胺]丙烷基-2-[(2-氰基乙基)-(N.N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，1-[5-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)戊氨基]-3-[5-芴醇甲氧基羰基氧戊醯胺]-丙烷基-2-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，三-2，2，2-[3-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙烷氧甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，琥珀醯亞胺反-4-(馬來醯亞胺基)環己烷-1-羧基酯(SMCC)，琥珀醯亞胺3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)，琥珀醯亞胺乙醯硫代乙酸酯，琥珀醯亞胺4-(p-馬來醯亞氨苯基)丁酸鹽(SMPB)；N-γ-馬來醯亞胺丁醯氧化琥珀醯亞胺酯(GMBS)；對-硝基苯基碘代醋酸酯(NPIA)；和4-(4-N-馬來醯亞胺苯基)丁酸醯肼(MPBH)。
M還可以包括通過已知的多聚體亞單位合成方法製備的多聚體鏈。形成選擇長度的含聚乙烯氧化物鏈的方法是熟知的，如Grossman等人，美國專利5,777,096。可以理解的是，這些涉及規定大小的多亞單位多聚體單位直接地或經連接基團彼此聯結的方法可應用與各種廣泛的多聚體，如聚醚(如，聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物)，聚酯(如，聚羥基乙酸，聚乳酸)，多肽，寡糖，聚氨酯橡膠，聚醯胺，聚磺醯胺，聚亞碸，聚膦酸酯，以及其嵌段共聚物包括由多亞單位組成的多聚體，亞單位通過帶電荷或無電荷的連接基團連接。除同型多聚體外，按照本發明使用的多聚體鏈包括選擇長度的共聚物如，聚乙烯氧化物單位與聚丙烯單位交替的共聚物。作為另一個實例，選擇長度的多肽和胺基酸組合物(即，含有天然存在的或人造胺基酸殘基)，作為同型多聚體或混合的多聚體。
在另一個方面，(M，D)的檢測部分通過能量傳遞機制產生螢光信號。優選地，在此方面，D是″D1-g-D2″形式，其中D1和D2是分子的受體—供體對，如Wu等人，Anal.Biochem.，2181-13(1994)，g是保持D1和D2在實質上固定距離的剛性連接劑。剛性連接劑g的選擇指導可在以下文獻中找到，We等人(上面引用的)和美國專利5,863,727；5,800,996；5,945,526；和6,008,379。D1或D2可以是受體而另一個是成對物中的分子供體。作為舉例，本發明使用的能量傳遞檢測部分公開於Lee等人，美國專利5,945,526；Lee等人，Nucleic Acids Research，252816-2822(1997)；Taing等人，國際專利公開物WO 02/30944；和類似文獻。優選地，剛性連接劑g的選擇使D1和D2間的距離保持在實質上固定的10-100埃的範圍內。在連接對單態氧穩定的限定條件下，可使用各種廣泛的連接基團。優選地，D1和D2選自以下系列螢光素，若丹明，若丹明6G，若丹明110，若丹明X，四甲基若丹明，及其滷化衍生物。更優選地，D1和D2都是螢光素染料。
在一個方面，g可以選自R1-R2-R1和R1-R2-C(＝O)-X1-R3的任一個，後者存在於D1和D2的任一方向；其中X1是O、S或NH；R1是(C1-C5烴二基，X1，C(＝O))使得括號中任何的1-3個部分以任意的線性順序排列；R2是選自以下基團的5至6個成員的環環戊烯，環己烯，環戊二烯，環己二烯，呋喃，吡咯，異吡咯，異唑，吡唑，異咪唑，吡喃，吡喃酮，苯，吡啶，噠嗪，嘧啶，吡嗪，惡嗪，茚，苯並呋喃，硫茚，吲哚和萘；R3是C1-C5烴二基。
在優選的方面，釋放後，電泳標記E被定義為如下結構式A-M-D其中A是-C(＝O)R，其中R是具有1至8個碳原子和0至4個雜原子的脂肪族、芳香族、脂環族或雜環，雜原子選自O、S和N；-CH2-C(＝O)-NH-CHO；-SO2H；-CH2-C(＝O)O-CHO；-C(＝O)NH-(CH2)n-NH-C(＝O)C(＝O)-(C6H5)，其中n的範圍從2至12；D是螢光染料；M如上所述，條件是A-M-D的總分子量在大約150至大約5000道爾頓範圍內。
在優選的方面，D是螢光素，如上面所述並圖解於圖6A和6B，且A-M-D的總分子量在大約150至大約2500道爾頓範圍內。
在另一個優選的方面，D是如上所述的″D1-g-D2″形式。
在一些實施例中，e-標記部分不需要帶電荷而僅僅在質量上不同。因此，可以使用相同或相似的單體，其中的功能基應是中性或被製成中性的，如羧酸的酯類和醯胺類。同樣，e-標記部分可以通過同位素取代而改變，如2H、18O、14C，等。
許多的電泳標記可包括寡肽以提供電荷，特別是2-6個單體的寡肽，通常是2-4個單體，或者由賴氨酸、精氨酸和組氨酸得到正電荷，或者由天冬氨酸和穀氨酸得到負電荷。當然，不一定使用天然存在的胺基酸，而是非天然的或合成的胺基酸如牛磺酸、磷酸鹽取代的絲氨酸或蘇氨酸、S-α-琥珀醯半胱氨酸，二元胺和胺基酸的聯合寡聚體，等。
在本發明的一個實施例中，給予電荷部分常規地主要由胺基酸組成，但也可包括硫代酸和其它具有1-5個碳原子的羧酸。給予電荷部分每部分可有大約1至30個胺基酸，優選地大約1至20個，更優選地大約1至10個，也可包括大約1至大約3個硫代酸或其它羧酸。但是，當與無電荷亞區一起使用時，帶電荷亞區一般會有大約1至大約4個胺基酸，常常是大約1至大約3個。如上面提到的，可以使用任何天然存在和合成的胺基酸。
在特殊實施例中，T-L-M-D可被描繪成如下結構式T-L-(胺基酸)n-L′-螢光劑其中L′是一個鍵或除氫以外1至20個原子的連接基團，n為1至20，L是與多肽結合部分連接的可裂解連接。在此實施例中，T通過可裂解連接與末端胺基酸連接。此實施例的一個例子，作為例子並不限於，螢光劑是螢光素，L′是醯胺連接形式的鍵，涉及螢光素後的羰基和賴氨酸的末端氨基，T是多肽結合部分。
根據這種標記共軛體的電泳標記實例可描繪如下螢光素-(CO)NH-(CH2)4-NH-(胺基酸)n其中中性pH下特定化合物的結構式和電荷列於表2中。
表2No.(胺基酸)n 電荷(q) 分子量(M) q/M2/3

其中q是電荷，M是質量，遷移率與q/M2/3成比例。
在另一個實施例中，遷移率修飾部分M依賴使用亞烴基或芳香烴基(包括具有大約1-2個脂肪族區和大約1-2個芳香族區的二價脂肪族基團，芳香族區通常是苯)，其中大約2至大約16個碳原子，更通常大約2至大約12個碳原子的基團可以被取代或未取代，通常是未取代的，其中遷移率修飾部分可將相同或不同的螢光劑連接到單體單位如核苷酸上。遷移率修飾部分可終止於以酯或醯胺形式存在的羧基、羥基或氨基中。通過改變螢光團上的取代基可以改變至少大約5個單位或以上的質量，通常至少大約9個單位，以在毛細電泳中獲得滿意的分離。為提供進一步的改變，可使用硫代琥珀醯亞胺基團在氮和硫上加入亞烴基或芳香烴基，使得碳原子的總數目可以在大約2至30範圍內，更通常是大約2至20。除了或與上述基團聯合，為增加親水性，可以使用烯氧基。
除了遷移率修飾部分的特性以外，如已經說明的那樣，可通過標記的化學和光學特性，使用能量傳遞複合體，改變影響遷移性的遷移率修飾部分的化學特性如摺疊、與溶劑和溶劑中的離子相互作用等獲得多樣性。在發明的一個實施例中，遷移率修飾部分可以是寡聚體，其中遷移率修飾部分可在一個支持物上被合成，或通過在合適的宿主中克隆或表達而產生。多肽可方便地被合成，其中除了一個端基，僅有一個半胱氨酸或絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸，天冬氨酸/穀氨酸，或賴氨酸/精氨酸/組氨酸，因此是被差異地職能化的獨特功能基。通過使用保護性基團，可以將側鏈功能基與末端胺基酸功能基區分開。而且，通過適當的設計，可以在遷移率修飾部分不同位點上存在的相同功能基之間提供優選的反應。是否使用合成或克隆來製備寡肽，在根本的程度上依賴於遷移率修飾部分的長度。
取代的芳香基基團可作為質量和電荷修飾區。許多功能基可被取代至芳香基團如苯基上，以對e-標記報告子提供質量或電荷。芳香基可以是僅需要一個連接功能基的末端基團，使游離羥基可被醯化，可以作為側鏈附著在e-標記報告子鏈的羥基上，或可以具有兩個功能基，如可用來形成亞磷酸酯的酚式羥基，和其他取代基如滷素、滷烷、硝基、氰基、烷氧羰基、硫代烷基等，其中這些基團可以是帶電荷或不帶電荷的。
可以使用本領域熟知的共扼技術製備標記結合物。可以從具有功能基團的更小分子合成M，這些功能基團通常在線性鏈上用來連接分子和另一個分子。這樣的功能基團包括羧酸、胺和羥基或硫醇基團。根據本發明，給予電荷的部分具有核心鏈伸出的一種或多種側鏈基團。側鏈基團具有一個功能基，以連接標記或給予電荷部分的另一個分子。從所使用的功能基團的反應中得到的普通功能基的實例是在要被結合的分子之間形成共價鍵。這樣的功能基是二硫化物、醯胺、硫代醯胺、雙硫醇、乙醚、尿素、硫脲、胍、偶氮、硫醚、羧酸鹽、和含硫和磷的酯和醯胺如磺酸鹽、磷酸酯、磺胺、硫酯等，和類似物。
e-標記部分組分的連接如上所述。可檢測部分和遷移率修飾部分之間的連接一般對致裂解部分的作用是穩定的，使得在e-標記報告子從e-標記探針中被裂解出來的過程中，遷移率修飾部分和可檢測部分可作為一個完整的單位從e-標記探針中釋放出來。
大概地，遷移率修飾部分可以是連接鍵，此時可檢測部分或標記直接結合於靶結合部分，或是鏈中大約1至大約500或更多原子的連接，普遍為大約1至大約300個原子，更普遍的是大約2至100個原子。在這個實施例中，鏈中原子的總數目依賴於識別被測定的所有靶標所需要的多樣性實際程度。遷移率修飾部分的鏈大概地包括碳、氮、氧、磷、硼和硫。許多取代基可存在於遷移率修飾部分上，它們可以是天然存在的，是天然存在單體的一部分，或通過合成被引入。可能在鏈上存在的功能基包括醯胺、磷酸酯、乙醚、酯類、硫醚、二硫化物、硼酸酯、硫酸酯等。側鏈包括胺，銨鹽，包括酚基的羥基，羧基，酯類，醯胺，磷酸鹽，雜環特別是氮雜環如核苷鹼基和胺基酸側鏈如咪唑和喹啉，硫醚，硫醇或其他基團以改變電泳標記的遷移性。
遷移率修飾部分可以是一個同型寡聚物或異型寡聚物，具有相同或不同化學特性的不同單體，如核苷酸和胺基酸。在一個實施例中，e-標記部分將含有一個連接子，可在遷移率修飾部分和可檢測標記分子之間提供連接，通常是螢光劑，或可含有用於連接可檢測標記分子的功能基。通過含有可分別與可檢測標記分子連接的不同功能基，提高了電泳標記多樣性的機率。使用加入至不同功能基中的不同螢光劑，不同的螢光劑可提供電泳標記在發射光和電荷-質量比例上的差異。
將多個電泳標記附著到結合部分上在涉及多肽的檢測中，單個靶分子的結合反應釋放多個e-標記報告子是有益的。在某種情況下，這樣可導致信號的擴增。期望從每個結合反應中釋放的e-標記報告子的數目為大約6×103至大約6×1010，優選6×104至大約6×108。當多肽結合部分具有多數的附著位點時，例如抗體，在抗體上有多數的結合位點可附著e-標記部分。當e-標記探針的多肽結合部分與多肽結合，第一個結合劑的第一個結合部分與多肽上的誘導結合位點結合，並因此可將致裂解部分帶入至可裂解的連接附近時，多數的e-標記報告子被釋放進行單個多肽參與的結合反應。例如，e-標記部分附著在一個抗體上可在每個抗體分子上產生大約2至大約10個分子的e-標記部分。
為了進一步增加釋放的e-標記報告子的數量，e-標記部分可裂解地附著在主幹上，e-標記探針的多肽結合部分也可以相對持久的方式附著在主幹上。對於含有多數附著位點的多肽結合部分，多數的主幹被附著在多肽結合部分上，其中每個主幹具有多數的要釋放的e-標記部分。因此，主幹的核心是一個多功能物質，正常是聚合的，含有多數的功能基團，如羥基，氨基，硫基，羧基，乙烯基，醛等，作為連接位點。主幹上的功能基應該是那些與e-標記部分上功能基，或要被附著的多肽結合部分反應的基團。優選一些功能基，因為它們可抵抗不希望的側鏈反應中的摻入作用。主幹的核心可以是水溶性和水不溶性的。主幹核心普遍至少大約35,000分子量，可以是大約1000萬或更大的分子量，但普遍大約為600,000以下，更普遍的是在大約300,000以下。實例的主幹核心包括多糖，多肽，多核苷酸，離子交換樹脂，和類似物。在一個方面主幹是一個有分支的連接子，它有許多可附著e-標記部分的多個位點。多位點連接子具有可附著多肽結合部分的一個附著位點，和多數可附著多個e-標記部分的位點。當然，e-標記部分必須通過連接鍵被附著，該連接鍵含有按照本發明可被致裂解部分裂解的功能基。
在一個實施例中，主幹核心是親水性聚合物，一般是加成化合物或濃縮聚合物，含有多個功能基可附著多個部分。可用作本發明反應劑的一類聚合物包括多糖聚合物。可使用的多糖如葡聚糖，瓊脂糖，多聚核糖，和類似物。其他類型的聚合物可來自被取代的乙烯或丁二烯型單體的加合聚合作用，包括短鏈未飽和單體，包括丙烯，其中這些單體含有取代基，這些取代基是親水基團，或被衍化為親水基團。可附著在乙烯上的合適的親水基團包括羥基，羧基和酯類及其醯胺，胺，和類似物。如果使用丙烯酸單體，該酸可在聚合之前或之後被衍化為合適的反應基團。因此，例如乙二醇和丙烯酸形成的酯可為衍化作用向e-標記探針的成分中提供羥基基團。其他合適的聚合物包括聚丙烯胺鹽和乙醇，例如聚乙烯乙醇。除了使用來自單個單體的聚合物，也可使用混合的聚合物。在這種情況下，通過非反應成分如聚乙二醇可提供親水性，然後進一步聚合成單體，單體上含有合適的功能基團可與e-標記探針的成分反應。這樣的一個聚合物是聚乙二醇和聚乙烯醇的共聚物。主幹的一個特殊的實例是葡聚糖，其中在每個葡聚糖分子上可附著大約10至大約300個分子的e-標記部分。
可使用顆粒來增加e-標記探針上存在的e-標記部分的數目。顆粒可以是固體(如由有機和無機聚合物或乳膠組成)，油滴(如碳水化合物，碳氟化合物，液體矽)，或囊泡(如合成的如磷脂或天然的如細胞和細胞器)。固體顆粒正常為聚合物，加合或濃縮聚合物，可很容易的分散在測定介質中。e-標記部分通過與本發明一致的可裂解的連接與顆粒連接。採用這種方式，大約100至105個e-標記部分可被連接至一個單個顆粒上。通常顆粒含有至少一個附著在其上的多肽結合部分。向顆粒上附著多個葡聚糖分子和通過上面討論的可裂解連接將多個e-標記部分連接至葡聚糖上，也包含在本發明的範圍內。
在本發明的e-標記探針的一個特殊實施例中，多肽結合部分是抗體。可使用許多不同的反應來將化合物共價附著在抗體上。這已經通過抗體分子的胺基酸殘基反應而完成，這些殘基包括賴氨酸的胺基團，穀氨酸和天冬氨酸的游離羧酸基團，半胱氨酸的巰基基團，和芳香族胺基酸的許多部分。與抗體的結合可以是隨機的或位點定向的。為了進行位點定向結合，連接子或遷移率變化的部分可以任何方便的方式加入至靶結合部分的單位中，如抗體的Fc部分或鉸鏈區的二硫化物。為了隨機結合，可使用抗體的胺基團(如N-末端或賴氨酸)。可選擇地，可使用羧酸酯基團(如，C-末端，天冬氨酸，穀氨酸)。其他的實例包括巰基。在與抗體結合中的主要考慮是保留抗體的識別特性或特異性和活性。
與抗體附著的特殊方法是已知的。這樣的一種方法是將一種化合物的羧基(或氨基)基團連接至抗體的氨基(或羧基)基團上的碳化二亞胺反應。另外，雙功能劑如二醛或醯亞胺酯已經用來將一種化合物的氨基基團連接至抗體分子的氨基基團上。在另一種方法中，希夫氏反應用來將化合物連接至抗體分子上。這種方法包括被連接化合物的高碘酸鹽過氧化，該化合物含有乙二醇或羥基基團，因此可形成醛，後者然後與抗體分子反應。通過形成希夫氏鹼發生與抗體分子氨基基團的附著作用。而且，異氰酸鹽已經用作將化合物與抗體共價結合的偶合劑。與氧化的抗體或氧化的抗體片段反應的合適連接子包括含有選自以下基團的胺類伯胺，仲胺，肼，醯肼，羥胺，苯肼，氨基脲和硫代卡巴肼基團。這樣的反應功能基團可作為連接子結構的一部分存在，或可通過不含有這些基團的連接子的合適的化學修飾而被引入。
在一個特殊的方法中，含多糖鏈的抗體被氧化以產生反應性醛基。這樣的氧化作用例如，可通過本領域已知的高碘酸鹽來完成。主幹分子，例如氨基-葡聚糖分子，含有通過可裂解連接而附著在其上的e-標記部分，通過還原性氨化作用形成的仲胺鍵附著在抗體的醛基上。
相應地，在本發明中一種或多種主幹分子可通過前述的方法之一附著在一個抗體上，以在本方法使用的條件下獲得相對持久的連接。當然，與本發明一致，e-標記部分可通過可裂解的連接附著在主幹上或通過這種可裂解連接直接附著在抗體上。通過第一個結合劑和含有抗體的e-標記探針結合多肽，將e-標記探針帶到致裂解試劑的附近，多個e-標記報告子可被釋放以進行隨後的檢測，並判斷多肽的存在或多肽存在的量。
如在此所使用的，術語「俘獲配體」是指典型地包括在e-標記探針的靶結合部分中的基團，它能夠特異地結合「俘獲劑」或受體。這樣一種俘獲配體和相應俘獲劑之間的相互作用可用來從釋放的e-標記報告子中分離未裂解的e-標記探針。如果需要，報告子可用來物理性的分離與其結合的分子，完全去除含有多肽結合區的完整e-標記探針或含有配體的修飾多肽結合區。這些修飾的多肽結合區可能是由於起始物質的降解、製備和異常裂解過程中的汙染，或是多肽結合部分的其它非特異性降解產物。如上，以生物素為例的配體附著於多肽結合區，以便在裂解時與e-標記報告子分離。
可以使用配體的受體。這樣的受體包括天然的或合成的受體，如免疫球蛋白，植物凝集素，酶等，親和素等等。期望受體帶有正電荷，天然的實例是親和素，或通過添加正電荷部分或如銨基團，鹼性胺基酸等部分來製成。親和素可與檢測探針附著的生物素和其降解產物結合。親和素是正電荷的，而被裂解的電泳標記是負電荷的。因此從未裂解的探針以及其降解產物中分離裂解的電泳標記，可很容易的通過常規的分離方法而完成。可選擇地，受體可與固體支持物或高分子量巨分子，如容器壁，顆粒如磁性顆粒，纖維素，瓊脂糖等結合，可通過物理分離或離心，透析等被分離。這種方法進一步增強了檢測的特異性，可進行更高程度的多重檢測。
一般情況下，如果多肽結合部分的特性允許，可以有兩個配體。如上所述，一個配體可用來整合與多肽結合區連接的e-標記部分，從缺少第一個配體的產物中保留第一個配體。然後可以分離和濃縮與缺少第一個配體的修飾多肽結合區結合的e-標記部分。在使用兩個配體的過程中，首先可將反應混合物與第一個配體的第一個受體結合，以去除保留了第一個配體的多肽結合區。可從組合物中分離第一個受體或在組合物中如所述保留第一個受體。然後可將得到的組合物與第二個受體結合，其中組合物中含有第一個配體的多肽結合區與第一個受體結合，其中第二個受體可用來分離或富集缺少第一個配體但保留第二個配體的修飾多肽結合區。第二個配體是可檢測的標記；可獲得一個受體的小分子，如一個半抗原或e-標記探針的一部分可用作第二個配體。產物被分離或富集後，e-標記受體可通過受體變性、產物置換，高鹽濃度和/或有機溶劑等而被釋放。
根據如上所述的e-標記部分附著的試劑，可以是單個的e-標記部分或多個的e-標記部分，通常範圍是從大約1至大約105，更普遍的是從大約1至大約300，更特別地從大約1至大約20，根據是否使用主幹或顆粒。與單個靶結合區結合的e-標記部分的數目依賴於所需的敏感性、e-標記部分的溶解度、多個e-標記部分對測定實驗的影響等。
e-標記探針的合成實施多種類型的合成法以形成給予電荷部分或作為肽鏈的遷移性調節物的化學在本領域是已知的。見例如，Marglin等人，Ann.Rev.Biochem.(1970)39841-866。通常，這樣的合成法涉及用一種合適的保護基團阻斷那些不參與反應中的功能性基團。然後游離的功能基團被反應形成所需的連接。如在Merrifield合成中在樹脂上產生肽(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(1980)852149-2154和Houghten等人，Int.J.Pep.Prot.Res.(1980)16311-320)。然後按照已知的技術從樹脂中去除肽。
可用來合成肽的許多技術的總結可見J.M.Stewart等人，「固相肽合成」，W.H.Freeman Co，San Francisco(1969)；和J.Meienhofer，「激素蛋白和肽」，(1973)，第2卷，46頁，學術出版社(紐約)，進行固相肽合成；和E.Schroder等人，「肽」，第1卷，學術出版社(紐約)，1965進行溶液合成。
通常，這些方法包括連續添加一種或多種胺基酸，或合適的被保護的胺基酸至一個正在延伸的肽鏈。正常情況，適當的保護基團可保護第一個胺基酸的氨基或羧基。被保護或衍化的胺基酸然後可附著在惰性的固體支持物上或在溶液中使用，通過在適合形成醯胺連接的條件下，加入含有被適當保護的互補(胺基酸或羧基)基團的序列中的下一個胺基酸。保護基團然後從新加入的胺基酸殘基中去除，然後加入下一個胺基酸(適當保護的)等等。所有需要的胺基酸被以正確的序列連接後，任何殘餘的保護基團(和任何固體支持物)按順序或同時被去除，以獲得最終的肽。如所需要的，根據已知的方法依靠所使用的特殊保護基團，去掉保護基團。例如，保護基團的去除可通過用氫，活性炭上的二溴化鈀，液氨中的鈉等還原；用三氟乙酸，氫氟酸和類似物水解。
使用氨基磷酸酯合成e-標記探針或相關的化學方法，可在文獻中獲得許多指導分子探針和研究產品手冊，第8版(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，2002)；Beaucage和Iyer，Tetrahedron，482223-35 2311(1992)；Moiko等人，美國專利4,980,460；Koster等人，美國專利4,725,677；Caruthers等人，美國專利4,415,732；4,458,066；和4,973,679；和類似文獻。許多這些化學方法可使電泳探針的成分可很方便的在自動DNA合成儀中被合成，如Applied Biosystems，Inc.(Foster City，Califomia)392型或394 DNA/RNA合成儀或類似儀器。
作為遷移率修飾部分的一部分，含有核苷酸的e-標記反應劑的合成，採用標準的氨基磷酸酯化學方法在固相上集合就可很容易的和有效的完成。得到的遷移率修飾部分可如上所述被連接至標記和/或多肽結合部分上。
前面提到的標記結合物與不同的電泳遷移性可進行多個多肽的多重檢測，所述多肽含有誘導的結合位點。當然，製備任何數目的標記結合物進行多重測定包括在本發明的範圍內。
舉例的電泳標記合成方法一個合成方法的實例在圖1中概述。從市售的6-羧基螢光素開始，苯酚羥基基團可使用酸酐來保護。可使用，嘧啶的異丁酸酐，但其他變異體也是同樣合適的。重要的是要注意選擇作為保護基團的酯類功能基的重要性。在氨基磷酸酯單體合成的過程中和寡核苷酸構建的過程中這些基團仍然是完整的。這些基團直至合成的寡鏈採用氨去保護時才被去除。在保護後，採用DCC作為耦合劑通過形成N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-酯)可在原位活化原料。DCU副產物被過濾，加入氨基醇。許多氨基醇可從商業渠道獲得，其中一些可從胺基酸還原而來。當氨基醇是「H2N-(CH2)n-OH」，n的範圍是從2至12，更優選的是從2至6。僅胺是反應性的，足以替換N-羥基琥珀醯亞胺。在標準的提取程序中，可獲得產物的95％產量。這種物質被亞磷酸化產生氨基磷酸酯單體。為了合成其他的e-標記部分，對稱的雙氨基醇連接子用作氨基醇(圖2)。同樣，然後在亞磷酸化反應之前，仲胺與許多羧酸衍生物(實例是在圖3中所示的幾種可能的安息香酸衍生物)偶聯。使用這種方法，幾百甚至幾千個具有不同電荷-質量比例的e-標記部分在探針合成過程中很容易的被裝配起來，探針的合成是採用標準的化學方法在DNA合成儀上進行。
可以選擇地，採用一種可選擇的策略可得到e-標記部分，這種策略採用5-氨基螢光素作為起始物質(圖4)。在大量的溶劑中向極度過量的二氯二酸中添加5-氨基螢光素形成的單乙醯代產物較形成的二聚體佔優勢。苯酚基團在這些條件下是沒有反應性的。水相的條件可將末端的醯基氯轉變為羧酸。這種產物類似於6-羧基螢光素，採用相同的系列步驟它可轉變為其保護性的氨基磷酸酯單體。商業渠道可購得許多二氯二酸和二酸，後者採用SOCl2或乙醯氯可被轉變為二氯二酸。這種方法是很有吸引力的，因為使用了第二個遷移率調節物。同樣，如果獲得了10個市售的修飾氨基磷酸酯和10個二氯二酸和10個氨基醇，就有潛力獲得1000個不同e-標記部分。有許多市售的二氯二酸和氨基醇(圖5)。這些合成方法從理論上是適合組合化學的。
用圖1，2和4中的方案構建的電泳標記可進一步在亞磷酸化之前或之後反應以便附著於可裂解的連接，如採用如下所述的化學方法。
e-標記部分可被裝配後，在末端含有一個合適的功能基，以便連接至多肽結合部分上。可使用多種功能基。因此，正常存在於多肽中的功能基，如羧基，氨基，羥基和硫醇，它們是共價鍵的反應性功能基的靶標。根據連接基團的化學方法和多肽結合部分上功能基的有效性，e-標記部分可被連接。例如，如上對多肽特異的抗體及其片斷如Fab』片斷的描述，硫醇基將用於使用活性烯烴，如馬來醯亞胺來形成硫醚。當使用賴氨酸時，可使用能在水中反應的活化酯，如硝基苯基酯或五氟苯基酯，或與碳化二亞胺和半酯碳酸混合的酸酐。在文獻中對結合作用有充足的化學方法，因此對於每種特殊的情況，在文獻中結合作用均有充足的先例。
在一個舉例的合成作用中使用了二醇。這種二醇的實例包括烯基二醇，聚烯基二醇，其中烯基的碳原子為2至3個，烯基胺或聚(烯基胺)二醇，其中烯基的碳原子為2至3個，氮被取代，例如封閉基團或烷基的碳原子為1-6個，其中一個二醇被一個常規的保護基團封閉，如二甲三苯甲基。這種基團可作為質量修飾區，含有氨基的可作為電荷修飾區。如果需要，質量修飾物可採用構建模塊來裝配，該模塊可通過氨基磷酸酯化學方法被加入。採用這種方式，電荷修飾物置於質量調節物之間。例如，可製備含有1，2，3，n個單位的系列聚乙烯氧化物分子。為了引入多個負電荷，可使用一個小的聚乙烯氧化物單位。質量和電荷修飾區可通過含有多個已被添加磷酸單位的聚乙烯氧化物單位而被構建。可選擇地，通過使用大的間隔區，可存在更少的磷酸基團，因此可實現較大差異的質量/電荷比例而沒有大的質量差異。
使用的化學方法是用於寡核苷酸合成的常規化學方法，其中使用構建模塊而不是核苷酸，但反應是常規的氨基磷酸酯化學法，構建模塊是常規的二甲基三苯甲基。當然，其他適合自動合成儀的化學方法也可使用。但是，需要儘量簡化該過程的複雜性。
如上所述，在一個實施例中，主幹核心通常是一個親水聚合物，可允許多個部分附著的具有多個功能基的一個加合或濃縮聚合物。可用於本發明的反應劑的一類聚合物包括多糖聚合物，如葡聚糖，瓊脂糖，聚核糖，聚木糖和類似物。例如，主幹可以是葡聚糖，多個e-標記報告子以與本發明一致的可裂解的方式附著其上。葡聚糖的一些醛部分被保留，並可用於通過還原性氨化作用將葡聚糖分子附著於寡核苷酸上的氨基基團上。在另一個實例中，使用葡聚糖作為主幹核心，葡聚糖被琥珀酸酐封閉，得到的物質通過形成醯胺被連接於含胺的寡核苷酸。
除了連接子和遷移率修飾部分的特性，如已經指明的那樣，其他的變化包括螢光劑的化學和光學特性，形成能量傳遞複合體，可影響遷移率的連接子化學特性，如摺疊的變化，與溶劑的相互作用和溶劑中的離子，以及類似因素。如已經說明的那樣，在一個實施例中，連接子是一種寡聚物，其中連接子在一個支持物上被合成或通過在一個合適的宿主中通過克隆或表達而產生。多肽可方便的被產生，其中僅有一個半胱氨酸或絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸，或賴氨酸/精氨酸/組氨酸，而不是一個末端基團，因此是一個獨特的功能基，在功能上是有差別的。通過使用保護性基團，可以從末端胺基酸功能基中鑑別出側鏈功能基。通過合適的設計，也可以在連接基團上不同位點上存在的相同功能基之間提供優選的反應。是否使用合成或克隆製備寡肽將在很大程度上依賴於連接子的長度。
對於20個不同的e-標記報告子，僅有5個不同的質量修飾區，需要一個可裂解的連接和4個不同的可檢測區。對於120個e-標記報告子，僅需要10個不同的質量修飾區，3個不同的電荷修飾區和4個不同的可檢測區。對於500個不同的e-標記報告子，僅需要25個不同的質量修飾區，5個不同的電荷修飾區和4個不同的可檢測區。
使用e-標記反應劑的方法下面對方法的總體描述和特殊實驗的實例是為了解釋而不是限制。在本領域中的專業技術人員將能夠應用這裡的技術以大多數實驗的形式用於任何分析物質的測定實驗中，這些形式對於專業技術人員，特別是在蛋白測定和化學遺傳學領域是很淺顯的。
在實施這些測定中，各種組分，即樣品，第一個反應劑和電泳探針，可在測定介質中以任何順序被組合在一起，通常是同時進行。可以選擇地，一種或多種反應劑可與一種或多種剩餘的反應劑組合在一起形成亞組合物。然後亞組合物被孵育。然後，剩餘的反應劑或其亞組合物混合在一起，並孵育混合物。反應劑的量通常以經驗確定。作為通常的規律，對於目的多肽所期望的最高的量，第一種反應劑和電泳探針至少以相同的量被應用，通常至少為大約1.5倍過量，更通常的是至少大約兩倍的過量，可大約10倍過量或更多。各種成分在結合的條件下被組合在一起，通常在水介質中，通常pH的範圍大約是5至大約10，緩衝液的濃度範圍是大約10至大約200mM。這些條件是常規的，其中使用常規的緩衝液，如磷酸鹽，碳酸鹽，HEPES，MOPS，Tris，硼酸鹽等，以及其他常規的添加物，如鹽，穩定劑，有機溶劑等。水介質可以是單一的水或可包含從0.01至80或更多體積百分比的組合溶劑。
組合的反應劑被孵育一定時間和一定的溫度，可允許進行大多數的結合反應。通常來說，在照射混合物或加入剩餘反應劑之前，在所有或部分反應劑組合後孵育的時間為至少大約5分鐘，更通常的為至少大約15分鐘。正常情況下在適度的溫度下孵育，通常是固定的溫度。孵育的溫度正常範圍從大約5°至99℃，通常從大約15°至70℃，更通常的是20至45℃。在測定過程中溫度通常的範圍是大約10°至70℃，更通常的是從大約20°至45℃，更通常的是20°至25℃。
在適當的孵育時間後，以及所有反應劑被組合形成一種化合物後，混合物被處理以活化致裂解部分，其中該化合物包含第一種反應劑或裂解誘導反應劑，樣品和電泳探針或e-標記探針。當然活化的特性依賴於致裂解部分的特性。
提到的發明採用多種反應劑系統，其中的結合作用可引起e-標記部分的釋放。致裂解部分的效應是通過物理，化學或酶學方式建立或破壞結合鍵。含有多肽結合區的不同電泳探針或e-標記探針的每種產物可被準確的檢測，以便能確定被誘導的結合位點參與的結合作用的發生。在結合作用後，產生一種或多種反應產物，它們可表現與e-標記探針或反應產物衍生的探針不同的遷移性。E-標記的釋放形式，稱為e-標記報告子，可表現與其衍生的e-標記探針不同的遷移性和/或質量。本發明對篩選已知和未知物質提供了很高的變化性。可採用一種電泳裝置以分離和檢測e-標記報告子。電泳裝置可與從裝置接收和處理數據以及操縱電泳裝置的數據處理器連接。
該系統的基礎是具有含有多個e-標記反應劑的文庫，這些反應劑至少含有多個不同的遷移率變化的部分，以便可通過電泳採用遷移率修飾部分附著的實體來分離。遷移率修飾部分被保留在反應的產物中，其中產物通過獲得和/或丟失一個基團而被修飾，與起始物質相比，該基團改變了產物的質量，也可改變產物的電荷。遷移率修飾部分通過可裂解的結合鍵被加入至多肽結合區上，以便在被誘導的結合位點與第一個結合劑結合後釋放遷移率修飾部分進行分析。
如上所述，在其他的應用領域中，本發明應用於翻譯後修飾的領域。可以確定宿主細胞，細胞器或類似物對與大量通路相關的化學和物理環境改變，表面蛋白群的改變，由於衰老，新生物，活化或其他天然發生現象而發生的變化的反應，其中蛋白被定量。可應用的方法可以是異源的或同源的。正常情況下異源技術涉及一個分離步驟，其中未結合的標記從結合的標記中被分離出來。在另一個方面，均一性測定不需要，但可採用一個分離步驟。
另外，在許多異源測定中，需要的是未結合的標記試劑可從結合的標記試劑中分離。可以通過許多種方法完成，每種都需要一種與固體支持物結合的試劑，可區分標記試劑和多肽的複合體。固體支持物可以是一種管壁，如微量滴定板孔，培養板孔，毛細管，培養板，載波片，小微珠，包括磁微珠，脂質體或類似物。固體支持物的基本特性是它可從未結合探針中分離出結合的已標記特異結合者，而且支持物不幹擾結合複合體的形成，也不幹擾測定的其他操作。
固體支持物可以是與支持物直接或間接結合的複合體。對於直接的結合，可含有與支持物共價或非共價結合的第一種試劑或e-標記探針。表面被多種功能基活化，將與第一種試劑形成共價鍵。這些基團包括滷代亞胺，活化的羧基基團，如混合酸酐或滷代醯基，氨基，α-滷代或pseudohaloketones等。與支持物表面結合的特異結合者可用來與複合體的一員結合。
通常，以異源的方式，未結合的標記試劑或e-標記探針將通過衝洗結合材料而被去除。當使用顆粒或小微珠，在衝洗之前，它們可通過過濾，離心，磁性分離等從上清液中被分離出來。衝洗後，支持物與一種液體置於一起，e-標記報告子可被釋放至其中和/或e-標記部分的功能基與可檢測的標記反應，然後釋放或之前被釋放。根據可裂解的結合鍵的特性和裂解的方法，液體包含任何進行裂解的其他試劑。當不需要裂解的試劑時，該液體可方便的用作電泳緩衝液。例如，當可裂解的連接是對光不穩定的，介質可用合適波長的光照射以釋放e-標記報告子。當可檢測的標記不存在於e-標記部分上時，e-標記報告子可與可檢測的標記反應。在一些實例中，可檢測的標記是能切斷可裂解結合鍵的試劑的一部分，如含硫醇的二硫鍵。當在不同的結合者上有多個不同的功能基可與標記反應，不同的標記含有與一種功能基反應的功能基。不同的標記可一起被加入或以連續的方式逐個加入。例如，當功能基包括硫醇，羧基，醛或烯烴，標記可分別是活化的烯烴，乙醇，胺和硫醇基。在一種或多種功能基中包含可去除的保護性基團，保護性基團可逐步被去除，逐步加入標記。以這種方式可避免交叉反應。最初是否存在可檢測的標記或加入可檢測的標記對本發明並不重要，多肽本身是否通過致裂解部分或多肽和第一種試劑，以及電泳探針的特性而被裂解經常是起主要作用的。
在一些實施例中，e-標記報告子需要從試劑溶液中分離，其中該試劑可幹擾電泳的分析。根據e-標記報告子和試劑的特性，可將e-標記報告子從試劑中通過使用離子交換柱，液體色譜，初始電泳分離等方法而分離。可選擇的是，如前面所述，可含有一種俘獲配體，它可與e-標記部分或靶結合區的保留部分結合以分離e-標記報告子，以便去除混合物中任何幹擾組分。一旦製備了e-標記報告子的溶液，去除任何幹擾組分，溶液就可用電泳分析。可採用毛細電泳裝置，微液裝置或其他可電泳分離多個化合物的裝置進行分析，可呈現出每個e-標記報告子的可分辨區帶。
優選地，根據本發明可以同源的方式進行測定。主要的均一性測定的方法一般根據類似的異源測定的步驟。這些方法採用一種信號產生系統，包括e-標記探針的標記，有些情況下可能有與e-標記探針或多肽相關的可裂解結合鍵，電磁輻射或反應中涉及的或為了消除背景信號的其他試劑。在涉及產生單態氧的實驗中，希望在溶液中含有可降解減少其壽命的過氧化氫的一種分子，以便避免在結合和未結合的含標記試劑產生的過氧化氫之間的反應。
通常，信號產生系統涉及的多種試劑的濃度將根據要分析的樣品中每個多肽的濃度範圍而變化，通常範圍為大約10nM至大約10mM。緩衝液通常使用的濃度範圍是大約10至大約200mM。每種多肽的濃度一般範圍是大約1pM至大約100M，更通常的範圍是大約100pM至大約10M。在特殊的情況下，濃度可更高或更低，依賴於分析物的特性，相互結合者的親和力，e-標記報告子釋放的效率，e-標記報告子檢測的敏感性，和多肽的數目以及其他因素。
根據本發明的一個方面，在多重反應中可監測一組多肽。在這種情況下，與多種多肽對應的多個e-標記探針對可在一個反應容器中在一定的條件下與樣品混合，在所述的條件下，當每種多肽與結合劑結合，介質被處理產生單態氧時，e-標記報告子從試劑中被釋放。e-標記報告子被標記進行檢測或通過e-標記部分上存在的反應性功能基加入標記。反應中的已標記e-標記報告子在電泳裝置上可與另一個區分開，在它們離開檢測儀後再次被監測。在此系統中可能的多重檢測水平僅受解析度的程度限制，該解析度可從電泳裝置上指定的一組e-標記報告子之間獲得。
經過e-標記部分被標記的時期後，實驗可有另外一些的靈活性。如上所述，當被引入反應中時，每種e-標記部分均已經含有一個可檢測標記。可以選擇地，e-標記部分可含有一個功能基，它可使其在與樣品的反應完成後結合於一個標記。在本實施例中，含有與可檢測標記結合的e-標記探針與樣品混合在一起。如果在樣品中存在靶多肽，在修飾e-標記探針遷移性的反應後，在樣品容器中，其他的試劑也可與第一個反應的產物混合在一起，該產物與修飾的e-標記報告子反應以加入可檢測的標記。
為了定量，可以選擇使用對照，可根據存在或被引入的靶標的數量提供信號。通過向每個樣品在電泳分離e-標記報告子之前添加已知數量的螢光基團可獲得對照物，使相對的螢光信號轉變為絕對數量。任何不幹擾e-標記報告子信號檢測的螢光基團可用於螢光信號的標準化。對照的信號優選含有的電泳遷移率與樣品中任何e-標記報告子不同，可具有相同或不同的發射波長。實例的螢光分子包括ROX，FAM和螢光素。
根據本發明實驗的一個實例涉及一種多肽磷酸化的檢測。樣品中含有細胞物質，翻譯後修飾是特殊多肽的磷酸化，所述多肽被指定為靶多肽。樣品與第一個試劑結合，該試劑含有與結合有金屬離子的金屬親和劑連接的光敏劑。如果存在磷酸化的靶多肽，磷酸基團與金屬-金屬親和劑複合體結合。電泳探針與上述的反應混合物結合。電泳探針含有靶多肽的抗體，它可裂解的連接於一個e-標記報告子。可裂解的連接包含一個可被單態氧切斷的部分。加入電泳探針和並孵育適當的時間後，反應混合物用光照射以激發光敏劑，產生單態氧。可裂解的部分被單態氧切斷，因為可裂解部分靠近光敏劑，稱為單態氧的活性成分，保留了足夠活性切斷可裂解部分，釋放e-標記報告子。電泳探針不與靶多肽結合，因為靶多肽不存在或電泳探針過量，或與多肽結合的電泳探針未磷酸化，它不能產生裂解的e-標記報告子，因為單態氧的活性壽命很短，由於存在磷酸化的靶多肽而不結合第一個試劑的任何電泳探針中的可裂解部分不能產生裂解的e-標記報告子。釋放的e-標記報告子由於不同的遷移性被分離，由於有檢測部分而被檢測，所述的檢測部分仍然附著在e-標記報告子的遷移率修飾部分上。釋放的e-標記報告子的存在和/或量說明了靶多肽的存在和/或量。
本發明發現了在靶多肽的多重測定中的特殊應用。根據本發明的這個方面，測定方法的一個實例涉及檢測多個多肽的磷酸化。樣品中含有細胞物質，翻譯後修飾是被指定為靶多肽的幾種多肽的磷酸化。樣品與含有光敏劑的第一個試劑結合，所述光敏劑與結合有金屬離子的金屬親和劑連接。第一個試劑是一種特殊類型的試劑，因為它可與反應混合物中的任何磷酸基團結合。如果存在磷酸化的靶多肽，磷酸基團與金屬-金屬親和劑複合體結合。多個的電泳探針與上述的反應混合物結合在一起。每種電泳探針都含有特殊靶多肽的抗體，一個e-標記報告子可裂解的連接於其上，所述的e-標記報告子對特殊的靶多肽是唯一的。可裂解的連接含有可被單態氧裂解的部分。加入電泳探針，並孵育合適的時間後，反應混合物被光照射以激發光敏劑，產生單態氧。可裂解部分可被單態氧切斷，因為可裂解的部分緊靠光敏劑，稱為單態氧的活性成分，保留了足夠的活性切斷可裂解部分並從所有與靶多肽結合的電泳探針中釋放e-標記報告子，所述的靶多肽與特殊類型的試劑結合。此外，不與靶多肽結合的電泳探針，因為以上的原因不能產生裂解的e-標記報告子，所述的靶多肽與特殊類型的試劑結合。釋放的e-標記報告子由於不同的遷移率被分離，並由於有檢測部分而被檢測出來，所述的檢測部分仍然保持與e-標記報告子的遷移率修飾部分附著。每個釋放的e-標記報告子的存在和/或量說明了每個靶多肽的存在和/或量。以這種方式，多種細胞通路可實時被研究。蛋白磷酸化和去磷酸化反應可被研究以了解關於代謝調節和信號轉導通路的更多信息。上述的方法可在細胞周期中的不同時間被重複以追蹤細胞的演變。
本發明的另一個應用是檢測靶多肽的多個磷酸化作用。例如，期望了解是否多肽已經被單磷酸化，雙磷酸化或更多的磷酸化。根據本發明的這個方面，實驗的一個實例涉及檢測靶多肽磷酸化的程度。含有細胞物質的樣品，與第一個試劑結合在一起，該試劑含有與一個主幹分子連接的多個光敏劑分子，金屬親和劑的多個分子和結合的金屬也連接在主幹分子上。通過特殊類型試劑的適當滴定，靶多肽的磷酸化水平可被確定。如果存在磷酸化的靶多肽，磷酸基團與金屬-金屬親和劑複合體結合。電泳探針與上述的反應混合物結合在一起。電泳探針包含特殊靶多肽的抗體，後者可裂解的連接e-標記報告子，所述的報告子對特殊的靶多肽是唯一的。可裂解的連接含有單態氧可裂解的部分。在添加電泳探針，並孵育適當的時間後，反應混合物用光照射以激發光敏劑，產生單態氧。可裂解的部分可被單態氧切斷，因為可裂解的部分緊靠光敏劑。稱為單態氧的活性成分仍然保留了足夠的活性以切斷可裂解部分，並從與靶多肽結合的電泳探針中釋放e-標記報告子，所述的靶多肽可與特殊類型的試劑結合。此外，不與靶多肽結合的電泳探針，因為以上的原因不能產生裂解的e-標記報告子，所述的靶多肽與特殊類型的試劑結合。釋放的e-標記報告子由於不同的遷移率被分離，並由於有檢測部分而被檢測出來，所述的檢測部分仍然保持與e-標記報告子的遷移率修飾部分附著。每個釋放的e-標記報告子的存在和/或量與加入的確定靶多肽磷酸化水平的特殊類型試劑的量有關。
採用本發明來確定靶多肽上磷酸化的位置或磷酸化位點。根據本發明這個方面的一個實驗的實例，含有細胞物質的樣品，與第一個試劑結合在一起，所述的試劑含有一種化學蛋白酶，並與結合有金屬離子的金屬親合劑連接在一起。如果存在磷酸化的靶多肽，磷酸基團與金屬-金屬親合劑複合體結合。化學蛋白酶可通過光照射而活化，位點特異的裂解發生在靶多肽上，後者的磷酸基團結合在金屬親合-金屬複合體上。裂解的產物表現為獨特的部分，或e-標記部分，例如可直接通過電分離法進行分析。另一方面，一種或多種電泳探針可與上述的反應混合物結合，為獨特的部分提供檢測部分。每種電泳探針都包含裂解部分的抗體，檢測部分附著在上面。E-標記報告子由於不同的遷移率被分離，由於有附著的檢測部分而被檢測。E-標記報告子的存在顯示了靶多肽的磷酸化位點。
根據本發明，實驗的另一個實例涉及多個多肽糖基化的檢測。樣品含有細胞物質，翻譯後修飾是被指定為靶多肽的幾個多肽的糖基化。樣品與第一個試劑結合，該試劑含有與含硼酸試劑結合的光敏劑。第一個試劑是一種特殊類型的試劑，因為它可結合存在於反應混合物中的任何碳水化合物部分。如果存在糖基化的靶多肽，碳水化合物基團與含硼酸試劑結合。每種電泳探針都含有特殊靶多肽的抗體，它可裂解的連接於一個e-標記報告子上，所述的e-標記報告子對特殊靶多肽是唯一的。可裂解的連接含有可被單態氧切斷的部分。在加入電泳探針，並孵育一段時間後，反應混合物被光照射以激發光敏劑，產生單態氧。可裂解的部分被單態氧切斷，從所有與靶多肽結合的電泳探針中釋放e-標記報告子，所述的靶多肽與特殊類型的試劑結合。此外，不與靶多肽結合的電泳探針，因為以上的原因不能產生裂解的e-標記報告子，所述的靶多肽與特殊類型的試劑結合。釋放的e-標記報告子由於不同的遷移率被分離，並由於有檢測部分而被檢測出來，所述的檢測部分仍然保持與e-標記報告子的遷移率修飾部分附著。每個釋放的e-標記報告子的存在和/或量分別顯示了每個靶多肽，如糖基化多肽的存在和/或量。上述的方法可在細胞周期中的不同時間被重複以追蹤細胞的演變。
本發明具有廣泛的應用，可研究細胞信號通路包括，通過例證而非限制，MAP激酶通路，Ras/ERK MAPK通路，INK/SAFE；和其他MAPK通路，NF-kB和背側通路，NF-AT雙重信號通路，淋巴細胞功能的調節，T細胞抗原受體信號轉導，多重信號轉換器和轉錄激活物，細胞分裂周期校驗點和類似通路。
有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK′s)可產生並可解釋生長因子和細胞因子受體信號轉導中的細胞事件。MAP激酶(也稱為細胞外信號調節蛋白激酶，或ERK)是三個激酶級聯中的終端酶。對於相關但不同的信號通路，三激酶級聯的順序反覆就可形成對MAPK的認識，它可作為在一個通路中連續作用的一種調節物，多功能信號元件，其中每個酶磷酸化，因此可激活順序中的下一個成員。最近對所有真核生物中保守的不同的MAPK級聯的鑑別表明MAPK組件已經用於解釋細胞外信號的不同排列。酶的MAPK超家族是中心交換器的重要成分，該交換器與多種細胞外和細胞內介質產生的進入信號是相匹配的。在MAPK組件中酶的特異磷酸化和活化可將信號傳遞至級聯反應中，引起許多在細胞中有重要調節功能的蛋白的磷酸化，包括其他蛋白激酶，轉錄因子，細胞骨架蛋白和其他酶(Cobb等人，Promega Notes Magazine(1996)5937，等等)。
其他類型的實驗涉及光敏劑與細胞的關聯，例如研究翻譯後修飾，可改變和/或控制它們所結合的蛋白的功能和/或表達的小分子，採用已知的小分子鑑別新的蛋白，篩選特徵性的靶標，如激酶，肽類等，篩選，蛋白功能類型的篩選實驗以鑑定新靶標如激酶，磷酸酶，DNA-或RNA結合蛋白，肽類，蛋白酶等。例如，被認為與目的靶標結合的小分子可與光敏劑分子結合，形成小分子-光敏劑複合體。可結合多個目的靶標的抗體分子將用不同的e-標記部分標記，形成e-標記-抗體複合體。然後通過形成e-標記-抗體靶標小分子-光敏劑複合體檢測特殊靶標的存在與否，並定量。抗體和小分子與靶標的相連將使e-標記部分與光敏劑靠近，使e-標記報告子釋放。光敏劑可與小分子，肽，抑制劑，脂類，碳水化合物，寡核苷酸和類似物附著。光敏劑也可附著在微生物或細胞的表面上，這些微生物或細胞具有上述任何結構，使人能夠檢測兩個細胞的細胞表面分子之間的相互作用。對於細胞表面的研究，光敏劑通過與特殊的細胞表面部分附著而與細胞相連，或非特異性的摻入至細胞膜中，其中光敏劑游離擴散在細胞膜中。
激酶相互作用的特殊測定法可例證被開發的許多類型的測定方法。特殊的激酶相互作用可採用夾心測定的方式來研究。例如，第一個抗激酶抗體用e-標記部分標記，第二個與磷酸化分子結合的抗體將用光敏劑標記。在形成免疫複合體後，e-標記部分通過用適當波長的光照射後被釋放，然後通過毛細電泳分離。在另一種形式中，可研究有多種特異性的激酶。抗激酶抗體用相同的光敏劑標記(如，光敏劑1-抗激酶1，光敏劑1-抗激酶2，光敏劑1-抗激酶3，等)，而特異激酶底物或抑制劑將用特異的e-標記部分來標記(如，底物1-e-標記1，底物2-e-標記2，底物3-e-標記3，等)。結合複合體將穩定或暫時形成。在照射和電泳分離後，產生多種特殊的圖譜顯示同時被測定的被選擇激酶靶標的多種水平。一旦建立了一種信號圖譜，多種藥物，處理的效應或遺傳改變可根據這種方式的變化而被檢測到。
將本發明用於蛋白學的實例見圖7。在這個實施例中，實驗首先要溶解細胞樣品。在細胞溶解物中的所有蛋白用致裂解部分標記。標記可在每個蛋白上至少獲得一個致裂解部分。如圖7顯示，蛋白用抗蛋白配體(APL)進行檢測，APL可以是一種受體或抗體。APL用特異的eTag報告子分子通過可裂解的連接標記；每個配體含有一個與其有關的獨特的eTag報告子。結合後，致裂解部分被活化釋放不同的報告子(Y)。致裂解部分和可裂解的連接必須緊靠以便釋放e-標記報告子。然後報告子經毛細電泳分離，並定量。此技術可以均一性測定形式對蛋白，小分子，酶底物和細胞表面受體進行多重定型。
蛋白細胞功能的測定一般需要一種改變功能的手段。一種途徑是遺傳法，涉及在編碼蛋白的基因中使用滅活或活化的突變。滅活包括刪除或敲除的途徑，活化或過度表達包括癌基因的途徑。其他的途徑包括使用可改變與它們結合的蛋白功能的小分子。存在能夠滅活或活化蛋白功能的配體。已經證明一些天然產物，基因敲除產物可獲得特異性(Schreiber，生物有機化學和醫用化學，6(1998)1127-1152；Stockwell等人，化學和生物學，6(1999)71-83)。小分子的天然產物可以幾種方式協助阻斷細胞周期事件中的複合體網絡，例如通過俘獲細胞周期中的特異時間點阻遏使細胞群體同步化。一旦形成了特異的結合相互作用，可滲透細胞的天然產物可用來闡明活細胞中其靶蛋白的功能。一些天然的產物可抑制從靜止狀態向為G1轉變狀態的轉變中所需的信號轉導通路。小分子可影響翻譯後的事件如蛋白糖基化，甲基化，脂化，異戊烯化，泛素化，磷酸化和乙醯化。
在細胞經歷活動性增殖，靜止狀態或G0期過程中，可進入和退出細胞周期，其中細胞的基本代謝被抑制，包括許多通常的活性功能如轉錄和蛋白的合成。去除生長因子可使細胞退回至靜止狀態，而用生長因子刺激可將引導細胞重新進入活動的周期中。細胞也可退出細胞周期，經歷分化過程或程序性細胞死亡(凋亡)。負責驅動細胞周期從一個時期進入下一個時期的元件是一系列能互相活化和滅活的蛋白激酶和磷酸酶。細胞周期蛋白依賴的激酶負責磷酸化細胞周期進程中關鍵的多種底物。細胞周期蛋白依賴激酶的水平在細胞周期中是不變的，但它們活性的調節是通過與稱為細胞周期蛋白的另外一組蛋白的相互作用，它們的水平是波動變化的。另外，在細胞漿膜上的許多受體是酪氨酸激酶，它們在活化過程中可啟動細胞內的信號轉導通路，該通路的終點是細胞的增殖。
本發明的方法和試劑可很好的適合上述的分析。多個的小分子可使其同源的靶標的功能喪失，這些同源物包括激酶，磷酸酶，膜受體，蛋白酶，異戊烯轉移酶和聚合酶。本發明的結果是，可在細胞內的環境中研究蛋白的功能。目標蛋白可被定量。對下遊蛋白如細胞周期蛋白水平的影響可採用本發明的試劑進行研究。根據細胞周期蛋白的表達來測定活化和滅活的細胞周期蛋白依賴的激酶(Cdk′s)。Cdk-細胞周期蛋白複合體也可被定量。信號轉導通路可使用本試劑來研究。
G1期是關鍵點，在此點細胞可決定是否進入另一輪分裂。在G1進程中的蛋白在人類癌症中經常是突變的，也是令人注目的治療性藥物的靶標。期望僅考慮早期G1期或晚G1期以確定是治療性藥物的化合物。目前，方法是在評價化合物中僅考慮細胞增殖或細胞死亡。所涉及的多個時期在圖8中描述。
在一個例證的實施例中，細胞生長在一個合適容器如孔的底部。細胞被固定後，可通過根據本發明的篩選方法探查特定的抗原。光敏劑試劑可被用來摻入細胞膜中，或可以選擇地，含光敏劑的光敏劑試劑附著於針對抗原或細胞表面上一類蛋白的抗體上。在此可使用e-標記試劑，其中抗原的抗體通過可裂解的連接與一個e-標記部分連接。在摻入細胞膜或與可能存在的與抗原結合的條件下，光敏劑試劑被加入至合適介質上的固定細胞中。然後加入e-標記探針，如果可能，則在抗原的抗體與抗原結合的條件下處理介質。下一步，光敏劑用如光照射來激活，例如，產生單態氧，僅在抗原存在於細胞上時切斷e-標記探針上可裂解的連接，將可裂解的連接引入至細胞膜上光敏劑的附近。然後檢測介質中釋放的e-標記報告子，其存在表明了抗原的存在。採用多個e-標記報告子可在同一個時間篩選多個抗原，每個探針都含有一個通過可裂解連接與一個e-標記部分相連的特殊抗原的特異抗體，所述的e-標記部分含有一個遷移率修飾部分，它可將e-標記報告子與由可能存在的其他抗原產生的其他e-標記報告子區分開。經過上述步驟後，介質提交至分離的步驟，其中e-標記報告子由於不同的遷移率而被分離。以這種方式可研究細胞中的蛋白表達。
以如上所述的方式進行的實驗的假定結果在圖9A，9B和9C中圖解。這些是理論上以細胞為基礎的測定，可同時監測Cdk的水平(採用Olomoucine標記的釋放誘導劑，如光敏劑)和細胞周期蛋白A-E。電泳探針試劑可採用一種表達蛋白的特異抗體，其中一種或多種獨特的e-標記可釋放的連接於每個抗體。就圖9A而言，對於對照細胞，即缺少待測化合物的細胞，可獲得8個峰，代表Cdk2，Cdk6，Cdk4，Cdc2和細胞周期蛋白A，D，E和B。當待測化合物引起早期G1停滯(圖9B)，可獲得3個峰，稱為Cdk6，Cdk4和細胞周期蛋白D。當待測化合物引起晚期G1停滯(圖9C)，可獲得5個峰，稱為Cdk2，Cdk6，Cdk4，細胞周期蛋白D和細胞周期蛋白E。在兩個化合物的處理中，被測化合物可能是治療患者的一種有效藥物。
其他的測定涉及使用可逆的蛋白共價修飾的調節物的小分子文庫來研究蛋白的翻譯後調節。製備一組探針，其中每個e-標記探針含有修飾或未修飾狀態的蛋白的抗體，可與在該組探針中獨特的e-標記部分可裂解的連接。光敏劑試劑被摻入至細胞中，在細胞膜中，胞漿中或其他適當的位置上。然後探針在合適的反應容器中與細胞結合在一起。每個文庫中的小分子被分別加入至容器中。液體介質然後如上所述被照射。每個容器中的液體介質被處理以分離和鑑定e-標記報告子。一種或多種e-標記報告子的存在與每個小分子調節蛋白的共價修飾的能力有關。
在研究蛋白翻譯後修飾的另一個方法中，製備一組e-標記探針，其中一個小分子文庫與每個e-標記探針的e-標記部分可裂解的連接。在適當容器中的細胞用光敏劑試劑處理，將光敏劑插入至合適的細胞位置中。整組e-標記探針，或其部分在一定條件下加入至容器中，其中小分子可發生期望的蛋白修飾。僅有這些參與目的修飾作用的小分子可將可裂解的連接帶到光敏劑附近。容器中的液體介質被處理以分離和鑑定e-標記報告子。一種或多種e-標記報告子的存在與每個小分子調節蛋白的共價修飾能力有關。
以上述的方式，根據小分子可改變的細胞事件的級聯反應來研究蛋白通路，小分子可作為抑制劑，激活劑，潛力藥物，激素，酶輔因子或其他類型的調節因子。研究小分子對基因表達和蛋白功能的影響，因此可使用小分子來鑑定新的蛋白。小分子的應用可象基因敲除一樣是特異性的。本發明可用於發現可立即改變功能的小分子，不能用於傳統的遺傳學中。可採用小分子來控制蛋白的功能，用於篩選實驗中，如激酶篩選，肽篩選，對激酶，肽類，蛋白酶，GPCR等的隨機篩選。使用本試劑可進行細胞周期阻滯劑的小分子抑制劑的篩選實驗。
根據本發明使用電泳探針的另一種方法在圖11中進行描繪。細胞膜顯示在其表面上含有包括受體R的多個受體。加入與受體R特異結合的抗原，如果存在受體R，抗原與其以及輔因子Co結合。酶Ea與上述的複合體結合，然後激活Ea，將P1轉化為其磷酸化產物P1a。激酶P2與P1a結合形成活性的複合體。這種系統可用於篩選活性複合體的抑制劑，如小分子或藥物。相應地，這種測定的試劑包括作為抑制劑被篩選的每個分子，其中每個分子與釋放誘導劑結合。電泳探針是複合體的抗體(Ab)，如複合體的P1a的抗體，其中抗體可釋放的連接於多個電泳部分。如果被篩選的其中一個分子結合併抑制複合體的活性，釋放誘導劑則被帶入至電泳探針的附近，e-標記部分被釋放，檢測和/或定量。
上述的方法也可用於篩選與特殊受體有結合活性的蛋白。在這種與圖11圖表一致的方法中，可使用具有非常明確靶標的藥物。根據與受體R結合的蛋白，如果僅存在一種或多種這樣的靶標，就能檢測到e-標記報告子。如已經見到的，本發明的方法有多種，整體上是已知的和未知的。
圖11圖表的變化在圖12中進行描繪。在這個實施例中，釋放誘導劑是抗體Ab1，它可與P2a和P1a的活性複合體特異結合。電泳探針是抗體Ab2，多個e-標記部分可釋放的連接在上面。可研究配體L與細胞表面上受體R結合的能力。如果L不與R結合，將形成P2a和P1a的活性複合體。抗體Ab1和Ab2與活性複合體結合，將可釋放的連接帶到緊靠釋放誘導劑的附近。E-標記報告子被釋放，檢測和定量。
圖13A描繪了蛋白-蛋白相互作用的假設實例，涉及多個磷酸化事件，本方法和組合物可用於其中。在這個圖解中，小分子可促進蛋白-蛋白的結合。FRAP可來自營養素和有絲分裂原與細胞表面上受體的相互作用。如在圖13A中所見到的，FKBP蛋白與FRAP(結合事件1)在雷帕黴素的存在下結合，產生4E-BP1，它參與了mRNA翻譯起始的控制。PP2A是FRAP激活的激酶(結合事件2)，在calyculin-A的存在下產生p70S6K，引起S6蛋白結合(結合事件5)。後者蛋白也參與了mRNA翻譯起始的控制。細胞表面上的另一個受體，RTK被生長因子作用產生激酶PI3K。在渥曼青黴素的存在下，PI3K被轉變為PDK1(結合事件6)，產生p70S6K，形成S6蛋白。PDK1也產生PKB(結合事件3)，反過來產生FRAP(結合事件4)。圖13B中的圖表顯示了測定的結果，其中沒有藥物存在，或其中存在渥曼青黴素，雷帕黴素或Calyculin，每一種都與釋放誘導劑結合，使用一種含有抗體的電泳探針，所述抗體是與一個電泳部分連接的參與一個結合事件中可釋放的其中一個蛋白的抗體。上述的通路有助於了解所涉及的多個結合事件，一種或多種這些結合事件中的抑制劑，一種或多種結合事件中的競爭劑，激酶活性的調節劑等。採用本發明的方法和試劑，上述的一種或多種物質可在單個測定中採用多個電泳探針來進行監測。
反應產物的分析電泳的方法是為人熟知的，其描述，例如見Krylov等人，Anal.Chem.，72111R-128R(2000)；RD.Grossman和J.C.Colbum，毛細電泳理論和實踐，AcademicPress，Inc.，NY(1992)；美國專利5,374,527；5,624,800；5,552,028；ABI PRISM 377DNA測序儀用戶指南，Rev.A，1995年1月，第2章(Applied Biosystems，Foster City，CA)；和類似文獻。多種合適的電泳介質包括非交聯的介質，可自商業渠道中從Applied Biosystems和其他銷售商獲得，採用自動儀器如Applied Biosystems「3700」和「3100」儀器來使用。在特殊的分離中使用的最佳電泳條件，如聚合物濃度，pH，溫度，電壓，變性劑的濃度依賴許多因素，包括要被分離的化合物的大小範圍，其組合物和類似物質。本發明的相應應用需要標準的預實驗以優化特殊分離的條件。
在電泳分離的過程中或之後，電泳標記被檢測或通過記錄螢光信號和被分離化合物的遷移時間(或遷移距離)，或通過對相對螢光和電泳標記的遷移順序(如電泳圖譜)作圖來鑑定。為了實施這種檢測，電泳標記可通過標準的方法進行發光，如高密度水銀蒸汽燈，雷射等。典型地，電泳標記可通過He-Ne雷射發生器或固態二極體雷射發生器產生的雷射來發光。然後通過感光檢測儀來檢測螢光信號，如光電倍增管，電荷耦合裝置或類似裝置。電泳檢測系統的實例的描述見美國專利5,543,026；5,274,240；4,879,012；5,091,652；6,142,162；或類似專利。
反應完成後，現在就可分析混合物，其中反應的監測可通過，例如監測信號的改變，如上所述的螢光，或取出等分樣品測定總游離的e-標記報告子。依靠儀器，可使用相同光源激發，在不同的可檢測標記上發光的1至4個不同的螢光劑。經改良，可獲得5個或更多的不同螢光劑，其中需要其他的光源。電化學檢測的描述見美國專利6,045,676。
在一個實施例中可通過包含在e-標記部分中的螢光標記檢測每種裂解的e-標記報告子的存在。分離標記e-標記報告子混合物典型地可採用電分離法來進行，該法涉及應用電場在液體中分離組分，優選應用動電學(動電流)或電泳流，或組合應用電泳流和電滲流，將e-標記報告子混合物分離成單個的餾分或條帶。電分離包括在遷移率不同的電場中遷移和分離分子。電分離的多種形式包括，作為實例而非限制，自由區帶電泳，凝膠電泳，等電聚焦，等速電泳，毛細管電色譜，和膠束動電色譜。毛細電泳包括電分離，優選通過動電流，包括電泳，雙電泳和/或電滲流，在試管或橫截面尺寸為大約1至200微米，通常為大約10至大約100微米的槽道中進行。毛細管可以是一個長的獨立毛細管或是圓晶片或由矽，石英，玻璃或塑料組成的膜上的槽道。
在毛細管電分離中，含有e-標記報告子的一等分反應混合物進行電分離，將此等分引入至電分離槽道中，該槽道是毛細管裝置的一部分或與其相連接，擴增和其他反應在所述裝置中進行。然後電位施加於槽道中包含的導電介質，實現化合物中組分的遷移。根據本領域中熟悉的經驗，通常施加的電位足以電分離所需的組分。在本領域中的專業技術人員將能夠確定本發明中使用的一組指定試劑的合適電位和/或已裂解標記的特性，反應介質的特性等等。電分離的參數包括介質和電位的參數，通常被優化以最大可能的分離所需的組分。這可採用經驗來確定，並包含在專業技術人員理解的範圍之內。
對於均一性測定，樣品、第一個和電泳探針、以及輔助試劑被組合在支持連接區裂解的反應混合物中。混合物被加工，從混合物的其他組分中分離出e-標記報告子。然後含有或不含有e-標記報告子富集物的混合物通常被轉移至一個電泳裝置中，通常是一個微流體或毛細電泳裝置和電泳分離所需要的被修飾的介質。在此期望從分離槽道中去除整個e-標記報告子分子，當e-標記報告子被釋放時，配體結合在不被釋放的e-標記報告子上。可選擇地，通過加入與e-標記報告子具有相反電荷的互補結合分子，使得總電荷與e-標記報告子的電荷相反，這些分子將向與所釋放的e-標記報告子分子相反的電極遷移。例如，可使用生物素和抗生物素蛋白鏈菌素，其中鏈菌素攜帶正電荷。在肽類分析物中，一個實施例將在一個位點上含有裂解點，其中配體仍然存在於肽類分析物中。例如，可含有取代蛋氨酸甲基的e-標記部分。使用修飾蛋氨酸的吡唑酮，可結合存在的賴氨酸。吡唑酮的氨基可用生物素取代。然後可用溴化氰進行裂解，釋放e-標記報告子，但生物素保留在肽和任何未從結合分子中釋放的e-標記部分中。然後對於分析物或靶結合部分，使用親和素來改變極性或分離與靶結合部分交聯的e-標記部分。
對於毛細電泳，可使用一種或多種檢測區帶來檢測被分離的裂解標記。當然根據反應，遷移率修飾部分等特性使用幾種檢測區帶是包含在本發明的範圍之內的。可以是與單個槽道或多個槽道相關的任何數目的檢測區帶。可用於檢測區帶的適合的檢測儀包括，例如光電倍增管，光電二極體陣列，雪崩光電二極體，線性和陣列電荷耦合裝置(CCD)晶片，CCD照相機組件，螢光分光光度計和類似裝置。激發源包括，例如濾光燈，LED，雷射二極體，氣態，液態和固態雷射等。檢測方法是雷射掃描激發，CCD照相檢測，共軸纖維光學，以單個或陣列構型的共焦反向或正向螢光檢測，和類似方法。
檢測可以使用與毛細電泳柱相關的任何已知方法，包括的方法見美國專利5,560,811(11欄，19-30列)，4,675,300，4,274,240和5,324,401，相關的公開書在此合併為參考文獻。電泳領域中的專業技術人員能識別的電位或能使用的場強範圍很寬，例如可使用的場強為10至1000V/cm，更典型地為大約200至大約600V/cm。市售系統的電壓上限為大約30kV，毛細管長度為大約40至60cm，產生的最大場為大約600V/cm。對於DNA，典型地毛細管被包被以降低電滲流，毛細管的注射末端仍保持負電位。
為了便於檢測，整個儀器用光學透明的塑料物質裝配起來，通常允許的光的波長範圍是從大約180至大約1500nm，通常為大約220至大約800nm，更普遍的是大約450至大約700nm，傳導損失較少。合適的物質包括熔融石英，塑料，石英，玻璃等。
使用e-標記試劑的試劑盒為了方便，本發明中在試劑盒中以整包裝組合的形式提供了預定量的試劑。多肽分析的一個實例試劑盒，在整包裝的組合中包括含有一個致裂解部分的第一種試劑和一個可與多肽上結合位點結合的結合試劑，該多肽已經經歷了翻譯後修飾。試劑盒進一步包括一種或多種電泳探針，該探針含有一個與e-標記報告子可裂解連接的特殊多肽的特異結合試劑。例如，每個e-標記探針可包括一個多肽結合部分，如與e-標記部分可裂解連接的一種抗體。每個e-標記探針的遷移率修飾部分所具有的遷移率可將e-標記報告子與其他區分開，並且對目的特殊蛋白是唯一的。試劑盒將包括至少大約1個，通常至少大約10個，更普遍至少大約20個，經常至少大約50個或更多不同的可產生e-標記報告子的探針，這些報告子可通過其遷移率被分離。另一方面，當多肽本身被特異的切斷產生e-標記部分，試劑盒包括一些試劑，其中為了與特異的裂解e-標記部分結合，每種試劑包含與該部分連接的檢測部分。
試劑盒進一步包括一種裝置，可進行毛細電泳以及需要激活裂解誘導試劑的致裂解部分的試劑。試劑盒進一步包括多種緩衝液，其中一些含有一種或多種上述試劑。
試劑盒中各種試劑的相對含量變化的範圍很寬，以便為達到本發明的目標提供所需的濃度。在適當的環境下，試劑盒中的一種或多種試劑可以乾粉被提供，通常是凍幹的，包括賦形劑，溶解時可提供含有適當濃度的試劑溶液，以便進行根據本發明的方法或測定。每種試劑被包裝在單獨的容器中或一些試劑被混合在一個容器中，其中可允許有交叉反應性和一定的儲存時間。試劑盒也可包含根據如上所述的本發明的說明書。
實施例本發明進一步通過下面的綜合推理和說明實例而證明。如果未特別說明，等分和百分比用重量來計算。如果未特別說明，溫度用攝氏度(℃)表示。下面的設備和實例是為了說明本發明而非限制其範圍。如果未特別說明，下面實例中所使用的肽類採用自動合成儀通過合成製備，用凝膠電泳或HPLC純化。
下列縮寫的含義如下Tris HCl-Tris(羥甲基)氨基甲烷-HCl(10x溶液)，購自BioWhittaker，Walkersville，MDHPLC-高效液相色譜
TLC-薄層色譜BSA-牛血清白蛋白，如可購自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，或類似的試劑供應商。
EDTA-乙二胺四乙酸，購自Sigma Chemical Companyg-克mM-毫克分子FAM-羧基螢光素EMCS-N-ε-馬來酸亞胺辛氧基-琥珀醯亞胺酯EDC-1-Ethyl-3-(3二甲基氨丙基)碳化二亞胺NHS-N-羧基琥珀醯亞胺DCC-1，3-二環己基碳化二亞胺DMF-二甲基甲醯胺Fmoc-N-(9-芴基甲酯基)-實施例1光敏劑分子和檢測試劑的接合光敏劑分子與金屬親和劑，含硼酸試劑，主幹分子和類似物通過多種常規的方法和構型交聯。例如，活化的(NHS酯，醛，磺醯氯等)光敏劑(玫瑰紅，酞菁等)可與含反應性氨基部分(氨基葡聚糖，含氨基試劑(含適當保護基團的金屬結合位點)，其他小和大的分子)反應。在多種測定實驗中直接使用已形成的交聯物(例如抗體-光敏劑交聯物，生物素-LC-光敏劑等)。已形成的交聯物也可進一步與抗體結合(例如，含有20-200個光敏劑和200-500個氨基的氨基葡聚糖-光敏劑交聯物可與高碘酸鹽氧化的抗體分子結合，產生抗體-葡聚糖-光敏劑交聯物)或與抗體和顆粒結合。例如，含有20-200個光敏劑和200-500個氨基的氨基葡聚糖-光敏劑交聯物與羧化聚苯乙烯微珠通過EDC耦合化學法結合在一起，形成光敏劑-氨基葡聚糖-顆粒交聯物。將光敏劑插入至顆粒中的方法見美國專利第5,340,716。然後Na-高碘酸鹽氧化抗體分子與氨基葡聚糖分子的氨基在硼氫化氰鈉存在的情況下反應，產生抗體-葡聚糖-光敏劑-顆粒交聯物，在此稱為「光敏劑微珠」。應該注意的是除了抗體分子，也可使用親和素或其他分子。
實施例2e-標記部分的接合和e-標記報告子的釋放圖14總結了e-標記部分與抗體或其他結合部分與游離氨基交聯的方法學，得到的交聯物與單態氧反應產生亞磺酸部分，稱為釋放的e-標記報告子。圖15A-J顯示了幾個e-標記試劑，大多數使用5-或6-羧基螢光素(FAM)作為起始物質。
實施例3製備Pro2，Pro4和Pro6至Pro13圖16A中描述的圖表顯示了製備羧基螢光素來源的e-標記部分的5步步驟，這些部分稱為Pro2，Pro4，Pro6，Pro7，Pro8，Pro9，Pro10，Pro11，Pro12，和Pro13。第一步5-或6-FAM與N-羧基琥珀醯亞胺(NHS)和1，3-二環己基碳化二亞胺(DCC)在DMF中反應，獲得相應的酯，然後用多種二胺處理產生所需的醯胺，即化合物1。用N-琥珀醯亞胺碘乙酸酯處理化合物1產生所期望的碘乙醯胺衍生物，不分離但進一步在三乙胺的存在下與3-巰基丙酸反應。最後，如上所述得到的β-硫代酸(化合物2)被轉變為其NHS酯。以5-或6-FAM和其中一種二胺開始合成多種e-標記部分。在圖16A的第一個反應中二胺被指定為H2N^X^NH2。FAM的區位異構體和二胺內的化學個體「X」在下表的每個合成的e-標記部分中被顯示。很明顯，二胺，X，如上所述在討論遷移率修飾部分時，可具有很寬範圍的其他形式。
e-標記部分FAMXPro25-FAMC(CH3)2Pro45-FAM無碳原子Pro65-FAM(CH2)8Pro75-FAMCH2OCH2CH2OCH2Pro85-FAMCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2Pro95-FAM1，4-苯基Pro10 6-FAMC(CH3)2Pro11 6-FAM無碳原子Pro12 6-FAMCH2OCH2CH2OCH2Pro13 6-FAMCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2化合物1的合成向5-或6-羧基螢光素(0.5mmol)在無水DMP(5mL)的攪拌溶液中加入N-羥基琥珀醯亞胺(1.1當量)和1，3-二環己基碳化二亞胺(1.1當量)。在大約10分鐘後，開始形成白色的固體(二環己脲)。反應混合物在室溫下在氮氣中攪拌過夜。TLC(9∶1CH2Cl2-MeOH)顯示起始物質已經完全消失。
上述混合物的上清液被逐滴加入至二胺(2-5當量)在DMF(10mL)的攪拌溶液中。來自TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)的證據表明，反應瞬間就完成了。在降低壓力的條件下去除溶劑。得到的殘基在Iatrobeads silica上的閃爍色譜產生了58-89％產量的目的胺(化合物1)。化合物1的1H NMR(300MHz，DMSO-d6)與指定的結構一致。
化合物2的合成向胺(化合物1)(0.3mmol)中順序加入無水DMF(10mL)和N-琥珀醯亞胺碘乙酸酯(1.1當量)。得到的混合物在室溫下被攪拌直至獲得清亮的溶液。TLC(40∶9∶1CH2Cl2-MeOH-H2O)表明反應已結束。
然後上述反應溶液用三乙胺(1.2當量)和3-巰基丙酸(3.2當量)處理。混合物在室溫下攪拌過夜。在降低壓力的條件下去除溶劑，然後通過閃爍色譜得到62-91％產量的β-硫代酸(化合物2)。根據其1NMR(300MHz，DMSO-d6)指定化合物2的結構。
合成Pro2，Pro4，和Pro6至Pro13向β-硫代酸(化合物2)(0.05mmo1)在無水DMF(2mL)的攪拌溶液中加入N-羥基琥珀醯亞胺(1.5當量)和1，3-二環己基碳化二亞胺(1.5當量)。混合物在室溫下在氮氣中攪拌24-48小時(直至所有起始物質均反應)。反應混合物在降低壓力的條件下被濃縮，然後通過閃爍色譜純化得到41-92％產量的靶分子。
製備Pro1本反應的化合物在圖16B中顯示。向5-碘乙醯胺螢光素(化合物4)(24mg，0.047mmol)在無水DMF(2mL)的攪拌溶液中加入三乙胺(8μL，0.057mmol)和3-巰基丙酸(5μL，0.057mmol)。得到的溶液在室溫下攪拌1.5小時。TLC(40∶9∶1CH2Cl2-MeOH-H2O)表明反應已完成。隨後，加入N-羥基琥珀醯亞胺(9mg，0.078mmol)和1，3-二環己基碳化二亞胺(18mg，0.087mmol)。反應混合物在室溫下在氮氣中攪拌19小時，此時TLC顯示起始物質完全消失。在降低壓力的條件下去除溶劑，隨後採用25∶1和15∶1 CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑進行閃爍色譜獲得Pro1(23mg，83％)。
製備Pro3本反應的化合物在圖16C中顯示。向6-碘乙醯胺螢光素(化合物5)(26mg，0.050mmol)在無水DMF(2mL)的攪拌溶液中加入三乙胺(8μL，0.057mmol)和3-巰基丙酸(5μL，0.057mmol)。得到的溶液在室溫下攪拌1.5小時。TLC(40∶9∶1CH2Cl2-MeOH-H2O)表明反應已完成。隨後，加入N-羥基琥珀醯亞胺(11mg，0.096mmol)和1，3-二環己基碳化二亞胺(18mg，0.087mmol)。反應混合物在室溫下在氮氣中攪拌19小時，此時TLC顯示起始物質完全消失。在降低壓力的條件下去除溶劑，隨後採用30∶1和20∶1 CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑進行閃爍色譜獲得Pro3(18mg.61％)。
製備Pro5本反應的化合物在圖16D中顯示。
合成化合物7向5-(溴甲基)螢光素(化合物6)(40mg，0.095mmol)在無水DMF(5mL)的攪拌溶液中加入三乙胺(15μL，0.108mmol)和3-巰基丙酸(10μL，0.115mmol)。得到的溶液在室溫下攪拌2天。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)表明反應已完成。反應溶液在降低壓力的條件下被蒸發乾燥。最後應用30∶1和25∶1 CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑進行閃爍色譜獲得β-硫代酸(化合物7)(28mg，66％)。
合成Pro5向酸(化合物7)(27mg，0.060mmol)在無水DMF(2mL)的溶液中加入n-羥基琥珀醯亞胺(11mg，0.096mmol)和1，3-二環己基碳化二亞胺(20mg，0.097mmol)。反應混合物在室溫下在氮氣中攪拌2天，此時TLC(9∶1 CH2Cl2-MeOH)顯示起始物質完全消失。在降低壓力的條件下去除溶劑，隨後使用30∶1 CH2Cl2-MeOH進行閃爍色譜獲得Pro5(24mg，73％)。
製備Pro14本反應的化合物在圖6E中顯示。
合成化合物9向5-氨基乙醯胺螢光素(化合物8)(49mg，0.121mmol)中順序加入無水DMF(4mL)和N-琥珀醯亞胺碘乙酸酯(52mg，0.184)。得到清亮的溶液，TLC(40∶9∶1CH2Cl2-MeOH-H2O)表明起始物質完全消失。
然後上述的反應溶液用三乙胺(30μL，0.215mmol)和3-巰基丙酸(30μL，0.344mmol)處理。得到的混合物攪拌2小時。在降低壓力的條件下去除溶劑，然後使用20∶1和15∶1 CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑進行閃爍色譜得到β-硫代酸(化合物9)(41mg，62％)。根據1NMR(300MHz，DMSO-d6)指定結構。
合成Pro14向化合物9(22mg，0.04mmol)在無水DMF(2mL)的攪拌溶液中加入N-羥基琥珀醯亞胺(9mg，0.078mmol)和1，3-二環己基碳化二亞胺(16mg，0.078mmol)。得到的溶液在室溫下在氮氣中攪拌大約24小時。反應混合物在降低壓力的條件下被濃縮，使用30∶1和20∶1 CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑通過閃爍色譜純化殘餘物得到Pro14(18mg，70％)。
合成Pro15，Pro20，Pro22和Pro28產生電泳標記Pro15，Pro20，Pro22和Pro28的NHS酯的合成圖分別在圖16F-I中顯示。所有的試劑和反應條件在本領域中是常規的，其實施與如上所述反應類似。
實施例4蛋白分析的e-標記報告子檢測A.用e-標記部分和生物素標記氨基葡聚糖(MW～500,000)氨基葡聚糖可作為一種模型，可用來證實與高分子量分子相關的e-標記報告子的釋放，也可作為蛋白的模型。10mg氨基葡聚糖的氨基數目計算為2×10-8摩爾。對於1∶4的生物素和e-標記部分的比例，所使用的生物素NHS酯的摩爾數目為1.85×10-6，馬來醯亞胺NHS酯的摩爾數為7.4×10-6。10.9mg氨基葡聚糖溶解在6mL0.1％PBS緩衝液中。10mg生物素-x-x NHS酯和23.7mg EMCS一起溶解在1mLDMF中，並以30分鐘的間隔50μL的量加入至氨基葡聚糖中，並不斷攪拌和避光。最後加入DMF溶液後，混合物保持過夜(同時攪拌和避光)。然後，混合物用分子量分離點為10,000道爾頓的膜進行透析。膜在含有2L水的燒杯中浸泡，同時攪拌。以2小時的間隔換水四次。膜在水中保留過夜(同時攪拌並避光)。然後溶液被凍幹，凍幹的粉末用來進行e-標記標記。
B.生物素和馬來醯亞胺標記的氨基葡聚糖與SAMSA部分的反應SAMSA[5-(((2-(和-3)-S-乙醯巰基)琥珀醯)氨基)螢光素]用作e-標記部分與氨基葡聚糖分子中的馬來醯亞胺反應。為此，0.3mg(～5.3×10-9摩爾)氨基葡聚糖標記的生物素和EMCS溶解在10μl水中。1.1mg SAMSA(～1.2×10-6摩爾)溶解在120μL 0.1M NaOH中，並在室溫下孵育15分鐘(為了活化硫醇基)。然後，加入2μL 6MHCl中和過量的NaOH，加入30μL磷酸緩衝液(200mM，pH 7.0)將溶液的pH調整至7.0。活化的SAMSA溶液加入至10μL標記的氨基葡聚糖溶液中，並孵育1小時。E-標記部分標記的氨基葡聚糖使用Sephadex G-25(Amersham)進行凝膠過濾純化，並收集純化的樣品。
C.從標記的氨基葡聚糖中釋放e-標記報告子2μL抗生蛋白鏈菌素標記的光敏劑微珠(100μg/mL)在黑暗的環境中輕輕地加入至5μL純化的標記氨基葡聚糖中，並在黑暗環境中孵育15分鐘。然後溶液在680nm照射1分鐘。使用CE2LabCardTM裝置(ACLARA BioSciences，MountainView，CA)通過CE檢測e-標記報告子的釋放。如在圖17A中所示，CE2LabCard 1包括兩部分蒸發控制和注射/分離。蒸發控制包括一個蒸發控制管道2(450μm寬和50μm深)，以及兩個補給緩衝液池3(直徑2mm)，蒸發控制樣品孔4(直徑1mm)位於蒸發控制管道的中間。當樣品孔的體積僅為1.2μL時，補給緩衝液池的體積是4.7μL，在樣品孔中央下面的管道2的體積大約為40nL。CE2的第二部分，用來進行注射和分離，包括一個注射微管道5和分離微管道6，在連接7處相交叉，其規格為120μm寬和50μm深。分離管道的兩個末端或與注射管道與緩衝液池8連接，而注射管道的第二個末端與蒸發控制樣品孔4直接連接。管道的封閉是通過將一層膜(MT40)覆蓋在LabCardTM上。檢測儀9距離連接10mm。用分離緩衝液(20mM HEPES，pH 7.4 and 0.5％PEO)注滿CE2LabCard裝置後，300nL檢測混合物加入至樣品孔4中。如圖17B所示通過加電壓於緩衝液池將樣品注射進微管道連接7中。然後如圖17C所示分離樣品。
圖18顯示了含有和不含有光敏劑微珠的標記氨基葡聚糖的純化電泳圖譜。加入光敏劑微珠，使用光敏劑在680nm下照射產生的單態氧可使e-標記報告子從氨基葡聚糖中釋放。實驗條件為分離緩衝液20mM HEPES pH 7.4，0.5％PEO；如圖17所述配置電壓；檢測混合物含有29(μg/ml)抗生蛋白鏈菌素標記的光敏劑微珠，並採用680±10nm濾光片和150W燈在680nm照射1分鐘。如所顯示的，加入光敏劑微珠，使用光敏劑在680nm下照射產生的單態氧可使e-標記報告子從氨基葡聚糖中釋放。為了優化照射時間，含有光敏劑微珠的反應混合物被照射不同的時間長度，從1分鐘至10分鐘。照射時間長於1分鐘，e-標記報告子的釋放沒有明顯的增加。
圖19顯示了光敏劑微珠濃度對e-標記報告子釋放的影響。圖表顯示使用不同濃度的光敏劑微珠對純化的標記氨基葡聚糖的分離。較高濃度光敏劑微珠可使更多的e-標記報告子從標記的氨基葡聚糖中釋放出來。實驗條件分離緩衝液20.0mM HEPES pH 7.4，0.5％PEO；如圖17所述配置電壓；使用680±10nm濾光片和150W燈在680nm照射檢測混合物1分鐘。
圖20描繪了e-標記報告子與光敏劑微珠濃度函數的線性標準曲線。使用CE2LabCard獲得結果。實驗條件分離緩衝液20.0mM HEPES pH 7.4，0.5％PEG；如圖17所述配置電壓；使用680±10nm濾光片和150W燈在680nm照射檢測混合物1分鐘。
另外，標記氨基葡聚糖濃度對e-標記報告子釋放的影響也可被檢測，結果在圖21顯示。如該圖所示，對於給定濃度的光敏劑微珠，低濃度的標記氨基葡聚糖可更有效的使e-標記報告子釋放(或釋放的e-標記報告子與標記氨基葡聚糖量的比例更高)。使用CE2LabCard獲得結果。實驗條件分離緩衝液20.0mM HEPES pH7.4，0.5％PEO；如圖17所述配置電壓；檢測混合物含有29ug/ml光敏劑微珠，並使用680±10nm濾光片和150W燈在680nm照射檢測混合物1分鐘。
實施例5蛋白分析的e-標記報告子檢測A.e-標記部分與抗體的接合採用兩種不同的方法進行結合。第一種方法包括e-標記部分與抗體的直接結合，第二種方法包括e-標記部分與葡聚糖結合，然後與抗體結合。
(A1)e-標記部分與抗體的直接接合用NHS酯末端合成e-標記部分，該末端可與抗體的伯胺反應形成穩定的醯胺連接。這樣使e-標記部分在抗體的表面上隨機結合。典型地每個抗體分子中含有6至12個NHS酯修飾的分子不會導致抗原結合活性的降低。即使NHS酯與抗體更高的比例也可能僅有輕微的活性損失。
步驟1.純化的人IgG(購自Sigma-Aldrich)在1X PBS中稀釋為2mg/ml(0.1M磷酸鈉，0.15M Nad，pH 7.2)。
2.含有e-標記部分的NHS酯溶解在DMF(二甲基甲醯胺)，終濃度在10至20nmols/μl DMF之間。
3.500μL稀釋的人IgG(6.5nmol)與1，5，25，或50μl e-標記部分(分別為14，68，340，和680nmols)混合。
4.溶液在黑暗環境中在冰上反應2小時。
5.e-標記部分結合的抗體在0.1X PBS(10mM磷酸鈉，15mM NaCI，pH 7.2)中4℃下透析20小時進行純化。
(A2)e-標記部分-葡聚糖與抗體的接合在第二個實例中，e-標記部分首先與含胺的葡聚糖如上所述通過醯胺連接結合。多克隆和一些單克隆抗體在抗體的Fc部分中含有碳水化合物。這些多糖可被高碘酸鹽氧化，形成可反應的醛殘基。含有氨基葡聚糖的e-標記部分然後與氧化抗體的醛殘基通過形成希夫氏鹼而結合。這種連接通過用氰氫硼化鈉還原成仲胺連接而進一步穩定。
含有50至500個可連接e-標記部分的氨基的巨大氨基葡聚糖(分子量為500,000)可明顯增加每個抗體上e-標記部分的數目，可引起信號的放大。因為葡聚糖通過碳水化合物結合在抗體Fc部分上，因此可足以從不參與活性的抗原結合位點上被去除。
e-標記部分與氨基葡聚糖接合的步驟1.氨基葡聚糖(分子量500,000，500胺/摩爾葡聚糖)溶解在90％DMF中，終濃度為2mg/ml(2nmol胺/μl)。
2.含有e-標記部分的NHS酯溶解在DMF(二甲基甲醯胺)，終濃度在10至20nmols/μl DMF中。
3.500μl氨基葡聚糖(1000nmol胺)與500，1000，或2000nmol e-標記部分混合。
4.溶液在黑暗環境中在冰上反應2小時。
5.e-標記部分結合的氨基葡聚糖在0.1X PBS(10mM磷酸鈉，15mM NaCI，pH7.2)中4℃透析20小時進行純化。
6.14,000xg離心5分鐘去除沉澱物。
用高碘酸鈉氧化抗體的步驟1.500μl(2.8mol)純化的抗人IL-4多克隆抗體(購自Pierce)在10mM高碘酸鈉(Aldrich)中被氧化。
2.溶液在室溫下在黑暗環境中反應30分鐘。
3.加入乙二醇至終濃度100mM，在室溫下孵育10分鐘。
4.氧化的抗體在0.1X PBS(10mM磷酸鈉，15mM Nad，pH 7.2)中4℃透析2小時進行純化。
被高碘酸鹽氧化的抗體與含有氨基葡聚糖的e-標記部分的接合步驟1.54μl(300pmol)氧化的抗人IL-4多克隆抗體與300pmol e-標記部分結合的氨基葡聚糖在200mM碳酸鈉，pH 9.5中混合。
2.溶液在室溫下在黑暗的環境中反應2小時。
3.加入硼氫化氰鈉(1N NaOH中新鮮製備)至終濃度為50mM，在室溫下反應30分鐘。
4.加入50mM乙醇胺，pH 9.6阻斷未反應的醛，在室溫下反應30分鐘。
5.結合物在0.1X PBS(10mM磷酸鈉，15mM NaCI，pH 7.2)4℃下透析20小時進行純化。
B.從標記的氨基葡聚糖中釋放e-標記報告子使用的步驟和裝置與上述的SAMSA e-標記部分基本上一樣。使用ABI310分離了總共8個e-標記報告子。分離條件如下50微米毛細管，47cm長，末端至檢測端為36cm；分離緩衝液，POP-6(PE Biosystems)；3.0kV注射60秒；分離電壓，9.4kV。結果在圖22的電泳圖譜中描繪。
C.用與e-標記部分接合的抗體進行免疫測定實施上述的結合e-標記部分建立的兩種免疫測定法(直接和間接或夾心)。
(C1)細胞因子的夾心免疫測定實施夾心免疫測定(圖23)。該測定可定性和定量已知的細胞因子抗原。在這個測定中，匹配的抗體對圍繞細胞因子抗原形成夾心，使兩個抗體靠近。這些抗體的其中之一與e-標記部分結合產生e-標記探針。
e-標記探針有一個單態氧不穩定連接，可在與單態氧反應後釋放e-標記報告子。第二個抗體與一個光敏劑染料結合，該染料可在680nm被照射時可產生單態氧。由於單態氧的半衰期相對較短，因此僅當兩個抗體形成夾心時，單態氧才可以切斷e-標記探針的可裂解連接。
細胞因子夾心免疫測定的步驟1.10μl檢測緩衝液(0.1X PBS，40mg/ml BSA)與1μl(100nM)生物素標記的抗人IL-4單克隆抗體(購自Pierce，目錄號M-450-B)和濃度範圍從0至500nM的1μl細胞因子IL-4(Pierce，目錄號R-IL-4-5)混合。
2.反應在室溫下進行30分鐘。
3.加入5μl 100μg/ml抗生蛋白鏈菌素標記的光敏劑微珠，混合物在室溫下在黑暗環境下孵育15分鐘。
4.為去除e-標記探針與抗生蛋白鏈菌素的非特異性相互作用，加入2μl 5μM生物素-DNP，在室溫下在黑暗環境中孵育10分鐘。
5.1μl 400nM結合氨基葡聚糖e-標記部分的抗人IL-4多克隆抗體，在室溫下黑暗環境中孵育30分鐘。
6.然後使用150瓦光源，680DF±20nm的光學濾光片照射反應混合物30秒。
7.然後加入1μl ROX T8標準品，1∶20(購自PE Biosystems)，通過毛細電泳在ABI310或ACLARA plastic LabCard(ACLARA BioSciences，Inc.Mountain View，CA)上分離釋放的e-標記。
8.在ABI310已釋放的e-標記報告子的分離條件如下50μm毛細管，47cm長，末端至檢測端為36cm；分離緩衝液，POP-6；在3.0kV注射60秒；分離電壓9.4kV。e-ta g報告子Pro1測定IL-4的結果見圖24。
對於多種細胞因子和多種e-標記部分重複上述的步驟如下使用e-標記部分Pro10研究DL-6，結果在圖25中顯示。使用e-標記部分Pro8研究IFNγ，結果在圖26中顯示。使用e-標記部分Pro7研究TNFα，結果在圖27中顯示。使用e-標記部分Pro4研究IL-10，結果在圖28中顯示。使用e-標記部分Pro2研究IL-8，結果在圖29中顯示。
如下與其他細胞因子的雙重反應研究IL-4IL-4和IL-6，IL-4和IL-8，IL-4和TNFα，IL-4和IFNγ。結果在圖30中顯示。進行5種細胞因子的多重測定(IL-4，IL-6，IL-8，TNFα，和IFNγ)，結果在圖31中顯示。進行6種細胞因子的多重測定(IL-4，IL-6，DL-8，IL-10，TNFα，和IFNγ)，結果在圖32中顯示。
(C2)IgG的直接免疫測定在直接免疫測定中，IgG抗原與e-標記部分結合形成e-標記探針。E-標記探針有一個單態氧不穩定連接，可在與單態氧反應後可釋放e-標記報告子。抗體與一種光敏劑染料結合，該染料當在680nm被照射時可產生單態氧。由於單態氧具有相對較短的半衰期，僅當兩個抗體結合時，單態氧才可切斷可裂解的連接以釋放e-標記報告子(圖33)。
人IgG直接免疫測定的步驟1.10μl檢測緩衝液(0.1X PBS，40mg/ml BSA)與1μl(100nM)生物素標記的抗人IgG抗體和濃度範圍從0至500nM的e-標記部分標記的1ul人IgG(購自Sigma)混合。
2.反應在室溫下反應30分鐘。
3.加入5μl 100μg/ml抗生蛋白鏈菌素標記的光敏劑微珠，混合物在室溫下黑暗環境中孵育15分鐘。
4.然後反應混合物使用150瓦光源和680DF±20nm的光學濾光片照射30秒。
5.然後加入1μl ROX T8標準品，已釋放的e-標記報告子通過毛細電泳在ABI310或ACLARA plastic LabCard上被分離。
不同濃度的人IgG的結果在圖34顯示。標準曲線在圖35中顯示。
從在此的結果中表明，本發明提供了有效的方式來製備用於多重測定中的組合物和採用這種組合物進行多重測定的方法。用來進行蛋白同源和異源測定的方法作為其他類型化合物的實例。
從上面的結果可進一步表明本發明提供了一個準確，有效和敏感的過程，以及用於這些過程的組合物，來進行多重反應。提供的步驟有很大的可調整性，其中可進行測定，並可用於很多情況下，包括半抗原，抗原，核酸，細胞等，其中可同時在單個或多個樣品上進行許多種測定，並分析樣品中的多個事件。測定的結果很容易使用電泳或質譜儀簡單的讀取。自動記錄的結果提供給系統，其中在加入樣品和試劑後，整個過程可在數據處理器的控制下進行。
在此說明書中引用的所有出版物和專利申請書在此合併為參考文獻，只要每篇出版物或專利申請書特別地和個別地被指明合併為參考文獻。
儘管前面所述的發明已經通過例證和實例詳細地描述，目的是為了加深理解，但對本領域的普通專業技術人員來說很明顯是在本發明的教導範圍內，即可據此進行某種改變和修飾，並不背離附錄的權利要求的精神或範圍。
權利要求
1.在懷疑含有靶多肽的標本中檢測一種或多種靶多肽存在或不存在的方法，該方法包括以下步驟提供種類特異的試劑和一種或多種電泳探針，種類特異的試劑具有有效接近範圍的致裂解部分和對一種或多種靶多肽的翻譯後修飾特異的第一種結合劑，每一種具有對靶多肽特異的結合部分的一種或多種電泳探針和每一個上附著在其上的通過可裂解連接的一種或多種電泳標記；混合標本、種類特異的試劑和一種或多種電泳探針，使種類特異的試劑和一種或多種電泳探針結合到一種或多種靶多肽上，且一種或多種電泳探針中的至少一個可裂解連接在有效接近致裂解部分的範圍內，使得一種或多種電泳標記被釋放；電泳分離釋放的電泳標記；和根據存在或不存在釋放的電泳標記檢測存在或不存在一種或多種靶多肽。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的一種或多種靶多肽是多個靶多肽。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述的致裂解部分是可以產生活性核素的感光劑。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的感光劑是光敏劑，所述的可裂解連接是氧化不穩定的連接，所述的活性核素選自過氧化氫，羥基，過氧化陰離子，苯氧基，和單態氧。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述的活性核素是單態氧。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述種類特異試劑的所述結合劑選自抗體，蛋白受體，蛋白受體的配體，植物血凝素，含生物素部分，含硼酸部分，適配子，酶底物，酶輔因子，和酶亞單位，其中所述電泳探針的所述結合部分是抗體或結合抗體的組合物。
7.根據權利要求5所述的方法，其中所述的翻譯後修飾選自磷酸化，糖基化，核糖基化，乙醯化，醯化，甲基化，脂化，異戊二烯化和泛素化。
8.根據權利要求5所述的方法，其中所述的多個靶多肽在2至100範圍內。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述的多個靶多肽在5至50範圍內。
10.根據權利要求5所述的方法，其中所述的光敏劑選自卟啉，酞花青，螢光素染料的滷化衍生物，若丹明染料的滷化衍生物，和水楊酸萘酯花青。
11.根據權利要求5所述的方法，其中所述的可裂解連接包括烯烴，硫醚，硒醚，噻唑，唑，或咪唑。
12.根據權利要求5所述的方法，其中所述的電泳探針被定義為如下結構式T-(L-E)k其中T是對靶多肽特異的結合部分，L是氧化不穩定的連接，E是電泳標記，k是大於或等於1的整數。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述的L選自烯烴，硫醚，硒醚，噻唑，唑，和咪唑。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述的E是分子量在大約150至2500道爾頓範圍內的螢光的、水溶性有機化合物。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述的E為(M，D)形式，其中D是螢光染料，其中M是遷移率修飾部分，它是一個鍵或直至100個除氫外選自碳，氧，氮，磷，硼，和硫原子的有機分子。
16.根據權利要求12所述的方法，其中所述的電泳標記E被定義為以下結構式A-M-D其中A是-C(＝O)R，其中R是具有1至8個碳原子和0至4個雜原子的脂肪族、芳香族、脂環族或雜環，雜原子選自O、S和N；-CH2-C(＝O)-NH-CHO；-SO2H；-CH2-C(＝O)O-CHO；-C(＝O)NH-(CH2)n-NH-C(＝O)C(＝O)-(C6H5)，其中n在2至12範圍內；D是螢光染料；和M是一個鍵或直至100個除氫外選自碳，氧，氮，磷，硼，和硫原子的有機分子，，以E的總分子量在大約150至大約5000道爾頓範圍內為限。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述的D是螢光素染料。
18.檢測標本中存在或不存在多個靶多肽的試劑盒，該試劑盒含有種類特異的試劑，具有致裂解部分和對一種或多種靶多肽上的翻譯後修飾特異的第一個結合劑；和一種或多種電泳探針，每一個具有對靶多肽特異的結合部分和一種或多種附著有可裂解連接的電泳標記。
19.根據權利要求18所述的試劑盒，其中所述的致裂解部分是光敏劑，所述的可裂解連接是氧化不穩定的連接。
20.根據權利要求19所述的試劑盒，其中所述的第一個結合劑選自結合抗體的組合物，蛋白受體，蛋白受體的配體，植物血凝素，含生物素的部分，含硼酸的部分，適配子，酶底物，酶輔因子，和酶亞單位。
21.根據權利要求20所述的試劑盒，其中所述一種或多種電泳探針的所述結合部分是結合抗體的組合物。
22.根據權利要求21所述的試劑盒，其中所述的一種或多種電泳探針是2至50範圍內的多個探針。
23.根據權利要求22所述的試劑盒，其中每一個不同的電泳探針對不同的靶多肽特異。
24.根據權利要求23所述的試劑盒，其中每一個所述的一種或多種電泳探針被定義為如下結構式T-(L-E)k其中T是所述的對靶多肽特異的結合部分，L是所述的氧化不穩定的連接，E是電泳標記，k是大於或等於1的整數。
25.檢測一種或多種靶多肽的物質組合物，該組合物包括定義為如下結構式的多個電泳探針T-(L-E)k其中T是對靶多肽特異的結合部分，L是可裂解的連接，E是電泳標記，k是大於或等於1的整數，如此多個中的每一個不同的T附著於不同的E，且多個中的每一個E具有不同於多個中其它E的光學特徵和/或電泳遷移率。
26.根據權利要求25所述的組合物，其中所述的L是氧化不穩定的連接，所述的多個在2至500範圍內，E的分子量範圍從150至10,000道爾頓。
27.根據權利要求26所述的組合物，其中所述的電泳探針被定義為如下結構式T-(L-(M，D))k其中T，L和k的定義如上；D是檢測部分；M是一個鍵或由1至100個不包括氫的選自碳，氧，氮，磷，硼和硫原子組成的水溶性有機化合物。
28.根據權利要求27所述的組合物，其中所述的D是螢光標記，發色標記，或電化學標記。
29.根據權利要求28所述的組合物，其中所述的M是選自以下任一的聚合物聚醚，聚酯，多肽，寡糖，聚氨酯，聚醯胺，聚碸醯胺，聚亞碸，聚膦酸酯，以及其嵌段共聚物。
30.根據權利要求29所述的組合物，其中所述的D是螢光素。
31.根據權利要求30所述的組合物，其中所述的螢光素選自5-和6-羧基螢光素，5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二甲氧基-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基螢光素，2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，1′，2′，7′，8′-二苯並-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，1′，2′，7′，8′-二苯並-4′，5′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，和2′，4′，5′，7′-四氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素。
32.根據權利要求27所述的組合物，其中所述的L選自烯烴，硫醚，硒醚，噻唑，唑，和咪唑。
33.根據權利要求27所述的組合物，其中所述的D是D1-g-D2，其中D1和D2之一是能量傳遞受體分子，D1和D2的另一個是能量傳遞供體分子，其中g是具有選擇長度的剛性連接子，使D1和D2之間發生能量傳遞。
34.根據權利要求33所述的組合物，其中所述的D1和D2選自若丹明，螢光素，及其滷化衍生物。
35.根據權利要求27所述的組合物，其中所述的T是結合抗體的組合物。
36.根據權利要求35所述的組合物，其中所述的T是抗體。
37.根據權利要求27所述的組合物，其中所述的M通過耦合2至10個選自以下化合物而構成二甲氧基三苯甲基保護的六乙烯乙二醇氨基磷酸酯，6-(4-單甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，12-(4-單甲氧基三苯甲基氨基)十二烷基-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，2-[2-(4-單甲氧基三苯甲基)氨基乙氧基]乙基-(2-氰基乙基)，N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，(S-三苯甲基-6-巰己基)-(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)-氨基磷酸酯，9-O-二甲氧基三苯甲基-乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，3(4，4′二甲氧基三苯甲氧基)丙烷基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′，2′-二脫氧核糖-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，18-O二甲氧基三苯甲基六乙烯乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，12-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，1.3-雙-[5-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)戊胺]丙烷基-2-[(2-氰基乙基)-(N.N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，1-[5-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)戊醯胺]-3-[5-芴醇甲氧基羰基氧基戊醯胺]-丙烷基-2-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，三-2，2，2-[3-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙烷基)]-氨基磷酸酯，琥珀醯亞胺基-反-4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基酯，琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶二硫)丙酸酯，琥珀醯亞胺基乙醯硫代乙酸酯，琥珀醯亞胺基4-(對-順丁烯二醯亞胺苯基)丁酸鹽；N-γ-順丁烯二醯亞胺丁基-氧基琥珀醯亞胺酯；p-硝基苯基碘代醋酸酯；和4-(4-N-馬來醯亞胺苯基)丁酸醯肼。
38.根據權利要求27所述的組合物，其中所述的多個所述電泳探針在5至100個範圍內。
39.根據權利要求38所述的組合物，其中所述的多個所述電泳探針在10至30個範圍內。
40.檢測標本中存在或不存在靶分子的物質組合物，該組合物包括定義為如下結構式的多個電泳標記A-M-D其中A是-C(＝O)R，其中R是具有1至8個碳原子和0至4個雜原子的脂肪族、芳香族、脂環族或雜環，雜原子選自O、S和N；-CH2-C(＝O)-NH-CHO；-SO2H；-CH2-C(＝O)O-CHO；-C(＝O)NH-(CH2)n-NH-C(＝O)C(＝O)-(C6H5)，其中n在2至12範圍內；D是檢測部分；M是一個鍵或直至100個，除氫外包括碳，氧，氮，磷，硼，和硫的原子的有機分子，以A-M-D的總分子量在大約150至大約5000道爾頓範圍內為限。
41.根據權利要求40的組合物，其中所述的D是螢光標記，發色標記，或電化學標記。
42.根據權利要求41所述的組合物，其中所述的D是螢光標記。
43.根據權利要求42所述的組合物，其中所述的D是螢光素。
44.根據權利要求42所述的組合物，其中所述的D是D1-g-D2，其中D1和D2之一是能量傳遞受體分子，D1和D2的另一個是能量傳遞供體分子，其中g是具有選擇長度的剛性連接子，使D1和D2之間發生能量傳遞。
45.根據權利要求44所述的組合物，其中所述的D1和D2選自若丹明，螢光素，及其滷化衍生物。
47.根據權利要求40所述的組合物，其中所述的D是螢光標記，其中所述的多個所述電泳標記在5至100個範圍內。
48.根據權利要求47所述的組合物，其中所述的多個電泳標記的每一個具有獨特的電荷-質量比或獨特的光學特徵，使得每一個電泳標記在電泳分離上形成可檢測的峰。
49.根據權利要求48所述的組合物，其中所述的D對所述多個電泳標記的每一個是相同的，而其中所述的多個電泳標記的每一個具有獨特的電荷-質量比，使得每一個電泳標記在電泳分離上形成獨特的峰。
50.根據權利要求40的組合物，其中所述的M是選自以下任一的聚合物聚醚，聚酯，多肽，寡糖，聚氨酯，聚醯胺，聚碸醯胺，聚亞碸，聚膦酸酯，以及其嵌段共聚物。
51.根據權利要求50所述的組合物，其中所述的D是螢光素。
52.根據權利要求51所述的組合物，其中所述的螢光素選自5-和6-羧基螢光素，5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二甲氧基-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基螢光素，2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，1′，2′，7′，8′-二苯並-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，1′，2′，7′，8′-二苯並-4′，5′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，2′，7′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素，和2′，4′，5′，7′-四氯-5-和6-羧基-4，7-二氯螢光素。
53.通過硫醚可裂解連接將電泳標記附著到結合部分的組合物，該組合物定義為如下結構式HOOC-R1-S-CH(R4)-C(＝O)-NH-R2-NH-R3其中R1是C1-C10烴二基；R2是C3-C10烴二基；R3是氨保護基團；R4是苯基或電子供體取代的苯基。
54.根據權利要求53所述的組合物，其中所述的氨保護基團是Fmoc，R4是苯基。
55.一種組合物，其含有(a)多個電泳探針，每一個上含有通過能夠與單態氧反應的可裂解連接附著在其上的一個電泳標記；和(b)含有光敏劑的種類特異的試劑，其中所述的光敏劑在激發態能夠將氧激活成其單態。
56.根據權利要求55所述的組合物，其中所述的種類特異的試劑包括一種或多種光敏劑微珠。
57.根據權利要求56所述的組合物，其中所述的一種或多種光敏劑微珠的每一個附著第一種結合劑。
58.根據權利要求55所述的組合物，其中所述的可裂解連接包括烯烴基團和一種或多種與所述的烯烴基團相連的電子供體取代物。
59.根據權利要求55所述的組合物，其中所述的多個電泳探針被定義為如下結構式T-(L-E)k其中T是對靶分子特異的結合部分，L是可裂解的連接，E是電泳標記，k是大於或等於1的整數，如此所述多個中的每一個不同的T附著於不同的E，且多個中的每一個E具有不同於所述多個中其它E的光學特徵和/或電泳遷移率。
60.根據權利要求55所述的組合物，其中所述的種類特異試劑特異地結合磷酸化的多肽。
61.一種組合物，其包括(a)靶多肽；(b)與靶多肽特異結合的電泳探針；和(c)含有效接近範圍的致裂解部分的種類特異試劑，種類特異試劑被特異地連接到靶多肽上，使電泳探針在所述的有效接近範圍內。
62.根據權利要求61所述的組合物，其中所述的靶多肽具有磷酸基團，且其中所述的種類特異試劑與其特異地結合。
全文摘要
本發明公開了在標本中檢測一種或多種靶多肽的方法、組合物和試劑盒，其中靶多肽已經接受了翻譯後修飾。含標本的混合物和含致裂解部分的第一個試劑及針對靶多肽上結合部位的第一個結合劑被置於各自結合部分發生結合的條件下。結合部位是靶多肽參與的翻譯後修飾活動的結果。本方法可用於檢測靶多肽本身。在另一個實施例中，靶多肽的存在和/或量與一個物質的存在和/或量和/或活性有關，如參與靶多肽翻譯後修飾的酶。第一個結合劑和結合部位間的相互作用將致裂解部分帶到可裂解部分的近旁，可裂解部分與多肽相連且僅當與致裂解部分接近時容易被裂解。以此方式，每個多肽的電泳標記可被釋放。釋放的電泳標記被分離，並根據相應的電泳標記檢測靶多肽的存在和/或量。
文檔編號G01N33/68GK1559006SQ02810325
公開日2004年12月29日 申請日期2002年5月21日 優先權日2001年5月21日
發明者S·辛格, H·薩利米－穆薩威, S·H·塔稀爾, G·J·沃韋伯, H·基拉科相, T·J·馬特雷, V·S·埃爾南德斯, S 辛格, 埃爾南德斯, 塔稀爾, 沃韋伯, 穆薩威, 葡, 馬特雷 申請人:埃克來拉生物科學公司